WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Функциональные и иммунно-биохимические изменения у цыплят-бройлеров после применения биокорректора тимогена

На правах рукописи

БЕЛЯЕВА Светлана Николаевна

ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И ИММУННО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ

У ЦЫПЛЯТ-БРОЙЛЕРОВ ПОСЛЕ ПРИМЕНЕНИЯ

БИОКОРРЕКТОРА ТИМОГЕНА

Специальность: 03.00.13 – физиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Белгород 2009

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия»

Научный руководитель: Заслуженный ветеринарный врач РФ,

доктор биологических наук, профессор

Безбородов Николай Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Семенютин Владимир Владимирович

кандидат биологических наук

Амельченко Ирина Анатольевна

Ведущая организация: ФГОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и

биотехнологии им. К.И. Скрябина»

Защита состоится «____» _________ 2009 г., в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.004.01 в ФГОУ ВПО «Белгородская государственная сельскохозяйственная академия» по адресу: 308503, Россия, Белгородский р-н, пос. Майский, ул. Вавилова 1; тел. /факс (4722) 39-22-62.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Белгородской государственной сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан «____» __________ 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Н. Литвинов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Из всех отраслей животноводства, птицеводство наиболее рентабельно и высокопродуктивно, а Белгородская область – одна из лидирующих областей РФ по объему производства птицеводческой продукции (Огурцов А., 2007; Родионов В., 2008; Фисинин В.И., 2008; Шапочкин В., 2009).

Несмотря на достигнутые высокие показатели, в промышленном птицеводстве остается много нерешенных проблем. Важнейшие из них – снижение стресс-факторов, вызывающих иммунодепрессивное состояние птицы, и производство экологически чистой продукции, решение которых позволит получить качественную продукцию и одновременно повысит экономическую эффективность отрасли. Как известно, в промышленном птицеводстве при выращивании цыплят-бройлеров проявляется высокая частота вторичных иммунодефицитных нарушений, которые осложняются возрастными (физиологическими) иммунодефицитами (Болотников И.А., 1983; Барабина М.Т., 1996; Джавадов Э.Д., 2003; Карпуть И.М., 2005; Mazurkiewicz M., 2005 и др.).

В последние годы эффективно ведется поиск профилактических мероприятий, направленных на повышение продуктивности и резистентности сельскохозяйственной птицы. Сохранить и даже повысить ее можно, проводя коррекцию иммунодефицитных состояний организма птицы, за счет применения препаратов из группы биокорректоров, способных за короткое время активизировать неспецифическую резистентность организма и оптимизировать обменные процессы. К числу таких средств относится биокорректор Тимоген®, состоящий из глутаминовой кислоты и триптофана.

Цель и задачи исследований. Целью исследований было изучение механизма действия и определение эффективности применения глутамил-триптофанового комплекса при активизации функциональных связей иммунной системы и адаптационно-метаболических процессов у цыплят-бройлеров в период выращивания, направленных на повышение их сохранности и продуктивности.

Для достижения данной цели были поставлены на разрешение следующие задачи:

  • исследовать иммунологическую реактивность цыплят-бройлеров в процессе роста и развития, до и после введения тимогена;
  • исследовать морфологические и биохимические показатели крови цыплят, характеризующие уровень обменных процессов и адаптационно-метаболический гомеостаз, до и после применения тимогена;
  • выявить характер гистоморфологических изменений в иммунокомпетентных органах цыплят – тимусе, бурсе и селезенке, отражающих их функциональное состояние после применения тимогена;
  • определить рациональный способ применения тимогена в промышленном пти­цеводстве для повышения сохранности и продуктивности цыплят-брой­ле­ров.

Научная новизна. Результаты исследований дополняют и расширяют имеющиеся представления о механизмах развития функциональной системы иммунитета и гемодинамики цыплят-бройлеров, что дает возможность выявления дополнительных критериев, характеризующих состояние птицы. Впервые комплексными исследованиями изучены иммунно-биохимические изменения, характеризующие процессы адаптации у клинически здоровых цыплят-бройлеров после внутримышечного и перорального введения синтетического биокорректора тимогена. Результаты проведенных исследований значительно расширяют существующие представления о механизмах пептидной регуляции и становлении гомеостаза у цыплят-бройлеров в период их промышленного выращивания.

Теоретическая и практическая значимость. На основании результатов исследований дано научное и практическое обоснование по применению синтетического тимогена в промышленном птицеводстве для профилактики и снижения иммунодефицитного состояния цыплят-бройлеров, повышения их сохранности и продуктивности в процессе выращивания.

Разработан доступный групповой метод обработки птицы, повышающий устойчивость организма к неблагоприятным факторам внешней среды – выпаивание 0,01% р-ра тимогена в критические периоды развития цыплят, что обеспечивает повышение резистентности организма. Установлены ростостимулирующая и профилактическая эффективность тимогена в процессе выращивания цыплят-бройлеров.

Положения, выносимые на защиту

1. Глутамил-триптофановый комплекс (тимоген) активизирует функциональную активность клеточного иммунитета (неспецифического и специфического) в процессе постнатального роста и развития цыплят-бройлеров.

2. Коррекция адаптационно-метаболических процессов у клинически здоровых цыплят, после воздействия синтетического тимогена, способствует повышению уровня естественной резистентности организма.

3. Картина морфологических и гистоструктурных изменений в центральных (тимус и бурса) и периферических (селезенка) иммунокомпетентных органах подтверждает биокорригирующее влияние тимогена на морфофункциональное развитие органов иммуногенеза.

4. Разработанный новый доступный групповой метод повышения устойчивости организма птиц к неблагоприятным факторам внешней среды, путем выпаивания 0,01% р-ра тимогена в критические периоды развития цыплят-бройлеров, обеспечивает повышение сохранности и продуктивности птицы.

Апробация работы

Материалы и результаты полученных исследований представлены на XII и XIII междунар. научно-производственных конференциях «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения», г. Белгород, 2008, 2009 гг.; на междунар. научной конференции «Молекулярные механизмы адаптации», г. Махачкала, 2008 г.; на II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», г. Кишинев, 2008 г.; во II и III этапе Всероссийского конкурса на лучшую научную работу среди аспирантов и молодых ученых ВУЗ Минсельхоза РФ, г. Белгород, 2008, 2009 гг.; г. Москва, 2009 г.; на конференции молодых ученых ЦФО, г. Калуга, 2009 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 164 страницах печатного текста. Список литературы включает 271 отечественных и 88 зарубежных источников. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 16 рисунками.

  1. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили цыплята-бройлеры кросса «Росс-508» и «Хаббард F-15» в течение всего цикла выращивания (42 дня), подобранные по принципу пар-аналогов в группы.

Всего в опытах было использовано около 60 тыс. клинически здоровых цыплят-бройлеров. Исследования проходили в два этапа: в лабораторных – первая серия и производственных условиях – вторая серия опытов, алгоритм которых представлен на рис. 1.

Основные лабораторные исследования проведены на факультете ветеринарной медицины во Вроцлавском университете наук о жизни и окружающей среде, Польша (Wroclaw University of Environmental and Life Sciences); на факультете ветеринарной медицины в Белгородской государственной сельскохозяйственной академии; в аккредитованной испытательной лаборатории ФГОУ ВПО БелГСХА; в ФГУ «Белгородской Межобластной ветеринарной лаборатории» (вирусологический и гистологический отделы).

В качества средства активизирующего адаптационно-иммунологические процессы в организме цыплят-бройлеров использовали биокорректор тимоген (ТУ 10.07.169-91), который представляет собой синтетический дипептид, иммуномодулирующей направленности действия (С12H2N3O5Na).

В первой серии опытов (виварий Вроцлавского университета наук о жизни и окружающей среде) объектом исследования служили цыплята-бройлеры кросса «Росс-508» с суточного до 42 дня жизни, которые в 5-ти суточном возрасте по принципу пар-аналогов были разделены на опытные – II, III, IV и контрольные – Iк, IIa, IIIa, IVa группы цыплят. Условия содержания, кормления и поения (свободный доступ) соответствовали общепринятым зоогигиеническим стандартам технологии.

Целью лабораторного опыта было изучение становления иммунно-биохими­че­ского гомеостаза у птиц и сравнение разных способов применения 0,01% р-ра тимогена. Для этого препарат вводили птице различными методами (парентерально, внутримышечно в дозе 0,1 мл/кг массы тела птицы и перорально в дозе 0,1 мл/голову) и в разные периоды онтогенеза c учетом возрастных (физиологических) иммунодефицитов на 5-е и 15-е сутки выращивания, в течение 10 дней.

Цыплята «Iк» группы (n=25) служили общим контролем для всех групп. Цыплятам «II» (n=25) группы вводили 0,01%-ный раствор тимогена внутримышечно в дозе 0,1 мл/кг массы тела с 5-го по 14-й день жизни в течение 10 дней; «III» (n=20) – внутримышечно с 15-го по 24-й день жизни; «IV» (n=20) – перорально с 15-го по 24-й день жизни в дозе 0,1 мл/гол. Кроме того, для экспериментальных групп были созданы дополнительные группы контроля – IIa (n=12), IIIa (n=12) и IVa (n=12), цыплятам которых вводили 0,9%-ный физиологический раствор, в той же дозе и тем же способом, что и 0,01%-ный р-р тимогена для опытных групп. Для исследований у птицы (n=6) брали кровь из подкрыльцовой вены (v. cutanea ulnaris) на 5-е; 11-е; 15-е; 21-е; 26-е; 35-е и 42 сутки эксперимента, а так же тимус, бурсу и селезенку после декапитации птицы.

Количество Т-лимфоцитов с фенотипами TCR, CD3, CD4 и СD8 и В-лимфо­ци­тов – СD19 определяли методом проточной цитофлюориметрии на цитометре FACSCalibur фирмы «Веcton Dickinson», США, c программным обеспечением CellQuest при помощью моноклональных антител к маркерам клеточной поверхности, меченных флуорохромами – флуоресцеин изотиоционатом (FITС) и фикоэритрином (PE) (Воронин Е.С., 2002; Zeromski J., 1996).

Количество лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобин определяли на гематологическом автоанализаторе с программным обеспечением (Vet 2.3) для животных Cell-Dyn 3500 и ABC PACK LMGE for animal blood, а гематокрит – микро-капиллярным методом. Содержание отдельных видов лейкоцитов путем подсчета лейкограмм маз-

ков крови. Исследование окрашенных по Паппенгейму мазков крови цыплят проводи-

ли черырехпольным методом при подсчете 100 лейкоцитов на микроскопе Микмед-1 ОАО «Ломо», используя объектив с масляной иммерсией (Симонян Г.А., Хисамутдинов Ф.Ф., 1995; Campbell T. W., 1988). Уровень глюкозы в плазме крови птицы определяли на автоматическом биохимическом анализаторе МAXMAT унифицированным тестом. Общий белок определяли на универсальном спектрофотометре ВioTek с помощью набора реактивов фирмы Sigma-Aldrich; белковые фракции – в сыворотке крови методом электрофореза на бумаге (Кондрахин И.П., 2004).

Изучаемые показатели

Сохранность поголовья учитывали путем ежедневной оценки клинического состояния птицы. Живую массу тела и среднесуточные приросты цыплят определяли путем индивидуального взвешивания, используя весы AXIS B 15W (max=15 kg, min=20 g, e=5 g), в суточном возрасте и далее на 5-е, 10-е, 15-е, 20-е, 25-е, 30-е, 35-е и 42-е сутки выращивания; а массу иммунокомпетентных органов птицы – взвешиванием на электронных весах Wag I Elektroniczne 53-143 RAR Wag-Dolnylsk (max=36 g, min=2mg, e=1 mg) на 5-е, 15-е, 26-е и 42-е сутки исследований. Индексы тимуса, бурсы и селезенки определяли по отношению массы органа к массе тела умноженное на 1000 (Апатенко В.М., 1988).

Во второй серии опытов, проходивших в производственных условиях птицефабрики ООО «Лопанское» Белгородского агрохолдинга «БЭЗРК-Белгранкорм» Белгородской области, объектом исследования были цыплята-бройлеры кросса «Нubbard F-15», из которых были сформированы две группы по принципу пар-аналогов, из суточных цыплят одной партии, вывода и кросса: V – опытная группа (n=29200 гол.) и VIк – контрольная группа (n=29000 гол.). Условия содержания – напольное выращивание и кормление полноценным комбикормом по периодам выращивания (ГОСТ Р 51851-2001) были идентичными. В опытной группе цыплятам-бройлерам применяли методом выпойки 0,01%-ный р-р тимогена в дозе 0,1 мл/гол/сут., в течение 7 дней, с 15-х по 21-е сутки откорма, дополнительно к основным лечебно-профилактическим мероприятиям, проводимых в хозяйстве. В контрольной группе тимоген не применяли. Учетный период наблюдений за цыплятами-бройлерами продолжался с суточного возраста до конца откорма (42-го дня).

Целью второй серии опыта было определение эффективности применения и изучение биокорригирующих свойств тимогена в промышленном птицеводстве.

Для исследований у птицы (n=6-10) брали кровь из подкрыльцовой вены (v. cutanea ulnaris) на 5-е; 11-е; 15-е; 21-е; 26-е; 35-е и 42 сутки эксперимента; тимус, бурсу и селезенку после декапитации птицы на 42-е сутки опыта, которые фиксировали в 10%-ном нейтральном растворе формалина; грудные и ножные мышцы в конце откорма, на 42-е сутки.

Форменные элементы (количество лейкоцитов и эритроцитов) определяли по стандартной методике, подсчитывая их в камере Горяева; гемоглобин крови – гемиглобинцианидным методом; количество иммуноглобулинов – нефелометрическим методом на фотоэлектроколориметре (цинк-сульфатный тест). Общий белок определяли в сыворотке крови по биуретовой реакции; белковые фракции сыворотки крови – методом электрофоретического фракционирования на бумаге (Кондрахин И.П., 2004). Фагоцитарную активность псевдоэозинофилов в крови цыплят определяли постановкой опсоно-фагоцитарной реакции в условиях in vitro по следующим показателям: процент фагоцитоза, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число, используя отправные критерии по оценке естественной резистентности с.-х. животных (Новосибирск, 2003). В качестве тест культуры для ОФР использовали E. coli. Гистологические препараты приготавливали по общепринятым методикам (Саркисов Д.С., Перов Ю.Л., 1996), окрашивая их гематоксилин-эозином, и анализировали под сканирующим микроскопом «Микмед-2» установки «Видео-тест. При гистоморфологических описаниях иммунокомпетентных органов у птицы учитывали отправные критерии, разработанные для определения иммуносупрессии и иммунодефицитов у птицы (Колоусова Н.Г., 1988). Серологические исследования на напряженность иммунитета цыплят (к болезни Ньюкасла) проводили на 15-е, 26-е, 35-е и 42-е сутки опыта: по 20 проб сыворотки крови цыплят-бройлеров из группы в РТГА (согласно утвержденным методическим указаниям по определению уровня антител к вирусу ньюкаслской болезни в реакции торможения гемагглютинации от 23 июня 1988г. № 988 Минсельхозпрод России).

Сохранность поголовья учитывали путем ежедневной оценки клинического состояния птицы. Живую массу и среднесуточные приросты определяли при групповом взвешивании птицы по 100-300 голов на 1-е; 5-е; 10-е; 15-е; 20-е; 25-е; 30-е; 35-е и 42 сутки выращивания цыплят-бройлеров. В конце откорма цыплят рассчитывали конверсию корма и индекс продуктивности (Тучемский Л.И., 2004). Качество полученной мясной продукции учитывали по химическому составу тушки (грудные и ножные мышцы) и белково-качественному показателю, используя методические рекомендации по определению качества мяса сельскохозяйственных животных и птицы (1982). Оксипролин в мясе определяли по Ньюмену и Логану с применением методики кислотного гидролиза мяса по Вербицкому. Триптофан в мясе определяли по методу Спайза и Чемберза в модификации Геллера (1958).

Полученный цифровой материал обрабатывали статистически на ПЭВМ с использованием пакета программ Microsoft Office 2003. Достоверность полученных результатов исследований определяли методом вариационной статистики с использованием критерия Стьюдента (Лакин Г.Ф., 1990). Разницу в значениях считали статистически достоверной при *р<0,05 и менее.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 Морфологические и иммунно-биохимические показатели

крови цыплят после применения тимогена

3.1.1. Морфологические показатели крови

Результаты исследований, в I и во II серии опытов, при изучении морфологического анализа крови показали, что наблюдается возрастная тенденция изменчивости показателей крови во всех группах: количество лейкоцитов, эритроцитов и гемоглобина изменяется закономерно: максимально возрастая к 26-35 суткам и понижаясь к 42-у дню исследований. Так, на 42-е сутки исследований количество лейкоцитов в опытных группах – II; III и IV – было достоверно выше по сравнению с Iк группой соответственно на 26,69%; на 30,27% и на 30,88%, а количество лимфоцитов – на 4%; 8,0 и 6,0%.

Учитывая то, что в качестве гематологического показателя, характеризующего степень напряжения организма при выращивании, важно использовать отношение гетерофилов (псевдоэозинофилов) к лимфоцитам (Г/Л) как наиболее информативный и доступный показатель, позволяющий выявить зависимость антистрессовых реакций от силы раздражителя, представленные ниже данные (табл. 1) показывают, как меняется соотношение гетерофилов к лимфоцитам в процессе откорма, отражая динамику адаптации (приспособления) птицы к окружающей среде содержания (Gross W.B., Siegel H.S., 1983; Graczyk S., 1999; 2005; Бусловская Л.К. с соавт., 2008; Ковалева О.Л., 2008; Ковтуненко А.Ю., 2008; 2009).

Так, на 15-е сутки исследований, во IIa группе цыплят выявлено достоверное повышение данного показателя по отношению к остальным группам почти в 2 раза. На 21-е сутки исследований выявлено достоверное повышение соотношения Г/Л в IIIa и повышение в IVa группах цыплят.

Таблица 1 – Соотношение Г/Л в периферической крови цыплят

Группы, n=6 Время исследований
На 5-е сут. На 11-е сут. На 15-е сут. На 21-е сут. На 26-е сут. На 35-е сут. На 42-е сут.
0,19±0,01 0,25±0,06 0,31±0,18 0,38±0,10 0,45±0,04
II 0,19±0,08 0,23±0,1 0,23±0,03 0,25±0,06 0,34±0,05 0,45±0,07
IIa 0,20±0,07 0,29±0,2 0,45±0,1
II 0,22±0,15 0,21±0,07 0,27±0,04 0,31±0,12 0,35±0,08
IIIa 0,24±0,02 0,43±0,09* 0,37±0,24
IV 0,28±0,26 0,25±0,10 0,26±0,04 0,28±0,04 0,39±0,09
IVa 0,23±0,09 0,31±0,11 0,32±0,06

_____________________________

Здесь и далее:

–*р<0,05 (внутри группы по отношению к предыдущему дню);

–*р<0,05 (между изучаемыми группами по дням исследований).

По-видимому, эффект воздействия тимогена на организм цыплят-бройлеров имеет «временной» характер, который определяет его действие: во II группе цыплят, которой применяли тимоген с 5-х по 14-е сутки выращивания, эффект сохраняется до 35-х суток (снижение с 0,34±0,05 до 0,45±0,07 при р<0,05), т.е. около 20 дней; в то время как во второй части I серии опыта, когда тимоген применяли как парентерально, так и энтерально, (с 15-х суток) действие препарата проявляется до конца периода откорма.

Таким образом, проведенные морфологические исследования крови цыплят, получавших пептидный иммуномодулятор тимоген парентерально (0,1 мл/кг массы тела) и энтерально (0,1 мл/гол) в течение 10 дней в критические периоды развития (на 5-е и 15-е сутки развития) выявили положительное влияние тимогена на физиологическое состояние птицы.

3.1.2. Активизация специфических факторов клеточного иммунитета

Проведенные исследования по иммунофенотипированию клеток периферической крови показали, что процентное соотношение Т- к В- лимфоцитам в разные дни жизни цыплят оставалось постоянным в периферической крови и составило 65-85% по Т-лимфоцитам и 15-35% – В-лимфоцитам.

Количество Т-лимфоцитов в разные периоды онтогенеза (на 15-е, 21-е и 26-е сутки исследований) было выше у опытных групп цыплят в отличие от их дополнительных контрольных групп от 14% до 100%, а по отношению к общему контролю от 2% до 17%. Повышение В-лимфоцитов наблюдали на 21-е и 26-е сутки исследований. По количеству Т- и В-лимфоцитов на 35-е сутки исследований между изучаемыми группами достоверных различий не выявлено. Незначительное понижение количества В-лимфоцитов наблюдаемое во второй группе цыплят, на 15-е сутки, можно, по-видимому, объяснить тем, что Т-клеточные цитокины, особенно те, которые стимулируют макрофаги, подавляют функции В-клеток.

Количество цитотоксических или супрессорных клеток с фенотипом СD8+ на 15-е, 21-е, 26-е и 35-е сутки исследований во всех группах цыплят изменялись незначительно, имея тенденцию к снижению, в то время как хелперные клетки с фенотипом СD4+ достоверно увеличивались с 15-х к 35-м суткам исследований. Это подтверждает тот факт, что у молодых цыплят более выражены супрессорные функции лимфоцитов, а с возрастом возрастает их хелперная функция.

Объективным тестом, позволяющим оценить функцию лимфоцитов, служит регуляторный индекс, определяемый как соотношение СD4/СD8 или хелперов/супрес­со­рам, значения которого были выше у всех групп, которым дополнительно вводили дипептид от 9 до 40% (табл. 2).

Установлено, что регуляторный индекс был наиболее сниженным на 21-е сутки исследований, особенно для IIIа и IVa групп цыплят, где снижение составило 39,21% и 29,11% по сравнению с III и IV группами цыплят (табл. 3).

Увеличение количества СD4+ Т-клеток в опытных группах свидетельствует о повышении реактивности лимфоцитов и доминировании Т-хелперов, в то время как увеличение СD8+ Т-клеток свидетельствует о понижении лимфоцитарной активности клеток. Полученные данные, по снижению количеству Т-лимфоцитов и регуляторному индексу в IIIa и IVa дополнительных группах цыплят, свидетельствуют о наличии иммунодефицитного состояния у птиц, проявившемуся на 21-26-е сутки исследований, что согласуется с данные других исследователей, которые указывают на данный период как возрастной физиологический иммунодефицит (Барабина М.Т., 1996; Карпуть И.М., 2005; Mazurkiewicz M., 2005).

Таблица 2 – Определение соотношения регуляторного индекса (CD4+/CD8+)

в периферической крови цыплят

Время иссле- дований, сут. Группы
Опытная группа (тимоген) 5 – 14-е сут. Контрольные Группы Опытные группы (тимоген) 15 – 24 сут. Контрольные группы
II IIa III IV IIIa IVa
На 15-е 2,52±0,5 2,09±0,1 2,52±0,4 2,48±0,5 2,40±0,3 2,49±0,4 2,32±0,4
На 26-е 3,15±0,2 2,81±0,9 2,32±0,3 2,97±0,3 2,13±0,4 2,28±0,6
На 35-е 3,70±0,5 3,24±0,2 4,29±0,6 3,14±0,5

Таблица 3 – Содержание cубпопуляций Т-лимфоцитов,

на 21-е сутки исследований,

в периферической крови цыплят

Группы, n=3 СD4+ СD8+ СD4+/CD8+
Группа III 21,40±1,64* (64,49% от IIIa) 8,56±0,51 (17,74% от IIIa) 2,50±0,21
Группа IIIа 13,01±3,06 (39,21% от III) 7,27±1,79 (15,07% от III) 1,79±0,33
Группа IV 25,39±2,42* (41,06% от IVa) 11,92±2,0 (21,26% от Iva) 2,13±0,51
Группа IVa 18,0±2,28 (29,11 % от IV) 9,83±1,78 (17,53% от IV) 1,83±0,27

Количество лимфоцитов периферической крови, экспрессирующей на своей поверхности рецептор TCR, у исследуемых опытных групп цыплят в разные периоды онтогенеза был выше, на 42-е сутки разница между опытными группами цыплят – II, III, IV и контрольной группой (Iк) составила – 47,5%; 45,26 и 41,09%.

Приведенные данные подтверждают иммуномодулирующее действие тимогена на организм цыплят-бройлеров, у которых уровень Т- клеточного звена выражен активнее, а уровень естественных киллерных клеток выше, представленных рецепторами цепи ТСR, обеспечивающих первую линию защиты против основных бактерий и выполняя важную роль в защите слизистых оболочек от инфекции.

3.1.3. Морфофункциональное развитие

иммунокомпетентных органов цыплят

Известно, что нормальный рост и развитие бурсы и тимуса – центральных органов иммунитета, – их функциональная активность в процессе постнатального онтогенеза, могут служить критерием оценки обмена веществ организма птиц и оптимальности течения биохимических процессов (Болотников И.А., 1987).

Так, на 15 сутки исследований, масса центральных и периферических органов иммунитета была выше во II опытной группе, где применяли внутримышечно тимоген в дозе 0,1 мл/кг массы тела, по сравнению как с дополнительным контролем, так и с основным. На 26 сутки, через 10 дней после введения тимогена, лучшие показатели были в IV группе цыплят, которым препарат вводили энтерально с 15-х суток. На 42 сутки, в конце выращивания птицы, лучшие значения наблюдались в III и IV группах, где препарат применяли с 15-х суток откорма. Сопоставляя данные по функциональному состоянию иммунной системы птиц и массе иммунокомпетентных органов можно сделать вывод, что вес тимуса коррелирует с содержанием Т-лимфоцитов в крови, а масса бурсы с количеством В-лимфоцитов, так как при увеличении у опытных цыплят массы данных органов, отмечается увеличение количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови.

3.2. Иммунно-биохимические показатели адаптации птицы

Для оценки биохимических показателей крови, характеризующих уровень обменных процессов и адаптационно-метаболический гомеостаз после применения биокорректора тимогена, определяли содержание глюкозы в плазме крови, уровень общего белка и белковых фракций, количество иммуноглобулинов в сыворотке крови подопытных цыплят-бройлеров.

Для всех исследуемых групп отмечено, что концентрация глюкозы во время роста и развития организма достоверно снижается к 35-м суткам – от 10 до 20% – (12 ммоль/л) и вновь повышается – на 10% – к 42-м суткам исследований (13-14 ммоль/л). Достоверных различий по содержанию глюкозы в крови цыплят между исследуемыми группами – Iк, II, IIa, III, IIIa, IV и IVa – не выявлено.

Изменения в динамике белковых фракций, выявленных у птицы, показало, что уровень общего белка не отражает картину белкового обмена цыплят в разные периоды онтогенеза.

Динамика белкового обмена в I серии опыта свидетельствовала о том, что в Iк группе цыплят количество общего белка имело тенденцию к достоверному увеличению с 5-х по 26-е сутки: с 17 г/л до 34 г/л, после чего его концентрация в крови оставалась неизменной – 33,22 и 33,65 г/л. У опытных групп (II, III и IV) наблюдалась иная закономерность: достоверное увеличение концентрации белка прослеживалась до конца откорма, что подтверждает более динамичное развитие птицы в этих группах. К 42 суткам выращивания разница между контрольной Iк группой цыплят (33,65±2,26 гл) и опытными группами имела следующие значения: для II группы была выше на 14% (38,52±3,16 гл); III – 20% при р<0,05 (40,23±2,09 гл) и IV – 11% (37,47±5,60 гл).

Изучение белковых фракций показало наличие диспротеинемии, проявляющейся в увеличении количества альбуминов и снижении фракции глобулинов, в дополнительных контрольных группах, на 26-е сутки выращивания, что может свидетельствовать об иммунодефицитном состоянии организма птицы.

В фракциях белка выявлено достоверное повышение -глобулиной фракции, на 42-е сутки, в Iк группе цыплят по сравнению с опытными – II, III и IV, что может свидетельствовать о скрыто протекающих воспалительных процессах в организме и увеличении количества С-реактивного белка, церулоплазмина, 1-антитрипсина, 2-макроглобин – ингибитора протеиназ, приводящих к снижению резистентности и, как следствие, сохранности птицы.

Альбумины в I серии опыта были выше в опытных группах (II, III, IV) по отношению к общему контролю (Iк), на 42 сутки, соответственно на 17 и 28%, а во II серии – выше в V опытной группе на 26-е и 42-е сутки откорма на 11% по сравнению с VIк контрольной группой.

По фракции -глобулинов, можно судить о морфологической зрелости и функциональной полноценности иммунореактивной ткани. Уровень -глобулинов, включающий в себя различные антитела сывороточных иммуноглобулинов (М, G, А) был снижен в дополнительных контрольных группах цыплят (IIa, IIIa и IVa) в I серии опыта, а во II серии опыта – на 26-е и 42-е сутки имел тенденцию к снижению в V опытной группе по сравнению с VIк группой цыплят на 17,36% и на 14,43%. Концентрация -глобулинов в VIк группе достоверно увеличилась с 15-х суток к 42-м суткам. Наблюдаемые изменения в контрольной VIк группе на 42-е сутки откорма – снижение количества альбуминов в сыворотке крови и увеличение -глобулинов свидетельствует о скрыто протекающих воспалительных процессах в организме птицы и нарушении работы внутренних органов. Данное предположение подтверждает и повышенный уровень иммуноглобулинов в сыворотке крови, указывая на повышенный синтез антител плазматическими клетками в ответ на присутствующий в организме антигенный раздражитель (табл. 4).

Уровень -глобулинов имел тенденцию к снижению в опытной V группе в течение всего периода наблюдений, максимально снижаясь на 26-е сутки по сравнению с контролем на 20,27% (р<0,05). Данное снижение фракции -глобулинов после введения 0,01% раствора тимогена, свидетельствует об участии их в процессах по обезвреживанию токсинов, а также осуществлении транспорта биологически активных веществ (витаминов, ферментов), в том числе и трансферрина, основного белка транспортирующего железо и необходимого для нормальной фагоцитарной активности сыворотки крови, компонентов комплемента и иммуноглобулинов.

Таблица 4 – Иммунно-биохимические показатели цыплят (II cерия опытов)

Группы, n=10 Иммуно- глобулины, ед. Общий белок, г/л Альбумины, % Глобулины, % А/Г
15-е сутки исследований (до введения тимогена)
V 0,70±0,07 23,1±0,070 49,34±1,23 14,39±0,86 12,09±0,31 24,18±1,04 0,97
VIк 0,82±0,10 25,2±0,12 48,84±1,37 14,80±1,16 11,07±1,03 25,29±0,85 0,95
21-е сутки исследований (6 дней от начала введения тимогена)
V 2,58±0,31** 29,3±0,21* 42,54±1,14** 16,81±0,61* 13,77±0,76* 26,88±0,92 0,74
VIк 2,91±0,19** 30,2±0,10* 42,82±1,43* 18,32±1,02* 13,78±1,04 25,08±1,17 0,75
26-е сутки исследований (11 дней от начала введения)
V 2,80±0,23 33,2±0,08 47,87±1,33 16,76±0,75 9,44±0,41** 25,93±0,72 0,92
VIк 3,34±0,27 32,8±0,18 43,24±1,10 16,93±1,12 11,84±0,68 27,99±1,23 0,76
42-е сутки исследований (27 дней от начала введения)
V 4,50±0,35** 45,7±0,25** 43,16±1,55* 17,32±0,78 11,59±0,58* 27,93±1,9 0,76
VIк 5,84±0,53** 4,74±0,26** 38,70±1,30* 16,39±1,04 12,28±0,99 32,63±2,2 0,63

______________________

– *р<0,05;**р<0,01 (внутри группы по отношению к предыдущему дню);

– *р<0,05 (между изучаемыми группами по дням исследований).

Количество псевдоэозинофилов, участвующих в процессе фагоцитоза, по мере морфофункционального развития организма увеличивается, а, следовательно, достоверно повышается фагоцитарная активность, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число к третьей недели жизни цыплят, что отображают данные, представленные в таблице 5.

Таблица 5 – Фагоцитарная активность крови цыплят-бройлеров

Группы, n=10 ПФ, % ФИ ФЧ
На 15-е сутки исследований (до введения тимогена)
Группа V 42,09±2,82 1,97±0,41 2,59±0,27
Группа VIк 40,97±2,31 2,0±0,61 2,74±0,60
На 26-е сутки исследований (11 дней от начала введения тимогена)
Группа V 69,67±3,16*** 4,61±0,44** 6,55±0,37***
Группа VIк 68,0±3,31*** 3,56±0,51 5,13±0,55
На 35-е сутки исследований (20 дней от начала введения)
Группа V 73,33±2,82 4,59±0,41 6,24±0,07
Группа VIк 70,0±2,31 3,43±0,54 4,73±0,63
На 42-е сутки исследований (27 дней от начала введения)
Группа V 77,17±3,43 4,52±0,53 5,74±0,46
Группа VIк 67,0±1,61 3,51±0,29 5,21±0,34

________________________

–**р<0,01; ***р<0,001 (внутри группы по отношению к предыдущему дню);

–*р<0,05 (между изучаемыми группами по дням исследований).

В результате активации ферментных процессов в фагоцитах опытной группы, происходит повышение фагоцитарной активности псевдоэозинофилов крови цыплят на 42-е сутки исследований. Фагоцитарная активность псевдоэозинофилов достоверно была выше в V группе на 15,18% по сравнению с VIк группой. Фагоцитарный индекс не выявил достоверных различий по исследуемым группам цыплят, но наблюдалась тенденция достоверного повышения фагоцитарного числа в V опытной группе цыплят по отношению к VIк контрольной: на 28% (26-е сутки), на 32% (35-е сутки) и 10,17% (42-е сутки).

Полученные данные по функциональному состоянию фагоцитарной активности организма цыплят свидетельствует о том, что как агрессивность псевдоэозинофилов, так и их активность была выше в группе, где применяли тимоген.

3.4. Гистоморфологические изменения в центральных и

периферических органах иммуногенеза цыплят-бройлеров

Выявленные иммуноморфологические изменения в первичных и вторичных лимфоидных органах цыплят-бройлеров в контрольной группе и общая гистологическая характеристика их, позволили установить у цыплят патологическое состояние соответствующее иммунодефицитному состоянию третьей степени. По сравнению с контрольной группой (VIк) в фабрициевой сумке опытной группы (V) цыплят патологических изменений не наблюдали, на что указывала хорошо выраженная зональность фолликулов, наблюдаемая при морфофункциональной зрелости органа и активизация коркового вещества фолликулов.

Таким образом, цыплята, которым применяли 0,01%-ный р-р тимогена методом выпаивания в дозе 0,1 мл/гол/сут., с 15-х по 21-е сутки выращивания, имели нормальное морфофункциональное развитие органов иммуногенеза.

3.5. Химический состав, качество мяса и продуктивные

показатели цыплят-бройлеров

Установлено, что в обеих группах цыплят (V и VIк во II серии опыта) статистически выше было содержание сухого вещества и БКП в грудных мышцах в отличие от ножных, а содержание жира и оксипролина преобладало в последних, что подтверждает диетические свойства белого мяса птицы.

Химический состав мяса бройлеров показал, что различий по содержанию влаги и сухого вещества между сравниваемыми группами цыплят не наблюдалось. Количество триптофана достоверно (р<0,05) было выше в V (опытной) группе, как в грудных, так и в ножных мышцах – 1,07±0,01% и 1,09±0,02% по сравнению с VIк группой (контрольной) – 0,98±0,01% и 0,98±0,02%, превышая ее соответственно на 9,18% и на 11,22%. По количеству оксипролина достоверных различий не обнаружено: в I группе было 0,24±0,01% в грудных мышцах и 0,48±0,03% в ножных, а в VIк группе – 0,23±0,03% и 0,45±0,03%.

Таким образом, химический состав мяса цыплят-бройлеров, показал, что биологическая полноценность мяса птицы, выраженная белковым качественным показателем, была выше в опытной группе, где применяли 0,01% р-р тимогена, как в грудных, так и в ножных мышцах соответственно на 3,94 и 2,77%.

Полученные результаты (табл. 6) по изучению влияния биокорректора тимогена на продуктивные показатели цыплят кросса Хаббард во II серии опыта показали, что до начала введения 0,01%-ного р-ра тимогена, птица в обеих группах развивалась примерно одинаково: средняя живая масса на 15-е сутки составила 400 г, а сохранность 98,49%. С возрастом статистически достоверно увеличиваются среднесуточные приросты цыплят, а, следовательно, и живая масса тела также пропорционально возрастает. Так, в V опытной группе цыплят повысилась сохранность на 4,3% по сравнению с VIк контрольной группой и живая масса на 86-90 г к концу периода откорма.

На 42-е сутки выращивания, живая масса цыплят в V опытной группе составила 2080 г и 95,3% сохранность. Для VIк контрольной группы живая масса составила 1994 г и 91% сохранность (рис. 2, 3).

Рис. 2 – Динамика массы тела за период выращивания

Рис. 3 – Сохранность цыплят за период выращивания

Таблица 6 – Продуктивные показатели цыплят бройлеров за период откорма

ПОКАЗАТЕЛИ Группы
V (опытная) VIк (контрольная)
Посажено, гол. 29200 29000
Срок выращивания, дн. (с учетом спецубоя) 40 40
Падеж, гол. 1384 2630
Сохранность, % 95,3 91,0
Средняя живая масса, г 2080 1994
Среднесуточный прирост, г 51,0 48,9
Конверсия корма, к.ед. 1,78 1,81
Индекс продуктивности, % 278 251

Результаты производственных опытов показали, что увеличение сохранности на 4,3 % и прироста живой массы тела на 86-90 грамм в V группе цыплят, позволили повысить рентабельность производства мяса птицы: индекс продуктивности в V группе цыплят составил 278 против 251% в VIк группе.

Экономическая эффективность применения биокорректора тимогена при промышленном выращивании цыплят-бройлеров составила 5,08 руб. на 1 рубль затрат.

ВЫВОДЫ

1. Дипептидный комплекс (глутамил-триптофан) препарата Тимоген, следует рассматривать в качестве регуляторного пептида сложной адаптивной системы организма, определяющего реализацию приспособительных реакций на всех уровнях ее интеграции (от клеточного до организменного).

2. Иммуномодулятор тимоген, применяемый в физиологические периоды иммунодефицита у цыплят – на 5-е и 15-е сутки выращивания, в течение 10 и 7 дней, как парентерально в дозе 0,1 мл/кг массы тела, так и энтерально, в дозе 0,1 мл/гол/сут., показал биокорригирующее влияние на становление обменных процессов и функциональную активность иммунной системы.

3. Морфологические исследования крови цыплят свидетельствуют об активизации гемопоэза в кроветворных органах опытных групп за счет лимфопоэза, достоверно отличаясь от контроля и нормальной реактивности организма цыплят. Показатели лейкограмм крови цыплят и соотношение гетерофилов к лимфоцитам (Г/Л) на 15-е; 21-е; 26-е; 35-е и 42-е сутки исследований, свидетельствуют о наличии у цыплят, которым применяли синтетический дипептид тимоген, признаков устойчивости по отношению к адрено-гипофизарно-надпочечниковой системе организма и проявлении антистрессового действия препарата:

а). при введении 0,1 мл/кг массы тела, с 5-х суток выращивания, парентерально, в течение 10 дней – Г/Л: 0,23; 0,25; 0,34 и 0,45 – до 35 дня откорма;

б). при введении 0,1 мл/кг массы тела, с 15-х суток выращивания, парентерально, в течение 10 дней – Г/Л: 0,22; 0,27; 0,31 и 0,35 – до 42 дня откорма;

в). при введении 0,1 мл/гол/сут., с 15-х суток, энтерально, в течение 10 дней – Г/Л: 0,28; 0,26; 0,28 и 0,39 – до 42 дня выращивания.

4. Проведенные иммунологические исследования подтверждают влияние тимогена на функциональную активность лимфоцитов периферической крови цыплят и возможность его использования в качестве модулятора функциональной активности клеточного иммунитета после парентерального и энтерального введения тимогена в дозе 0,1 мл/кг массы тела птицы и 0,1 мл/гол/сут., в течение 10 дней, с 5-х и 15-х суток выращивания цыплят, что сопровождалось в опытных группах:

а). активацией дифференцировки Т-лимфоцитов от 13,70% до 100%;

б). восстановлением соотношения регуляторного индекса (CD4/CD8):

выше на 9-40% на 15-е, 21-е, 26-е и 35-е сут. – по сравнению с контролем;

в). повышением уровня рецептора ТСR – на 20-50%.

5. Тимоген, применяемый в дозе 0,1 мл/гол/сут., в течение 7 дней, с 15-х суток выращивания цыплят, способствовал повышению неспецифических клеточных факторов защиты организма. Через 11 дней от начала его введения достоверно повышался процент фагоцитоза, фагоцитарный индекс и фагоцитарное число соответственно на 61,56, 78,0 и 87,23%. На 42-е сутки выращивания уровень фагоцитоза псевдоэозинофилов достоверно был выше на 15,18% по отношению к контрольной группе птиц.

6. Морфофункциональное состояние тимуса, бурсы и селезенки, после применения тимогена характеризовалось повышением абсолютной массы органов и активизацией в них лимфоцитов на разных этапах постнатального развития, что характеризует биокорригирующие свойства тимогена.

7. Биохимические исследования подтверждают нормализующее влияние дипептида на уровень протеинового питания:

а). сохранялось альбумино-глобулиновое соотношение на протяжении всего периода выращивания;

б). процессы ассимиляции белка протекали интенсивней у цыплят, которым применяли тимоген, особенно на финишном периоде развития, коррелируя с массой тела птицы:

– при введении 0,1 мл/кг массы тела с 5-х суток выращивания, парентерально, в течение 10 суток – выше на 2,83%;

– при введении 0,1 мл/кг массы тела с 15-х суток выращивания,

парентерально, в течение 10 дней – выше на 4,43%;

– при введении 0,1 мл/гол/сут. с 15-х суток, энтерально, в течение 10 дней – выше на 3,98%, а в течение 7 дней – выше на 4,3%.

8. Гистоморфологическая картина первичных (тимус, бурса) и вторичных иммунокомпетентных (селезенка) органов цыплят после введения биокорректора тимогена имела соответствующее возрасту морфофункциональное развитие. В фабрициевой сумке цыплят наблюдалась выраженная зональность фолликулов с процессами активизации пролиферирующих клеток эпителиального слоя. Фолликулы были заполнены лимфоцитами, находящимися на разных стадиях дифференциации, макрофагами и плазмоцитами.

9. Химический состав мяса цыплят-бройлеров показал, что биологическая полноценность мяса птицы, выраженная белковым качественным показателем, была выше в группе, где применяли тимоген в дозе 0,1 мл/гол/сут., методом выпаивания, как в грудных, так и в ножных мышцах на 3,94 и на 2,77%, по отношению к контрольной группе. При этом отмечено достоверное повышение содержания количества триптофана в грудных и ножных мышцах соответственно на 9,18 и на 11,22%.

10. Применение глутамил-триптофанового комплекса тимогена цыплятам-бройлерам кросса «Hubbard F-15» в дозе 0,1 мл/гол/сут., методом выпаивания, в течение 7 дней, позволило повысить продуктивность птицы к концу периода откорма:

а). увеличился прирост массы тела на 86-90 г или 4,5-5,0%;

б). повысилась сохранность на 4,3%;

в). повысился индекс продуктивности на 9,7%.

11. Серологические исследования в РТГА по напряженности иммунитета к ньюкаслской болезни у цыплят-бройлеров кросса «Hubbard F-15» на птицефабрике подтвердили биокорригирующее влияние тимогена на формирование адекватного антителогенеза вакцинированной птицы – 85% групповой иммунитет цыплят, который обеспечивает защиту привитой птицы от развития симптомов болезни.

12. Экономическая эффективность применения биокорректора тимогена в птицеводческих хозяйствах, составила 5,08 руб. на 1 рубль затрат.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В целях профилактики иммунодефицитных состояний, повышения прироста живой массы и сохранности цыплят-бройлеров при промышленном выращивании, рекомендуется применять биокорректор тимоген в дозе 0,1 мл/гол/сут. 0,01% раствора, методом выпаивания, в течение 7 суток, с 15-го дня выращивания.

Список опубликованных работ

1. Беляева С.Н. Влияние биокорректора тимогена на организм цыплят-брой­ле­ров в процессе выращивания / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Достижения науки и техники АПК. – 2008. – № 9. – С. 32-34. Рец. ВАК.

2. Беляева С.Н. Адаптационно-иммунологические процессы в организме цыплят бройлеров после применения иммуномодулятора тимогена / С.Н. Беляева, Н.В. Безбо­родов // Птица и птицепродукты. – 2009. – № 3. – С. 14-20.

3. Беляева С.Н. Коррекция иммунобиохимического статуса сельскохозяйственной птицы / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Научные труды II съезда физиологов СНГ: «Физиология и здоровье человека». – Москва – Кишинэу: Медицина – Здоровье, 2008. – С. 296.

4. Беляева С.Н. Содержание глюкозы после применения тимогена при выращивании цыплят-бройлеров / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Материалы XII междунар. науч.-произв. конф.: «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». – Белгород : Изд-во БелГСХА, 2008. – С. 84.

5. Беляева С.Н. Влияние тимогена на гематологические показатели цыплят-бройлеров / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Материалы XII междунар. науч.-произв. конф.: «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». – Белгород : Изд-во БелГСХА, 2008. – С. 85.

6. Беляева С.Н. Физиологическая оценка некоторых биохимических показателей у цыплят-бройлеров после применения иммуномодулятора тимогена / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Молекулярные механизмы адаптаций: сб. ст. междунар. конф. – Махачкала: ИПЦ ДГУ, 2008. – С. 87-90.

7. Беляева С.Н. Влияние тимогена на качественный состав мяса птицы / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Материалы XIII междунар. науч.-произв. конф.: «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». – Белгород : Изд-во БелГСХА, 2009. – С. 91.

8. Беляева С.Н. Оценка фагоцитарной активности крови цыплят после применения синтетического иммуномодулятора / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов, Н.В. Позд­ня­кова // Материалы XIII междунар. науч.-произв. конф.: «Проблемы сельскохозяйственного производства на современном этапе и пути их решения». – Белгород: Изд-во БелГСХА, 2009. – С. 92.

9. Беляева С.Н. Профилактика стресса и иммунодефицитных состояний в промышленном птицеводстве биокорректором тимоген / С.Н. Беляева, Н.В. Безбородов // Ветеринарный вестник. – 2009. – № 10 (89). – С. 3-5.

Список сокращений:

А/Г– альбумины/глобулины; CD8+ – цитотоксические / супрессорные Т-лимфоциты;

Г/Л – гетерофилы/лимфоциты; CD4/CD8 – регуляторный индекс;

ПФ – процент фагоцитоза; ТСR – Т-клеточный антигенраспознающий рецептор;

РТГА – реакция торможения гемагглютинации; ФИ – фагоцитарный индекс;

CD3 – (thymocytes, mature T-cells) зрелые Т-лимфоциты; ФЧ – фагоцитарное число.

CD19 – (Pan B-cell) зрелые В-лимфоциты;

CD4+ – (T-helper/Inducer cells) субпопуляция T-хелперов;

Формат 60х84, 1/16. Усл. печ. л. 1,0.

Заказ № 3792. Тираж 100 экз.

Типография БВЦ



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.