WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Генетические основы этиологической гетерогенности злокачественных новообразований


на правах рукописи

КАЗУБСКАЯ ТАТЬЯНА ПАВЛОВНА

Генетические основы этиологической

гетерогенности злокачественных новообразований

14.01.12 - онкология

03.02.07 - генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук


Москва 2010 г.

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук, онкологическом научном центре им. Н.Н.Блохина РАМН

(Директор академик РАН и РАМН, профессор М.И.Давыдов)

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор

Раиса Федоровна Гарькавцева,

доктор медицинских наук, профессор,

Владимир Юрьевич Сельчук.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор

Петр Васильевич Новиков,

член-корреспондент РАМН,

доктор медицинских наук, профессор

Николай Евгеньевич Кушлинский,

доктор медицинских наук, профессор

Валентин Сергеевич Мазурин.

Ведущая организация: ГОУ ДПО Российская медицинская академия постдипломного образования Минзравсоцразвития России

Защита диссертации состоится « » 2010 года в часов на заседании диссертационного совета (Д.001.017.02.) по адресу:115478 Москва, Каширское шоссе, д.24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Автореферат разослан « » 2010г.

Ученый секретарь диссертационного Совета,

доктор медицинских наук, профессор Ю.А.Барсуков

Общая характеристика работы ­ Актуальность темы.

Интерес клиницистов к роли генети­чес­ких факторов, как первичных фак­то­ров риска в этиологии рака по­вы­шался с последо­ва­тель­ными откры­тиями гер­ми­наль­ных мутаций генов Rb, BRCA1/2, RET, ассоциированных с ра­зви­ти­ем ретино­бла­с­томы (Friend SH. et al.,1986, Lee WH.et al.,1987), рака молоч­ной же­лезы (Wo­oster R. at al.,1994, Ford D. at al.1994), синдромов множест­ве­н­­­ных эн­до­к­рин­ных неоплазий 2 типа (МЭН2) (Takahashi M.еt al.,1985). Ин­те­­рес стал более интенсивным, когда выяснилось, что анализ клини­чес­кой кар­­тины боле­зни, выявление связи между клини­чес­ки­ми проявления­ми за­бо­левания и лежащими в их основе молекуля­р­ными поврежде­ниями, от­к­ры­ва­­ют воз­мож­ности иденти­фи­ка­ции новых форм болез­ни и установления при­чин их возникно­ве­ния, что может привести к более наце­ленному изменению ра­кового конт­ро­ля и таргет­ной терапии.

С гене­тичес­кой точки зрения главной особенностью неоплазий является клинический полиморфизм и генетическая гетеро­ген­но­сть, а для так назы­ва­емых мультифакториальных злокачественных опухолей - су­ще­ство­ва­ние их на­следственных и ненаследственных форм без четких гра­ниц. Проблема ге­не­­­тичес­кой гетерогенности на­следственных форм опухолей занимает важное место, поскольку кажущееся фено­типиче­ски однородным, генетически гете­рогенное заболевание, может включать в себя несколько клинически, генети­чески и био­химически самостоятельных форм (Гинтер Е.К.,2001). Анализ клини­чес­­кой картины болезни (фенотипа) и выявление взаимосвязи между генотипом и фенотипом, пре­­до­ставляет возможность установить не только какие генети­че­с­к­ие изме­не­­­ния лежат в основе формирования предрасполо­женности к нео­плазии, но и разработать стратегию формирования прицельно однород­ных групп риска, оп­тимизи­ро­вать процедуру проведения ДНК-ана­лиза. Изу­чение особен­ностей проявления неоплазий и причин, которые их фор­ми­ру­ют, явля­ется одним из важнейших направлений в меди­ци­­не вообще и клини­чес­кой гене­тике в частности, и лежит в основе успешной диаг­нос­ти­ки и меди­ко-гене­тического консультирования больных и их семей.

Указанные осо­бен­ности характерны и для рака щитови­дной железы (РЩЖ), мела­номы кожи (МК) и первично-множествен­ных злокачест­венных опухолей (ПМЗО). Имею­щ­иеся на сегод­няшний день работы, посвященные гетероген­ности этих форм опухолей, не имели сис­тем­ного подхода и ограни­чи­вались областью профессио­наль­ных интере­сов (мо­лекулярно-генетичес­ки­ми изуче­ниями отдельных нозо­логичес­ких форм нео­п­лазий). Однако недо­с­та­­­точная изучен­но­сть отдель­ных генети­ческих вариантов злокачественных опу­хо­лей может привести к тому, что в рамках одной нозо­ло­ги­чес­кой формы рака, мо­гут рас­смат­риваться за­бо­ле­вания с различ­ной гене­ти­че­ской при­ро­дой и различными патогенетическими механизмами развития.

Про­б­лема своевремен­ного выявления РЩЖ, МК, ПМЗО зак­лю­чается не только в бес­симптомном развитии, но и в от­сутствии на­деж­ных мар­керов, способствующих их раннему выявлению. Наряду с этим, пер­вично-мно­­жес­т­вен­ные опухоли предст­а­в­ляет собой особую диаг­нос­тиче­с­кую про­б­лему. Изу­­­че­ния, прицельно направ­лен­­ные на выявление спе­ци­фи­­ческих при­знаков, кото­рые могли бы у пациен­тов увеличивать риск прояв­ле­­ния вторых первич­ных раков, являются акту­а­ль­ными с клинической и биоло­гической точек зре­ния. Значение проблемы возрастает еще и в связи с неуклонным ростом заболе­ва­емости и смерт­ности от этих ново­образований (Давыдов М.И., Аксель Е.М., 2009). В этой связи осо­бое значение имеет иден­тифика­ция на­с­лед­ст­вен­ных форм РЩЖ, МК, ПМЗО, разработка стратегии преодо­ления гене­ти­ческой гетеро­генно­сти с ис­поль­зованием биологических пара­метров на клини­чес­ком, ге­нетиче­ском и моле­ку­­­ля­р­ном уровнях, которая поз­во­лит иден­тифициро­вать семьи со схо­д­ными клиническими признаками. При этом актив­­ное выяв­ле­ние даже относительно небольшого числа случаев зло­качес­твен­­ных ново­об­ра­зований среди практи­чес­ки здоровых родственников из се­мей больных этими забо­ле­ваниями мо­жет рассматриваться как важная нау­чно-практи­чес­кая задача.

И хотя оценка ге­не­тичес­ких параметров нас­лед­ст­венных форм опухолей зат­руднена, реше­ние этих вопросов имеет перво­с­те­­­пенное значение для раз­работки прог­рам­мы клинико-генетической ди­а­г­но­стики, профи­лактики (в том числе и пре­на­та­­льной) и патогенетически ори­ентированной терапии. Все эти вопросы пла­ни­ровались и разработаны на мо­де­ли рака щитовидной же­ле­зы, меланомы кожи, пер­­вич­но множест­венных зло­ка­че­с­твенных опухо­лях.

Цель и задачи исследования.

Цель работы: определить роль наследственных факторов в этиоло­гии рака щитовидной железы, меланомы кожи и первично множест­венных злокачест­венных опухолей, выделить генетически детерми­нирова­н­­ные формы этих заболеваний, изучить их генетическую гетероген­ность, раз­работать тактику медико-генетического консульти­ро­вания при разных их ва­ри­антах.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить размах вариабельности клинико-генетического проявления рака щитовидной железы (РЩЖ) меланомы кожи (МК) и первично множест­вен­ных злокачественных опухолей (ПМЗО).

2. Определить фенотипические и генетические корреляции различных фо­рм опухолей в семьях больных РЩЖ, МК и ПМЗО.

3. Изучить клинические, цитогенетические и молекулярно-генетические особенности РЩЖ, МК и ПМЗО.

3.1 Изучить частоту и спектр молекулярных изменений при медуллярном РЩЖ (МРЩЖ).

3.2 Определить частоту и спектр повреждений некоторых участков хромо­сом в клетках крови больных МК и диспластических невусов (ДН).

3.3 Изучить молекулярно-генетические и эпигенетические изменения гена р16/CDKN2A в образцах опухолей МК.

3.4 Оценить значимость биологических микрочипов в диагностике ге­р­ми­нальных мутаций генов BRCA1,2 и CHEK2 у больных первично множе­с­твен­ным раком с поражением яичников.

3.5 Изучить статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста: RASSF1A, RAR2, SEMA3B, опреде­лить их значение в молекулярном пато­ге­незе и диагности­ке солитарного и первично мно­жес­твенного рака молочной железы и яичников.

4. Установить структуру и соотношение генетически детерминирован­ных форм РЩЖ, МК и ПМЗО.

5. Разработать основные при­нципы медико-генетичес­кого консультирова­ния семей РЩЖ, МК и ПМЗО.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые на основе комплексного клинико-генетического и молекулярно- биологического изучения больных раком щитовидной желе­зы, меланомой кожи и первично множественными зло­качественными опухолями выявлены основные клинико-генетические особенности этих заболеваний. Расширены представления о генетической ге­те­ро­генности (ал­лельного или локусного про­исхождения) РЩЖ, МК, ПМЗО, определена структура и соотношение их генетически детерминирован­ных форм, разработаны крите­рии для вы­деления генетически самос­то­­ятельных вариантов.

Показано, что молекуляр­ной основой МЭН2 являются мутации в гене RET, установлена четкая ассоциация му­та­ций в этом гене с синдромами множест­венных эндокринных неоплазий 2 типа, определен спектр его мутаций, обна­ружены новые мутации гена RET у рос­сийских больных, что позволяет рас­ширить спектр мутаций, который можно рекомендо­вать для рутинного лабо­раторного анализа. Установлено, что при­чиной клини­ческого по­ли­­мор­фи­зма медуллярного РЩЖ является разное положение точко­вой мутации в одном из цис­те­и­­но­вых кодонов гена RET, обнаружи­вая алле­ль­­ную гетероген­ность этого за­болевания. Впервые в стране по результа­там ДНК-диагнос­тики ме­ду­ллярного РЩЖ про­ве­дено про­филак­ти­чес­кое удаление щитовид­ной желе­зы, вне­д­рена в пра­к­ти­ку прена­та­ль­ная диаг­нос­тика этого заболева­ния. ­­­­­­­ Разработана комплексная программа выяв­ле­ния лиц предрасположен­ных к развитию МРЩЖ, позво­ляющая не только уто­ч­нить индивидуальный гене­тический диагноз, дать более точный прог­ноз те­че­ния заболевания, но и осу­ще­­ст­вить своевременные лечебно-профилакти­ческие меропри­ятия, направ­лен­ные на предотвращение развития этой опухоли. ­ ­­­

Выявлено наличие характерных для МК и ДН генетических и эпигенети­чес­ких нарушений. У индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей дисплас­ти­ческих невусов в трех участках коро­т­кого плеча хромосомы 1-1р22,1р31, 1р32 наблюдается общ­но­сть в ин­диви­ду­альном распре­де­ле­нии ра­зрывов и отличается от нормы с высо­кой досто­вер­ностью, что ассоции­руется с локаль­ной хромо­сом­­ной неста­би­льностью и является ранним событием в цепи из­ме­­­нений, предшествующих МК. Аномальное метилирование про­моторного рай­она гена CDKN2A является неслучайным изменением у больных МК и вы­является у всех больных ПМЗО с поражением МК.

С использова­нием технологии олигонук­лео­тидных био­чипов показано, что частота наиболее распространенных герминальных мута­ций в гене BRCA1 у боль­ных ПМЗО с поражением яични­ков выяв­ля­ется в 53% случаев.

Впервые проведено определение статуса метилирования СрG-островков ге­нов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолевых и нормальных тканях моло­ч­ной железы, яичников больных первично множественными опухолями, боль­ных со­литарным РМЖ и РЯ и лимфоцитах периферической крови здоровых доноров. Показана высокая частота аномального метилирования промотор­ных районов этих генов в тканях больных ПМЗО с поражением молочной же­лезы и яични­ков и солитарных РМЖ и РЯ, с частотами от 30% до 90%. Впервые показано, что бо­льные с аномальным метилиро­ванием генов RASSF1A, RAR2 могут иметь тенденцию к первично множествен­ному пора­жению РМЖ и РЯ. Выя­в­­лена дос­товерная положительная корреляция час­то­ты мети­лирования генов RAR2 и SEMA3B со стадией и степенью анаплазии РМЖ и РЯ. По­ка­­за­но, что аномаль­ное метилирование промоторной области гена RASSF1A мож­но обна­ру­жить на доклинической стадии развития этих опухолей, что позво­ляет реко­мендовать их в качестве молекулярных марке­ров диагностики и прогноза этих заболеваний и свидетель­с­твует о больших возможностях ме­тилирования ДНК для разработок неинва­зив­ной диагнос­тики рака.

Внедрение в практику.

Результаты исследования внедрены и используются в клинической практике различных подразделений РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены и обсуждены на Российс­ких онко­логи­чес­­ких конгрессах:VII,X,XI,XII (Москва 2003, 2006-2008 г.); научно-пра­­к­ти­чес­кой конференции "Проб­ле­мы онко­гене­тики: науч­ные и при­кла­д­ные ас­пек­ты", Украина, Киев, 2002; Conference on Frontiers in Can­cer Prevention Re­search (USA, Boston, 2002), научно-практической конферен­ции НИИ он­ко­логии ТНЦ СО РАМН (Томск, 2003); Conference on Frontiers in Cancer Pre­ven­tion Research (Toronto, 2003); Human Genome Meeting“HGM'99”( Scot­land, Edinburgh, 2001); 28th Meeting of the Federation of Euro­pean Bioc­hemica Soci­eties (Turkey, Istanbul, 2002); Российской конференции по онкогинеко­ло­гии (Москва, 2009); European School of Oncolo­gy “Мелано­ма” (Москва 1995), “Thy­roid cancer” (Moscow, 2004); cъезде онкологов рес­пу­блики Казахстан (Алма-Ата, 2003); I Всероссий­ском съезде онкологов «Сов­ремен­ные тех­но­логии в онколо­гии» (Ростов-на-До­ну, 2005); IV съезде онко­логов и радио­ло­гов СНГ (Баку, 2006); кон­фере­н­ции с меж­ду­народным уча­с­тием "Генетика в Рос­сии и мире" (Моск­ва, 2006); 30th Conference of American Society of Pre­ventive Oncology (USA, Bethesda, 2006); 4-й Российской кон­ференции по фун­да­ментальной онкологии “Пет­ровские Чтения”, (Санкт-Петербург, 2008); 19th Internati­onal Cong­ress on Anti Cancer Treatment (ICACT) (Paris, France, 2008); III кон­грессе с между­народным участием «Опу­холи головы и шеи», (Сочи, 2009); II Рос­си­йском симпозиуме «Моле­куляр­но-ге­не­тическая диаг­ностика злокачес­т­венных опухолей человека» (Москва, 2009).

Апробация работы состоялась 11 декабря 2009 года на совместной научной конференции с участием лаборатории клинической онкогенетики, отделения биотерапии опухолей, отделения гинекологичес­кого, отде­ле­ния опухолей молочных желез, проктологического отделения, отдела опухо­лей головы и шеи НИИ клинической онкологии РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН; а также кафедры генетики и кафедры онкологии факультета после­ди­пломного образования Московского государственного медико-сто­ма­толо­ги­ческого университета Министерства здравоохранения и социального разви­тия.

По теме диссертации опубликовано 83 печатных работы в российских и за­рубежных журналах, из них – 36 в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ, 3 работы оформлены как главы в справочниках и учебных пособий.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 245 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литера­туры, материалов и методов, трех глав собственных результатов исследо­вания и их обсуждения, выводов, списка литературы, который содержит 22 отечественных и 290 зарубежных источников. Работа ил­люст­рирована 39 таблицами, 2 графиками, 52 рисунками.

Материалы и методы исследования.

В НИИКО РОНЦ им.Н.Н.Бло­хина РАМН за 1988-2008 годы сформирован кан­­цер-ре­гистр лаборатории клинической онкогенетики, cтавший осно­вой ис­­­­сле­дуемой выборки, объем которой составил 1495 боль­ных и 8700 их род­ст­вен­ников 1-2-й степени родс­тва. Из них 208 больных РЩЖ (140 папил­ляр­ным и фол­ли­кулярным РЩЖ и 68 боль­ных меду­л­ляр­ным РЩЖ), 460 бо­ль­ных МК, 400 больных ПМЗО, жителей Москвы и обла­сти. Каждая семья ре­гистриро­ва­лась через одного члена семьи, т.е. путем оди­но­ч­­ного отбора. Особое вни­мание уде­лялось подтверждению диагноза онколо­ги­­чес­ко­го за­болевания у ро­д­ствен­ни­ков I степени родства: родителей, сибсов (брать­ев и сестер), де­тей, которые затем включались в дальнейший анализ. ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­

В анализе исполь­зо­вались клинические, эпидемиологические, кли­­ни­­ко-ге­­неа­ло­­гичес­кие, цито­ге­нети­ческие, молеку­лярно-генетические, ге­не­­тико-ма­те­мати­че­с­кие методы ис­следования. У всех паци­ентов было полу­чено инфор­ми­рованное согласие об участии в иссле­довани­ях. Все случаи рака классифи­циро­ваны по TNM согласно требованиям Международного противоракового со­юза (UICC, версия 1989 г.)

В качестве контроля использовались популяционные частоты распрост­ра­нен­ности раз­личных злокачественных новообразований, которые были вы­чис­лены по данным учет­ных форм № 090/V пос­ту­пив­ших из всех районных онко­логических отделений г. Москвы в отдел медицинской статистики МГОД. Дан­ные о половозрас­тном составе насе­ления г. Москвы в изучае­мый пери­од бы­ли получены в Московском городском статистическом упра­вле­нии. Пока­затели заболе­ваемости были стандарти­зованы по возрасту пря­мым методом с исполь­зо­ванием мирового стандарта возрастного распреде­ле­ния населения.

Идентификация наследственных синд­ромов проводилась в соответствии с ус­та­новленными между­народ­ными критериями для каждого из них.

Изучение расп­ро­ст­ра­ненности ДН в г. Москве проводилось на основании резуль­татов осмотра 509 человек, случайно отобран­ного контин­ген­та взрос­лого насе­ления. Для поиска специфических опухолевых ассоци­аций в семьях больных МК ис­­поль­зова­лись клинико-генеалогические данные, включавшие 98 чело­век име­­ю­щих на коже мно­жес­твенные меланоцитарные невусы и их 259 родст­вен­ников 1-й сте­пени родства и 22 человека с мно­жественными невусами, ото­б­ранных при осмотре 247 близких родствен­ников из семей 91 боль­ного с гис­то­ло­ги­чески подтвержденным диа­г­нозом МК. Каждый паци­ент-носитель множественных не­вусов получил лече­ние и наблю­дался от 5 до 18 лет в кли­нических отделе­ни­ях РОНЦ в пе­ри­од с 1988 по 2005 г. В качес­т­ве контроль­ных групп слу­жили 2 вы­борки: одна из них состояла из 1001 бол­ьного с гис­то­ло­гически подтверж­ден­ным диагно­зом - рак желудка и 3793 их родст­вен­ника 1-й сте­пени род­ства; вто­рая включала 1048 клини­чески здо­ровых лиц, не имев­ших злока­чественных опу­холей и их 4654 родст­венника 1-й степени родства также соб­ран­ных среди мос­ковского населения в период с 1985 по 2003 годы. Все анализиру­емые груп­пы были подобраны по полу и во­з­расту и были жителями Москвы и Москов­с­кой области.

Молекулярные исследования, ДНК-диаг­нос­тика наличия точко­вых мута­ций в прото­он­ко­­гене RET проводилась на базе Медико-генети­чес­кого науч­ного цент­ра РАМН совместно с лабо­раторией молеку­лярной генетики и кли­­никой Гам­бург­ского уни­верси­тета. Материалом для исследо­ваний служи­ла ДНК паци­ентов меду­л­лярным РЩЖ находившиеся в РОНЦ им.Н.Н.Блохи­на РАМН с 1998 по 2007г. Геномную ДНК выделяли из лим­фоцитов перифе­рической крови, об­раз­цов опу­хо­ле­вых и нормаль­ных тка­ней щи­­то­­видной железы (кусочки или гис­толо­гические срезы) и исполь­зовали в качестве матри­цы для ПЦР-амп­ли­фи­ка­ции экзонов гена RET.

Цитогенетическое изучение наиболее частых перестроек встречающихся при МК, вклю­­чаю­щих в себя сайты повы­ше­н­ной ломкости хро­мо­сом(СПЛХ), конститу­ти­вные (кСПЛХ) или fragile sites про­во­дили на G-окра­шенных ме­та­­фазных пластинах лимфо­ци­тов перифери­че­ской крови, куль­ти­вируемых по стандартной мето­дике, проводилось совместно с лабораторией цитогенетики в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. Молекулярно–генетические иссле­до­ва­ния МК про­води­лись в лаборато­рии эпигенетики Медико-генетиче­ского на­уч­но­го цент­ра РАМН. Материалом исследования служила ДНК лим­фоци­тов пе­риферичес­кой крови и ткани опухолей больных МК. Для исследо­ваний ис­по­ль­зовали 10 микросателлитных маркеров на хромосоме 9р, распо­ложен­ных в рай­оне гена р16/CDKN2A. Анализ метилирования про­мо­торной обл­ас­ти ге­на р16/CDKN2A был проведен методом метилчувствите­ль­ной ПЦР.

Определение спектра и частоты наиболее частых точковых мутаций в ге­нах BRCA1/2 и CHEK2 у больных первично-множествен­ными опухолями с пора­же­нием яичников и боль­ных органо­специ­фичес­ким раком яичников в по­пуляции россий­ских женщин проводились на базе Инсти­тута молеку­ляр­ной биологии им. В.А.Энгельдгард­та. Методом аллель-специ­фичной гибри­ди­за­ции, сочета­ю­щего му­льтиплексную ПЦР и гибри­дизацию с олигонук­лео­­тид­ными биочипами, оп­ре­де­лялась час­тота встречаемости мутаций в гене BRCA1- 185delAG, 300T>G, 4153delA, 4158A>G и 5382insС, в гене BRCA2- 695insT, 6174delТ и в гене CHEK варианта 1100delC.

Исследование уровня мети­лиро­вания промоторных районов ге­нов RASSF1A, RAR2, SEMA3B проводилось на базе Государственного Науч­ного Центра РФ ГосНИИ генетика и совместно с Каролин­ским ин­­сти­ту­том (Шве­ция). Иссле­до­ва­­ние включало комбинацию методов: ПЦР-ана­­­лиз образцов ге­но­мной ДНК, пос­ледовательно расщипленной с помощью набора метил­чув­ствительных рест­рик­таз (МЧРА), бисульфитной модификации ДНК с пос­ледующей метилспе­ци­фи­ч­ной ПЦР. В анализ включены 330 пар об­ра­з­цов ДНК, выделенной из опу­хо­ле­вой и гистологи­че­ски нормальной ткани бо­ль­ных раком молочной железы, яичников и первично-множествен­ны­ми опухо­лями с поражением молочной железы и яич­ни­­ков. В качестве кон­т­­роля ис­по­­ль­­зовали лимфо­циты перифери­ческой крови здоро­вых инди­видов (15 чело­век). ДНК выде­ляли из ткани опу­холи и из лимфо­цитов крови по стандарт­ной мето­ди­ке.

Пере­смотр гистологических препаратов проведен в отделе патоморфоло­гии РОНЦ им. НН.Блохина РАМН.

Исследование проведено с использованием генетико-математических ме­то­дов изложенных в методических разработках (Трубников В.И., Москва, 1998), в пакете программ “Biometrika”. Для создания базы данных испо­ль­зо­вался прог­рам­мный продукт фирмы VNIINSoft КАРАТ. Основные ста­тис­ти­ческие методы – критерии Фишера, ранговая корреляция Спирмана с исполь­зо­ва­нием t-теста Стьюдента и критериев.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенное исследование посвящено одной из сложных проблем в кли­ни­ческой онкологии: изучению генетической обусловленности и генети­че­с­кой гетерогенности и клинического полиморфизма рака щитовидной желе­зы, мела­­но­мы кожи и первично-мно­жественных злокачественных опухолей.

Клинико-генетический анализ рака щитовидной железы. ­ ­ ­ Раннее выявление РЩЖ, клинико-генетическая идентификация его нас­ле­д­­ст­венных вариан­тов, разработка методов выявления аналогичного забо­ле­ва­ния среди родст­вен­ни­ков больных РЩЖ и тактика лечения бессимп­то­м­ных но­си­телей пато­логи­ческих мутаций гена/ов, ответственных за раз­ви­тие РЩЖ, явля­е­т­ся важ­ной задачей онкологии и генетики. Хотя папилля­р­ный и фол­ли­куляр­ный (не­ме­дуллярный) РЩЖ (НМРЩЖ) является наи­более час­той фор­мой рака этой локализации, о его наслед­ст­вен­ном эквива­ле­н­те из­ве­с­т­но очень мало.

для решения вопроса о наследственной предрасположен­ности к НМРЩЖ бы­ли изу­чены 140 больных, у которых папиллярный рак наб­лю­дал­ся у 74%, папил­лярно-фол­лику­лярный в 23% и в 3% слу­чаев - фоллику­лярный. При ана­­лизе установлены различия в прояв­ле­нии этого заболе­ва­­ния в за­ви­­си­­­мо­сти от пола (со­отно­шение муж­чин и же­н­щин -1:5), что указывает на су­ще­с­т­во­вание раз­личных величин риска развития НМРЩЖ для мужчин и же­н­щин. Воз­раст ди­а­гностики заболева­ния в среднем составляет 47,7 ±1,61 года, у 78% бо­ль­­ных пер­вые признаки заболевания проявляются в среднем на 6 -7 лет рань­ше. У бо­ль­ных с НМРЩЖ обна­ру­жено сочетанное пораже­ние раз­ных органов, частота перви­ч­но-мно­жес­твен­ных неопла­зий составила 5,7%, что выше час­тоты в попу­ляции (0,003%)(р0,01). Анализ показал на­ли­чие се­мейного на­коп­ления разных неоплазий, частота которых составила 4% и доб­ро­качественных опухоле­вых и неопухолевых заболеваний щи­­­то­ви­дной желе­зы - составила 3,2%.. ­­ При изучении семейных случаев НМРЩЖ впервые установлен наследс­т­ве­н­ный синдром семейного папиллярного РЩЖ (ПРЩЖ), признаками кото­рого яв­ля­ются ­преимущес­т­венно мультифо­ка­ль­ное и двустороннее пораже­ние па­пил­лярным раком только ткани щи­то­вид­ной же­лезы у трех и более чле­нов се­мьи, рис.1. Воз­раст диагностики ПРЩЖ оказа­лся мно­го мо­ложе общей вы­бор­ки боль­ных НМРЩЖ, составив 34,1± 6,8 года против (47,7 ± 1,6 года) (р 0,05), в це­лом, показы­вая бо­лее тяже­лый фенотип и аутосомно-доми­нантный тип (ро­ди­тели-дети) нас­ле­до­ва­ния за­бо­­ле­ва­ния.

Родословная семей больных С и В, диагноз: синдром семейного ПРЩЖ

I

II

III

Рис.1. Отец больной (II-2) умер в 36 лет от ПРЩЖ, (II-1) умер в 38 лет от ПРЩЖ, (III-2) –папил­лярный РЩЖ, его бабушка (I-4) умерла от ПРЩЖ на фоне множествен­ных адено­ма­тозных узлов щитовидной железы, а (I-5) –умерла в 73 года от рака поджелудочной железы.

В результате исследования выявлены наследственно обусловленные син­д­ро­мы, компонентом которых является папиллярный и фолликулярный РЩЖ. Эти синдромы характеризуются двумя клинико-генетическими ва­ри­антами. Пе­рвый, ассоциирован с множественными типами опухолей, воз­ни­ка­ющих в тка­нях ра­з­ных органов и наследуе­мых по ауто­сом­но-доми­нант­но­му типу. Это си­н­дромы -Гард­не­ра, Каудена и МЭН1, которые в ана­ли­зиру­е­мой вы­бор­ке больных иденти­фи­ци­ро­ваны в 3,6% случа­ев. Второй - синдром семейного ПРЩЖ(СПРЩЖ), при кото­ром преобладаю­щим и посто­янным приз­наком является па­пилляр­ный РЩЖ, обнару­жен в 1,4% слу­чаев.

Проведенное ис­следование показало существование нас­лед­с­т­венно обус­ло­в­­ле­нных форм НМРЩЖ и в отдельно взятых семьях ко­сегре­га­цию НМРЩЖ с нео­плазиями почки, мо­­ло­ч­ной железы, кожи (мела­но­мы), нерв­ной системы и толс­той ки­шки. В целом, среди больных НМРЩЖ наслед­ственно детерми­нирован­ные фор­мы этого заболевания выявлены в 5% слу­чаев.

Полученные данные позволяют иден­тифицировать семьи с наследственно обу­словленными формами НМРЩЖ и форми­ро­вать группы "высокого рис­ка" сре­ди родственников из семей больных НМРЩЖ, а так­же осуществлять индиви­ду­альный прогноз развития заболевания для членов семьи боль­но­го в зависимос­ти от конкретной семе­й­ной ситуации. На основании полученной информации, раз­ра­ботаны критерии иденти­фи­кации лиц с высоким рис­ком развития НМРЩЖ, которые включают: 1) пора­жение НМРЩЖ до 40 лет и наличие пора­женных чле­нов семьи анало­гичным заболеванием; 2) наличие в анамнезе или в се­мье дру­­гих нео­п­лазий: в поч­ках, толстой кишке, молочной железе, нервной сис­те­мы, кожи и наличие га­мар­том; 3) наличие в анамнезе или у членов семьи добро­ка­че­с­твен­ных опу­холей в щитови­дной железе; 4) наличию в се­мье ПМЗО с по­ра­­жением щито­видной железы; 5) внимание к щитовидной же­ле­зе при иде­нти­фи­ка­ции у па­циентов наследс­т­венных муль­ти­опухолевых синд­ромов.

Важной про­блемой является выявление С-клеточной гиперплазии или ме­ду­л­лярного РЩЖ (МРЩЖ) на ранней ста­дии заболевания. В этой связи, до­стиже­ния в молеку­лярной биологии, позво­лили не только понять причи­ны развития медул­ляр­ного рака, но и реально по­­дойти к решению вопроса ран­ней диагнос­тики и профилактики этой фор­мы РЩЖ.

Проведенный анализ 68 семей больных МРЩЖ выяви­л генетически де­те­р­минирован­ный МРЩЖ в 24,9% случаев, которые имели разные формы про­явления, такие как МЭН2А, МЭН2Б, си­ндром СМРЩЖ и медуллярный РЩЖ как компонент ней­­ро­фиброматоза 1 типа. Ис­хо­дя из важного наблю­де­ния, что ген RET эксп­рессируется только в опре­де­ле­нных тканях нейроэн­док­рин­ной диф­­ферен­ци­ровки, включая пара­фолли­ку­ля­рные С-клетки щито­вид­ной железы, экстра и интраадрена­ло­вые хрома­фи­н­ные кле­тки надпочеч­ни­ков, пери­фери­ческие нервы, описываемые случаи сов­мест­ного пораже­ния эти­­ми редки­ми формами забо­леваний как нейрофиб­ро­матоз и МРЩЖ пред­пола­га­ют возмож­ность существования об­щего био­ло­гичес­кого меха­ни­зма, ответ­ст­вен­ного за их развитие. Частота споради­ческого МРЩЖ сос­та­вила 75,1%, среди ко­торых, мо­гут быть случаи обус­ло­в­­ленные мутацией "de no­vo" в поло­вых клетках одного из роди­телей.

При изучении семей с синдромами МЭН 2 типа ус­тано­влен широкий спе­­ктр клиничес­кого проявления МРЩЖ, высокая вариа­бе­льность риска ра­­­­з­­­­ви­тия нео­плазии среди родственников. Для синдрома МЭН2А характерно би­ла­те­раль­ное раз­витие феохромоцитом у больных и их род­ст­­венников, ко­то­рые являлись частой причиной вне­зап­ной смерти. Наличие феохромо­ци­то­мы ус­та­­нов­лено в 50% семей, у одного из больных, помимо МРЩЖ и фе­о­хро­мо­циомы, был обнаружен тре­тий первичный рак молоч­ной железы. Выяв­лена ас­соци­ация МРЩЖ с ано­ма­лией почек, обнару­женная у носи­тельницы му­тации гена RET.

Ана­лиз семей с синдромом МЭН2Б показал, что 90% бо­льных является ре­зуль­татом мутации de novo. МРЩЖ при этом синдроме возникает го­ра­здо ра­ньше (как правило, до 5 летнего возраста) и протекает более агрес­си­вно. Для синдро­ма семейного МРЩЖ характерно поражение родствен­ни­ков сайт-спе­ци­фичес­ким медуллярным раком при отсутствии клини­чес­ких или биохи­миче­с­ких приз­наков пора­же­ния паращито­­ви­­дных желез или над­по­­чеч­ников.

Возраст манифестации МРЩЖ у пациентов и их родст­вен­ников с МЭН2 ва­рьирует в зависимости от метода диагностики. При МЭН2А возраст диа­гнос­ти­ки в среднем 28 лет (колебался от 7 до 45 лет), а у не­­­которых родст­венников к мо­менту изучения этих семей возраст превы­шал 50, 62 и 75лет. При СМРЩЖ он в среднем составил 30 лет, в то время как при МЭН2Б развитие заболе­вания наблю­да­лось в среднем 8,6 года, пока­зы­вая самый тя­желый фенотип.

Впервые в России проведен скрининг герминальных мутаций в гене RET в семьях больных с МЭН2. В результате установлена четкая ассоциация му­та­ций в этом гене с МЭН2 синдромами. В семьях с МЭН2А идентифици­ро­ваны 2 спе­цифи­ческие му­та­ции в кодоне 634 гена RET, в семьях с МЭН2Б вы­я­влена мута­ция в кодоне 918 гена RET. При син­д­роме се­мейного МРЩЖ обна­ружена му­та­ция в кодоне 620 гена RET. Ха­ра­к­тер­ные для этих синд­ромов меж­инди­виду­альная из­ме­н­­чивость, как по воз­расту на­чала забо­лева­ния, так и по тя­же­сти его проя­в­ле­ния (даже в пре­де­лах од­ного под­типа) могут быть обус­ловле­ны не только варь­иру­ющей эксп­рессив­но­стью и пене­т­ран­т­ностью гена RET, но и положением точковой му­та­ции в одном из цис­те­иновых кодонов этого гена. Молекулярная ДНК-диа­гностика гена RET, ста­ла ре­альным подтвер­ж­де­нием выявле­нных наследс­твен­ных форм МРЩЖ.

Нали­чие аллельной гетерогенности находит свое отражение в выяв­лен­ной вза­­имосвязи между фе­но­типом- RET генотипом и тяжестью проявления за­боле­ва­ния. У больных с MЭН2A му­та­ция в кодоне 634 ассоци­ируется с фео­хро­мо­цитомой и гиперпаратиреозом и до сих пор, не бы­ла обнару­же­на ни в одной из семей с си­н­дромом семе­й­ного МРЩЖ, что позволя­ет рассмат­ри­вать ее в каче­с­­­т­ве мар­ке­ра при про­г­нози­ровании ри­ска развития этих забо­леваний у бес­сим­птомных носи­телей этой мута­ции. Ге­р­ми­на­льные мутации в кодоне 918 ха­ра­кте­р­ны иск­лючи­тельно для МЭН2Б и свя­за­ны с пороками развития скелета и сли­зи­стых. Выявленная ассоциация позволяет дать более точный прог­ноз тече­ния заболевания у больных МЭН2.

Единственным эффективным мето­дом лечения МРЩЖ является тире­оид­эк­то­мия, поэтому так важна ран­няя и до­кли­ническая ди­а­гностика этого заболе­вания. Однако вопрос о профилактической тиреоидэктомии остается пред­ме­том пос­то­­­янной дискуссии, поскольку все еще отсутст­вуют данные дли­те­ль­ного наблю­де­ния за пациентами, перенесшими в раннем детском возрасте тиреоид­эк­томию, ос­нован­ную на прямом тестировании гена RET, и которые могли бы пока­зать, что МРЩЖ радикально изле­чен. Прямое те­стирование гена RET среди родст­вен­­ников больных МЭН2А об­­наружило 8 бессимп­том­ных носите­лей гермина­ль­ных мута­ций этого гена в возрасте от 3,5 до 42 лет из 4-х обс­ледова­нных нами семей (табл.1). Первый российский опыт профи­ла­к­ти­чес­кого хи­­­­ру­­р­гичес­кого лече­ния вы­пол­нен у 6 из них, согласившихся на опе­­ративное лече­ние. Как оказалось, толь­ко у двух из них, самых юных паци­ен­тов (3,5и 9 лет), опе­ра­ция была про­­­филакти­чес­кой, у остальных об­на­руже­ны очаги С-кле­то­ч­ной гипер­пла­зии и медуллярный рак.

Таблица 1.

Клиническая характеристика родственников семей с МЭН 2А и результаты тестирования гена RET (выявленный генотип) каждой семьи.

Пациенты: № семьи, (возраст/пол) Наличие фео­хро­моцитомы/ медул­ляр­ного рака у па­циен­тов ( Ф/М) Мутация гена RET (генотип) замена аминокислоты/кодон Бессимптомные носители мутации гена RET (+ ), тиреоидэктомия
Семья №1: 32 года/м 50 лет/м 3,5 года/ж 9 лет/м 38 лет/ж 9 лет/ж 10 недель, беременности ф/м ф - - - - - TGCCGC,ко­дон 634, экзон 11 Не тестировался TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 ( - ) ( - ) ( - ) ( - ) (+ ) тиреоидэктомия
Семья №2: 35 лет/ж 25 лет/ж 29 лет/ж 20 лет/м 9 лет/ж 2 года/м ф/м ф ф м - - TGCCGC,ко­дон 634, экзон 11 Не тестировалась Не тестировалась TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 ( - ) (+ ) тиреоидэктомия (+ ) тиреоидэктомия
Семья №3: 14 лет/ж 21 год/ж 42 года/ж 31 год/ж 69 лет/ж М - М Не обследована Визуальное уве­личение щито­ви­дной железы TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 ( - ) TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 TGCCGC, ко­дон 634, экзон 11 От обследова­ния и лечения отказалась (+ ) тиреоидэктомия ( + ) ( + )
Семья №4: 14 лет/ж 12 лет/м 38 лет/ж 74 года/ж М М М щи­товид. железа уда­ле­на в 45 лет TGCGGC,кодон634, экзон11 TGCGGC, кодон634, экзон11 TGCGGC, кодон634, экзон11 Не тестировалась, от обследова­ния и лечения отказалась (+ ) тиреоидэктомия (+ ) тиреоидэктомия

Эти дан­ные пока­за­ли, что носи­тели мутаций могут быть подвергнуты тире­оид­эк­томии до по­я­в­ления МРЩЖ. Послеопе­ра­ционное на­блю­дение от 1,5 до 8 лет (в сред­нем 4,8 года) позволило установить, что ти­ре­­о­идэктом­ия про­ве­де­нная на до­кли­­ни­че­ском уровне, позво­ля­ет из­бе­жать ме­­та­ста­зиро­ва­ния и имеет бо­лее благопри­ят­ный исход за­бо­лева­ния (табл.2), раннее выяв­ление за­бо­лева­ние на осно­ве ДНК-тес­ти­­рования может изменить течение МРЩЖ.

Изучение исходного и стимули­рован­ного уровня ка­льцитонина - как диа­г­­нос­тического маркера показало, что этот тест не всегда является абсо­лют­ным кри­терием. У пациентки 3,5 лет из семьи с МЭН2А наб­людае­мый уро­вень каль­­­ци­то­ни­на был вы­ше нормы поч­ти в 2,5 раза (76,8 пг\мл), од­на­ко при гис­толо­ги­чес­ком ис­сле­до­ва­нии приз­наков МРЩЖ обна­ру­жено не бы­ло (табл.2). Неоспори­мая ценно­сть этого метода в воз­мо­ж­ности оце­нить полно­ту хи­рур­ги­чес­кого лечения.

Таблица 2.

Клиническая характеристика членов семей больных МЭН 2А, до и после

тиреоид­эк­томии

Данные обследования пациентов до тиреоидэктомии
Возраст 3,5 года 9лет 14 лет 20 лет 38 лет 42 года
Кальцито- нин (пг/мл) 76,8 42,3 97,0 20,3 40,0 83,4
Катехола-мины норма норма Норма норма норма норма
Мутация гена RET + + + + + +
Данные обследования пациентов после тиреоидэктомии
Гистоло­ги­ ческое ис-­ следование щито­вид. железы Без приз- ­наков С-­ ­ клеточ. ги­перп­­ла­зии Без приз­на ков С-кле- точной ги- перплазии С-клеточная гиперплазия, узлы медул- лярного рака (0,7-1,0 см) Множ. узлы медулл. рака (0,7-1,0 см), очаги С-кл. гиперпл. в обеих долях Множ. узлы медулл. рака (до1,0 см) с амилоидо-зом в обеих долях Множеств. узлы медул- ляр.рака (до 1,0 см) на фоне С-клет. гиперплазии
Кальцито- нин (пг/мл) норма норма норма норма 80,3 норма
Катехол-амины норма норма норма норма норма норма
Длительно-сть наб-ния после опер. 4 года 8 лет 3 года 7 лет 5 лет 2 года

Ис­­­хо­дя из при­об­ретенного опыта, паци­ен­­там с мута­цией в кодоне 634, мы реко­мендуем прово­дить тире­оид­эк­то­мию независимо от уров­ня каль­ци­то­­ни­на. Выя­в­­ленная взаимо­связь геноти­па и фенотипа у носи­телей этих му­таций мо­жет способ­ствовать пла­ниро­ва­нию тиреоидэктомии, при­нятию ре­ше­ния от­но­­ситель­но объема и времени прове­­­ния профилак­тичес­кой тире­оид­эк­то­мии, раз­работ­ке тера­пев­ти­че­ских подхо­дов по отноше­нию к паци­ентам-носи­те­лям мутаций. Комби­нированный с моле­кулярными техно­ло­ги­ями под­ход к кли­ни­че­ской, био­хи­мичес­кой диаг­ностике и ведению паци­ен­тов из се­мей с МЭН2А может стать основным в умень­шение леталь­ности от МРЩЖ.

Первый опыт доро­до­вой диагностики синд­рома МЭН2 в нашей стране про­­­­ве­ден в семьях с МЭН2А и синдромом семейного МРЩЖ. Пренатальная диа­г­­нос­тика про­веде­на в семье №1 (табл.1), где у па­циента 32 лет с синд­ро­мом МЭН2А (носителя мута­ции в кодоне 634) ожидалось появ­ле­ние пото­мства. На сро­ке бе­ре­мен­ности 10 не­дель проведена из кле­ток ворсин хо­ри­она, у его буду­щего ре­бенка, была выделена геномная ДНК и выпол­нена прямая ДНК-диаг­но­с­тика гена RET. Для исклю­че­ния контаминации иссле­ду­емого матери­ала мате­рин­­с­­ки­ми тканями прове­дено конт­роль­ное исследова­ние. Мута­ции гена RET не обна­ру­жено, вы­­явлен муж­ской пол плода, ро­ди­лся здоро­вый мальчик. В возрасте 1 ме­сяца, ему про­ве­дено повторное тестиро­вание ДНК, анализ ока­зался отрица­те­ль­­ным. В се­мье с синдромом СМРЩЖ, у па­ци­ентки с мута­ци­ей TGC(Cys)CGC(Arg) в ко­доне 620 (экзон10), в 35 лет на фоне лечения МРЩЖ встал воп­рос о дор­о­довой диаг­ностике. На сро­ке бе­ре­ме­н­ности 13-14 недель прове­дено прямое тестирова­ние гена RET, у пло­да выяв­лена ана­ло­ги­ч­ная мутация­ гена RET. Пациентка при­няла решение пре­р­вать беремен­ность.

Таким образом, при­ме­не­ние RET-анализа дает возмож­ность диа­г­ностиро­вать (или иск­лю­­­чить) наследственную форму МРЩЖ, подготовить ро­дите­лей к рож­дению боль­но­го ребенка или предотвра­тить рождение тако­вого.

Проведенный поиск со­матиче­с­­ких мутаций в гене RET у боль­ных со спо­ра­дическим МРЩЖ позво­лил иде­н­ти­фи­цировать мута­ции в 28,6%. Выяв­лено 6 ти­пов соматических мутаций, три из которых - гетеро­зи­готные мута­ции в кодо­нах 639, 641 и 922 оказались неизвестными ранее. Это дает новые сведе­ния по молекулярной генетике синдромов МЭН2 и позволяет расши­рить спе­ктр мута­ций, который можно рекомендо­вать для рутинного лабо­раторного ана­лиза. При изучении мута­ций гена RET в образцах крови 13 больных со спо­ра­дичес­ким МРЩЖ, обна­ружена герми­на­ль­ная му­та­­ция “de novo” тем са­мым показана нео­бходи­мость ДНК-тести­рования спо­радичес­ких форм МРЩЖ. Созданы предпо­сылки для формирования банка ге­не­тической ин­фо­р­ма­ции клинически верифи­цированных больных с МЭН2 в России.

На основе полученных в ходе исследования данных, высокий риск разви­тия гипер­пара­тироза и феохро­моцитомы в семьях с синдро­мом МЭН2А пре­­­д­­­пола­гает необходимость включения в скрини­рую­щие прог­раммы диа­­г­нос­ти­ку этих заболеваний. Выявление му­та­ции в кодоне 918 ге­на RET сви­де­те­ль­ствует о са­мом агрессивном типе синдромов – МЭН2Б и во­­­з­мож­­но­с­ти ра­н­него ме­­та­с­тази­рования заболе­вания и соот­вет­ственно пла­ни­ро­вания воз­­раста тирео­ид­эк­то­мии, вы­бор кото­рого прово­дится индивиду­а­льно, но не позднее первых 5 лет жизни. Син­д­ром се­ме­й­­ного МРЩЖ про­те­кает менее тяжело и возникает в более поз­д­нем возрасте. ДНК-диагностику в семьях с МЭН2 сле­дует проводить осно­вы­ва­ясь на вари­антах этого синд­ро­ма и в соответ­с­твии с хара­ктерис­ти­ками мутаций гена RET.

Структура и соотношение генетически детерминированных форм МРЩЖ вклю­чает: 1) семейный синдром МЭН2А (7,4%); 2) МЭН2Б (11,7%); 3) син­д­ром СМРЩЖ (4,4%); 4) в составе синд­рома Реклингхаузена (1,4%).

Проведенный генетический анализ МРЩЖ позволил разработать комп­ле­ксную программу выявления лиц, предраспо­ложенных к развитию этого за­бо­левания, включающую три этапа мероприятий:1) выявление и ре­гис­т­ра­­ция се­­мей с MЭН2; 2) ДНК-диагностика бес­симптом­ных членов се­мей с наслед­с­твен­ным МРЩЖ («груп­па риска»), дающая инди­ви­ду­аль­ный прог­ноз, пре­ду­смат­риваю­щий в зави­си­мости от типа герминаль­ных мутаций так­­­тику ве­де­ния па­циентов; 3) клини­чес­кий мониторинг инди­ви­дов из груп­пы риска, вклю­­чаю­щий общее кли­ни­ческое обсле­дование, оп­ре­деление уро­в­­ня базаль­ного и пента­гаст­рин-сти­му­лированного кальци­то­ни­на, а так­же ди­а­г­нос­тику сим­п­томов фео­хро­­мо­цито­мы и гиперпара­ти­ре­оза (табл.3). Программа вклю­чает тактику создания профилактического регистра носи­телей онкопато­ло­ги­че­с­ких генов, которая осно­ван­а на соблюдении прин­ци­пов добро­воль­но­го про­ведения ДНК-диагнос­тики, конфеденциальности гене­ти­чес­кой инфор­мации, права человека самому решать быть или не быть про­ин­форми­рованным о результа­тах генети­че­с­­кого анализа и его последст­виях. Только после согласия паци­ен­та-носителя, он включа­ется в профилак­ти­чес­кий ре­гистр с последующей организацией и коор­ди­­на­цией клинико-генети­ческого монито­ринга за состо­янием его здоровья, про­филак­тичес­ких опера­ций, пси­холо­ги­ческой помощи.

­ Таблица 3.

Выявление наследственных форм МРЩЖ и формирование «групп риска»

­ Разра­бо­танная нами система комплексной диагностики этих заболе­ва­ний позволила эффективно провести ДНК-диагностику в онкологическую прак­тику.

Клинико-генетический анализ меланомы кожи.

Генетическая детерминация МК в определенной степе­ни мо­жет опреде­ля­ться частотой пора­же­ния членов семьи. Изучено 460 бо­ль­­ных МК, оценка се­мей­ной час­тоты это­го заболевания (2,62±0,42%) в 4 раза пре­­вы­си­ла таковую “накоплен­ную” за­бо­ле­вае­­мость (0,66%) в популя­ции, свиде­тель­ствуя о не­слу­­чайной сегре­га­ции МК в семьях этих боль­ных.

Анализ выявил особенности се­ме­й­ного про­явления МК. Развитие МК у жен­­­­­­­­щин насту­пает в бо­лее моло­дом возрасте (37,10±3,98) против общей вы­бор­ки же­нщин (44,53±0,70) (р<0,05). Возраст проявления МК у мужчин (52,20± 5,26) превышает этот пока­затель общей выбор­ки (44,65±1,09). Пол­у­чен­ные дан­ные о половых различиях воз­раста про­яв­ле­ния МК указы­ва­ют на существо­вание раз­лич­ных кри­териев риска для мужчин и женщин и поддер­жива­ют идею ге­нетичес­кой гетероген­нос­ти этого заболевания. Частота появ­ле­­ние первично-множест­вен­ных очагов МК - 0,22 во мно­го раз вы­­­ше ана­ло­гичной частоты несе­мей­ных форм (0,02) (р0,01 при =28,067). В 17% слу­чаев ПММК раз­ви­лась на фо­не ати­пич­­ных и ДН, про­тив 2,6% для общей выб­о­р­ки больных. Час­тота на­к­о­пления ДН у родст­ве­н­ников больных с се­ме­й­ны­ми фор­мами (0,86), до­с­­то­ве­р­но выше тако­вых, без се­мей­ных нако­п­ле­ний МК (0,41) (р0,05 при =3,87), а наличие мелано­ци­­тар­ных и ДН ока­за­лось ти­пичным, как для боль­ных МК, так для здоро­вых родственников из семей с накоп­ле­ниями МК.

Изучена степень внутриклассовой корреляции фенотипического сход­ства по возрасту начала заболевания семейных форм МК, данные представлены в таблице 4.

Таблица 4.

Данные возраста манифестации заболевания МК в парах родственников, их средняя оценка и коэффициенты корреляции.

№ п/п Пробанды Родители Побанды Дети Пробанды Сибсы
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 34 33 30 41 32 23 34 34 60 49 44 80 78 49 28 59 64 57 77 64 57 41 68 42 34 25 52 35 42 33 39 19 33 64 42 37 44 61 64 57 52 61 35 29 36 32 44 49 30 58 42 56
Среднее значение 32,63 55,88 58,75 34,88 51,50 41,10
Дисперсия 25,13 301,55 153,64 102,13 135,83 110,54
Критерий Фишера 12,0021 Р0,005 1,5044 1,23
Критерий Стьюдента 3,6384 Р0,001 4,2216 Р0,001 1,87
Корреляция R1=0,4179±0,2919 =1,14 R2=0,7418±0,1590 =4,40 R3=0,0679±0,3148 =0,0461

Полученные зна­чения коэффициентов корреляции для пар: пробанды-роди­тели 0,418, про­бан­ды-дети 0,742, пробанды-сибсы 0,068 не показали досто­верных раз­ли­чий по методу, подтверждая гипотезу доминантного наследо­вания семе­й­ных случаев МК. Следо­вательно, характерные для семейных форм МК та­кие признаки как, сегрегация этого заболевания, по­явле­ние пер­вично-мно­жест­вен­ных очагов опухоли, наличие ДН и ати­пи­чных ме­­­ла­­ноци­та­р­ных не­ву­сов и могут быть использо­ваны в диагнос­тике наследст­вен­ных вариан­тов этого заболевания.

Оце­нивая степень участия меланоцитарных и ДН в развитии МК, были изу­­чены три группы пациентов с большим количест­вом меланоцитар­ных не­вусов, изнача­льно имеющих разный риск развития МК. Первая вклю­чала 29 человек, отобранных одномоментно среди 509 индивидов органи­зо­ванного населения г.Мо­с­квы. Вторую группу составили 70 человек, обратившихся в полик­ли­нику РОНЦ с жалобами на на­ли­чие множест­вен­ных пигментных не­вусов на ко­же. Третья группа, ото­б­рана при осмотре 247 родственников 91 больного МК и сос­та­вила 22 чело­века с большим количе­с­твом разнообра­зных невусов на коже туловища. ДН выяв­ле­­ны и подтверждены гистоло­ги­чески во всех трех изу­чен­ных груп­пах индивидов и у членов их семей. Полученные данные по­ка­зали, что множес­т­венные мелано­цитарные невусы, также как и ДН, имеют тен­де­нцию накапли­ваться в семьях. Лица-носители множествен­ных мелано­ци­тар­ных и атипич­ных невусов имеют по­вы­шенный, хотя и разный риск раз­ви­тия МК, ко­торый значительно по­вы­ша­ет­ся при наличии в се­мье родст­вен­ника пора­женного МК. Об этом сви­­детель­ствует 0,8% обна­ру­жен­­ных нами новых случаев МК сре­­ди близ­ких родст­вен­ни­ков бо­ль­ных МК, что в 3 раза превысило популя­ци­он­ную час­тоту (0,34%) это­го забо­лева­ния. Из полученных данных сле­дует, что ДН не всегда несут зло­­ка­чес­т­ве­н­ный по­тен­циал и, по-видимому, су­ще­ст­вует ряд изме­нений в ме­ла­но­ци­тар­ных не­ву­сах, часть из которых, на опреде­лен­ной биоло­гичес­кой стадии ме­ла­­но­­ци­тар­ных пов­режде­ний, способна трансфор­ми­роваться в меланому и это явля­ется причиной того, что кли­ни­ческие и морфоло­гические приз­наки ати­­­­пич­ных (ди­сплас­ти­че­с­ких) невусов не всегда совпада­ют. Активный ме­тод выявле­ния МК у лиц с боль­шим количеством мелано­ци­тарных невусов является пред­поч­ти­тель­ным.

Свидетельством гетерогенности МК в пределах категории наследствен­ных меланом стали моногенно наследуемые син­­д­ро­мы, компо­нентом которых явля­е­тся МК, выявленные в 3,9% случаев. Одни из них, характери­зу­ются раз­ви­ти­ем опухолей разных локализаций, такие как синд­ром «семей­ного рака» (си­н­д­рома Линча II), синдром Li-Fraumeni. Дру­гие, вклю­чают нейро­кожные нарушения, так называемые ней­ро­кристо­па­тии, такие как нейро­ко­жный ме­ла­ноз, синд­ром ба­зально­клето­чно­го невуса, Реклингха­у­зе­на, Гард­нера, изу­че­ние кото­рых, даёт осно­вание для предполо­же­ния о су­ще­ст­во­ва­нии об­щей па­тоге­не­ти­чес­кой осно­вы семей­ной предра­с­по­­ложен­ности к ме­ла­­номе, по­ра­же­нию нервной системы и де­ри­­ва­тов кожи. К ней­ро­кри­сто­­патиям относится и син­дром дисплас­ти­чес­ких невусов, ко­то­рый установлен в 1,1% от общей выборки боль­ных МК.

Частота поражения разными неоплазиями членов семей больных МК со­с­та­вила 14%, превысив аналогичную час­тоту в популяции - 4,0% (р0,01). Чтобы уяс­­нить нали­чие или от­сут­ствие зако­но­мер­ностей в раз­витии тех или иных форм опухолей, поражающих родственников бо­ль­ных МК, проведен анализ час­тоты разных неоплазий встречающихся в семьях: больных МК, лиц-носи­телей множественных невусов, больных раком желудка и здоро­вых лиц конт­роль­ной группы, данные приведены в таблице 5.

Как видно из таблицы родст­вен­­­ники лиц-носи­те­лей множе­ст­­венных мела­но­ци­тарных нев­у­сов, наиболее час­то поражаются МК (p<0,01), опу­­хо­лью мозга (p<0,01), раком кожи (p<0,01) по сравнению с таковыми из группы здоровых индивидов. Сравнительный анализ частоты поражения неопла­зи­ями членов се­мей бо­ль­ных МК с аналогичной частотой лиц носителей мно­жественных неву­сов достоверных разли­чий не выявил. Однако сравнение частоты поражения нео­­п­лазиями родственников этих двух групп с таковыми, поражающими родст­венников здоровых индивидов из контрольной группы, показало, что члены их семей статистически достоверно чаще поражаются МК, опухолями мозга и ра­ком кожи. Следовательно, опухоли, которыми наиболее часто поражаются род­ст­венники из семей больных МК и лиц-носителей множес­т­вен­ных невусов, имеют тен­денцию к косегрегации МК, опухоли мозга и ра­ка кожи, дос­товерно отличаясь от таковых, накап­ли­вающихся не только среди род­ственников здоро­вых лиц контроль­ной групп­ы, но и в семьях боль­ных р­а­ком желудка.

Таблица 5.

Частота различных форм опухолей в семьях исследуемых выборок

Число пораженных (в %) среди родственников 1-й степени родства
Локализация злока­чествен­ной опухоли Лиц- носи­те­лей меланоцитарных неву­­сов (общее кол-во родствен­ников-259 чел-к) Больных мела­но­мой кожи (об­щее кол-во род­ственников –1667 чело­век ) Больных ра­ком желудка (об­­­щее кол-во родств-ков -3733 челов.) Контрольной груп­пы лиц, не болев­ших нео­плазиями (общее кол-во родствен­ни­ков - 4654 челов.)
Желудок 1,93 1,6 3,88 (p< 0,01) 1,42
Толстая кишка 0,4 0,6 0,58 0,43
Молочная железа 1,54* 1,76* 0,48* 0,43*
Легкое 0,39 0,89 (p<0,05) 1,27 (p< 0,01) 0,32
Поджелудоч- ­ная железа 0,38 0,42 0,43 (p< 0,05) 0,15
Мозг (нерв ная система) 1,54 (p< 0,01) 0,42 (p<0,05) 0,21 0,085
Меланома кожи 1,54 (p< 0,01) 0,89 (p< 0,01) 0.08 0,024
Базальноклеточный рак кожи 1,54(p< 0,01) 0,48 (p< 0,01) 0,29 0,15
Почка - 0,48 (p< 0,05) 0,13 0,085
Лейкоз 0,39 0,66 (p< 0,01 ) 0,24 0,15
Саркома мяг­ких, кост­ных тканей - 0,54 (p< 0,01 ) 0,19 0,065
Эндометрий 0,4* 0,5* 0,77* (p< 0,05 ) 1,1*
Мочевой пузырь - 0,24 0,21 (p< 0,05 ) 0,02

*Расчет частоты поражения проводился только на женщин.

Выявленная закономерность подтверждена пос­ре­д­ством расчета оценок корреляций между установленными формами опу­хо­лей на основе частоты этих заболеваний: у родственников носителей мел­ано­ци­та­р­ных невусов, в популяции и лиц контрольной группы ( табл. 6).

Таблица 6. Оценки гене­ти­ческих корреляций между изучаемыми признаками на основе семейной выборки лиц-носителей меланоцитарных невусов

Дисплас- тический невус Родственники 1 степени родства
Меланома кожи Опухоль мозга Рак желудка
0,435±0,092 (H=0,87) 0,402±0,123 (H=0,81) 0,138± 0,071 (H=0,28)
Популяционная частота изучаемых заболеваний
(0,7%) 273 (0,1%) 4 (0,08%) 1467 (0,7%)

Оце­нки генетических корреляций: ДН–МК - 87%, ДН - опухоль мозга - 81% показали существова­ние высокого генети­чес­­кого сходства между ДН, МК и опухолью мозга. Уста­­новленную в ходе исследо­вания связь между опу­холе­вой и предопу­холевой патологией, у родст­вен­ников из семей больных МК и у родст­венников лиц с множественными невусами, можно рассмат­ри­вать как фак­тор фо­р­ми­ру­ющий повы­шен­ный риск раз­вития выше­ука­занных забо­ле­ва­ний, а поя­в­­ле­ние этих заболе­ва­ний в семьях лиц-носителей множест­вен­ных меланоци­тар­­ных невусов и МК, более закономерно, чем следует из тра­ди­ци­он­ных клини­че­с­­ких представ­лений. Возможность пора­же­ния этими зло­каче­с­т­венными опухо­лями должна учи­ты­ваться при оп­ре­де­ле­нии риска в се­мь­ях больных МК и лиц с мно­жест­вен­ными неву­сами.. ­ Цитогенетическое изучение частоты и хара­к­тера распределения сайтов по­вы­ше­н­ной ломкости хро­мосом (СПЛХ), проведено у пациен­тов, ус­ло­в­но ра­с­пре­де­лен­ных на 4 груп­пы: больные МК, больные МК и ДН, пациен­ты носи­те­ли дисп­ластических невусов, здоро­вые доно­ры (табл.7). Как видно из таблицы, наи­бо­лее высокая частота спонтан­ных аберраций на­­­б­лю­да­ется у пациентов с ДН. Сред­ний процент аберрантных метафаз в гру­­п­­пе «ДН» сос­тавил 6,69±0,8, в группе «меланома +ДН» -6,79 ±0,7, по сра­в­не­нию с 2,43±0,6 у здоро­вых индивидов (Р0,01). У 6 из 8 обс­ле­дованных бо­ль­ных МК иден­ти­­фициро­ван синдром ДН и для каж­дого из них зафикси­ро­ван по­вы­шен­ный уровень спон­тан­ных аберраций. ­ ­ ­­­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ Полученные дан­ные поз­во­ляют рас­сматри­вать синдром ДН как заболева­ние с хромо­сомной неста­би­ль­нос­тью, что соот­вет­­с­твует современным пред­ставлениям об этом синд­ро­ме.

Таблица 7.

Результаты цитогенетических исследований разных групп пациентов

Здоровые доноры Больные меланомой Пациенты с ДН Больные с МК и ДН
Пол (воз-раст) Частота аберрант-ных мета­фаз (%) Пол (воз-раст) TNM класси- фикация Частота аберрантных мета­фаз (%) Пол (воз- раст) Частота аберрант-ных мета­фаз ( %) Пол (воз-раст) TNM Класс-ифи­ка­ция Часта аберрант-ных мета­фаз (%)
Спонтан-ных Индуци-ров. Спо-нтанных Инд--цир. Спо-нтанных Инд-уци-ров. Спо-нтан. Индуцир.
Ж (33) Ж (34) М (35) Ж (36) М (36) Ж (41) Ж (42) Ж (51) Ж (53) Ж (53) 5.0 2.0 0 0 6.0 4.0 0 0 0 3.0 60.8 27.3 33.3 47.4 36.5 61.4 51.8 60.6 42.1 58.5 М(35) Ж(37) Ж(37) М(37) Ж(42) Ж(44) Ж(51) М(51) Ж(52) Ж(53) М(56) ToNoMo Рецидив T3NoMo T2NoMo ToN2Mo T3NoMo T3NoMo T4NoMo T3NoMo T3NoMo ToNoM3 5.0 4.0 6.0 5.0 6.0 2.0 4.0 2.0 1.0 3.0 2.0 61.4 58.8 66.7 54.2 38.0 64.1 39.8 54.3 43.0 55.8 43.1 М (14) Ж (22) Ж (24) Ж (27) 3.0 0 14.0 9.0 37.6 80.4 34.1 47.1 Ж (23) М (38) Ж (41) М (52) М (53) М (63) М (70) М (72) T3NoMo T4NoMo T2NoMo T2NoMo T2N+Mo ToNoMo T1NoMo T4NoMo 4.6 8.0 1.0 4.0 9.0 6.0 8.0 14.0 60.0 64.2 30.5 67.3 26.0 65.4 72.8 55.1

­

­ У индивидов с МК, ДН и МК+ДН в трех участках коро­т­кого плеча хромо­со­мы 1 -1р22,1р31,1р32 наблюдается общ­но­сть в ин­диви­ду­альном распре­делении ра­зрывов и отличается от нормы с высо­кой досто­верностью. Что ассоциируется с локальной хромосомной нестабильностью ( рис.2).

Рис.2. Сайты повышенной ломкости хромосом, экспрессия которых увеличена у больных МК и или ДН по сравнению со здоровыми индивидами контрольной группы.

Поскольку эти изменения при­сутствуют у пациен­тов с ДН, ло­кальная хро­мо­сомная нестабиль­ность отно­сится к ранним событиям пред­шествующих разви­тию МК.

Анализ потери гетерозигот­ности в районе локализации гена p16/CDKN2A по микросателлитным маркерам (D9S157, D9S161,D9S171,D9S169, D9S301) у 37 больных МК показал, что в 24% сл­у­чаев больных МК наб­людается геми­зигот­ность по различному набору испо­ль­зуемых маркеров.­

Изучение аномального метилирования промоторного района гена CDKN2A показало, что метилирование этой области ДНК ге­на CDKN2A определяется в

24,3% образ­цов МК. Причем гиперметилирование промо­то­р­ного района гена CDKN2A выя­в­лено у всех боль­ных с первично-множест­венными злокаче­ст­вен­­ными о­пухолями, включаю­щи­ми МК, позволяя предположить, что бо­ль­ные МК с ано­мальным метилированием гена CDKN2A имеют тен­ден­цию к раз­витию по­ли­нео­плазии.

Структура генетически детерминированных форм МК включает: 1) семей­ные фор­мы заболевания (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первич­но-множественную МК (2,6%); 4) первично-множес­т­венные злока­чес­т­­вен­­ные опухоли в сочетании с МК (4,1%); 5) МК в составе наследст­вен­ных синдромов (3,9%).

Как показали наши исследования, се­мей­ный анамнез позволяет устано­вить, является ли МК изо­лирован­ной патологией, одним из про­явлений опу­холе­вых по­ра­жений в семей­ном клас­тере или является инте­гра­льной частью опу­холевого спек­тра наследствен­ных синдромов, ассоциируясь с дру­ги­­ми опу­хо­лями. Полу­ченные в ходе исследования данные, явились ос­новой для фо­рми­рова­ния групп риска среди семей больных МК, индивиду­аль­ного про­гно­зи­рования развития заболевания для родственников больного в зави­си­мо­сти от формы МК и конкретной семейной ситу­ации. Пока­за­ни­ем для вклю­че­ния па­ци­ента в группу риска, является: 1) МК у чле­нов семьи (риск повы­ша­ется при наличие более одного родст­венника бо­льного МК); 2) на­ли­чие в семье пер­вично множес­т­венной МК или ПМЗО, вк­люча­ющую МК 3) нали­чие в семье множественных невусов и опухоли мо­зга или немела­ном­ного рака ко­жи; 4) наличие в семье ДН и МК; 5) наличие бо­ль­­шо­го коли­чес­т­ва мелано­цитарных невусов и/или атипи­ч­ных невусов у чле­на семьи; 6) наличие в се­мье моно­генно наследуемого син­дрома, ком­по­нентом которого мо­жет быть МК.

Клинико-генетический анализ первично-множес­т­­вен­ных злокачествен­ных опухолей.

Другими изученными локализациями явились первично множест­вен­ные зло­ка­­чест­венные опухоли, включавшими оценку кли­­нических, эпи­де­миоло­ги­чес­ких и молеку­ляр­ных осо­бе­н­ностей 400 бо­ль­ных с синхронным и мета­х­ронным ПМЗО. Проведенный анализ создал осно­ву для выде­ления ра­­зных вариантов пато­логии и показал существо­ва­ние ко­сегрегации отдель­ных форм опухолей в семьях таких больных. Устано­влено, что риск раз­ви­тия этих заболеваний тесно коррели­рует с семейным анам­незом заболе­ва­ния. Ча­с­тота ПМЗО среди родс­т­вен­ников (0,8%), во мно­го раз превышает анало­гич­ную частоту в по­пуля­ции г.Мос­квы (0,008%). Ча­­с­тота поражения раз­ны­ми злокачественными новообразованиями членов семей больных ПМЗО (26,9±­­1,8 %) также превысила ана­ло­ги­ч­ную частоту (4,0±0,03%) в попу­ляции (Р<0,001). Сравнение частоты по­ра­же­­­­ния неоплаз­ия­ми родст­ве­н­ников боль­ных ПМЗО с таковой у боль­ных солитар­ным раком контрольных групп (больных раком желудка, мо­ло­­ч­­­ной желе­зы и меланомы кожи) показало не то­лько более тяжелый фе­но­тип заболевания при ПМЗО, но и то, что члены семей этих больных являются пре­дметом высокого онколо­ги­­­че­ского риска (Р<0,001) ( рис.3).

Рис.3. Частота злокачественных опухолей среди различных групп родст­вен­ников 1-ой степени родства больных ПМЗН, больных раком желудка и мела­номой кожи и раком молочной железы.

Выявлена тен­денция к предпочтительному пора­же­нию идентичных ор­га­­­нов в семьях бо­льных с первично множествен­ным пора­же­нием раком то­л­­стой кишки (рис. 4).

 Семейная агрегация колоректального рака в семьях больных-0

Рис.4. Семейная агрегация колоректального рака в семьях больных единс­т­венным раком толстой кишки и в семьях больных первично-множественным раком толстой кишки (ПМЗНТК).

Частота накопления од­но­типных опухолей в семьях боль­ных с первично мно­жествен­ным раком толстой кишки (5,8±0,6%) выше, чем ана­­логичный по­ка­за­тель в семьях больных с солитарным раком толстой ки­ш­­ки (3,0±0,2%) (Р0,001), следовательно для чле­нов се­мей бол­ь­ных с ПМЗО с пора­же­ни­ем тол­стой киш­ки ри­ск разви­тия рака этой локализации повышен. Частота ра­звития первично множественного рака у больных раком толс­той киш­ки вы­ше, чем у боль­ных раком прямой ки­ш­ки. Про­порция пораже­ния мно­жест­вен­ной малиг­ни­за­цией толстой кишки у мужчин боль­ных раком тол­с­той кишки (2,4±1,6%), по отно­ше­нию к тако­вой у мужчин больных раком прямой киш­ки (0,8±1,8%), соста­ви­ла 3:1 (Р0,001). У жен­щин бо­льных ра­ком тол­стой киш­ки и раком прямой кишки, таких раз­ли­чий не выя­влено. Отсу­т­­с­твие этих различий у жен­щин исклю­ча­ет возмо­жность ар­те­фа­кта из-за ве­ро­я­тнос­ти вклю­чения в анализ синдрома ННКРР. Исходя из по­лу­ченных данных, бо­ль­­ных с первично мно­жес­т­вен­ным раком толстой ки­ш­ки и раком прямой ки­ш­ки следует рас­сматри­вать как две отдельные, биоло­гичес­ки более гомоген­ные группы.

В семьях больных ПМЗО выявлена тен­де­нция к совместному разви­тию не­ко­торых видов рака. Из группы женщин больных ПМЗО, при первом пер­вичном раке молочной железы, вто­рая пер­вичная опу­холь чаще всего пора­жает: толс­тую ки­шку -25%, эндо­ме­т­­­рий - 5,8%, яич­ники -5,8%, шейку мат­ки -4,5%, молоч­ную железу -2,7%, желудок - 11%, и др. Если раз­ви­тие един­ст­ве­нного РМЖ в зна­­чительной степени обу­с­ловлено вли­я­ни­ем ок­ру­жающих факторов риска, то у пациен­ток, поражен­ных допо­л­ни­те­ль­­ными первичными опухо­лями, вли­яние ге­не­тических фак­торов мо­жет быть до­ми­нирующим. Подтверждением этому яв­ля­­ется то, что 16% родст­венников, из семей этих пациенток, также были пора­жены поли­неоп­ла­зия­ми, частота кото­рых пре­вышала тако­вую в популя­ции (4,2%) (р0,05). ­ ­ ­ ­ ­ ­­ ­­ Изучение совместных ло­кализаций по­ли­­нео­плазий среди 543 же­нщин с ПМЗО, у половины ко­то­рых, од­ной из первичных опухолей был РЯ, а у дру­гой - рак эндомет­рия, выявило, что в обе­их гру­п­пах, сочетание по­ра­же­ния раком: яич­ников, эндо­метрия, мо­­лоч­ной же­ле­зы и орга­нов желудоч­но-кише­ч­ного тра­к­та, имеет устойчивую ассоциацию, данные представлены на рисунках 6,7.

 Локализация второй первичной Локализация второй первичной ­-1

Рис. 6. Локализация второй первичной Рис.7. Локализация второй первичной ­ опухоли у 211 больной ПМЗО с пораже- опухоли у 232 больных ПМЗО с жением эндометрия. пора­­жением яичников.

Полученные данные стали основанием для оценки генетических кор­ре­ля­ций между выявлен­ными формами рака в семьях больных ПМЗН. Уста­но­в­лены достаточно высокие оценки корреля­ций между раком эндо­ме­трия и ра­ком толстой кишки (0,9±0,2), между раком моло­чной желе­зы и раком толс­той кишки (0,7±0,3), между раком желудка и раком мо­лоч­ной железы (0,8±0,6). ­ ­

Хотя каждая из указанных форм опухолей имеет харак­тер­ные имен­­­но для нее системы детерминации, однако доля общих ге­нов по­двержен­ности свиде­те­ль­­ствует о наличии общих этиологических механиз­мах (гене­ти­ческой общ­но­сти) их раз­ви­тия и выраженности связей опре­деленных типов опухолей в семьях боль­ных ПМЗО. Эти наблюдения предс­тав­ляют интерес, поскольку, если у больного одна из первичных опухолей соот­ветствует ука­зан­ным вы­ше, то можно ожи­­дать в отдельно взятых семьях ана­логичные со­литарные опу­холи у ро­дствен­ников.

­ ­ Установленная общность генетических ме­ханизмов под­ве­р­­же­н­ности к прояв­ле­нию указан­ных форм опу­холей подтвер­ждает наличие генети­чес­кой гете­ро­ген­­ности ме­жду «спо­ра­диче­скими» формами рака жен­ских репродук­тив­ных ор­ганов, же­лу­дка, толс­той кишки и ПМЗО, компонентами которых они являются.

­ ­­­­­­ Показано, что развитие ПМЗО ассоциируется с моно­генно наследуемыми си­н­дромами. Эти синдромы, обла­дают уникаль­ными кли­ни­ческими особен­нос­тя­ми к пора­же­нию первичной злока­чест­вен­ной опу­хо­лью нес­кольких ана­то­ми­ческих облас­тей. Ассоцииро­ван­ная ге­не­тическая предраспо­ложен­ность особен­но выражена для остео-, мягко­тканых сарком, лейкозов, РМЖ и для но­вых опухолей в области мозга и ЦНС при синд­роме Li-Fraumeni, при синд­роме Каудена - рака молочной железы, щитови­дной желе­зы и толстой кишки и др. В семьях боль­ных ПМЗО наследст­венные варианты злока­чес­т­венных опу­хо­лей встре­чаю­т­ся значительно чаще (17,3%), по сравнению с таковыми, уста­но­в­­лен­ными при ра­­вных условиях в семьях 460 больных МК (3,9%) и се­мь­ях 950 больных ра­­­­ком желудка (2,1%) (р0,01). Возраст диагностики пер­во­го первич­ного ра­ка у бо­ль­­ных с синдро­ма­ми оказался более ранним (43,6± 1,6 года), по сра­в­нению с таковым в общей группе боль­ных ПМЗО (49,8±0,9 года) (р0,01).

­ Коэффициент насле­ду­емости ПМЗО, рассчитанный на основе корреля­ций, оказа­лся равным - 77,4%, что без учета гетероген­ности этих опухолей, свиде­те­ль­ству­ет о высокой генетической детерми­на­ции и, следовательно, ге­не­ти­че­ской отягощен­ности этих семей. ­ ­ ­ ­ ­­

Определение частоты наиболее распространенных герминальных мута­ций в генах BRCA1/2 и CHEK2, с использова­нием технологии олигонук­лео­тидных био­­чипов у 20 боль­ных ПМЗО с поражением яични­ков и 68 боль­ных одним РЯ показало, что герминальные мутации в гене BRCA1 выяв­ля­ются в 52,63% бо­ль­ных ПМЗО и только у 10,3% больных солитарным РЯ (р<0,01). Наличие у па­ци­ен­тки ПМЗО с поражением яичников увели­чи­вает вероят­ность обнару­же­ния в семье му­та­ции в гене BRCA1.Синдромы «се­мей­ного ра­ка» иденти­фи­цированы у 55% больных ПМЗО - носителей гер­ми­нальной му­т­ации в гене BRCA1. У больных одним РЯ вы­я­в­лено два типа мутаций: 185delAG (1,47%) и 5382insC (8,82%). У боль­ных ПМЗО с пора­жением яични­ков, иде­н­тифици­рованы 4 типа мутаций гена BRCA1 (табл.8). ­

Таблица 8.

Типы мутаций гена BRCA1 обнаруженные у 11 из 20 пациенток, у которых одной из первичных опухолей был рак яичников.

Локализация опухоли Мутация в гене BRCA1 Количество случаев
РЯ - РМЖ 5382insC (экзон 20) 4153delA (экзон 11) 185delAG (экзон 2) 300T>G (экзон 5) 3 1 1 2
РЯ + злокач.гистиоцитома пр.гематоракса 300T>G (экзон 5) 1
РЯ + рак щитовидной железы 5382insC (экзон 20 1
РЯ + рак почки 5382insC (экзон 20) 1
РЯ + меланома кожи 5382insC (экзон 20) 1

Анализ семей больных с выявленными генотипами гена BRCA1 показал, что формы опухолей, которыми поражаются родственники этих больных, ра­з­ли­ча­ется в зависи­мости от вариантов мутаций в пределах гена. В семьях ас­соци­иро­ванных с мута­цией в позиции 5382insC, по срав­не­нию с дру­гими ти­пами мута­ций в гене BRCA1, родствен­ники чаще пора­жаются раком жен­с­ких репроду­к­ти­вных органов, предстательной железы и меланомы кожи (МК), (рис. 9). Родословная больной С. (мутация 5382insC гена BRCA1).

Рис. 9. У больной ( III-2) с герминальной мутацией 5382insC, меланома кожи верхней трети правого бедра диагностирована в 41 год, РЯ в 51 год, у матери (II-3) МК лица уда­лили в 41 год, а через 10 лет у не обнаружен рак эндометрия, умерла в 70 лет, дедушка (I-1) рак кожи. Сестра (III-1) полипоз эндометрия, мутации не обнаружено.

В семьях носи­те­лей мутации в позиции 300 замена T>G гена BRCA1, члены семей поражались раками разных типов, среди которых рак толстой кишки и желу­д­ка встречался чаще, чем при других типах мутаций (рис.10).

­ ­­ Родословная больной Н. (мутация 300T>G гена BRCA1).

Рис.10. У больной (II-2) с герминальной мутацией 300T>G, рак молочной железы обна­ружен в 34 года, а в 38 лет диагностирован второй первичный рак яичников, мать (I-4) умерла 54 года от РЯ, брат (II-3) умер от рака толстой кишки, сестра (II-4) рак эндометрия, бабушка (I-4) – РЯ, у дочери (III-1) выявлена мутация 300T>G.

При му­та­циях 4153delA и 185delAG, род­с­­твен­ники наиболее часто пора­жа­лись ра­­ком той же самой анатоми­чес­кой ло­ка­лизации и/или РМЖ (рис.11).

Родословная больной О, (мутация 185delAG )

Рис. 11. У больной (II-3) РМЖ обнаружен в 41 г, РЯ в 50 лет, у дочери (III-1) рак обеих яичников обнаружен в 39 лет, мать больной (I-2) умерла от РЯ в 44г.

Мутация во 2 экзоне гена BRCA1 - 185delAG обнаружена у матери (II-3) и дочери (III-1), у детей (IY-1,2) мутации не обнаружено.

Хотя полученные данные статистически незначимы, встречаемость этих форм рака следует учитывать в семьях больных ПМЗО с поражением яичников и их использование могло бы быть полезным при прогнозе риска развития неоплазий у родственников в зависимости от ва­рианта выявленной герми­нальной мутации у больного.

В анализируемых гру­ппах мутации в гене BRCA2 выяв­ле­ны у больных с билате­раль­ным РМЖ, мута­ций в гене CHEK2 не обна­ру­же­но. ­ ­ ­ Статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR2 и SEMA3B ­­исследован в представительной выборке, вклю­чав­ших 330 об­раз­цов РМЖ и РЯ. На рисунке 12 приведены примеры анализа метилиро­- вания CpG-островка гена RASSF1A в образцах РМЖ и яич­ни­ков.

Рисунок 12. Примеры типичных результатов анализа метилирования промоторной об­ла­сти гена RASSF1A с применением метода МС-ПЦР в образцах РМЖ и РЯ. Элект­ро­фо­рети­ческое разде­ле­ние в 10 % ПААГ продуктов МС-полимеразной цепной реакции (ПЦР), по­лу­ченных для образцов ДНК. ПЦР проводили на ДНК конвертированной бисульфитом. Ис­следован фрагмент 168 п.н. гена RASSF1A. М-маркер длин фрагментов с шагом 10 п.н. (10 bp DNA ladder ). Контроль полноты рестрикции – фрагмент 445 п.н.; контроль целост­ности ДНК – фрагмент 229 п.н.; анализируемый фрагмент гена RASSF1A 357 п.н.. К (-) – отрицательный контроль ( в отсутствие ДНК). М – маркер длин фрагментов с шагом 100 п.н. (100 bp DNA ladder). Т- опухоль, N- норма.

Вы­явлена высокая частота аномального ме­ти­­лирова­ния CpG-остро­вка генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолях мол­о­чной железы: 78% (32/41), 46% (26/56), 35% (22/65), в опухо­лях яич­ни­ков:73% (33/45), 30% (15/50), 50% (25/51), соотве­тственно. Впервые обна­ру­жено, что у больных ПМЗО мети­ли­рование ДНК из образцов ткани рака мо­ло­чной же­лезы, принад­ле­жащих СрG остро­в­кам генов RASSF1A, RAR2 выявлялось практически во всех слу­чаях -90% (11/12) и - 90% (4/5), соот­ве­т­ственно. При наличии у больных ПМЗО с пора­жением яични­ков, ано­ма­ль­ное метили­рование CpG островка ге­на RASSF1A выявлялось в 67% (8/12), а гена RAR2 практически во всех случаях 90% (4/5). На рисунке 13 показано схематическое изображение метилирова­ния промоторного района гена RASSF1A в образцах РМЖ.

 Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе-4

Рисунок 13. Применение бисульфитного секвенирования и МЧРА при анализе мети­ли­рования CpG-островка промоторной области гена RASSF1A. Сверху даны позиции CpG-динуклеотидов; CpG- динуклеотиды 2,3, 9.. и 31; с левого края при­ведены номера обра­з­цов РМЖ. Черный прямо­у­гольник указывает на выявление метилирования, белый пря­мо­угольник – метилирование не выя­в­лено. Приведены данные анализа для 12-ти образцов ДНК первичных опухолей РМЖ, №341-527, № 510 и 374- образцы, принадлежа­щие больным с ПМЗО. Справа по­ка­заны клинико-гистоло­ги­ческие характе­рис­тики опухоли: D - инфильтративно-протоковый рак молочной железы; L – ин­филь­тративно-дольковый рак молочной железы, Mix – смешанный; ста­дия и степень анаплазии опухоли.

По­ка­­за­но, что аномальное метилирование промоторной области гена RASSF1A мож­но обна­ру­жить на доклинической стадии развития этих опу­хо­лей. В мор­фо­ло­гичес­ки не­и­­змененной ткани уровень метилирования для гена RASSF1A составил 14% (РМЖ) и 5% (РЯ). От­сут­с­т­вие метилирования этих учас­тков ДНК в крови здоровых доноров (0/15), что поз­­во­ляет считать ме­­­ти­­лирова­ние этого гена ранним молеку­ляр­ным маркером злока­чествен­ной тран­с­фо­р­ма­ции РМЖ и РЯ. Выявлена корре­ля­ция час­то­ты метили­рова­ния промоторных районов генов RAR2, SEMA3B с клини­че­с­кой стадией и сте­пе­нью анап­ла­­­зии РМЖ и РЯ ( рис.14).

 А. Частота метилирования промоторного CpG-островка гена RAR2 в-5

Рис.14. А. Частота метилирования промоторного CpG-островка гена RAR2 в об­разцах ДНК первичных опухолей РМЖ и РЯ по сравнению с образцами ДНК гис­тологически-нормальной ткани от тех же пациентов. B. Корреляция уровня мети­лирования (с учетом плотности метилирования CpG островка) гена RAR2 со сте­пенью анаплазии опухоли (1/2 против 3, 1-я пара столбиков) и с клинической ста­дией рака молочной железы (I/II против III/IV, 2-я пара столбиков). Достовер­ность рассчитана с помощью теста Фишера (P0.005).

Как видно на рисунке 14 значение частоты метилирования в ДНК опу­хо­лей мо­­­ло­чной железы и яичников досто­верно выше соответствующих вели­чин, по­лученных для ДНК морфологически нормальной ткани из этих орга­нов, полученных от тех же пациентов (Р0,001).

Результаты исследования метилирования промоторных районов генов RASSF1A, RAR2 и SEMA3B, свиде­тель­с­твуют о значительной роли эпиге­не­ти­чес­ких факторов в регуля­ции фун­кции этих генов в канцерогенезе рака мо­лоч­ной железы и рака яични­ков. Выявленные в ходе исследования дан­ные по­казали, что бо­льные с гиперме­ти­ли­­рованием гена RASSF1A и RAR2 имеют тенденцию к разви­тию перви­ч­но множествен­ных пора­же­ний, вклю­чающих молочную железу и яичники. Мети­ли­­­ро­­вание промоторных райо­нов ге­нов RASSF1A, RAR2, SEMA3B, может испо­льзо­вать­ся в качестве мар­ке­ров в ком­п­лексной диаг­ностике и прогнозе этих заболева­ний и имеет бо­льшие воз­мож­но­с­ти для раз­ра­ботки неинвазив­ной диагностики рака. ­ ­ ­ ­ ­­ ­ ­ ­ ­ Генетически детерминированных формы ПМЗО выявлены в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследс­твен­ных синдро­мов -17%. Еще одним существенным обстоятельством, в плане использования как диагнос­ти­­ческого инструмента определения предрасположенности к раку в семьях больных ПМЗО, является: 1) ранний возраст манифестации рака у больного или у члена его семьи; 2) наличие в семье больных с первично множествен­ным поражением злокачественными опухолями; 3) наличие в семье большого числа мультифо­ка­ль­ного и двустороннего поражения парных органов; 4) большое число пора­жен­ных индивидов более чем в одном поколении родственников; 5) наличие в семье специфических опухолевых ассоциаций, которые можно объединить в понятие синдром; 6) выявление мутации гена, специфически связанного с возникнове­ни­ем неоплазии у одного из членов семьи.

Таким образом, разработаны и внедрены, основанные на приме­нении кли­нико-генеалогических, цитогене­ти­че­­ских и молекулярно-биологических ис­сле­­до­­ваний, методы оценки генетической детерминации развития рака щи­то­вид­ной железы, меланомы кожи, пер­вич­но-мно­же­ст­венных злока­чест­вен­ных опухолей и их генетической гетеро­ген­но­сти, позволившие соз­дать в меди­ко-генетическом консультировании этих неоплазий но­вые воз­мо­ж­­нос­ти для ранней диагностики, профилактики, про­гноза развития неоп­ла­зий у кли­ниче­ски здоровых родст­ве­н­ни­ков из семей этих больных, выборе так­тики лече­ния, вопросах планирования семьи.

Разработаны реко­мен­дации по ранней диагнос­тике и оценке эффек­тив­ности прогноза развития неоплазий у клинически здоровых родст­ве­н­ни­ков из семей этих больных и у ряда из них, с профилак­тической целью, про­ведены дородовая диагностика и хирургическое вмеша­тельство, что практи­чески исключало риск развития рака.

Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий выяв­ле­ние и регистрацию семей с отягощенным семей­ным анамнезом, уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагнос­ти­ку), формирование групп риска и их мониторинг, который мож­но представить в виде схемы:

ВЫВОДЫ

1. Анализ 1495 бо­льных раком щитовидной железы (РЩЖ), меланомы кожи (МК) и первично множественных злокачественных опухолей (ПМЗО) и 8727 их родст­вен­никах 1-й-2-й степени родства выявил основные особен­нос­ти и генетические закономерности их проявления.

2. Наследственные варианты немедуллярного РЩЖ (НМРЩЖ) установ­лены в 5% случаев, из них в 3,6% НМРЩЖ встречается у больных с наслед­с­твен­ны­ми синдромами. Впервые выявлен синдром семейного папиллярного РЩЖ (1,4%). Обнаружена тенденция к поражению раз­ных органов у боль­ных НМРЩЖ: частота первично мно­жественного пора­же­ни­я в семьях (5,4%) превы­сила таковую в популяции (0,003%). Выявлена косегрега­ция НМРЩЖ с нео­плазиями почки, молочной железы, МК, толстой кишки.

3. Генетически детерминированные формы медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) иде­­н­тифицированы в 24,9% случаев и клинически они проявляются как синд­ром МЭН2А, МЭН2Б и синдром семейного МРЩЖ. Моле­ку­­ляр­ной основой МЭН2 являются мутации в гене RET. Выявлены мутации гена RET в цистеи­но­вых кодонах: 634- в семьях с МЭН2А, 918 –в семьях МЭН2Б, 620 - при синдроме СМРЩЖ. Показано, что причиной клини­ческого поли­морфизма МРЩЖ являе­т­ся аллельная гетерогенность.

4. ДНК-диагностика МРЩЖ откры­вает во­з­мож­ность до­родо­вого выявле­ния син­д­ромов МЭН 2 и позво­ля­ет разрабо­тать терапев­тические под­ходы у но­сителей мутаций гена RET. Первый опыт пренаталь­ной диаг­но­стики в се­мь­­ях с МЭН2А и синдромом СМРЩЖ показал высокую надежность и эф­фе­к­тивность этого метода, а «про­филакти­че­ская» тирео­идэк­томия, проведенная у бес­сим­­­том­ных но­си­телей му­та­ции этого ге­на, получила гистологическое подтвержде­ние диагноза медуллярного РЩЖ почти во всех случаях.

5. Структура генетической детерминации МК, включает: семей­ную форму (2,6%); 2) синдром диспластических невусов (1,1%); 3) первично-множест­вен­­­ную МК (2,6%); 4) первично-множес­т­венные злокачес­т­вен­ные опухоли с включением МК (4,1%); 5) МК в составе наследст­венных синдромов (3,9%).

Риск развития МК для лиц с бо­ль­­шим коли­чес­т­вом меланоцитарных, ати- пи­чных и ДН значительно повы­шается при нали­чии в семье МК. В семьях больных МК и лиц - носи­телей мно­жествен­ных и ДН выявлена косегрегация опухоли мозга, МК, рака кожи. Оценки генетических корреляций между ДН-МК, ДН-опухолью мо­з­га, по­казали высокое генетическое сходство, под­тве­р­ждая, что опу­хо­ли нервной системы и МК могут независимо накап­лива­ть­ся в этих семьях.

6. Установлено, что цитогенетические изменения с наибольшей часто­той аккумулируются в трех участках кроткого плеча хромосомы 1(1р), обнаружи­вая общ­но­сть в ин­диви­ду­альном распре­делении ра­зрывов в регионах 1р22, р31, р32 у индивидов с МК, МК+ДН и у лиц носителей ДН, что ассоциирует­ся с локальной хромосомной нестабильностью и является ран­ним событием в цепи изменений, предшествующих МК.

7. Гемизигот­ность по разли­ч­ному набору испо­ль­зуемых мар­керов (D9S157, D9S161, D9S171, D9S169, D9S301) в районе локализации гена p16/CDKN2A наб­людается у 24% больных МК. Аномаль­ное мети­лирование про­мо­тор­ной об­ла­сти ге­на CDKN2A выявляется у 24,3%, однако инакти­вация этого участка ДНК гена CDKN2A в результате ме­ти­ли­рова­ния выяв­ля­ет­ся у всех боль­ных с первично множест­венными нео­пла­зиями, включа­ю­щи­ми МК.

8. ПМЗО являются наследственно детермини­ро­ван­­ными в 18,1%, из них семейные формы - 0,8%, в составе наследс­твен­ных синдро­мов -17,3%. Час­тота поражения нео­плазиями родственников из се­мей боль­ных ПМЗО (26,9± 1,8 %) превышает ана­ло­гич­ную частоту в популяции (4,0±0,03%) (Р<0,001) и таковую у боль­ных солитарным раком контрольных групп (РМЖ, МК и ра­ком желудка), определяя, что члены семей больных ПМЗО относятся к груп­пе вы­сокого онко­логи­че­ского риска. У больных ПМЗО вы­явлена ор­ган­­ная ас­со­циация между опухолями, по­ра­жающими бо­ль­ных и членов их семей. Тен­денция к совместному развитию рака яич­ников, эндо­метрия, моло­чной желе­зы и органов желудочно-кише­ч­ного тра­кта подт­вер­ждена оцен­ка­ми ге­нети­ческих корреляций между РЭ и РТК (0,9±0,2); РМЖ и РТК (0,7±0,3); раком желудка и РМЖ (0,8±0,6), указывая на нали­чие общно­сти генов, детер­мини­рующих предрасполо­жен­ность к развитию этих опу­хо­лей.

9. Частота гер­ми­нальных мутаций в генах BRCA1 больных ПМЗО с по­ра­же­нием яич­ни­ков составляет 52,63%, тогда как у боль­ных од­ним РЯ - 10,3% (р<0,01). У больных ПМЗО - носителей герминальной мута­ции в гене BRCA1, синдромы «семейного рака» выявлены в 55%. Обнаруже­но, что локализация неоплазий у родственников больных ПМЗО - носителей му­таций в гене BRCA1, различается в зависимости от типа мутаций: в се­мь­ях, ассоци­ирова­н­ных с мута­цией 5382insC, родствен­ники пора­жа­лись ра­ком жен­с­ких ре­п­­роду­к­ти­вных орга­нов, предстательной железы и МК; в се­мь­ях но­си­те­лей му­­тации 300T>G, рак толстой кишки и желу­д­ка у членов се­мей встречался ча­­ще, чем при других ти­пах му­таций, а при му­та­циях 4153delA и 185delAG род­с­­твенни­ки чаще по­ра­жались ра­ком той же самой ана­томи­чес­кой ло­кализации и/или РМЖ.

10. Исследованный статус метилирования генов-супрессоров опухолевого роста RASSF1A, RAR2 и SEMA3B в опухолях молочной железы и яичников показал, что аномальное метили­ро­вание промоторных районов этих генов выявляется в опухолях молочной железы, соответственно, в: 78%, 46% и 35%; в опу­холях яичников: 73%,30% и 50%, тогда как, при наличии у боль­ных ПМЗО ано­ма­ль­ное метилирование CpG островка гена RASSF1A выяв­ля­лось практически во всех случаях РМЖ и РЯ, а гена RAR2-во всех случаях РЯ. Выявлена ко­рре­ля­ция час­тоты метилирования промоторных райнов ге­нов RAR2 и SEMA3B с клинической стадией и сте­пе­нью анап­ла­­­зии опухо­ли. Показано, что метили­ро­вание промоторных районов генов RASSF1A, RAR2, SEMA3B может испо­льзоваться в качестве маркеров в комплексной диагнос­тике и прогнозе этих заболеваний, что дает возможность раз­ра­ботки неинва­зи­вной диагностики рака.

11. Разработан алгоритм медико-генетического консультирования при

РЩЖ, МК и ПМЗО, включающий оценку семейной отягощенности (выяв­ле­ние и регистрацию семей с отягощенным семейным анамнезом), уточнение генетического диагноза (в том числе ДНК-диагностику), формирование групп риска и их мониторинг.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Казубская Т.П.,Ситникова Т.С., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Клини­-ко -генетический анализ распространенных злокачественных забо­ле­ваний. //Со­вет­ская меди­цина. 1989, №6, С. 16-19.

2. Гарькавцева Р.Ф., Сотникова Е.Н., Казубская Т.П., Акуленко Л.В.,

Нефедов М.Д., Лиснянский И.Е. Медико-генетические аспекты злока­че­ст­вен­ных новообразований. // Обзорная инфор­ма­ция «Ме­ди­цина и здраво­ох­ране­ние», серия – Oнкология. 1990, вып.2,С.1-18

3. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Нефедов М.Д., Гарькавцева Р.Ф. Генетические аспекты первично-множественных злокачественных ново­об­разований.// Вестник ВОНЦ АМН СССР.1990, № 1, С.28-31.

4. Казубская Т.П., Ситникова Т.С., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Гарькав­це­ва Р.Ф. Роль наследственных фак­торов в возникновении мела­номы кожи.// Всесо­юзный симпозиум «Кли­ника и лечение меланомы кожи» Саратов. 1990, С.28-30.

5. Сельчук В.Ю., Казубская Т.П. Генетическая гетеро­ген­ность и прог­но­зи­ро­вание первично-множественных злокачественных ново­об­разований.// YI республиканнская науч. конф. онко­логов Молдавии, Кишинев.1990, С. 9-10.

6. Sitnikova T., Kazubskaya T. Clinical genetic analisys malignat melanoma.// Eur. J. Cancer EACR-XI, Genua, Italy, 1991, Suppl.3, V. 27, Post. 2015, S.24

7. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Сельчук В.Ю. Анализ генетической предрасположенности к раку в семьях больных первично-множест­вен­ны­ми злокачественными новообразованиями.// Цитология и ге­не­тика. Киев, 1992, Т. 21, С.32-36.

8. Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Демидов Л.В., Мусатов В.К., Гарькав­це­­ва Р.Ф. Диспластические невусы и их значимость для идентифика­ции предрас­по­ложенности и ранней диагностики меланомы.// Вестник ОНЦ АМН Рос­сии. 1993, № 1, С.20-25.

9. Сокова О.И., Кириченко О.П.,Чеботарев А.Н., Казубская Т.П., Харкевич Г.Ю., Мусатов В.К., Копнин Б. П. Повышенная частота пов­реждений неко­торых уча­стков хромосом в клет­ках крови больных меланомой и/или дис­п­ластическими невусами.// Вестник ОНЦ России. 1993, № 1, С. 34-38.

10. Kazubskaya T., Selchuk V., Belev N.,Garcavtseva R. Genetic-epidemiolo­gi­cal study of multiple primary malignant neoplasms.// Cancer Detection and Pre­ven­­ti­on, 1993, V. 17, № 99, Р.114-115.

11. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П. Идентификация наследст­венных вари­антов мелано­мы кожи.// 50-лет Акад. мед. Наук, Москва. 1994, C.153-154.

12. Selchuk V., Kazubskaya T., Klimenkov A., Garkavtseva R. Multiple Pri­mary Malignant Neoplasms.// XVI International Cancer Congress. 1994, 30 Oct.-5 Nov. India, Delhi, Ref -00110, P.284

13. Гарькавцева Р.Ф., Ситникова Т.С., Казубская Т.П., Демидов Л.В., Хар­ке­вич Г.Ю. Генетический анализ предрасположенности к развитию мела­но­мы кожи. Сообщение 1. Распрост­ра­неность, семейное изу­че­ние, генети­чес­кая гетеро­генность.// Генетика. 1995, Т.31, №11, С.557-1561.

14. Харкевич Г.Ю., Казубская Т.П.,Агапова Р.К., Мусатов В.К., Трубников В.И., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ пре­д­расположенности к раз­ви­тию меланомы кожи. Сообщение 2. Взаимосвязь и патоге­не­тическая общ­ность мела­номы кожи с диспласти­ческими невусами.// Генетика.1995, Т.31, №11, С.1562-1565.

15. Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф. Генетический анализ и раз­ра­ботка прин­ципов прогно­зи­ро­вания злокаче­ственных опу­холей в се­мьях больных раком же­лудка и первично множес­т­венными новообразо­ва­ниями.// Генетика. 1995, Т.31, № 34, С.410-414.

16. Базов И.В., Аксенова М.Г., Казубская Т.П., Смирнов А.В., Забаровский Е.Р. Брага Э.А. Анализ аллельных потерь в области короткого плеча хромо­сомы 3 в карцино­мах почки, тела матки и яичников с помощью три- и тетра­мерных маркеров.// Молекулярная био­ло­гия. 1997, №31,С. 805-809.

17. Kasubskaya T.P., Bazov I.V.,Braga E.A., Pugacheva E.M., Ermilova V.D Garkavtseva R.F. Human chromosome 3p deletion mapping in car­cinomas of kidney, lang and reproductivе organs.// 17th International Cancer Congress. 1998, Brazil, A.600, P.141.

18. Braga E, Pugacheva E, Bazov I, Ermilova V, Kazubskaya T, Garkavtseva R,

Mazurenko N, Kisseljov F.,Liu J, Garkavtseva R, Zabarovsky E, Kisselev L. Comparative allelotyping of the short arm of human chromosome 3 in epithelial tumors of four different types.// FEBS Letters.1999 July 9; V.454, №3, Р.215-219.

19. Амосенко Ф.А., Козлова В.М., Любченко Л.Н., Казубская Т.П., Гарькав­цева Р.Ф. Мутации в прото­онко­гене RET у больных с медул­ля­р­­­­ным раком щито­ви­дной же­лезы и возможности докли­­нической диаг­ности­ки и про­филак­ти­че­с­кого лечения но­сителей этого заболевания.// Вестник онко­ло­ги­ческого науч­ного центра им.Н.Н.Блохина РАМН. 2000, № 1, С.20-26.

20. Braga E., Bazov, I., Senchenko V., Liu J, Loginov V., Ermilova V., Kazubs­kaya T., Garkavtseva R. Common deletion regi­ons on chromosome 3p in different types of cancer.// Abstracts of HUGO's Human Genome Meeting “HGM'99”, Van­cou­ver, Canada, April, 2000, Р.75.

21. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Генетика рака желудочно-кишечного тракта.// Современная онкология. 2001,Т.3, №4. С.151-153.

22. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Парфенова Д.Н., Михайловский А.В., Трубников В.И., Сельчук В.И., Гарькавцева Р.Ф. Результаты длительного ак­тив­ного наблюдения и клинико-генетический анализ пигментных невусов.// Вестник дерма­тологии и вене­рологии. 2001, №1, С.4-9.

23. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н, Козлова В.М., Белев Н.Ф., Сельчук В.Ю. Наследственный рак: иден­ти­фикация, гене­ти­ческая гетеро­генность, медико-генетическое консультирование.// Вестник РАМН. 2001, №9, С.27-33.

24. Амосенко Ф.А.,Фриллинг А.,Козлова В.М.,Любченко Л.Н., Казубская Т. П., Гарькавцева Р.Ф. Молекулярная диаг­ностика множественной эндо­к­рин­ной неоплазии 2 типа.// Вестник Академии наук. 2001, №2,С.34-37.

25. Braga E.,Bazov I.,Ermilova V., Kazubskaya Т., еt al. Critical tumor-sup­pres­sor gene regions on chromosome 3p in major.// Int. J.Cancer.2002,V.100,P.534-41.

26. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Лиснянский И.Е. Генeтические аспе­кты медуллярного рака щитовидной железы.// Проблемы эндо­кри­нологии. М. 2002, Т.48. №.4. С.16-20.

27. Казубская Т.П., Мусатов В.К., Михайловский А., Сельчук В.Ю., Шаба­нов М.А., Трофимов Е.И. Меланома кожи: клинико-генетическая гете­­ро­ген­ность и принципы медико-генети­че­ского консуль­ти­рования.// Рос­сий­ский онколо­гический журнал. 2003, №3, С.26-33.

28. Амосенко Ф.А., Бржезовский В.Ж., Любченко Л.Н., Шабанов М.А.,

Козлова В.М., Казубская Т.П., Ванушко В.Э. Анализ мутаций в прото-онко­гене RET у рос­сий­ских больных с медул­ля­рным раком щитовидной железы.// Генетика. 2003, Т.29, №6. С.1-7.

29. Белев Н.Ф., Самотыя Е.Е., Халипли С.Д., Софрони М.Ф., Казубская Т.П., Гарькавцева P. Ф. Сегрегационный и гене­тико-дис­персионный ана­лиз пред­рас­поло­женности к первично-мно­же­стве­н­ным злокачественным ново­об­разованиям.// Съезд онкологов республики Казахстан. Алма-Ата. 2003,С. 8-9.

30. Казубская Т.П., Козлова В.М., Мусатов В.К, Михайловский А.В., Шабанов М.А.,Трофимов Е.И., Сельчук В.Ю. Идентификация наследствен­ных вариантов меланомы кожи.// Генетика. 2004, Т.40, №1, С.1-9.

31. Senchenko V., Liu J, Loginov V, Bazov I.,Ermilova V., Kazubskaya T., Garkavtseva R, Braga E., ZabarovskyYu. Discovery of frequent homozygous deletions in chromosome 3p21.3 LUCA and AP20 regions in renal, lung and breast carcinomas.// Oncogene. 2004, V.23, №34, P.5719 –5728.

32. Логинов В.И.,Маликова А.В.,Серегин Ю.А., Ходырев Д.С, Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Киселев Л.Л, Брага Э.А. Метилирование промо­то­рного региона гена RASSF1A кан­ди­дата в опухолевые супре­с­соры в первичных эпи­те­лиа­льных опухолях.// Молекулярная биология. 2004, Т.38, № 4, С.654-667.

33. Amosenko F., Kazubskaya T. Mutation analysis RET proto-oncogene in Rus­sian patients with inherited medullary thyroid carcinoma.// 30th American Society of Preventive Oncology. 2006, Bethesda, USA, P. 37.

34. Корчагина Е.Л., Казубская Т.П., Сазонова М.А., Гарькавцева Р.Ф. Роль наследственной предрасположенности в возникновении рака толстой кишки. // Медицинская генетика. 2005., Т.4, №5, C.209-210.

35. Федорова О.Е., Любченко Л.Н., Паяниди Ю.Г., Казубская Т.П., Амос­сенко Ф.А., Наседкина Т.В. Использование биочипов при изучении расп­рост­раненных мутаций в генах BRCA 1/2 и CHEK 2 у больных органо­спе­ци­фи­чес­ким раком яични­ков и первично-множествен­ными злокачествен­ными ново­об­ра­зо­ваниями с поражением яич­ников (российская попу­ляция­).//Моле­ку­лярная биология. 2007, Т.41, №1, С.37-42.

36. Казубская Т.П., Козлова В.М., Шишков Р.В., Поляков В.Г., Бржезов­с­кий В.Ж., Амоссенко Ф.А., Гарькавцева Р.Ф. Синдром множествен­ных эндок­рин­ных неоплазий типа 2А. Профилак­тичес­кая тиреоидэктомия.// Детская онко­логия (Pediatric oncology). 2007, №2, С.24-31. ­ ­ 37. Казубская Т.П., Белев Н.Ф, Нефедов М.Д., Паяниди Ю.Г., Сельчук В.Ю. Клинико-генетический анализ первично множес­твенных злокачест­вен­ных новообразований.// Российский онкологический журнал.2007, №2, С.4-9.

38. Казубская Т.П, Амосенко Ф.А, Козлова В.М., Гарькавцева Р.Ф. Диа­г­но­стика и профилак­тика медуллярного рака в семьях больных синдро­мом мно­жественной эн­докринной неоплазии тип 2.// Материалы XI Рос­сий­ского он­ко­­ло­гического конг­ресса. Москва 2007. Издательская группа РОНЦ, С.179

39. Kazubskaya T., Shatalova E., Loginov V., Sudomoina M., Blanchard P.,

Favorova O.O., Braga E.A. Genetic and epigenetic alterations associated with breast cancer risk in Russian women.// 19th International Cong­ress on Anti Cancer Treatment. Paris, France. 2008, Р.154, Р.182.

­­40. Казубская Т.П., Козлова В.М., 5. Амосенко Ф.А., Шишков Р.В., Поля­ков В.Г., Бржезовский В.Ж., Любаев В.Л., Гарькавцева Р.Ф. Синдромы мно­жест­вен­ных эндокринных неоплазий и медуллярный рак щитовидной желе­зы. // Рос­сийский онкологический журнал. 2008, №1, С. 4-9. ­ ­ ­ ­ ­ ­ ­­ ­ ­ ­ ­ ­ ­ 41. Логинов В.И., Базов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Ермилова В.Д., Гарькавцева Р.Ф., Забаровский Е.Р., Брага Э.А. Районы по­тен­­циальных генов-супрессоров эпителиальных опухолей почки, молочной железы и яичников на хромосоме 3 человека.// Генетика. 2008, Т. 44, С.250-6 ­­­

42. Ходырев Д.С., Логинов В.И., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькав­це­ва Р.Ф., Брага Э.А. Метилирование промоторной области гена RAR-beta2 в опу­хо­лях почки, молочной железы и яичников. //Генетика. 2008, T. 44, C. 1126 -1132.

43. Корчагина Е.Л., Белев Н.Ф., Казубская Т.П., Барсуков Ю.А.,Тимофеев Ю.М., Музаффарова Т.А., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Кли­нико-гене­тические аспекты рака толстой кишки и идентификация его наследствен­ных форм. // Колопроктология. 2008, Т.2, №24, С.9-14. ­ 44. Логинов В.И., Ходырев Д.С., Пронина И.В., Казубская Т.П., Гарькавцева Р.Ф., Брага Э.А. Изменение уровня метилировния гена SEMA3B в эпители­альных опухолях.// Мол. биология. 2009, Т.43, №3, С.436-445. ­ ­ ­ ­­ ­ 45. Гарькавцева Р.Ф., Казубская Т.П., Любченко Л.Н. Роль наследственных факторов в развитии злокачественных новообразований. // В справочнике прак­тического врача «Онкология» под ред. чл-корр. РАМН, проф. И.В. Под­дубной, Москва 2009, издательство «МЕДпресс-информ», С.18-30.

46. Брага Э.А., Логинов В.И., Пронина И.В., Ходырев Д.С. Казубская Т.П.,

Ермилова В.Д., Забаровский Е.Р., Гарькавцева Р.Ф. От структурно-функцио­наль­ных изменений в генах хромосомы 3 в эпи­телиальных опухолях к онко­мар­керам.// II Рос­си­йский симпо­зиум «Моле­ку­лярно-ге­не­тиче­с­кая диаг­нос­ти­ка злокачес­т­венных опухолей чело­ве­ка» Вестник РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН. 2009, Т.2, №1, С.79-80.

47. Казубская Т.П. Диагностика наследственной предрасположенности к па­ил­лярному и фолликулярному раку щитовидной железы.// Российский онко­логи­чес­кий журнал. 2010, № 2, принята в печать.

Автор выражает глубокую признательность и благодарность проф. д.м.н. Р.Ф.Гарькавцевой, проф. д.м.н. В.Ю.Сельчуку, за постоянный интерес к данным исследованиям, за обсуждение результатов диссертацион­ной работы, критические замечания и большую помощь при подготовке рукописи.

Автор выражает искреннюю благодарность, д.б.н. Э.А. Браге, к.б.н. Ф.А. Амосенко, к.б.н. Т.А. Наседкиной, проф. д.м.н. Н.Ф. Белеву, проф. д.м.н. Д.В. Залетаеву, и всем коллегам, сот­руд­­ничество с которыми позволило осуществить эту работу.



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.