На правах рукописи
Смирнов Максим Александрович
Совершенствование средств диагностики, профилактики
и лечения поросят, больных колибактериозом
06. 02. 02 – ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология,
микология с микотоксикологией и иммунология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандидата
ветеринарных наук
Курск – 2010
Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова».
Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, профессор Евглевский Анатолий Алексеевич
Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор
Коваленко Анатолий Михайлович
кандидат ветеринарных наук
Шевцов Илларион Андреевич
Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт патологии, фармакологии и терапии»
Защита состоится « » 2010г. в « » часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» по адресу: 305021, г. Курск, ул. К. Маркса, 70, КГСХА.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Курской государственной сельскохозяйственной академии имени профессора И.И. Иванова.
Автореферат разослан « » 2010г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Г.Ф. Рыжкова
3
1. Общая характеристика работы
Актуальность темы. С момента открытия Т.Эшерихом в 1886 году эшерихий и установления их роли в развитии заболеваний животных и, особенно, пищевых токсикоинфекций людей продолжается изучение их свойств, строения и патогенеза, на фоне постоянного усиления экологического воздействия.
Колибактериоз наносит существенный экономический ущерб как животноводству в целом, так и отдельным его отраслям, особенно птицеводству. От одного только некротического дерматита, портящего товарный вид тушек кур, США и Бразилия в 2003 году потеряли около 40 и 10 миллионов долларов соответственно (de Brito B.G., Gaziri L.C.J., Vidotto M.C., 2003). По данным Росптицесоюза, в России в первом полугодии 2007 года колибактериоз диагностировали в 73,4% случаев падежа птицы.
Эшерихии и их бактериофаги являются обитателями кишечника человека и животных. Они входят в группу бактерий кишечной палочки (ГБКП) и считаются родоначальниками всех санитарно-показательных микроорганизмов (Покровский В.И., Поздеев О.К., 1999).
Наличие у E. coli ряда биологических свойств и, прежде всего, большого набора серологических вариантов (более 10 тысяч), факторов адгезии и колонизации, «незавершенность» иммунитета, ускоренное размножение как внутри, так и вне клеток органов и тканей – удвоение через каждые 15-30 минут, способности токсинообразования, инвазивной активности, устойчивости к различным антибактериальным препаратам обеспечивает этому микроорганизму широкое распространение и циркуляцию в организме животных и во внешней среде (Зароза В.Г., 1991).
Постоянная эволюция эшерихий, выражающаяся в повышении их резистентности к антибактериальным препаратам, дезинфектантам, бактериофагам, физическим факторам, изменении патогенных и вирулентных свойств определяет актуальность исследований по изучению воздействия региональных факторов внешней среды на биологические свойства этих микроорганизмов.
Отдельный практический интерес представляют более совершенные средства и методы выделения эшерихий из патологического материала, а также совершенствование методов профилактики и лечения колибактериозов.
Цель работы: Целью работы явилось совершенствование питательных сред индикации и выращивания эшерихий для получения анатоксин-вакцины, изучение влияния лазерного, магнитного воздействия на биологические и физико-химические свойства, действия ряда антибиотиков и пробиотиков на E. coli.
Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:
1.Разработать синтетические питательные среды для выделения и выращивания эшерихий.
2.Изыскать возможность нового метода получения и применения колибактериозной анатоксин-вакцины, обладающей повышенными протективными и иммуногенными свойствами.
3.Изучить воздействия лазерного облучения и переменного магнитного поля на биологические и физико-химические свойства эшерихий.
4.Изучить действие ряда антибиотиков и пробиотиков на E. coli.
Научная новизна. Разработаны жидкая и плотная с 2,5% агаром синтетические среды для выделения и выращивания эшерихий и доказана эффективность 2,5% раство-
4
ра перекиси водорода с 2,5% раствором янтарной кислоты для подавления посторонней микрофлоры.
Установлено наличие влияния на E. coli экологических факторов, в частности, геомагнитных полей Железногорского района Курской области на проявление антибиотикоустойчивости; переменного магнитного поля и лазерного излучения на рост, устойчивость к высокой температуре, дезосредствам, сохранность в объектах внешней среды.
Изготовлена колибактериозная анатоксин-вакцина, полученная путем выращивания эшерихий на синтетической питательной среде, свободной от балластных веществ мяса, казеина и детоксикации колибактериозных токсинов двумя детоксикаторами: первоначально 0,2% раствором формалина, а затем 0,5±0,1% раствором этония, обладающая высокими протективными и иммуногенными свойствами (патент на изобретение №2372937).
Проведено испытание схемы комплексного лечения поросят, больных колибактериозом с использованием пробиотиков (бифидумбактерин форте, бифитрилак и пробифор), а также протеолитических ферментов (террилитина и терридеказы) и пребиотического препарата «Асид-Лак» в качестве единственного средства этиотропной терапии (временное наставление от 16 сентября 2009 года).
Практическая ценность. Апробированные синтетические питательные среды и 2,5% раствор перекиси водорода с 2,5% раствором янтарной кислоты для подавления посторонней микрофлоры рекомендуем использовать для выделения и выращивания эшерихий, и в качестве контроля качества импортируемой мясной продукции.
Установленное геомагнитное воздействие на повышенную устойчивость эшерихий к антибиотикам следует учитывать при лечении животных больных колибактериозом и проведении ветеринарно-санитарных мероприятий.
Полученная анатоксин-вакцина внедрена в свиноводческих хозяйствах для профилактики, а схема с использованием пробиотиков и протеолитических ферментов для лечения колибактериозов у поросят (Приложение №5 - справка о внедрении).
Основные положения выносимые на защиту.
1.Материалы разработки синтетических питательных сред для выделения и выращивания эшерихий.
2.Результаты получения и апробации анатоксин-вакцины.
3.Влияние лазерного облучения и магнитных полей на биологические свойства эшерихий.
4.Материалы по изучению действия ряда антибиотиков и пробиотиков на E. coli.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы изложены и одобрены на международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса» (Курск, 2008г.); международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2008г.); международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова «Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины» (Курск, 2009г.); международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (Санкт-Петербург, 2010г.).
5
Публикации результатов исследований. По теме работы опубликовано 9 научных статей и получено 2 патента на изобретение.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 123 страницах компъютерного текста и включает общую характеристику работы, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований и их обсуждение, выводы и практические предложения. Работа иллюстрирована 7 рисунками и 18 таблицами. Список литературы включает в себя 205 источников, в том числе 82 иностранных авторов.
2. Материал и методы исследований
Работа выполнена на базе кафедры эпизоотологии, паразитологии, вирусологии и ОЭВД Курской государственной сельскохозяйственной академии имени И.И. Иванова, Курской областной ветеринарной лаборатории, Железногорской зональной ветеринарной лаборатории, Курской областной санитарно-эпидемиологической станции, в хозяйствах Курской области в период с 2006г. по 2009г.
Объектом исследования служили E. coli, выделенные из трупов павшей птицы, крупного рогатого скота, свиней; фекалий телят, поросят и поверхностных водных источников из регионов с различным геомагнитным фоном.
После вскрытия павшей птицы, крупного рогатого скота и свиней с характерными для колибактериозов патологоанатомическими изменениями делали посевы из сердца, печени, селезенки, желчного пузыря, костного мозга (трубчатой – бедренной кости) и тонкого кишечника. Перед посевом поверхность сердца, печени, селезенки и желчного пузыря прижигали раскаленным шпателем, а бедренную кость разрезали и фламбировали поверхность среза. Посевы производились пастеровскими пипетками. Со слизистой тонкого кишечника делали соскоб стерильным шпателем и помещали его в питательную среду.
Пробы кала от телят и поросят помещали в стерильные флаконы с ватно-марлевыми пробками, прибавляли по 90,0 см3 0,1%-ной пептонной воды, тщательно перемешивали и подращивали в термомтате при 370С 48 часов. Из внутренних органов делали высевы в пробирки с 5,0 см3 0,1%-ной пептонной воды и подращивали в этом же режиме.
Для выделения и культивирования энтеробактерий использовали 2,5% мясо-пептонный агар с рН 7,2-7,4(МПА); 0,1%-ную и 1%-ную пептонную воду (ПВ); мясо-пептонный бульон с рН 7,2-7,4 (МПБ) и на разработанной нами синтетической питательной среде (жидкий и плотный варианты).
Для изучения чувствительности к антибиотикам использовали 1,5% МПА и бумажные диски производства НИЦФ.
Идентификацию выделенных культур энтеробактерий проводили на основании изучения культурально-морфологических, биохимических и антигенных свойств. При проведении исследований использовали чистые (клонированные) 18-20 часовые бульонные культуры, а также культуры, выращенные в течение 2-3 суток на элективной среде. Морфологические особенности изучали при микроскопии мазков, окрашенных по Граму.
Идентифицированные выделенные чистые культуры E. coli были использованы для проверки сравнительной эффективности элективной синтетической питательной среды и агара Эндо для выделения и выращивания кишечной палочки. Для чего были использованы свежевыделенные и лабораторные штаммы эшерихий, сарцин, протея и стафилококков.
6
Изучение сохранности культур кишечной палочки, выделенных из трупов павшей птицы, крупного рогатого скота, свиней; фекалий телят, поросят и поверхностных водных источников до и после сочетанного воздействия лазерного излучения и ПМП проводили с использованием 20 мл флаконов с водопроводной водой с рН 7,2±0,2 после кипячения. Флаконы с водопроводной водой, содержащие 100 тыс. микробных клеток кишечной палочки в 1мл хранили при 10-150С, 20-250С и 40-450С в течение 180 дней. Высевы проводили на МПА и МПБ в пробирки с синтетической средой через месяц с момента инфицирования с интервалом 3-5 дней.
Для лечения колибактериоза были использованы различные пробиотики: бифидумбактерин-форте, «Пробифор», «Бифитрилак». Все больные, независимо от метода и схемы лечения получали общепринятую «базисную» терапию (диета, оральная регидратация, ферменты, симптоматические средства и др.). Из лечения больных, получавших пробиотики, были исключены энтеросорбенты и другие средства этиотропной терапии. Одновременно с пробиотиками внутрибрюшинно вводили протеолитические ферменты (террилитин и терридеказу) в дозе 100 протеолитических единиц на 1кг массы животного, а поросята пред- и послеотъемного периодов с комбикормом получали пребиотический препарат «Асид-лак» (из расчета 300 грамм на 100 кг. комбикорма). В качестве контроля служили больные поросята, получавшие традиционную терапию подтитрованными антибиотиками в сочетании с сульфаниламидными и нитрофурановыми препаратами (30 поросят разного возраста и формы течения болезни).
Профилактика колибактериоза осуществлялась при помощи колибактериозной анатоксин-вакцины (КАВ), полученной путем выращивания эшерихий на синтетической среде в 2-х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру в течение 3-х суток с концентрацией 60±10 млрд/мл микроорганизмов с последующим автоклавированием при 1,0 атм. в течение 30 минут. Концентрация молекулярных токсинов составляла 1,2±0,2 мг/см3.
К полученной суспензии автоклавированных эшерихий с растворимыми токсинами был внесен формалин до 0,2% концентрации для детоксикации при 40±10С в течение 7 суток, а затем добавлен этоний до 0,5% концентрации для завершения детоксикации при 41±10С в течение 7 суток всех видов колибактериозных токсинов.
После сорбции анатоксин-вакцины на гидроксиде алюминия (3мг/см3) проведена расфасовка препарата в 20,0 и 100,0 мл флаконы и стерилизация при 1,0 атм. в течение 20 минут.
Полученная анатоксин вакцина применялась подкожно поросятам и супоросным свиноматкам, а также выпаивалась с водой 3-4 недельным поросятам.
Оценку иммуногенных свойств колибактериозной анатоксин-вакцины проводили путем определения титра специфических антител в сыворотках крови у свиноматок и поросят до и после вакцинации. С этой целью была поставлена пробирочная реакция агглютинации с колибактериозным антигеном, содержащим в 1 милилитре 5108 клеток E. coli.
Общая схема исследований представлена на рисунке 1.
7
| Общая схема исследований | |
| Часть первая Материалы по разработке синтетических питательных сред для выделения и выращивания кишечной палочки и изыскание щадящего средства подавления посторонней микрофлоры с целью выделения E. coli. | |
| Часть вторая Определение чувствительности к антибиотикам культур E. coli, выделенных из различных патматериалов в зонах с различным уровнем магнитных полей. | |
| Часть третья Воздействие переменного магнитного и лазерного излучений на биологические и физико-химические свойства E. coli (скорость роста и размножения, устойчивость к температуре, дезосредствам, сохранность в воде). | |
| Часть четвертая Совершенствование лечения и профилактики колибактериозов у поросят (лечение пробиотиками и специфическая профилактика колибактериозной анатоксин-вакциной). | |
Рис.1. Общая схема исследований
3. Результаты исследований
3.1. Изучение эпизоотической ситуации по колибактериозу в хозяйствах Курской области
Поскольку колибактериоз поражает молодняк сельскохозяйственных животных, снижается рост численности их поголовья и, как следствие, увеличивается экономический ущерб. Колибактериоз лошадей не регистрируется в области с 2004 года и произошло снижение числа неблагополучных пунктов по колибактериозу мелкого рогатого скота. Однако, число случаев заболевания и смертности среди крупного рогатого скота, свиней, птицы не сократилось, а, если сравнивать период с 2005 по 2006 годы, и с 2007 по 2008 годы, то произошло увеличение количества неблагополучных пунктов и смертности от колибактериоза у свиней. Таким образом, анализ ветеринарной отчетности Управления ветеринарии Курской области за 2003-2008 годы свидетельствует, что колибактериоз все еще представляет угрозу для регионального животноводства. В этой связи необходимо разрабатывать новые и совершенствовать старые методы диагностики, профилактики и лечения больных колибактериозом животных.
8
3.2. Материалы по разработке синтетических питательных сред для выделения и выращивания эшерихий
В последнее время в развитии колибактериоза и сальмонеллеза пищевой путь передачи возбудителя инфекции становится ведущим. В этой обстановке медико-ветеринарные службы нуждаются в рациональных методах экспресс-индикации обсемененности эшерихиями и сальмонеллами мясной, рыбной и растительной продукции, чтобы в сжатые сроки иметь возможность сделать заключение о реализации исследуемой партии продукции или ее апрещения, а также выявить источник болезни.
Для исследований были использованы свежевыделенные и лабораторные штаммы эшерихий, протея, сарцин, стафилококки и питательная среда Эндо.
Серия поставленных опытов по изысканию синтетической питательной среды для выращивания эшерихий позволила установить рациональный состав среды, содержащий в 1 литре дистиллированной воды следующие ингредиенты в г/л: лимонную кислоту; фосфорнокислый калий 2-зам.; фосфорнокислый натрий 2-зам.; хлористый натрий; сернокислый цинк; сернокислое железо; сернокислый магний; янтарную кислоту.
Таблица 1.Состав синтетической среды для выращивания кишечной палочки.
| Наименование ингредиентов | Количество, г/л |
| Лимонная кислота | 8,0 |
| Сернокислый цинк | 0,1 |
| Сернокислый магний | 0,5 |
| Сернокислое железо | 0,1 |
| Фосфорнокислый калий 2- замещенный | 3,0 |
| Фосфорнокислый натрий 2-замещенный | 3,0 |
| Хлористый натрий | 1,0 |
| Янтарная кислота | 2,0 |
| Дистиллированная вода | 1000мл |
После установления реакции до 7,2-7,4 среда фильтруется через несколько слоев марли или фильтровальное полотно, расфасовывается в 2-х литровые биобутыли или другие емкости и автоклавируется при 1,0 атм. в течение 20 минут.
Накопление эшерихий на указанной среде после 2-3 суточного инкубирования в 2-х литровых биобутылях достигает 60±10 млрд/см3 микробных тел. Питательные свойства среды не изменяются при ее изготовлении из предварительно смешанных ингредиентов в сухом веществе (таблица1). В последующем, состав разработанной жидкой синтетической среды был использован в качестве минеральной основы для изготовления элективной синтетической среды с агаром, подобной МПА. Приготовление плотной среды с агаром проводили путем разведения жидкой синтетической среды в соотношении 1:1; 1:2; 1:3 и в цельном виде при добавлении 2,5% агара.
Реакция устанавливалась аммиаком до pH 7,2 -7,4, раствор подогревался до расплавления агара, разливался по флаконам и стерилизовался при 1,0 атм. в течение 20 минут.
Перед употреблением к 100 мл. среды стерильно добавляли 1,2 граммов лактозы 1,5 мл насыщенного фуксина и 1,5 мл 10%-ного раствора сернокислого натрия (Na2SO3). Питательные свойства среды не изменяются при хранении во флаконах в течение 1 года.
9
На предложенной плотной с агаром элективной синтетической среде (таблица 2) кишечные палочки вырастают в виде ярко-розовых и красных колоний. Это происходит от способности бактерий ферментировать, т.е. биохимически перерабатывать под действием ферментов лактозу с изменением pH среды в кислую сторону и образовывать ацетилальдегид, который реагируя с сульфатом натрия (Na2SO3) вызывает красное окрашивание микроорганизмов кишечной палочки. На элективной среде рост посторонней микрофлоры практически не происходит.
Чистые культуры бактерий засевали по 0,1 мл взвеси содержащей 1000 микробных клеток в 1 мл. Смеси с другими микроорганизмами готовились из равных объемов взвесей микробов такой же концентрации.
Таблица 2.Результаты посевов микробов на среде Эндо и элективной среде.
| №п/п | Посевной материал | Среда Эндо | Элективная среда |
| Чистая культура | |||
| 1 | Кишечная палочка | Рост в виде темно-красных колоний | Рост в виде темно-красных колоний |
| 2 | Протей | Ползучий рост | Нет роста или очень мелкие колонии через 48 часов |
| 3 | Стафилококки | Рост | Нет роста |
| 4 | Сарцины | Рост | Нет роста |
| Смешанные культуры | |||
| 5 | Кишечная палочка и протей | Ползучий рост протея и рост кишечных палочек | Рост кишечной палочки, а протейные культуры не дают роста |
| 6 | Кишечная палочка и синегнойная палочка | Рост кишечных и синегнойных палочек | Рост кишечных палочек |
| 7 | Кишечная палочка и сарцины | Рост кишечных палочек и сарцины | Рост кишечных палочек |
| 8 | Кишечная палочка и стафилококк | Рост кишечных палочек и стафилококков | Рост кишечных палочек |
Из полученных данных следует, что элективная синтетическая среда с лактозой, фуксином и сернокислым натрием имеет по сравнению со средой Эндо то преимущество, что на ней подавляется рост посторонней микрофлоры (кокков, сарцин, препятствуется роению протея) и позволяет проводить не только дифференциацию, но и селекцию кишечных палочек.
Для удобства использования синтетических питательных сред необходима разработка эффективного средства подавления посторонней микрофлоры при выделении E. coli.
3.3. Изыскание щадящего средства подавления посторонней микрофлоры при выделении кишечной палочки
Материал для исследования брали из различных источников: трупов павшей птицы, крупного рогатого скота, свиней; фекалий телят, поросят и поверхностных водных источников.
10
Было проведено сравнительное изучение эффективности выделения кишечной палочки при внесении в питательную среду щадящего средства подавления посторонней микрофлоры с различной концентрацией компонентов.
Чтобы обеспечить чистоту эксперимента патологический материал дополнительно обсеменялся заведомо известными смешанными культурами, содержащими наряду с E. coli сальмонеллы, протей и сарцины. Посевы предварительно подращивали в 0,1% пептонной воде при 370С в течении 48 часов. Затем из надосадочной жидкости делали высев на жидкую питательную среду (перевар Хоттингера). Предварительно в нее внесли щадящее средство подавления микрофлоры с различной концентрацией компонентов.
После 24 часового термостатирования производили пересевы на плотную питательную среду – среду Эндо. Затем с поверхности плотной питательной среды снимали характерные для кишечных палочек ярко-красные с металлическим блеском диаметром 2-3мм колонии, из которых приготавливали мазки и окрашивали по Граму. В случае обнаружения при микроскопии грамотрицательных палочек, производили пересев колоний на МПА. Последующую идентификацию этих микроорганизмов проводили по схеме, изложенной в разделе «Материалы и методы».
При изучении биохимических свойств выделенные штаммы существенных отличий от свойств, типичных для рода Escherichia не проявляли, то есть: разлагали до кислоты и газа манит, глюкозу, арабинозу, образовывали индол, аммиак, не образовывали сероводород, давали положительную реакцию с метиленовым красным и отрицательную Фогес-Проскауэра, желатину не разжижали, не утилизировали цитраты и соли аммония, не расщепляли мочевину.
В ходе исследований установлено, что наиболее оптимальным средством, позволяющим подавлять постороннюю микрофлору до 100 тыс. микроорганизмов в 1 мл гомогенной массы патологического материала в течение 30-40 минут является смесь, состоящая из 2,5% раствора перикиси водорода с 2,5% раствором янтарной кислоты при последующей нейтрализации суспензии 5% раствором аммиака.
Таблица 3.Результаты изыскания щадящего средства подавления посторонней микрофлоры с целью выделения E. coli.
| № п/п | Экспериментальная концентрация компонентов | Микроорганизмы с концентрацией 100 тыс/мл | |||
| Эшерихии | Сальмонеллы | Протей | Сарцины | ||
| 1 | 1,5% раствор перикиси водорода и 1,5% раствор янтарной кислоты | + | + | + | + |
| 2 | 2,0 % раствор перикиси водорода и 2,0 % раствор янтарной кислоты | + | + | + | + |
| 3 | 2,5% раствор перикиси водорода и 2,5% раствор янтарной кислоты | + | - | - | - |
| 4 | 3% раствор перикиси водорода и 3% раствор янтарной кислоты | - | - | - | - |
11
Этот вид обработки позволяет повысить оперативность лабораторного исследования, так как обработка патологического материала едким натрием и серной кислотой в сравнении с янтарной кислотой и перикисью водорода приводит к уменьшению бактериологического выделения эшерихий на 20% и задержке роста микроорганизмов на 5-8 дней. Одновременно с выделением чистой культуры кишечной палочки используемая смесь, состоящая из 2,5% раствора перикиси водорода и янтарной кислоты, является оптимальным средством для подавления роста протея, сарцин, сальмонелл.
Совершенствование диагностики колибактериозов невозможно без учета чувствительности различных культур кишечной палочки к антибиотикам. Следовательно, необходимо ее детальное изучение с привязкой к конкретным территориям, где была выделена E. coli.
3.4. Определение чувствительности к антибиотикам культур E. coli, выделенных из различных патматериалов
Выделенные из трупов павшей птицы, крупного рогатого скота, свиней, фекалий телят и поросят культуры кишечной палочки проверялись на чувствительность к антимикробным препаратам.
Всего протестировали 42 культуры бактерий.
Больше всего культур E. coli, выделенных на территории Курской области, проверено на чувствительность к гентамицину (39), левомицетину (36), стрептомицину (36); меньше всего к флорану (2) и цефиксиму (3). Культуры E. coli показали повышенную чувствительность к цефатоксиму и цефиксиму (8,7% и 0% резистентных культур соответственно). Умеренная резистентность (от 25 до 50% резистентных культур) была выявлена к антибиотикам: амикацин (42,9%), офлоксацин (35,7%), флоран (50%), энроксил (50%). К 11 антибиотикам у протестированных культур была зафиксирована резистентность (более 50% культур устойчивы к действию антибиотика): ампицилину (83,3%), гентамицину (56,4%), канамицину (78,6%), левомицетину (72,2%), полимиксину (85,7%), стрептомицину (94,4%), тетрациклину (89,7%), фурадонину (74%), фуразолидону (81,25%), цефазолину (58,9%), ципрофлоксацину (68,2%).
Наибольшее количество культур, выделенных на территории Железногорского района проверено на чувствительность к гентамицину (12) и левомицетину (11). Культуры E. coli проявляли абсолютную резистентность (100%) к полимиксину, стрептомицину, фурадонину, ципрофлоксацину. Помимо этих антибиотиков выделенные эшерихии были резистентны к: ампицилину (75%), гентамицину (66,7%), канамицину (75%), левомицетину (82%), тетрациклину (66,7%), фуразалидону (75%), цефазолину (80%).
Из данных полученных в ходе исследований было установлено, что эшерихии (более 75% культур) были чувствительны к цефатоксиму и цефиксиму. От 25 до 50% этих микроорганизмов были резистентны к амикацину, офлоксацину, флорану, энроксилу, а более 50% к ампицилину, гентамицину, канамицину, левомицетину, полимиксину, стрептомицину, тетрациклину, фурадонину, фуразалидону, цефазолину, ципрофлоксацину.
При сравнении культур кишечной палочки, выделенных в Железногорском районе и в остальных районах Курской области были обнаружены различия.
12
Эшерихии, выделенные в Курской области (за исключением Железногорского района) были чувствительны к цефатоксиму и цефиксиму. От 25 до 50% кишечных палочек были резистентны к офлоксацину, амикацину и стрептомицину, а более 50% к цефазолину, левомицетину, тетрациклину, гентамицину, фурадонину, энроксилу, фуразалидону, канамицину, полимиксину, ципрофлоксацину, ампицилину, флорану.
От 25 до 50% кишечных палочек, выделенных в Железногорском районе были резистентны к офлоксацину и цефатоксиму, а более 50% к ампицилину, гентамицину, канамицину, левомицетину, полимиксину, стрептомицину, тетрациклину, фурадонину, фуразалидону, цефазолину, ципрофлоксацину.
Выявленные различия в устойчивости эшерихий к антибиотикам в зависимости от уровня геомагнитного поля побудили к исследованию влияния искусственных излучений на их биофизические свойства.
3.5. Изучение воздействия лазерного облучения и переменного магнитного поля на биологические и физико-химические свойства E. coli (скорость роста и размножения, устойчивость к температуре, дезосредствам, сохранность в воде)
Источником лазерного излучения в наших опытах служил гелий-неоновый (газовый) оптический квантовый генератор ЛГ-75, генерирующий излучение длиной волны 632,8 нм и плотностью мощности 25 мВт/см2. Для получения ПМП напряженностью 8000-10000 Тл использовали постоянный магнит, вращаемый со скоростью до 1200 об/мин.
В ходе исследования изучено влияние сочетанного действия энергии лазерного излучения и переменного магнитного поля (ПМП) на размножение Е. соli, устойчивость к температуре, дезосредствам (3% р-р NаОН, 2% р-р фенола, 3% р-р формальдегида, 11% раствор аминоэтилэтиленимина) и сохранность в воде.
Изучение влияния сочетанного действия лазерного излучения и ПМП на сохранность Е. соli в воде проводили с использованием кишечных палочек выделенных от свиней, КРС, птицы; из фекалий телят, поросят, поверхностных водных источников. Для изучения влияния лазерного излучения и ПМП на размножение Е. соli, устойчивость к температуре, дезосредствам, были использованы энтеропатогенные кишечные палочки, выделенные от свиней.
В ходе исследований влияния лазерно-магнитного облучения на рост популяции E. coli установлено что однократное воздействие по 10, 15 и 20 минут влияет на рост популяции E. coli. Так, 20-ти минутное воздействие на 12-ти часовую культуру кишечной палочки вызывает удвоение числа колоний по сравнению с контролем. Также возрастает число колоний через 24 часа (с 32±1 до 43±1) и 36 часов (с 416±1 до 499±25). Многократное лазерно-магнитное воздействие по 5 минут с интервалом 10 минут полностью приостанавливает рост эшерихий в первые 12 часов наблюдения, а количество колоний в 36 часовой культуре было в пять раз меньше по сравнению с контролем (79±4).
Однократное лазерно-магнитное воздействие увеличивает время гибели клеток E. coli под влиянием дезосредств, а режимы по 15 и 20 минут наиболее существенно изменяют продолжительность жизни популяции эшерихий. Так, 20-ти минутный режим увеличивает время гибели кишечной палочки при воздействии 3% NaOH на 10 минут, 2%-го раствора фенола - на 11 минут, 3%-го раствора формальдегида - на 12 минут, 11%-го раствора аминоэтилэтиленимина (этония) - на 15 минут.
13
Многократное воздействие (за исключением первого режима) снижает продолжительность жизни культур E. coli, после внесения в них дезрастворов. Пятнадцатикратное сочетанное воздействие вызывает гибель эшерихий при добавлении 3% NaOH в 2 раза быстрее контроля, 2%-го раствора фенола за 6 минут, 3%-го раствора формальдегида за 6 минут, 11% этония за 4 минуты.
Изучение устойчивости к температуре выявило, что однократное лазерно-магнитное воздействие увеличивает время гибели клеток E. coli. Например, режим по 20 минут – вдвое (до 21 минуты). Многократное облучение снижает жизнеспособность E. coli, а 12-ти и 15-ти кратные режимы наиболее губительны (5 и 11 минут соответственно).
При изучении сохранности кишечной палочки в воде выяснилось, что она также как скорость роста и размножения, устойчивость к температуре, дезосредствам находится в прямой зависимости от того какой тип воздействия выбран – однократный или многократный (однократное увеличивает, многократное снижает). Исследование влияния лазерно-магнитного воздействия на сохранность E. coli в воде проводилось в трех температурных режимах: 10-150С; 20-250С; 40-450С.
Увеличение сохранности эшерихий в воде после сочетанного воздействия лазерного излучения и ПМП в первом и третьем температурных режимах объясняется еще и так называемыми феноменами «теплового шока» и «холодового шока».
Феномен «теплового шока» был открыт Гитоссой в 1952 году и лучше всего изучен у бактерий семейства кишечной палочки, когда при нагревании среды до 420С активируется работа ряда генов, вследствие чего в 5-20 раз увеличивается синтез почти 20 белков, возрастает число делений за единицу времени.
При холодовом шоке снижение температуры роста E. coli с 370С до 100С вызывает увеличение в 3-300 раз синтеза 13 белков и, также, как при «тепловом шоке» возрастает число удвоений за единицу времени.
Таким образом, проведенные испытания выявили, что при однократном воздействии происходило увеличение количества колоний, устойчивости кишечной палочки к дезосредствам, высокой температуре и сохранности в воде, а при многократном воздействии – снижение.
Усовершенствование методов диагностики обусловило дальнейшие исследования в области лечения и профилактики колибактериозов у поросят.
3.6. Изучение лечебного действия пробиотиков «бифидумбактерина форте», «пробифора» и «бифитрилака» в комплексной терапии острых кишечных инфекций у поросят
В последние годы большое внимание уделяется изучению клинической эффективности и разработке новых методов и схем лечения ОКИ без использования антибиотиков. Как показывают отечественные и зарубежные клинические исследования перспективными являются пробиотики в повышенной (ударной) суточной дозе.
Поскольку при большинстве форм ОКИ из воспалительного очага в кровоток поступают продукты деструкции тканевых элементов и лейкоциты, а также различные по функциональной активности медиаторы иммунного ответа в последние годы особое внимание уделяется применению в комплексной терапии иммунокоррегирующих препаратов (Алехин Е.К., Лазарева Д.Н., 1994; Карлов В.А., Белоцкий С.М., Алексеев А.А. и др., 1991; Кузнецов В.П., Беляев Д.Л., Бабаянц А.А., 1996), в частности, протеолитиче-ских ферментов, способствующих стимуляции организма и повышающих его защитные свойства.
14
Под нашим наблюдением находилось 170 больных поросят пред- и послеотъемного периода, а также 60 поросят 2-3 недельного возраста в комплексном лечении которых в качестве единственного средства этиотропной терапии были использованы пробиотики бифудумбактерин форте по 100, 150 и 60 доз/сутки, бифитрилак по 10 (у 2-3 недельных поросят), 15, 21 дозы (у поросят пред и послеотъемного периодов), а также пробифор по 10 доз/сутки и 15 доз/сутки соответственно 1-2 дневным курсом. Отличием препарата «Пробифор» является более высокое содержание бифидумбактерий, что соответствует 10-ти порошкам «обычного» бифидумбактерина форте. Из 230 поросят 84 получали лечение бифудумбактерином форте, 78 препаратом «Пробифор», а остальные препаратом «Бифитрилак» (отличием бифитрилака от бифидумбактерина форте является дополнительное содержание лактобактерий). Одновременно с пробиотиками внутрибрюшинно вводили протеолитические ферменты (террилитин и терридеказу) в дозе 100 протеолитических единиц на 1кг массы животного, а поросята пред- и послеотъемного периодов с комбикормом получали пребиотический препарат «Асид-лак» для стимуляции роста и метаболизма микроорганизмов, обитающих в толстом кишечнике (из расчета 300 грамм на 100 кг. комбикорма). В качестве контроля служили больные поросята, получавшие традиционную терапию подтитрованными антибиотиками в сочетании с сульфаниламидными и нитрофурановыми препаратами (30 поросят разного возраста и формы течения болезни).
У большинства поросят (149) наблюдалась септическая и энтеротоксемическая формы болезни, а у 81 поросенка колибактериоз протекал в форме энтерита.
Все больные, независимо от метода и схемы лечения получали общепринятую «базисную» терапию (диета, оральная регидратация, ферменты, симптоматические средства и др.). Из лечения больных, получавших пробиотики, были исключены энтеросорбенты и другие средства этиотропной терапии.
Бифидумбактерин форте в суточной дозе 60 (30 доз с интервалом 10-12 часов), 100 доз (40, 30 и 30 доз с интервалом 6 часов) и 150 доз (по 50 доз 3-кратно с интервалом 6 часов) был включен в комплексную терапию колибактериоза в начальном периоде заболевания (в первые 2-3 дня).
Проведенное нами изучение клинической эффективности препаратов «Пробифор» 1-2 дневным курсом по 10 (4, 3 и 3 дозы с интервалом 6 часов) у 2-3 недельных поросят и 15 доз/сутки (по 5 доз на прием 3-кратно с интервалом 6 часов) у поросят пред- и послеотъемного периода; и препарата «Бифитрилак» по 10 (у 2-3 недельных поросят), 15, 21 дозы (у поросят пред и послеотъемного периодов) не выявило существенных отличий. При использовании в комплексном лечении колибактериоза пробифора имелась лишь тенденция к укорочению средней продолжительности симптомов интоксикации (2,2±0,3 дня) и диарейного синдрома (2,8±1,03 дней), а при использовании бифитрилака помимо укорочения средней продолжительности симптомов интоксикации (1,9 ±0,3 дня) и диарейного синдрома (2,3 ±0,98 дней) снизилась средняя длительность лихорадки (1,45±0,3 дня).
У 3-х поросят в контрольной группе, у которых на 8-10 сутки лечения антибиотиками отмечались непереваренные комочки пищи, примесь слизи и крови лечение антибиотиками было прекращено и заменено 2-3 дневным курсом пробифора с протеазами по той же схеме. На 4-й день от начала лечения у всех поросят наступило полное клиническое выздоровление.
15
Таким образом, проведенные нами клинические исследования позволяют сделать заключение о том, что пробиотики в сочетании с протеолитическими ферментами могут быть использованы в комплексной терапии колибактериоза у поросят как единственное средство этиотропной терапии.
Добиться эффективной борьбы с колибактериозом одними лишь лечебными мероприятиями невозможно, поэтому были проведены исследования по совершенствованию методов специфической профилактики колибактериозов у поросят.
3.7. Получение колибактериозной анатоксин-вакцины и испытание ее свойств в условиях эпизоотического эксперимента
За прототип при получении колибактериозной анатоксин-вакцины был взят способ, включающий выращивание E. coli в бульоне Хоттингера, стерилизацию и детоксикацию токсинов 1% раствором формалина, сорбцию на гидроксиде алюминия с последующим внесением консерванта – мертиолята (Осидзе Н.Д., Борисович Ю.Ф., Кирилов Л.В. Ветеринарные препараты. – М.: Колос, 1981, с. 219-225).
Недостатком указанного способа является выращивание эшерихий на гидролизате Хоттингера и проведение детоксикации 0,8±0,2% раствором формалина.
Испытание новых детоксикаторов выявило эффективность ряда бисчетвертичных аммониевых соединений, в частности, этония (1,2-этилен-бис-(N-диметилкарбдецилоксиметил) аммония дихлорид). Безвредность и эффективность этония подтверждена в использовании его в гуманной медицине в качестве мазей, паст и растворов при дерматитах, трещине сосков, прямой кишки, для заживления ран, при кератитах и стоматите и пр.
Для получения колибактериозной анатоксин-вакцины (КАВ) выращенные эшерихии на синтетической среде в 2-х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру в течение 3-х суток с концентрацией 60±10 млрд/мл микроорганизмов подвергнуты автоклавированию при 1,0 атм. в течение 30 минут. Концентрация молекулярных токсинов составляла 1,2±0,2 мг/см3.
К полученной суспензии автоклавированных эшерихий с растворимыми токсинами был внесен формалин до 0,2% концентрации для детоксикации при 40±10С в течение 7 суток, а затем добавлен этоний до 0,5% концентрации для завершения детоксикации при 41±10С в течение 7 суток всех видов колибактериозных токсинов, в том числе, и энтеротоксинов, которые формалин не способен детоксицировать.
После сорбции анатоксин-вакцины на гидроксиде алюминия (3мг/см3) проведена расфасовка препарата в 20,0 и 100,0 мл флаконы и стерилизация при 1,0 атм. в течение 20 минут.
Общая схема получения колибактериозной анатоксин-вакцины приведена на рис.2.
Изучение безвредности анатоксин-вакцины, проведенное на 8 белых мышах массой 18-20 г и 10 поросятах 15-30 дневного возраста путем подкожного введения 0,5 см3 и 5,0 см3 биопрепарата, показало, что в течение 10 суток все животные оставались клинически здоровыми без видимых изменений на месте введения.
При испытании колибактериозной вакцины на активность среди вакцинированных поросят не отмечено признаков заболевания через 15 суток после заражения.
Испытание эффективности КАВ не выявило у народившихся поросят диарейных признаков.
Получение колибактериозной анатоксин-вакцины представлено на рисунке 2.
16
| Выращивание эшерихий в 200 мл стерильных флаконах и 40 мл пробирках с 0,1% пептонной водой в термостате при 370С в течении 48 часов | |
| Выращивание эшерихий на жидкой СПС в 2-х литровых биобутылях с объемом среды равной 1 литру в течение 3-х суток с концентрацией 60±10 млрд/мл микроорганизмов | |
| Автоклавирование выращенной колибактериозной культуры при 1,0 атм. в течение 30 минут | |
| Детоксикация колибактериозных токсинов 0,2% раствором формалина при 40±10С в течение 7 суток | |
| Детоксикация колибактериозных токсинов, в том числе, и энтеротоксинов 0,4±0,1% раствором этония при 40±10С в течение 7 суток | |
| Сорбция колибактериозной анатоксин-вакцины на гидроксиде алюминия (3мг/см3) | |
| Расфасовка препарата в 20,0 и 100,0 мл флаконы и стерилизация при 1,0 атм. в течение 20 минут | |
Рис.2. Основные технологические этапы изготовления колибактериозной анатоксин-вакцины.
Особый практический интерес вызывают полученные результаты по профилактике колибактериоза у поросят путем применения вакцины с водой и кормом.
Для профилактики колибактериоза у поросят использовали колибактериозную вакцину из энтеропатогенных культур E. coli, выделенных в стационарно неблагополучных по колибактериозу подсобных хозяйствах, принадлежащих ФБУИН №2 и №9 (поселок Косиново Курского района).
Вакцину выпаивали с водой шестидесяти 3-4 недельным поросятам в дозе 4-7 мл в течение 10-12 суток. В одной дозе в среднем содержалось 10-15 млрд. инактивированных микроорганизмов и 0,6-0,8 мг/мл токсинов, подвергнутых детоксикации. Для контроля было использовано двадцать поросят этого же возраста, зараженных подкожно суспензией энтеропатогенных культур E. coli, выделенных в этом хозяйстве в дозе 150 тысяч микробных тел через 15 суток после вакцинации, которым в качестве лечения применялись антибиотики. Из лечения больных, получавших антибиотики, были исключены энтеросорбенты и другие средства этиотропной терапии.
Изучение протективной активности колибактериозной анатоксин-вакцины из местных штаммов при пероральном применении показало, что не один из поросят, которым выпаивали вакцину не заболел, а падеж в контрольной группе составил 70%.
Иммуногенная активность вакцины оценивалась по результатам постановки пробирочной реакции агглютинации с колибактериозным антигеном.
Максимальный титр специфических колибактериозных антител у поросят и свиноматок до вакцинации составлял 1:50, а после вакцинации колибактериозной анатоксин-вакциной титр возрос до 1:200, причем у вакцинорованных поросят наблюдалась более выраженная реакция агглютинации в указанном титре (+++), чем у вакцинированных свиноматок (++).
17
Главным достоинством полученной колибактериозной анатоксин-вакцины является обеспечение полной и необратимой детоксикации комплекса колибактериозных токсинов после выращивания эшерихий на синтетической среде, свободной от балластных веществ мяса, казеина, уменьшение концентрации формалина до 0,2% путем внесения второго детоксикатора этония в концентрации 0,5±0,1% для заключительной детоксикации при 40±10С в течение 6-7 суток всех видов токсинов, в том числе, энтеротоксинов, которые формалин не детоксицирует и, следовательно, не может превратить их в анатоксины.
При этом исходная концентрация формалина снижается до 0,05%, а этония до 0,2-0,3% из-за связывания их с белковыми молекулами токсинов и микроорганизмов.
Таким образом, полученная в ходе исследований колибактериозная анатоксин-вакцина обеспечивала стабильную полноту детоксикации всех колибактериозных токсинов, в том числе энтеротоксинов, была безвредной и эффективной.
4. Выводы
1.Для повышения оперативности микробиологической диагностики колибактериоза была предложена синтетическая среда для выращивания эшерихий, содержащая в 1 литре дистиллированной воды следующие ингредиенты в г/л: лимонную кислоту- 8,0; фосфорнокислый калий 2-зам.- 3,0; фосфорнокислый натрий 2-зам.- 3,0; хлористый натрий-1,0 сернокислый цинк- 0,1; сернокислое железо- 0,1; сернокислый магний- 0,5; янтарную кислоту- 2,0, и отдельно элективная синтетическая среда с 2,5% агаром в соотношении жидкой и плотной основы 1:1; 1:2; 1:3; в цельном виде для культивирования кишечной палочки на которой в первые 2-3 дня не происходит роста посторонней микрофлоры (кокков, сарцин, роения протея).
2.Накопление эшерихий на жидком варианте синтетической питательной среды после 2-3 суточного инкубирования в 2-х литровых биобутылях достигает 60±10 млрд/см3 микробных тел.
3.Доступность ингредиентов предложенной синтетической питательной среды, стабильность состава и отсутствие балластных веществ гидролизатов мяса, казеина, гороха, высокое накопление эшерихий позволяет использовать ее при изготолении вакцин, как из лабораторных, так и из свежевыделенных штаммов, вызывающих заболевания животных колибактериозом.
4.Наиболее оптимальным средством при выделении эшерихий из патматериала, позволяющим подавлять постороннюю микрофлору до 100 тыс. микроорганизмов в 1 мл гомогенной массы патологического материала в течение 30-40 минут является смесь, состоящая из 2,5% раствора перикиси водорода с 2,5% раствором янтарной кислоты при последующей нейтрализации суспензии 5% раствором аммиака.
5.Изменения биологических и физико-химических характеристик эшерихий, выявленные после сочетанного воздействия лазерного излучения и ПМП могут быть использованы как для культивирования, так и для борьбы с ними.
6.Разный уровень антибиотикоустойчивости культур кишечной палочки, выделенных из региона с повышенным уровнем геомагнитного поля (Железногорский район) в сравнении с остальными районами Курской области целесообразно учитывать при лечении животных больных колибактериозом.
7.Проведеные испытания схемы комплексного лечения поросят, больных колибактериозом с использованием пробиотиков бифидумбактерин форте, бифитрилак и пробифор, а также протеолитических ферментов (террилитина и терридеказы) и пре-
18
биотического препарата «Асид-Лак» показали ее эффективность в качестве единственного средства этиотропной терапии.
8.Исследования по усовершенствованию колибактериозной анатоксин-вакцины позволили изготовить безвредную и эффективную вакцину с высокой концентрацией инактивированных микроорганизмов (60±10 млрд/мл) и молекулярных токсинов (1,2±0,2 мг/см3 ), обладающую высокими протективными и иммуногенными свойствами.
5. Практические предложения
1. Разработанные элективные синтетические питательные среды могут быть использованы для экспресс-выделения эшерихий из патологического материала, фекалий и воды.
2. Обработку патологического материала сильно загрязненного посторонней микрофлорой смесью, состоящей из 2,5% раствора перикиси водорода с 2,5% раствором янтарной кислоты при последующей нейтрализации суспензии 5% раствором аммиака целесообразно использовать для выделения эшерихий.
3. Изготовленная с использованием разработанной синтетической питательной среды, свободной от балластных веществ мяса и казеина, с пониженной концентрацией формалина за счет использования второго детоксикатора – этония колибактериозная анатоксин-вакцина (патент на изобретение №2372937) может с успехом применяться для профилактики колибактериозов у поросят и супоросных свиноматок.
4. Предложено временное наставление по применению пробиотиков бифидумбактерин форте, бифитрилак и пробифор, а также протеолитических ферментов (террилитина и терридеказы) и пребиотического препарата «Асид-Лак» в качестве единственного средства этиотропной терапии поросят, больных колибактериозом, с указанием доз, кратности, сроков использования данных препаратов, возраста больных животных.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.Смирнов М.А., Евглевский Д.А. Жидкая синтетическая питательная среда для выделения и выращивания эшерихий//Материалы международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов КГСХА имени проф. И.И. Иванова «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса». Курск. – 23-25 января 2008, ч.3. – С.124-126.
2.Смирнов М.А., Евглевский Д.А. Плотная синтетическая питательная среда для выделения и выращивания эшерихий//Материалы международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов КГСХА имени проф. И.И. Иванова «Актуальные проблемы повышения эффективности агропромышленного комплекса». Курск. – 23-25 января 2008, ч.3. – С.126-128.
3.Смирнов М.А., Евглевский Д.А., Евглевский Ан.А. Пробиотики в комплексной терапии колибактериоза у поросят//Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 125- летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». Курск. 22-23 мая 2008. – С.104-107.
4.Евглевский Д.А., Смирнов М.А., Разинькова И.А., Евглевский Ан.А., Стебловская С.Ю. Пробиотики в комплексной терапии сальмонеллеза у поросят//Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 125-летию ветеринарии Курской области «Актуальные проблемы ветеринарной медицины». Курск. 22-23 мая 2008. – С.434-437.
19
5.Смирнов М.А., Евглевский Д.А., Разинькова И.А., Стрекалова Е.А. Влияние лазерного облучения и магнитных полей на биологические свойства Escherichia Coli и Salmonella Tiphimurium//Материалы международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов КГСХА имени проф. И.И. Иванова «Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины». Курск. - 2009. – С.61-66.
6.Смирнов М.А., Евглевский Д.А., Стрекалова Е.А. Синтетическая среда для выделения и выращивания эшерихий//Материалы международной научно-практической конференции профессорско-преподавательского состава и аспирантов КГСХА имени проф. И.И. Иванова «Теоретические и прикладные проблемы ветеринарной медицины». Курск. - 2009. – С.67-69.
7.Евглевский Д.А., Смирнов М.А., Стрекалова Е.А., Кузьмин В.А. Разработка элективной синтетической питательной среды для совершенствования колибактериозных анатоксин-вакцин// Материалы международной научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов Санкт-Петербургской академии ветеринарной медицины. Санкт-Петербург. - 2010. – С.27-29.
8.Смирнов М.А., Евглевский Д.А., Разинькова И.А., Стрекалова Е.А. Особенности повышения эффективности средств специфической профилактики и терапии колибактериозов и сальмонеллезов//Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – 2009. - №1-2. – С.97-99.
9.Евглевский Д.А., Смирнов М.А., Стрекалова Е.А., Кузьмин В.А. Совершенствование средств диагностики, специфической профилактики и терапии больных колибактериозом животных//Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. – 2009. - №1-2. – С.99-103.
Патенты РФ
10.Смирнов М.А. Способ получения колисальмонеллезной анатоксин-вакцины/ М.А Смирнов., Д.А. Евглевский, Ан.А. Евглевский, И.А. Разинькова, Е.А. Стрикалова // Патент РФ №2371197 от 27 октября 2009 года – Бюл. №30.
11.Смирнов М.А. Способ получения колибактериозной анатоксин-вакцины/ М.А Смирнов., Д.А. Евглевский, Ан.А. Евглевский // Патент РФ №2372937 от 20 ноября 2009 года – Бюл. №32.
________________________________________________________________________
Сдано в набор 15.10.2010 г. Подписано в печать 15.10.2010 г.
Формат 6084. Бумага Айсберг. Объем 1,0 усл. печ. л.
Гарнитура Таймс.
Издательство КГСХА им. проф. И.И. Иванова.
305021, г.Кукрск, ул. К. Маркса, 70
Отпечатано в множительном центре ВНИИЗиЗПЭ
305021, г.Курск, ул. К. Маркса, 70-б
