WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Особенности изменений липидного компонента семян льна-долгунца ряда сортов в зависимости от температурных режимов хранения

На правах рукописи

ВОРОБЬЕВА АННА СЕРГЕЕВНА

Особенности изменений липидного компонента

семян льна-долгунца ряда сортов в зависимости

от температурных режимов хранения

03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Тверь - 2007

Работа выполнена на кафедре биохимии и биотехнологии и кафедре экологии Тверского государственного университета

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Ильяшенко Дмитрий Владиславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Николай Николаевич Соколов

доктор медицинских наук, профессор

Николай Николаевич Слюсарь


Ведущая организация: Тверская государственная

сельскохозяйственная академия

Защита состоится «12» ноября 2007 г. в 1400 на заседании диссертационного совета К 212.263.01 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70 а, корп. 5, ауд. 318.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государственного университета по адресу: 170000, г. Тверь, ул. Володарского, 44 а.

Автореферат разослан «___» _____________ 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Костюк Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. На территории Российской Федерации льноводство всегда имело значительное распространение, а продукция, получаемая из культуры льна, пользовалась, и продолжает пользоваться, успехом как у промышленных предприятий, так и у общества. Льняное масло – один из продуктов переработки семян льна – важный пищевой компонент по многим показателям (Тарасов В.Е. и соавт., 1996; Verleyen T. et al., 2002).

Пищевое льняное масло является важнейшим источником незаменимых для организма животных и человека полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК) (Прозоровская Н.Н. и соавт., 2003; Ипатова О.М. и соавт., 2004). К ПНЖК льняного масла относят -линолевую и -линоленовую кислоты (витамин F). ПНЖК обладают антиатерогенными, противоаллергическими и другими важнейшими физиологическими свойствами (Гаврисюк В.К., 2001; Титов В.Н., 2006). Следует отметить, что в льняном масле, в отличие от других растительных масел выявлен наиболее оптимальный для организма человека баланс указанных кислот: до 60% линоленовой и до 16% линолевой кислот. В льняном масле, как и в других растительных маслах, жирные кислоты (ЖК), в том числе и ПНЖК, входят в состав диацилглицеринов (ДГ), триацилглицеринов (ТГ), фосфолипидов (ФЛ), а также могут находиться в свободном виде (свободные жирные кислоты (СЖК)) (Миронова А.Н. и соавт., 1996; Eristland J., 2000).

В связи с этим, немалую роль играет регион произрастания семян льна, из которых в дальнейшем вырабатывается льняное масло, а также условия его возделывания и хранения (Кузнецов Н.В., 1976). Однако, при наиболее распространенном, так называемом «горячем» способе прессования семян масличных культур и, в частности, семян льна происходит значительное снижение в них количества ПНЖК в результате процессов термоокисления (Щербаков В.Г., 1992). Поэтому в последние годы в нашей стране и за рубежом появились новые технологические линии, позволяющие выделять растительные масла при низких, не превышающих +40-450С, температурных условиях. Полученные методом «холодного» отжима масла, являются более дорогими, в связи с уменьшением их выхода, но более ценными с точки зрения пищевой и медицинской значимости (Sionek B., 1997).

Представленные выше сведения о производстве пищевого льняного масла касаются в первую очередь высокомасличных семян льна-кудряша и льна-межеумка, являющихся сырьевыми культурами, выращиваемыми, главным образом, в южных районах страны. Тем не менее, северные культуры льна и, в первую очередь, лен-долгунец, несмотря на более низкую масличность, по своему количественному и качественному жирнокислотному составу являются более ценными для применения в медицине (Капрельянс Л.В., 2002; Сутыгина А.И., 2003). Биохимические показатели липидного состава семян различных сортов льна-долгунца, произрастающих в средней полосе России, при их районировании, хранении в различных температурных режимах и перспективы их биотехнологической переработки изучены мало.

В СССР дефицит ПНЖК возмещался регулярным приемом в детских садах рыбьего жира. В настоящее время, в связи с загрязнением акватории Мирового океана, рыбий жир может содержать токсические вещества, поэтому его должны получать только из пелагических рыб возрастом не более 2-х лет. Льняное масло, получаемое как из северных, так и из южных сортов льна-долгунца, по пищевой ценности и экологической чистоте не уступает рыбьему жиру (Hall C., 2006).

Таким образом, актуальность работы связана с необходимостью изучения влияния сроков и температурных режимов хранения семян льна-долгунца на содержание и особенности распределения и взаимопревращений липидных фракций, что является научно-практической основой для использования семян льна-долгунца различных сортов как перспективного сырья в промышленном производстве льняного масла.

В соответствии с вышеизложенным, были определены цель и задачи исследования.

Цель исследования - изучение особенностей изменений липидного компонента семян льна-долгунца некоторых сортов Тверского и Удмуртского регионов в зависимости от температурных режимов хранения.

Задачи исследования:

  1. Провести анализ влажности семян льна-долгунца в зависимости от сорта, региона произрастания, срока и различных температурных режимов хранения.
  2. Изучить изменения количества общих липидов в семенах льна-долгунца в зависимости от сорта, региона произрастания, временных и температурных условий эксперимента.
  3. Исследовать характер изменений липидных фракций в семенах льна-долгунца сортов Удмуртского региона при их хранении в температурных режимах эксперимента.
  4. Выявить особенности изменений основных групп липидов в семенах льна-долгунца сортов Тверского региона при их хранении в температурных режимах эксперимента.

Научная новизна работы.

Проведено сравнительное исследование влажности, количества общих липидов и фракционного состава основных групп липидов семян льна-долгунца ряда сортов и регионов. Выявлены особенности воздействия на липидный профиль семян изученных сортов различных температурных и временных режимов хранения.

Показано наличие сложных и неоднотипных перестроек липидного компонента масличных семян в зависимости от температурной нагрузки. Проанализированы возможные пути взаимопревращений отдельных липидных фракций на основе гидродлазных, трансацилазных и других процессов биодеградации и биотрансформации липидов семян льна-долгунца. Отмечена специфика поведения некоторых липидных фракций, обусловленная регионом произрастания.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. Изменение содержания общих липидов в семенах льна-долгунца в процессе хранения при различных температурных режимах зависит от исходного их количества.
  2. Практически при всех экспериментальных температурных диапазонах хранения семян льна-долгунца наблюдается снижение концентрации основной мажорной липидной фракции – триацилглицеринов и нарастание доли эфиров фитостеринов.
  3. Фракционный состав липидов семян льна-долгунца в зависимости от воздействия на них различных температурных нагрузок при хранении претерпевает ряд сложных, неоднозначных, часто разнонаправленных перестроек, особенно в отношении фракций фосфолипидов, диацилглицеринов и свободных жирных кислот.
  4. Наибольшей деградации липидный профиль семян льна-долгунца различных сортов в ходе их хранения в течение 6 месяцев подвергается при воздействии низких положительных температур (-1-(+1)0С).

Теоретическая значимость работы.

Теоретическое значение работы связанно с выявлением специфики липидного профиля льна-долгунца различных сортов и регионов произрастания. Определены основные закономерности и особенности поведения отдельных липидных фракций семян льна-долгунца при воздействии на них положительных, низких положительных и отрицательных температур в процессе хранения. Полученные данные расширяют представление о молекулярно-биохимических путях превращений липидного компонента растений и, в частности, семян масличных культур.

Практическая значимость работы.

Модифицированы методы экстракции и концентрирования образцов липидов из семян льна. Результаты исследований используются автором на кафедре экологии ТвГУ при проведении лабораторных занятий по курсу «Биология клетки».

Разработаны практические рекомендации, касающиеся оптимальных режимов хранения семян льна, а также особенностей их фракционного липидного состава, для предприятий, специализирующихся на производстве льняного масла пищевого назначения.

Полученные экспериментальные данные могут быть использованы для оценки перспективности сортов льна-долгунца как сырья для производства льняного масла лечебно-профилактического назначения.

Апробация работы. Материалы диссертационного исследования докладывались и обсуждались на 4-ой Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек» (Москва, 2001); на 6-ой, 7-ой, 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века» (Пущино, 2002, 2003, 2004 гг. соответственно); на научной конференции студентов и аспирантов ТвГУ (Тверь, 2001, 2003 гг.); на III-й Международной научно-практической конференции «Медицинская экология» (Пенза, 2004 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 2 в изданиях, рекомендуемых ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 131 странице машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследований, результатов собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических рекомендаций и списка литературы, включающего 198 источников, из которых 45 иностранных. Работа иллюстрирована 22 таблицами, 4 рисунками и схемами.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве объектов исследования были взяты семена льна-долгунца 4-х сортов Удмуртского региона (2002 г сбора): Синичка, Псковский-359, Кром, Восход; семена льна-долгунца 3-х сортов Тверского региона (Бежецкий район): Тверца (2002 г. сбора), Торжокский-4 и Могилевский-2 (2002, 2003 и 2004 гг. сбора). Выбор указанных сортов был определен их семенным качеством и практической пригодностью как сырья для посева семян или для производства пищевого льняного масла. Полученные из регионов семена собирались в период с конца августа до середины сентября.

Низкотемпературное хранение семян масличных культур при температурной нагрузке -18-(-20)0С является наиболее оптимальным режимом для сохранения нативной структуры липидов и предупреждения их автоокислительных превращений (Мукаилов М.Д., 2004; Луговой А.В. и соавт., 1989). В основном, на льноперерабатывающих предприятиях семена льна хранятся в режиме комнатных температур (+18-(+20)0С). Практически не изучено влияние на липидный компонент масличных культур низких положительных температур (-1-(+1)0С). Средний срок хранения семян льна на складах предприятий, производящих пищевое льняное масло или работающих с семенами льна, как посевным материалом, составляет 6-7 месяцев (иногда до 9 месяцев и более). Данный промежуток времени соответствует времени от закладывания семян на хранение до начала высева материала (с октября-ноября до апреля-мая) (период производства) (Павловская Н.Е. и соавт., 2007). Выбор временных (6 месяцев хранения) и низкотемпературных условий эксперимента был обусловлен целью и задачами исследования, а также теоретическими положениями и практическими рекомендациями по биохимии хранения семян масличных культур (Щербаков В.Г., 1991, 1999; Плешков Б.П., 1987).

В таблице 1 представлена схема проведения исследований. Опытные группы составили семена, которые хранились в течение 6 месяцев в 3-х экспериментальных группах в зависимости от температурного режима хранения: 1-ая экспериментальная группа – хранение при +18-(+20)0С; 2-ая группа эксперимента– хранение в диапазоне -1-(+1)0С; 3-ая экспериментальная группа – хранение в режиме -18-(-20)0С. Данные образцы семян считали опытными группами.

Таблица 1

Схема проведения исследований

Изменения влажности, количества общих липидов и их отдельных фракций в семенах льна-долгунца в зависимости от сорта, региона произрастания, срока и температурных режимов хранения
Регион произрастания семян Объекты исследования (сорта семян) Разновидность семян льна Год сбора Начало эксперимента Окончание эксперимента
Удмуртский регион Синичка
Лен-долгунец
2002 г. Ноябрь 2002 г. Апрель 2003 г.
Псковский-359
Кром
Восход
Тверская область Тверца Лен-долгунец 2002 г. Ноябрь 2002 г. Апрель 2003 г.
Торжокский-4 2002 г. Ноябрь 2002 г. Апрель 2003 г.
2003 г. Ноябрь 2003 г. Апрель 2004 г.
2004 г. Ноябрь 2004 г. Апрель 2005 г.
Могилевский-2 2002 г. Ноябрь 2002 г. Апрель 2003 г.
2003 г. Ноябрь 2003 г. Апрель 2004 г.
2004 г. Ноябрь 2004 г. Апрель 2005 г.

Экспериментальные группы
Режимы хранения семян в течение 6 месяцев, Т0С
+18-(+20)0С (1-ая эксперимен-тальная группа) Положительные температуры -1-(+1)0С (2-ая эксперимен-тальная группа) Низкие положительные температуры -18-(-20)0С (3-я эксперимен-тальная группа) Отрицательные температуры
Исследуемые показатели Влажность, количество общих липидов, качественный и количественный состав отдельных фракций липидов

Интактными считали семена, которые не закладывали на хранение, а анализировали непосредственно после получения из регионов опытной партии (контрольная группа семян). Семена каждой экспериментальной группы (500 г) засыпали в чистые холщовые мешочки и закладывали на хранение в указанные температурные режимы. Во избежание развития процессов самосогревания семян и развития в них перекисного окисления липидов массу семян перемешивали каждый месяц в течение всего срока хранения. Анализ исходной партии семян начинали одновременно с подготовкой и закладыванием на хранение экспериментальных групп семян.

Отбор проб семян льна-долгунца для анализа проводили согласно ГОСТ 29142-91 (Семена масличных культур. Отбор проб, 1991). Навеска, используемая для определения отдельных показателей качества или состояния семян, сохраняла представительное качество, соответствующее всей партии. Влажность семян (в %) определяли по разнице массы навески до и после высушивания (ГОСТ 10856-96. Семена масличные. Определение влажности семян). Высушивание проводили при 1050С (Щербаков В.Г., 1999).

Выделение и очистку общего липидного экстракта из исследуемых образцов семян проводили по методу Фолча (Folch I., 1957). Для полноты выделения липидов экстракцию проводили на холоде 24 часа, вместо 2 ч. Полученный общий липидный экстракт использовали в дальнейшем для количественного определения общих липидов и разделения их на фракции с помощью хроматографических методов с последующим количественным анализом полученных фракций.

Определение содержания общих липидов в семенах проводили методом разложения с серной кислотой (Грибанов Г.А., 1980). Содержание общих липидов (ОЛ) в пробах рассчитывали (в мг% на сырой вес семян). Количественное содержание фракций липидов в семенах льна определяли аналогичным способом.

Фракционирование общих липидов семян льна проводили с использованием метода микротонкослойной хроматографии на силикагеле. В связи со спецификой исследуемых объектов (семена льна) нами был модифицирован метод подготовки аликвоты общего липидного экстракта для нанесения на хроматографическую пластинку. На хроматографическую дорожку наносили 30-50 мкл тотального липидного экстракта семян льна без предварительного упаривания аликвоты на водяной бане при температуре 35-400С и дальнейшего разведения хлороформом. Данная модификация предупреждает термическое воздействие на липиды семян льна, а также позволяет более четко разделить отдельные липидные фракции.

Идентификацию липидных компонентов проводили с помощью известных значений длины пробега (Rf), которые составляют для ФЛ-0; ДГ-0,10; ФС – 0,13; СЖК - 0,26; ТГ - 0,55; ЭФС – 0,90 (Грибанов Г.А., 1980; Кейтс М., 1975; Щербаков В.Г., 1999).

Статистическую обработку полученных результатов проводили на компьютере с использованием компьютерной программы Microsoft Excel-2000. Степень достоверности различий между изучаемыми величинами оценивали по t-критерию Стьюдента. Достоверными считали различия между сравниваемыми величинами при р0,05 (0,01, 0,001) (Лакин Г.Ф., 1973).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительная характеристика изменений содержания общих липидов, влажности в семенах льна-долгунца различных регионов произрастания в зависимости от срока и температурных режимов хранения

Влажность интактных семян всех анализируемых сортов находилась в среднем в пределах от 6,0 до 10,0%, что является нормативным показателем РФ по влажности для семян масличных культур, закладываемых на хранение (Государственные стандарты. Зерновые, зернобобовые и масличные кульутры, 1990). На рис. 1 и 2 представлены диаграммы изменений влажности и количества общих липидов в семенах льна-долгунца Удмуртского и Тверского регионов в зависимости от срока и температурных режимов хранения. Количество общих липидов, выделенное из исследуемых семян льна-долгунца, соответствует данным, указанным в литературных источниках (Коренский Н.Г., 1987). В интактных семенах изученных сортов количество общих липидов находилось в среднем в пределах от 13874,3 мг% (сорт Синичка) до 35442,5 мг% (сорт Могилевский-2 (сбор 2004 г.)).

Концентрация общих липидов (так называемого «сырого» жира) в изученных объектах также претерпевала ряд существенных изменений в динамике исследования, за исключением 2-ух сортов: Синичка (2002 г.) и Торжокский-4 (2004 г. сбора).

 Изменение влажности семян льна-долгунца Удмуртского и Тверского-1

Рис. 1. Изменение влажности семян льна-долгунца Удмуртского и Тверского регионов

в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,01; *** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,001

 Изменение количества общих липидов в семенах льна-долгунца Удмуртского-2Рис. 2. Изменение количества общих липидов в семенах льна-долгунца Удмуртского и Тверского регионов в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3-6 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05

Для этих сортов не было обнаружено достоверных изменений содержания общих липидов во всех экспериментальных группах. Липидный компонент семян указанных сортов оставался стабильным, тогда как влажность семян льна-долгунца сорта Синичка возрастала при всех временных и температурных условиях эксперимента. Особенно резко влажность семян сорта Синичка повысилась при хранении семян в течение 6 месяцев в диапазоне -18-(-20)0 С.

Очевидно, несмотря на состояние покоя, данные семена могли поглотить некоторое количество влаги из воздуха, что находит подтверждение в ряде литературных источников, где описаны колебания влажности семян ряда зерновых, масличных и других культур во время их хранения (Щербаков В.Г., 1999; Ключкин В.В., 1972).

Для семян сорта Торжокский-4 (2004 г. сбора) наблюдалось незначительное, но достоверное снижение влажности при сроке хранения 6 месяцев в условиях 1-ой и 2-ой групп эксперимента. Обращает на себя внимание факт наличия практически одинаковых значений влажности интактной группы семян указанных выше сортов. При анализе изменений влажности других изученных сортов Тверского и Удмуртского регионов обнаруживается еще одна интересная закономерность: если у интактных семян влажность превышала 8,0%, то, как правило, происходило снижение влажности при любых температурных условиях. Причем, если в интактных семенах влажность была не более 8,0%, то в этом случае происходило увеличение влажности. Таким образом, происходит своеобразное регулирование количества воды в семенах льна-долгунца в зависимости от исходных показателей.

При закладывании семян масличных культур на хранение с целью их дальнейшего использования в севообороте и при производстве пищевого льняного масла оптимальная влажность складируемых семян должна находиться в пределах 6,0-10,0%, что соответствует нормативным показателям (Коренский Н.Г., 1987). Вместе с тем, отмечается, что наиболее оптимальная влажность при хранении семян должна быть 7,2% (критическая влажность), так как при более высоких значениях может наблюдаться снижение уровня общих липидов семян, вследствие процессов автоокисления, сопровождающих самосогревание семян (Новоселов В.С., 1986).

Следует отметить, что определенный вклад в изменение параметров влажности семян вносит не только вода, но и различные летучие вещества (низкомолекулярные органические кислоты, эфирные масла, углекислый газ и др.) (Щербаков В.Г., 1999). Учитывая, что некоторые из указанных соединений (эфирные масла) могут входить в общий липидный компонент масличного семени, можно предположить, что они также будут оказывать влияние и на изменение количественных характеристик общих липидов и их отдельных фракций (Секанов Ю.П., 1985).

Анализируя изменения содержания общих липидов семян льна-долгунца в динамике эксперимента, можно выделить следующие группы сортов:

  1. Сорта, для которых не наблюдалось изменения уровня общих липидов (Синичка (2002 г. сбора), Торжокский-4 (2004 г. сбора)).
  2. Сорта, в которых наблюдалось снижение количества общих липидов во всех изученных группах (Торжокский-4 (2002 и 2003 гг. сбора)), Могилевский-2 (2004 г. сбора).
  3. Сорта, для которых выявлены неоднотипные изменения концентрации общих липидов в зависимости от температурных режимов хранения: (Псковский-359, Кром, Восход, Тверца (2002 г. сбора), Могилевский-2 (2002 и 2003 гг. сбора)).

Выявлена особенность в поведении общего липидного компонента: если его исходная концентрация в интактных семенах льна-долгунца была выше 25 000,0 мг%, то в большинстве случаев происходило весьма значительное (до 45-50% от исходного количества) снижение доли общих липидов, что в ряде случаев сопровождалось повышенными значениями влажности семян при тех же условиях хранения.

Сопоставляя эти изменения с данными по влажности семян, достаточно сложно выявить четкие закономерности, так как не во всех случаях возрастание влажности сопровождалось уменьшением общих липидов и, наоборот. Возможными механизмами снижения количества общих липидов, в перечисленных выше случаях, может быть интенсификация процессов распада липидного компонента семян. Не исключено, что в состоянии относительного покоя семена, таким образом, поддерживают свою жизнеспособность за счет реализации липидных энергетических ресурсов. В то же время, отмеченное в двух случаях (сорт Кром - 1-ая экспериментальная группа, сорт Восход - 3-я экспериментальная группа) возрастание количества общих липидов предположительно свидетельствует о наличии процессов синтеза липидов в семенах льна, находящихся в состоянии покоя.

Можно предположить наличие достаточно сложной и неоднозначной системы взаимодействия воды и липидного компонента, что подтверждается отсутствием прямой связи между колебаниями влажности и уровнем общих липидов в исследованных семенах.

2. Особенности изменений липидных фракций семян льна-долгунца в зависимости от температурных режимов хранения

В семенах льна обнаружены практически все основные липидные фракции, характерные для семян масличных культур: ФЛ, ДГ, ФС, СЖК, ТГ, ЭФС. Главной мажорной фракцией среди всех изученных сортов являются ТГ. На рис. 3-8 представлены изменения относительного и абсолютного содержания основных липидных фракций в семенах льна-долгунца Удмуртского и Тверского регионов в зависимости от температурных режимов хранения.

В интактных семенах изученных сортов Удмуртского региона относительная концентрация фракций находилась в пределах: ФЛ – от 1,3 до 5,5%; ДГ – от 1,5 до 2,7%; ФС – от 1,6 до 3,3%; СЖК – от 3,7 до 5,7%; ТГ – от 78,0 до 85,5%; ЭФС – от 3,7 до 7,5%. В свою очередь, абсолютное количество фракций липидов интактных семян составило: для ФЛ – 299,4-763,0 мг%; для ДГ – 236,0- 542,2 мг%; для ФС – 222,0-542,2 мг%; для СЖК – 619,6-949,0 мг%; для ТГ – 10808,1-19689,5 мг%; для ЭФС – 836,0- 1358,7 мг%.

Анализ изменений относительного и абсолютного содержания липидных фракций в семенах льна-долгунца сортов Тверского региона в зависимости от срока и температурных режимов хранения показал, что в интактной группе семян относительное содержание фракций для изученных сортов колебалось: для фракции ФЛ – от 2,1 до 10,2%; для ДГ – от 1,2 до 3,4%; для ФС – от 1,0 до 7,0%; для СЖК – от 3,0 до 4,7%; для ТГ – от 65,0 до 83,8%; для ЭФС – от 5,3 до 25,6%. Абсолютная концентрация выделенных фракций липидов в интактной группе семян сортов Тверского региона составила: ФЛ – от 576,6 до 2714,0 мг%; ДГ – от 315,4 до 935,0 мг%; ФС – от 275,0 до 1932,0 мг%; СЖК – от 753,0 до 1391,2 мг%; ТГ – от 14631,5 до 25350,2 мг%; ЭФС – от 1410,2 до 6273,3 мг%.

А). 1-ая экспериментальная группа (+18-(+20)0С). Анализ изменений (рис. 3-8) как относительного (в % от суммы фракций), так и абсолютного (в мг%) содержания ТГ показал, что практически во всех экспериментальных группах ТГ снижались, по сравнению с интактными семенами. В семенах льна сортов Удмуртского региона и ряда сортов Тверского региона (Торжокский-4 (2004 г.), Могилевский-2 (2004 г.)) в режиме +18-(+20)0С уровень ТГ или не изменяется, или уменьшается незначительно. Указанные выше изменения подтверждают присутствие в семенах масличных культур всех основных липаз, в том числе и триглицеридлипаз (Брокерхоф Х., 1978; Кретович В.Л., 1980).

Незначительное снижение ТГ в режиме +18-(+20)0С происходит у сортов, имеющих исходно невысокое содержание общих липидов. Например, в сортах Синичка, Восход, Кром, где практически не наблюдалось снижения доли ТГ, исходный уровень общих липидов в контрольной группе был самым низким среди изученных сортов. У данных сортов Удмуртского региона наблюдалось некоторое повышение количества ДГ в условиях 1-й группы эксперимента. При этом количество СЖК или не изменялось (сорт Синичка), или незначительно, но достоверно возрастало.

Можно предположить наличие у сортов, имеющих исходно невысокий уровень липидов, не только гидролитического, но и трансацилазного механизма взаимопревращений липидной триады: ТГ – ДГ – СЖК (Верещагин А.Г., 1972; Березов Т.Т., 1998). Очевидно, температура +18-(+20)0С в изученных случаях не является оптимальной для активности гидролитических липаз, а сам процесс распада мажорной фракции ТГ может идти и неферментативным путем за счет возможного локального самосогревания семян (Щербаков В.Г., 1991). Несущественная выраженность гидролиза при хранении семян в диапазоне комнатных температур может быть связана и с невысоким уровнем влажности семян указанных сортов как в интактной группе, так и в рассматриваемой группе.

А). Сорт Синичка  Б) Сорт Синичка А). Псковский-359 Б). Псковский-359 -4 Б) Сорт Синичка
 А). Псковский-359 Б). Псковский-359 Изменения относительного-5 А). Псковский-359 Б). Псковский-359 Изменения относительного (А) и абсолютного (Б)-6Б). Псковский-359

Рис. 3. Изменения относительного (А) и абсолютного (Б) содержания фракций липидов семян льна-долгунца в сортах Синичка и

Псковский-359 Удмуртского региона в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,01

А). Сорт Кром  Б). Сорт Кром А). Сорт Восход Б). Сорт Восход -8 Б). Сорт Кром
 А). Сорт Восход Б). Сорт Восход Изменения относительного-9 А). Сорт Восход  Б). Сорт Восход Изменения относительного (А) и абсолютного (Б)-10 Б). Сорт Восход

Рис. 4. Изменения относительного (А) и абсолютного (Б) содержания фракций липидов семян льна-долгунца в сортах Кром и Восход

Удмуртского региона в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,01

А). Тверца Б). Тверца
А). Торжокский-4 (2002 г. сбора)  Б). Торжокский-4 (2002 г. сбора) Изменения относительного (А) и-14 Б). Торжокский-4 (2002 г. сбора)

Рис. 5. Изменения относительного (А) и абсолютного (Б) содержания фракций липидов семян льна-долгунца в сортах Тверца и

Торжокский-4 (2002 г. сбора) Тверского региона в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,01

А). Могилевский-2 (2002 г. сбора) Б). Могилевский-2 (2002 г. сбора)
А). Торжокский-4 (2003 г. сбора)  Б). Торжокский-4 (2003 г. сбора) Изменения относительного (А) и-18 Б). Торжокский-4 (2003 г. сбора)

Рис. 6. Изменения относительного (А) и абсолютного (Б) содержания фракций липидов семян льна-долгунца в сортах Могилевский-2 (2002 г. сбора) и Торжокский-4 (2003 г. сбора) Тверского региона в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,01

А). Могилевский-2 (2003 г. сбора) Б). Могилевский-2 (2003 г. сбора)
А). Торжокский-4 (2004 г. сбора)  Б). Торжокский-4 (2004 г. сбора) Изменения относительного (А) и-22 Б). Торжокский-4 (2004 г. сбора)

Рис. 7. Изменения относительного (А) и абсолютного (Б) содержания фракций липидов семян льна-долгунца в сортах Могилевский-2 (2003 г. сбора) и Торжокский-4 (2004 г. сбора) Тверского региона в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,01

А). Могилевский-2 (2004 г. сбора)

 Б). Могилевский-2 (2004 г.сбора) Изменения относительного (А) и-24 Б). Могилевский-2 (2004 г.сбора)

Рис. 8. Изменения относительного (А) и абсолютного (Б) содержания фракций липидов семян льна-долгунца в сортах Могилевский-2 (2004 г. сбора) Тверского региона

в зависимости от срока и температурных режимов хранения

n=3 (n – число серий в экспериментальной группе); * - достоверно по сравнению с семенами интактной группы при p0,05; ** - достоверно по сравнению с семенами интактной группы

при p0,01

Несмотря на незначительное содержание, ФЛ масличных культур играют существенную роль в метаболизме семян, содержат ПНЖК (Койфман Т.Ш., 1977; Корнена Е.П., 1973). ФЛ обеспечивают органолептические свойства и лечебно-профилактическую ценность пищевого льняного масла (Арутюнян Н.С., 1986). До сих пор крайне мало сведений о взаимоотношениях данной фракции с другими липидными компонентами семян льна, в том числе, в процессе хранения.

При комнатных температурах хранения в течение 6 месяцев в семенах Удмуртского региона происходит значительное, по сравнению с исходными значениями, повышение уровня ФЛ, за исключением сорта Синичка. Возможными причинами описанного явления могут быть как синтетические процессы, имеющие место в семени, так и ряд взаимопревращений отдельных липидных фракций, таких как ДГ, СЖК и частично ТГ (Щербаков В.Г., 1991, 1999; Кретович В.Л., 1980; Плешков Б.П., 1987).

Обращает на себя внимание факт достаточного резкого накопления в семенах льна Удмуртского региона доли ЭФС при хранении в режиме +18-(+20)0С. При этом, количество ФС изменялось мало. Однако, этерификация ФС может происходить с использованием общего пула ЖК, которых вполне достаточно для осуществления этих процессов (Алиев А.А., 1980; Grunwald C., 1975; Verleyen T. et al., 2002).

В семенах льна-долгунца изученных сортов Тверского региона, в отличие от сортов Удмуртского региона, в большинстве случаев наблюдалось достаточно резкое снижение уровня ТГ. Исключение составил сорт Торжокский-4 (2004 г. сбора), тогда как аналогичный сорт урожая 2002 и 2003 гг. отличался не только существенным уменьшением ТГ, но и исходно невысоким уровнем ОЛ.

Количество ДГ во многих случаях нарастало. Однако, для сорта Торжокский-4 (2003 г. сбора), Могилевский-2 (2003, 2004 гг. сбора) ДГ или не изменялись, или даже снижались, что особенно хорошо видно в абсолютных значениях этой фракции (в мг%). О поведении фракции СЖК нельзя сделать однозначного заключения. Так, если в одних сортах (Торжокский-4 (2002, 2003 гг. сбора)) просматривается увеличение СЖК, то в других сортах (Тверца, Могилевский-2 (2004 г.)) их уровень или не меняется, или достоверно снижается. Такие изменения свидетельствуют о наличии достаточно сложных взаимопревращений отдельных липидных фракций, которые протекают не только по классическому гидролитическому пути. ФЛ в изученных сортах Тверского региона подвергались, в отличие от Удмуртских сортов неоднотипным изменениям. Наряду с нарастанием уровня ФЛ во многих случаях их количество не изменялось.

В ряде сортов Тверского региона выявлено существенное нарастание количества ЭФС при хранении семян в диапазоне температур 1-ой группы эксперимента. Вместе с тем, у двух сортов – Торжокский-4 (2004 г. сбора), Могилевский-2 (2004 г. сбора) – в отличие от урожая предыдущих лет (2002, 2003 гг.), доля ЭФС или не менялась, или даже достоверно снижалась на фоне некоторого увеличения уровня ФС. При этом исходное количество ЭФС у данных сортов 2004 г. сбора было весьма высоким. Можно предположить наличие особого механизма взаимопревращений липидного спектра семян льна-долгунца, проявляющегося при температуре +18-(+20)0С.

Б). 2-ая экспериментальная группа (-1-(+1)0С). Оценивая характер изменений фракции ТГ в семенах льна-долгунца сортов Удмуртского региона при хранении в температурных условиях -1-(+1)0С (2-ая группа эксперимента), можно отметить, что во многих случаях количество ТГ снижалось (рис. 3-8). В абсолютных значениях данной фракции обращает на себя внимание тот факт, что в сортах Синичка и Восход уровень ТГ не только не менялся, но даже возрастал. Только в случае сорта Псковский-359, доля ДГ возрастала, тогда как в других сортах их количество или не изменялось, или снижалось. Содержание СЖК оставалось практически неизменным.

Концентрация ФЛ и ЭФС значительно нарастала в семенах льна-долгунца изученных сортов Удмуртского региона при хранении в режиме -1-(+1)0С. Уровень ФС колебался незначительно. Данный температурный интервал может приводить к определенной стабилизации липидного компонента, а для взаимопревращений липидных фракций еще более характерен трансацилазный, чем гидролазный механизм. Но столь существенное увеличение ФЛ и ЭФС, которые, возможно, снабжаются ацильными группами, освобождающимися из диады ТГ-ДГ, может приводить к нарушению ригидности комплекса мембран семян (Девис Д., 1966; Климов А.Н., 1999; Крокер В., 1955; Шипова Е.В. и соавт., 1986).

В семенах льна-долгунца сортов Тверского региона при температурном режиме хранения -1-(+1)0С отмечено существенное снижение количества ТГ. При этом в большинстве случаев значительно нарастает уровень ДГ, которые являются одними из основных продуктов гидролиза ТГ (Березов Т.Т., 1998; Верещагин А.Г., 1972; ).

Если в случае сортов Удмуртского региона данный температурный диапазон хранения не приводил к нарастанию доли СЖК, то в изученных сортах Тверского региона содержание СЖК существенно увеличивалось. Известно, что на уровень СЖК, как и ДГ, влияет гидролиз фракции ТГ. Количество ФЛ, главным образом, увеличивалось. Оценивая поведение фракций ФС и ЭФС, можно выделить разнонаправленный характер их изменений. Если уровень ЭФС возрастает, то у ряда сортов Тверского региона количество ФС достоверно снижается или не изменяется, тогда как для сортов Могилевский-2 (2004 г. сбора), Торжокский-4 (2004 г. сбора) наблюдалась прямо противоположная тенденция.

Представленные выше особенности изменений фракционного состава липидов семян льна-долгунца сортов Тверского региона при их хранении в течение 6 месяцев в условиях -1-(+1)0С, позволяют сделать заключение о ярко выраженном гидролитическом механизме расщепления основных липидных фракций. Таким образом, липидный компонент изученных сортов Тверского региона весьма нестабилен. Отмечено неоднозначное, и даже неблагоприятное воздействие указанного температурного режима на липидный спектр изученных семян.

В). 3-я экспериментальная группа (-18-(-20)0С). При анализе специфики поведения липидного компонента семян льна-долгунца Удмуртского региона при хранении в течение 6 месяцев в условиях низких температур (-18-(-20)0С) обращает на себя внимание факт схожести изученных изменений со 2-ой экспериментальной группой (-1(+1)0С) (рис. 3-8). Так, для сортов Псковский-359 и Кром показано существенное снижение доли ТГ, а для сортов Синичка и Восход наблюдалось даже повышение содержания этой фракции. Концентрация ДГ изменялась неоднотипно, для которой отмечалось в большинстве случаев возрастание (Синичка, Псковский-359, Восход), а в сорте Кром доля ДГ практически не изменялась. Концентрация СЖК менялась незначительно. Лишь в некоторых случаях выявлено небольшое нарастание уровня СЖК.

Количество ФЛ в изученных сортах Удмуртского региона как возрастало, так и снижалось. Сложно выделить какие-либо однозначные закономерности в поведении фракции ФЛ. Уровень ЭФС во всех исследованных образцах Удмуртского региона при хранении в режиме (-18-(-20)0С) нарастал. Однако, данное количество было несколько ниже, чем при хранении семян в группе (-1(+1)0С). Концентрация ФС в основном снижалась или не изменялась. Исключение составил лишь сорт Псковский-359 и Синичка (абсолютные значения), где доля ФС возросла. Возможной причиной описанных изменений может являться увеличение полноты выхода из мембранных структур как ФС, так и ЭФС при гомогенизации и экстракции липидного компонента из замороженных при низких температурах семян льна (Тарасов В.Е. и соавт., 1996; Кейтс М., 1975). Не исключено частичное воздействие подобных механизмов и на другие фракции липидов.

При хранении семян льна-долгунца Тверского региона в условиях -18-(-20)0С, можно выделить ряд характерных отличий. Так, во всех изученных случаях ТГ снижались, особенно резко в сортах Торжокский-4 (2002, 2003 гг. сбора), Могилевский-2 (2004 г. сбора), несмотря на низкотемпературные условия хранения. Очевидно, для поддержания жизнеспособности в семени происходит потребление главнейшего энергетического ресурса, какими являются ТГ. Нельзя однозначно сказать о серьезной деградации липидного компонента, в частности, в отношении сортов Тверца, Торжокский-4 (2004 г. сбора), Могилевский-2 (2003 г. сбора), где гидролиз ТГ наименее выражен. Подтверждением сказанному служит весьма незначительное, по сравнению с более высокотемпературными режимами хранения, накопление фракции ДГ, содержание которой для ряда сортов или не изменяется, или даже снижается. Обращает на себя внимание факт высокой стабильности фракции СЖК, что позволяет предположить наличие не только гидролитических, но и трансацилазных путей взаимопревращений отдельных липидных фракций (Верещагин А.Г., 1972; Девис Д. и соавт., 1966; Климов А.Н., 1999).

Фракция ФЛ при низкотемпературном режиме хранения семян Тверского региона в одних случаях снижалась, а в других случаях незначительно возрастала, в отличие от 1-й и 2-й групп эксперимента. Уровень ФС во всех случаях, за исключением сорта Торжокский-4 (2002 г. сбора), несколько нарастал. Также в ряде случаев увеличивалась концентрация ЭФС. Одним из возможных путей данных изменений может быть активация трансферазных и даже синтетических механизмов превращений липидных фракций (Кретович В.Л., 1980). Таким образом, хранение семян льна-долгунца при низких температурах приводит к определенному изменению липидного спектра, смещенного в сторону условной деградации основных фракций.

Анализ представленных в работе данных позволяет предложить следующую схему возможных взаимопревращений отдельных липидных фракций изученных семян льна-долгунца в условиях проведенного эксперимента (рис. 9).

 Общая схема возможных взаимопревращений отдельных липидных фракций-25

Рис. 9. Общая схема возможных взаимопревращений отдельных липидных фракций семян льна-долгунца при их хранении в различных температурных режимах

где - основные пути взаимопревращений;

- возможные пути взаимопревращений

Степень выраженности указанных в схеме возможных реакций между представленными липидными фракциями зависит как от региона произрастания семян льна-долгунца (Тверской или Удмуртский регион), так и от температурных интервалов хранения (экспериментальные группы).

Очевидно, различные температурные режимы хранения семян льна-долгунца вызывают в них неоднотипные перестройки липидного компонента, на характер которых значительное влияние оказывает липидный профиль интактных семян, который, несомненно, связан с их сортовой и региональной спецификой.

Вместе с тем, прослеживаются и общие пути биотрансформации липидов, имеющие в своей основе гидролазные и трансацилазные пути превращений липидных фракций. Стоит отметить возможность интенсификации в семенах при их хранении как синтетических, так и ряда неферментативных процессов, влияющих на количественный состав отдельных фракций. Обнаруженные колебательные изменения липидов указывают на параллельное протекание указанных выше реакций.

ВЫВОДЫ

  1. Если концентрация общих липидов в интактных семенах льна-долгунца сортов Тверского региона выше 25 000,0 мг%, то при хранении семян в течение 6 месяцев в разных температурных режимах происходит снижение содержания общих липидов и, как правило, сопровождается повышением влажности семян. Для сортов Удмуртского региона при разных температурных режимах отмечаются разнонаправленные изменения уровня общих липидов и влажности.
  2. В большинстве семян льна изученных сортов Удмуртского региона (Синичка, Кром, Восход) при их хранении в течение 6 месяцев в условиях температуры +18-(+20)0С наблюдается незначительное снижение содержания ТГ (в среднем на 15 %), а в семенах Тверского региона (Тверца, Торжокский-4 (2002, 2003 гг. сбора), Могилевский-2 (2002, 2003 гг. сбора)) уменьшение количества ТГ более выражено (в среднем на 20 %). В семенах указанных сортов льна-долгунца в ряде случаев отмечается нарастание уровня ФЛ, ДГ и частично СЖК. Количество ЭФС повышается практически при всех температурных режимах хранения, уровень ФС меняется разнонаправленно.
  3. При хранении семян льна-долгунца Удмуртского региона в течение 6 месяцев в условиях низких положительных температур -1-(+1)0С в некоторых сортах (Кром, Псковский-359) наблюдается существенное снижение доли ТГ (в 1,5 раза). Количество ДГ изменяется разнонаправлено, уровень СЖК практически не меняется. Концентрация ФЛ возрастает в 2 раза, а ЭФС – более чем в 4 раза от значений интактной группы семян. В семенах льна-долгунца сортов Тверского региона отмечается снижение содержания ТГ на 30-40% с одновременным возрастанием ДГ и СЖК. Уровень ФЛ также увеличивается, для фракций ФС и ЭФС выявлен противоположный характер изменений.
  4. В семенах льна-долгунца Удмуртского региона при их хранении в течение 6 месяцев в температурном диапазоне -18-(-20)0С происходит значительное уменьшение количества фракции ТГ (в среднем в 1,3 раза), нарастание доли ЭФС – в среднем в 2 раза по сравнению с исходными значениями. При аналогичных условиях хранения для семян сортов Тверского региона наблюдается несущественное снижение количества ТГ. В ряде случаев отмечается возрастание содержания ДГ в 3 раза. Уровень СЖК практически не меняется. Показан разнонаправленный характер изменений фракции ФЛ, в ряде случаев накапливаются ФС и ЭФС.
  5. В основе выявленных изменений липидного компонента семян льна-долгунца при их хранении в течение 6 месяцев при разных температурных режимах могут лежать гидролазные, трансацилазные и другие пути биотрансформации отдельных липидных фракций. Причем, возможно одновременное протекание указанных реакций, которое зависит от исходного липидного профиля семян льна-долгунца, от их сортовой и региональной специфики.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. При полугодовом хранении урожая семян льна-долгунца с целью их дальнейшей переработки для производства пищевого льняного масла рекомендуется использовать отрицательные температурные режимы (-18-(-20)0С). При сложности создания данных условий хранения альтернативным температурным интервалом является +18-(+20)0С.
  2. При выборе семян льна-долгунца северных сортов, как перспективного сырья для производства пищевого льняного масла, рекомендуется проводить качественную и количественную оценку их липидного фракционного состава, что поможет спрогнозировать возможные изменения липидов в процессе хранения семян.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Воробьева А.С. Изменения содержания липидов семян льна-долгунца Тверского и Удмуртского регионов в зависимости от сроков и условий хранения / А.С. Воробьева, Г.А. Грибанов // Тезисы докладов 8-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века». Сборник тезисов. – Пущино, 2004. – С. 50.
  2. Воробьева А.С. Исследование содержания общих липидов семян льна Тверского и Удмуртского регионов / А.С. Воробьева, Г.А. Грибанов // Тезисы докладов 7-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века». Сборник тезисов. – Пущино, 2003. – С. 319.
  3. Воробьева А.С. Льняное масло и рыбий жир как источники полиненасыщенных жирных кислот / А.С. Воробьева // Сборник научных работ «Естествознание и гуманизм». – Томск, 2004. – Т. 1, № 3. – С. 42-43.
  4. Воробьева А.С. Об особенностях липидного состава некоторых сортов льна-долгунца Тверского региона / А.С. Воробьева, Г.А. Грибанов // Материалы научной конференции студентов и аспирантов ТвГУ. – Тверь, 2003. – С. 30-35.
  5. Воробьева А.С. Применение льняного масла в биомедицинской практике и перспективы его производства из семян льна-долгунца / А.С. Воробьева, Д.В. Ильяшенко, Г.А. Базанов, В.П. Козлов // Сборник статей III-й Международной научно-практической конференции «Медицинская экология». – Пенза, 2004. – С. 18-20.
  6. Воробьева А.С. Сравнительная характеристика липидного компонента семян льна-долгунца, льна-кудряша и льняного масла / А.С. Воробьева, Д.В. Ильяшенко // Научная жизнь. – 2007. – № 2. – С. 5-10.
  7. Воробьева А.С. Сравнительная характеристика липидного компонента семян льна и льняного масла / А.С. Воробьева, Д.В. Ильяшенко, Г.А. Грибанов // Тезисы докладов 6-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология – наука 21-го века». Сборник тезисов. – Пущино, 2002. – Т. 1. – С. 230-231.
  8. Грибанов Г.А. Об особенностях липидного состава льняного масла, получаемого методом «холодного» отжима / Г.А. Грибанов, Д.В. Ильяшенко, А.Н. Панкрушина, А.С. Воробьева // Материалы 4-й Международной научно-технической конференции «Пища. Экология. Человек». – Москва, 2001. – С. 193-194.
  9. Грибанов Г.А. Особенности распределения липидного компонента в продуктах переработки льняного семени / Г.А. Грибанов, Д.В. Ильяшенко, А.С. Воробьева // Тезисы докладов научной конференции аспирантов и студентов ТвГУ. – Тверь, 2001. – С. 26-27.
  10. Ильяшенко Д.В. Биомедицинские и технологические аспекты производства льняного масла из семян льна северных сортов / Д.В. Ильяшенко, А.С. Воробьева, В.П. Козлов // Технологии живых систем. – 2005. – Т. 2, № 3. – С. 67-72.
  11. Ильяшенко Д.В. Льняное масло как алиментарно-профилактический фактор в экологии питания / Д.В. Ильяшенко, А.С. Воробьева // Вестник Тверского государственного университета. Серия «Биология и экология». – Тверь, 2005. – вып. 1. – С. 80-83.
  12. Ильяшенко Д.В. Распределение и пути взаимопревращений липидов семян льна-кудряша в продуктах их биотехнологической переработки и перспективность использования для данных целей семян льна-долгунца / Д.В. Ильяшенко, А.С. Воробьева, В.П. Козлов // Биомедицинские технологии. – 2003. – вып. 20. – С. 38-48.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ДГ диацилглицерины ЖК – жирные кислоты

ОЛ общие липиды ПНЖК – полиненасыщенные жирные кислоты

ТГ - триацилглицерины СЖК – свободные жирные кислоты

ФЛ – фосфолипиды ФС – фитостерины

ЭФС – эфиры фитостеринов

Выражаю благодарность доктору биологических наук, профессору Тверского госуниверситета Грибанову Геннадию Александровичу за консультации и помощь в организации работы.



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.