WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Генотипы штаммов yersinia pseudotuberculosis и их клиническое и диагностическое значение

На правах рукописи

КОКОРИНА

Галина Ивановна

ГЕНОТИПЫ ШТАММОВ YERSINIA PSEUDOTUBERCULOSIS

И ИХ КЛИНИЧЕСКОЕ И ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2012

Работа выполнена в Федеральном бюджетном учреждении науки «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Пастера»

Научный руководитель:

Заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук, профессор Ценева Галина Яковлевна

Официальные оппоненты:

Сбойчаков Виктор Борисович – доктор медицинских наук, профессор, ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, кафедра микробиологии, начальник кафедры.

Суворов Александр Николаевич – доктор медицинских наук, профессор, ФГБУ "НИИЭМ" Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук, отдел молекулярной микробиологии, руководитель отдела.

Ведущее учреждение: ФКУЗ Ростовский-на-Дону противочумный институт Роспотребнадзора.

Защита диссертации состоится 28 мая 2013 года в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 215.002.08 на базе ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации (194044, Санкт-Петербург, ул. Акад. Лебедева, дом 6).

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации.

Автореферат разослан «__» апреля 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук, профессор Митин Юрий Алексеевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Псевдотуберкулез остается актуальной проблемой здравоохранения в России и во многих странах мира. Заболевание отличают выраженный полиморфизм клинических проявлений, отсутствие четких патогномоничных симптомов, склонность к затяжному и хроническому течению. Между тем причины, обуславливающие данное многообразие и сложность патогенеза, остаются невыясненными.

Инфекционный процесс представляет собой ограниченное во времени сложное взаимодействие биологических систем микроорганизма и макроорганизма, протекающее в определенных условиях внешней среды. В этой связи чрезвычайно актуально изучение роли детерминант вирулентности Y. pseudotuberculosis, влияния их продуктов на течение инфекционного процесса и территориальное распространение бактерий.

В отдельных работах предприняты попытки объяснить разнообразие клинических форм псевдотуберкулеза за счет наличия у возбудителя тех или иных генетических детерминант вирулентности (Fukushima H. et al., 2001; Carniel E., 2001; Mollaret H., 1990; Чеснокова М.В. и соавт., 2006). Типичный для России симптомокомплекс псевдотуберкулеза получил название – дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка. Основные клинические симптомы инфекции, вызванной Y.pseudotuberculosis в России, Японии и Южной Корее разнообразнее и тяжелее, чем на Европейских территориях и характеризуются системными проявлениями болезни.

Открытие способности к синтезу суперантигена и установление его роли в патогенезе инфекции позволили пересмотреть механизм появления некоторых симптомов при псевдотуберкулезе. В настоящее время с продукцией Y. pseudotuberculosis суперантигена YPMa связывают такие иммунопатологические осложнения псевдотуберкулеза, как реактивный артрит, синдром Рейтера, острый увеит и синдром Кавасаки (Sato К. et al., 1983; Treacher D. et al., 1986; Baba K. et al., 1991).

Хорошо изучен «остров» высокой патогенности Y. pseudotuberculosis, ответственный за биосинтез и регуляцию системы утилизации железа. Считают, что он необходим для проявления высоковирулентного фенотипа возбудителя (Carniel E., 2001).

Особый интерес представляет плазмида с молекулярной массой 82 МДа (pVM82), обнаруживаемая до настоящего времени у штаммов Y..pseudotuberculosis серотипа О:1b только в России, и не встречающаяся у других представителей рода Yersinia. Доказано, что наличие плазмиды pVM82 у возбудителя способствует более тяжелому течению инфекции (Шурыгина И.А., 2007).

К настоящему времени выявлены особенности распространения штаммов Y..pseudotuberculosis, содержащих ypmA или «остров» высокой патогенности, cвязанные с географическими регионами (Fukushima H. et al. 2001).

Учитывая многообразие вариантов течения болезни, обусловленного различиями в патогенных свойствах возбудителя псевдотуберкулеза, для клинической практики актуально, прежде всего, изучение биологических характеристик штаммов Y. pseudotuberculosis циркулирующих на различных территориях. Вместе с тем, для оптимизации мониторинга за возбудителем, а также выбора тактики обследования больных требуются наиболее полные знания о влиянии возбудителя псевдотуберкулеза с различным набором генетических детерминант вирулентности на патогенез и совершенствование специфической диагностики инфекции.

Ограниченные возможности распознавания случаев заболевания иерсиниозами, в частности псевдотуберкулеза, на поздних сроках приводят к гиподиагностике, развитию хронических форм (до 30% случаев) и осложнений. Это обуславливает необходимость поиска новых более чувствительных методов этиологической диагностики заболевания.

В связи с изложенным, представлялось актуальным изучение генетических характеристик штаммов возбудителя псевдотуберкулеза и разработка набора для серологической диагностики иерсиниозов.

Степень разработанности темы исследования

До настоящего времени не определена последовательность нуклеотидов плазмиды Y. pseudotuberculosis pVM82, способствующей более тяжелому течению инфекции, не установлены гены плазмиды, оказывающие влияние на вирулентность бактерии. Методом дот-блот гибридизации не была исследована коллекция штаммов Y..pseudotuberculosis на наличие генов вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа и umuDC плазмиды pVM82, выделенных в разных регионах мира.

Ранее изучена коллекция штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на пяти континентах на наличие генетических детерминант вирулентности: генов суперантигена уpmА, уpmB и уpmC; HPI и R-HPI и pVM 46 МДа. При этом исследований на выявление плазмиды pVM82; YAPI и L-YAPI не проводилось. Фрагментарные сведения имеются относительно определения плазмиды pVM82, генов суперантигена и HPI у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на территории Сибири и Дальнего Востока. Штаммы из Северо-Западного региона, Украины на наличие генетических детерминант вирулентности не изучались.

При генотипировании штаммов Y. pseudotuberculosis по содержанию уpmА, уpmB и уpmC; HPI и R-HPI и pVM 46 МДа, выделенных на пяти континентах, охарактеризовано 6 генетических групп штаммов. Было установлено, что для территорий России (исследованы только дальневосточные штаммы), Японии и Кореи для штаммов Y..pseudotuberculosis характерно содержание уpmА и отсутствие HPI. В то же время для штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных на всех остальных территориях мира, главным образом, характерно содержание HPI и отсутствие уpmА, что свидетельствует о взаимосвязи наличия этих детерминант вирулентности с клиническими симптомами псевдотуберкулеза, различными для этих территорий. Описаны клинические проявления псевдотуберкулеза у больных, от которых выделены штаммы 2 (HPI+), 3 (ypmA+) и 5 (R-HPI+ ypmС+) генетических групп. В то же время по содержанию генов pVM82, YAPI и L-YAPI генотипирование не проводилось, хотя ранее было доказано, что наличие плазмиды pVM82 оказывает влияние на тяжесть течения псевдотуберкулеза.

Существующие отечественные препараты и тест-системы для диагностики иерсиниозов недостаточно эффективны, особенно при хроническом течении заболеваний. В мировой практике «золотым» стандартом серологической диагностики иерсиниозов признан метод иммуноблота. В настоящее время на основе этого метода существуют зарубежные наборы. В РФ до настоящего времени не разработана методика конструирования набора для определения антител классов А, М и G методом иммуноблота.

Цель исследования

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Y..pseudotuberculosis и совершенствование этиологической диагностики иерсиниозов.

Задачи работы:

  1. Изучить наличие генетических детерминант вирулентности у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных в различных географических регионах мира.
  2. Охарактеризовать генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis различного происхождения и их распространенность в разных регионах мира.
  3. Установить особенности клинического течения псевдотуберкулеза, вызванного штаммами Y. pseudotuberculosis различных генотипов.
  4. Разработать набор для серологической диагностики иерсиниозов.

Научная новизна:

С использованием метода дот-блот гибридизации у штаммов Y..pseudotuberculosis различного происхождения выявлена плазмида pVM82, несущая гены вирулентности, основные из них - гены icm/dot системы секреции IVB типа, опосредующие внутриклеточное персистирование микроорганизма в эпителиальных клетках, что может обуславливать скарлатиноподобные проявления заболевания.

Впервые изучена распространенность pVM82 у представителей мировой популяции Y. pseudotuberculosis.

На основании содержания основных генетических детерминант вирулентности: pVM82, генов суперантигена, YAPI и HPI выделено 14 генотипов штаммов Y. pseudotuberculosis. Показано распространение штаммов Y..pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран пяти континентов.

Установлено, что псевдотуберкулез с симптомами ДСЛ вызывают все штаммы Y. pseudotuberculosis, обладающие геном ypmA, кодирующим YPMa.

Получены новые знания о тяжести течения псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3a, 3b, 3c. Полученные данные могут свидетельствовать о более тяжелом течении инфекции, вызванной штаммами Y. pseudotuberculosis генотипов 3b (ypmA+L-YAPI+) и 3c (ypmA+L-YAPI+pVM82+), по сравнению с инфекцией, обусловленной штаммами Y..pseudotuberculosis генотипа 3a (ypmA+).

Практическая значимость работы:

Изученные российские штаммы Y. pseudotuberculosis и их характеристики представлены в коллекции лаборатории бактериальных капельных инфекций ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера, Санкт-Петербург.

Для повышения эффективности диагностики псевдотуберкулеза обоснованы показания к обследованию больных с симптомами острого аппендицита, мезентериального лимфаденита и гастроэнтеральными симптомами с целью выявления их инфицированности Y. pseudotuberculosis генотипов 2a и 2b, вызывающих инфекцию с абдоминальными проявлениями.

Для микробиологического мониторинга за возбудителем псевдотуберкулеза предложена методика генотипирования штаммов Y..pseudotuberculosis.

Разработана методика конструирования набора для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, A, и M в крови или плазме человека методом иммуноблота.

На основе результатов работы подготовлены следующие документы:

1. Методические рекомендации для эпидемиологов, инфекционистов, педиатров и микробиологов «Псевдотуберкулез и иерсиниоз» Г.Я. Ценева, Г.И. Кокорина, Е.А. Воскресенская и др. СПб, 2005. – 49 с.

2. Материалы диссертации представлены в монографии «Иерсинии и иерсиниозы» (Глава 8, «Современные возможности лабораторной диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза» Г.Я. Ценева, Г.И. Кокорина, Е.А. Воскресенская и др.) СПб.: ООО «Бастион», 2006. – 168 с.

3. СП 3.1.7.2615-10 «Профилактика иерсиниоза» М., 18 с.

4. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I». - № 2465319 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И.

5. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы Ia». - № 2465321 от 16.09.2011. – Авторы: Ценева Г.Я., Кокорина Г.И., Климов В.Т.

6. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы II». - № 2465317 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Чеснокова М.В.

7. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы IIa». - № 2465318 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Климов В.Т.

8. Материалы диссертации представлены в «Национальном руководстве по клинической лабораторной диагностике» (Раздел: «Иерсинии»), - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011.- 2т.

Методология и методы исследования

В соответствии с целью и задачами исследования был использован следующий материал и применены методы, представленные в таблице 1.

Таблица 1. Объем проведенных исследований различными методами

Методы Объем
  1. Бактериологический:
    1. Изучение характеристик циркулирующих штаммов Y. pseudotuberculosis
    2. Культивирование на питательных средах Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica
232 штамма 314 штаммов
  1. Молекулярно-генетический:
    1. Определение нуклеотидной последовательности плазмиды pVM 82 (секвенирование) методом «дробовика»
    2. Секвенирование участка генов ypm локуса Y. pseudotuberculosis
    3. Выделение тотальной ДНК методом фенол-хлороформной эсктракции
    4. Выделение плазмидной ДНК методом щелочной экстракции по Бирнбоу-Долли с модификацией
    5. Дот-блот гибридизация ДНК каждого штамма с 10-ю зондами
    6. ПЦР
1 плазмида 23 штамма 313 штаммов 1 штамм 2770 реакций 650 реакций
  1. Иммунологический:
    1. Определение уровня антител в сыворотках крови людей методами РА, РНГА, ИФА, иммуноблота
    2. Определение уровня антител в сыворотках крови иммунизированных животных методами РА, РНГА, ИФА, иммуноблота
241 ОСК 6 ОСК
  1. Экспериментальный: получение гипериммунных кроличьих иерсиниозных сывороток и сывороток на композицию рекомбинантных белков Yops
6 ОКС
  1. Анализ историй болезни
256 историй болезни
  1. Биоинформатические: - обработка данных с использованием компьютерных программ: BlastN – для сравнения исследуемой нуклеотидной последовательности с имеющимися в GenBank, Choice of Primers by the Octamer Frequency Disparity (OFD) Method – для выбора праймеров при постановке ПЦР;
TIGR Manatee system - сборка и аннотация генома плазмиды.

Для выполнения исследований использовано 309 штаммов Y..pseudotuberculosis: 232 из коллекции Национального Референс-центра по мониторингу за иерсиниозами и 77 штаммов из Коллекции Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера за период 1989 по 2008 гг. В работе использовано 4 референс-штамма, содержащие различные детерминанты вирулентности Y. pseudotuberculosis из Национального Yersinia референс-центра и Центра сотрудничества с ВОЗ Парижского института Пастера. Плазмида pVM82 выделена из штамма Y. pseudotuberculosis IP31758, изолированного от больного псевдотуберкулезом с типичными симптомами ДСЛ.

Для иммунизации кроликов использован охраноспособный штамм Y..enterocolitica O:3 КМ 174 (Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», Саратов), содержащий плазмиду pYV 46 MДа.

Выделение, идентификацию и культивирование микроорганизмов проводили в соответствии с Методическими рекомендациями «Псевдотуберкулез и иерсиниоз» № 11-3/8-09 (2005).

Серотипирование культур Y. pseudotuberculosis осуществляли в мультиплексной ПЦР с использованием специфичных праймеров по методике Bogdanovich T. (2003) или с применением набора коммерческих моновалентных сывороток (производства ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера) к серотипам Y. pseudotuberculosis О:1 и О:3 с помощью реакции агглютинации на стекле.

Выделение тотальной бактериальной ДНК осуществляли методом фенол-хлороформной экстракции (Carniel E., 1989).

Методом дот-блот гибридизации или ПЦР проведена детекция генов ypmB, ypmA/C, irp2, fyuA, pilPQ, api 74, yopM, yscQ, dot O, mucAB.

Для дот-блот гибридизации денатурированную ДНК штаммов наносили по 5 мкл на положительно заряженную нейлоновую мембрану (Hybond N+; Amersham, Англия), фиксировали, облучая ультрафиолетовыми лучами в течение 4 минут с использованием прибора GS Gene Linker UV Chamber (Bio Rad) в режиме C3. Зонды получали с помощью ранее известных (Carnoy C., 1999; Schubert S., 1998; Collyn F. 2004; Collyn F. 2005; Tsukano H., 1996) и сконструированных праймеров, синтезируя их методом ПЦР. Праймеры разработаны с помощью программы OFD Method и BlastN. Продукты амплификации были очищены от агарозы и примесей с помощью набора микроколонок QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen). Мечение продукта ПЦР пероксидазой и использование его в качестве комплементарного ДНК-зонда для гибридизации с фиксированными на мембране ДНК исследуемых штаммов осуществляли при 42 оС с помощью набора реагентов для мечения ECL (ECL Direct Nucleic Acid Labelling and Detection Systems; Amersham, Англия). Для выявления ДНК иерсиний, гибридизованных с зондами, мембрану обрабатывали с помощью набора реагентов ECL и экспонировали в течение 30 минут на светочувствительной пленке Hyperfilm ECL, помещенной в кассету.

ПЦР проводили в режиме автоматической амплификации на приборе PTC-100 (MJ Pesearch, Inc). Финальный объем реакционной смеси составил 50 мкл и содержал 1,25 U Taq ДНК полимеразы (Roche/Cetus) с прилагаемым буфером, MgCl2 в концентрации 2 мМ и по 200 мкМ каждого из четырех дезоксинуклеозид- трифосфатов. Все праймеры использовали в финальной концентрации 0,3 мкМ. ПЦР проводили по программе: 1 цикл 94 0С -3 мин; 30 циклов амплификации 94 0С - 30 сек, 55 0С – 1 мин, 72 0С – 2 мин; 72 0С – 10 мин. Продукты ПЦР разделяли методом электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием этидий бромидом и последующей визуализацией в ультрафиолетовом свете.

Проведено секвенирование генома плазмиды pVM82 по методике «дробовика» (работа проводилась в рамках совместного проекта с Институтом геномных исследований, (США)). Выделение плазмидной ДНК проводили методом щелочной экстракции ДНК по Бирнбоу-Долли с модификацией (Feliciello J., 1993). Плазмидную ДНК подвергали случайному дроблению (Nelson K.E., 1999), последовательность генома плазмиды была собрана используя Celera assembler (Huson D.H., 2001). Для аннотации генома использовали TIGR Manatee system.

Для секвенирования генов ypmA и ypmC проводили ПЦР со штаммами Y. pseudotuberculosis с использованием праймеров к гену ypmA. Продукт ПЦР очищали, применяя набор микроколонок QIAquick PCR purufication Kit (Qiagen). Секвенирование проводили, используя Big Dye terminator cycle sequencing FS Ready Reaction kit (Perkin-Elmer) и ABI Prism 310 genetic analyzer (Perkin-Elmer).

В ходе разработки тест системы получены гипериммунные сыворотки. Для этого штамм Y. enterocolitica O:3 культивировали 24 ч в мясопептонном бульоне, затем 24 ч на агаре Хоттингера (рН 7,2) при 28 оС, готовили взвесь бактерий в физиологическом растворе с концентрацией 109 кл/мл. Кроликам массой 2,5 - 3 кг вводили взвесь бактерий по схеме: под конъюнктиву - 0,1 мл, через 3 дня и далее вводили такую же дозу внутривенно трехкратно с интервалом 3 дня, через 7 дней - под конъюнктиву, через 3 дня однократно внутривенно. Также готовили гипериммунные сыворотки к комплексу рекомбинантных белков (Yops) YopM Y. enterocolitica, YopE Y. enterocolitica, YopH Y. enterocolitica, YopD Y. enterocolitica (Cat. No. #RPY003, #RPY004, #RPY005, #RPY006 «Omnio AB», Швеция). Кроликов иммунизировали по схеме: внутримышечно – 10 мкг двукратно с интервалом в 7 дней, внутрибрюшинно - 2,5 мкг через 14 дней, подкожно - 15 мкг через сутки, внутрибрюшинно двукратно по 15 мкг через 3 дня, внутривенно по 15 мкг через 4, 2, и 2 дня соответственно.

Электрофорез белков проводили по Laemmli (1970), с использованием камеры для вертикального электрофореза Mini-Protean Tetra Cell; Bio-Rad, США. Для переноса белков на НЦМ по Towbin H (1992) полусухим методом применяли аппарат Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell; Bio-Rad, США.

Для выявления антител к иерсиниям методом иммуноблота использован диагностический набор Иммуноблот (А), разработанный в ходе настоящего исследования.

В качестве препарата сравнения использован коммерческий набор (Иммуноблот (К)) «Иерсинии IgG Вестерн-блот» и «Иерсинии IgА Вестерн-блот» производства «Euroimmun», Германия.

Применяли РНГА с коммерческими эритроцитарными диагностикумами: псевдотуберкулезным и кишечноиерсиниозными О:3 и О:9 (НИИВС, Санкт-Петербург).

Для постановки РА использовали иерсиниозные корпускулярные антигены серотипов: Y. pseudotuberculosis серотипа О:1 и О:3, Y. enterocolitica серотипов О:3; О:5,27; О9 (ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера).

Для выявления иерсиниозных антител методом ИФА применены коммерческие тест-системы «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgA», «Иерсиниоз-ИФА-IgM» (ООО «Омникс», Санкт-Петербург), предназначенные для выявления антител классов A, M и G к белкам наружной мембраны иерсиний.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

  1. Для штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территории России и Японии, в сравнении со штаммами, выделенными на территории Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки характерно наличие различных генетических детерминант вирулентности (ypmA, ypmB, ypmС, HPI, R-HPI, YAPI, L-YAPI, pVM82).
  2. У штаммов Y. pseudotuberculosis охарактеризовано 14 генотипов:1a (HPI+ ypmA+), 2a (HPI+), 2b (HPI+L-YAPI+), 2c (HPI+YAPI+), 3a (ypmA+), 3b (ypmA+L-YAPI+), 3c (ypmA+L-YAPI+pVM82+), 3d (ypmA+ pVM82+), 4 (ypmB+), 5a (R-HPI+ ypmC+), 5b (R-HPI+ ypmC+L-YAPI+), 6a (HPI-ypm-YAPI-pVM82-), 6b (L-YAPI+), 6c (pVM82+). Установлена особенность распространенности штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов на территориях 25 стран мира пяти континентов.
  3. У больных псевдотуберкулезом, от которых выделены штаммы генотипов 3b и 3c достоверно чаще выявляются поражения печени, что утяжеляет течение болезни, по сравнению с пациентами, заболевание которых обусловлено Y. pseudotuberculosis генотипа 3a.
  4. Применение набора, разработанного для выявления специфических противоиерсиниозных иммуноглобулинов G, A, и M в образцах крови или плазмы человека методом иммуноблота, позволяет проводить этиологическую диагностику иерсиниозов, в том числе с хроническим течением. Чувствительность диагностического набора составляет 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.

Степень достоверности и апробация результатов:

Штаммы Y. pseudotuberculosis, использованные в работе выделены от больных, животных, с продуктов питания в ходе расследования вспышек псевдотуберкулеза, а также спорадических случаев заболевания и при текущем эпидемиологическом надзоре. Больные включены в исследование на основании лабораторного подтверждения диагноза иерсиниозной инфекции при отрицательных результатах обследования на другие инфекции вирусной и/или бактериальной этиологии, за исключением сопутствующих инвазий, а также при отсутствии соматической патологии.

Статистическая обработка данных проведена методами статистического анализа при помощи стандартных пакетов программ STATISTICA 6.0. Для оценки достоверности различий между несколькими группами наблюдений использованы методы дисперсионного анализа. Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента (t) и величины вероятности (p). За достоверность различий принимали значение р<0,05, вероятность различий составляла 95% и более.

По теме диссертации опубликованы: 18 работ, в том числе 4 – в изданиях, рекомендуемых ВАК, получено 4 патента.

Основные результаты исследований доложены и обсуждены на российских и международных конференциях в 2006 -2011 гг.: 22-24 марта 2006 г. СПб, Российская научно-практическая конференция, посвященная 110 –летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины»; 12-13 октября 2006 г. СПб, II Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями»; 11 апреля 2006 г. НИИЭМ им. Пастера, СПб, заседание общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в Санкт-Петербурге и Ленинградской области; 2-4 июня 2008 г. СПб, Четвертая международная конференция «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями»; 18-20 мая 2010 г. СПб, НИИЭМ им. Пастера, Международная конференция «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями»; 10-12 ноября 2010 г. СПб, НИИЭМ им. Пастера Семинар «Унификация лабораторных методов индикации и идентификации иерсиний и антител к ним»;24-25 ноября 2011 г. СПб, 8-я Северо-Западная научная гастроэнтерологическая сессия «Гастроэнтнрология. Гепатология. Колопроктология. Фармакотерапия. Питание.»; 12-15 октября 2011 г. СПб, Третья всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями».

Личный вклад автора

Основные результаты получены лично автором. Выделение штаммов проведено в Национальных Yersinia референс-центрах ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера и Парижского института Пастера, ГБОУ ВПО СПбГПМУ Минздрава России, ФГУЗ Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока и ЦГЭ Республики Карелия.

Исследования по генотипированию штаммов Y. pseudotuberculosis, секвенированию участков гена ypmA/C проведены автором на базе Парижского института Пастера и ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера в Санкт-Петербурге.

Микробиологические, серологические, экспериментальные исследования, систематизация и анализ полученных данных, статистический анализ данных проведен автором в лаборатории бактериальных инфекций ФБУН «Санкт-Петербургский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера».

Секвенирование плазмидой ДНК штамма Y. pseudotuberculosis проведено сотрудниками института геномных исследований, США, в рамках совместного проекта.

Структура и объем диссертации

Основной текст диссертации изложен на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, 3 глав собственных исследований, заключения, приложений.

Диссертация иллюстрирована 23 таблицами и 9 рисунками. Список литературы содержит 157 источников, в том числе 39 отечественных авторов и 118 источников зарубежных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Определение генетических детерминант вирулентности у штаммов Y..pseudotuberculosis, выделенных в различных географических регионах

Отсутствие данных о нуклеотидной последовательности генома плазмиды pVM82, обусловило проведение её секвенирования. Определены гены вирулентности плазмиды pVM82, кодирущей несколько факторов, которые могут играть роль в патогенности Y. pseudotuberculosis, основным из которых являются гены icm/dot системы секреции IVB типа (Segal G., 2005). icm/dot система секреции, ранее обнаруженная у Legionella pneumophila и Сoxiella burnetti, опосредует внутриклеточное персистирование микроорганизмов в эпителиальных клетках, является триггером для иммунной системы макроорганизма, и, соответственно, может вызывать скарлатиноподобные проявления заболевания (Wren B.W., 2003). Также плазмида несет оперон umuDC, гомологичный таковому у E. Coli, который придает бактерии устойчивость к ультрафиолетовым лучам, что способствует ее выживанию в окружающей среде (Penny J., 2009).

С помощью методов дот-блот гибридизации и ПЦР исследовано 309 штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на пяти континентах, на наличие генов плазмид pVM82 и pYV 46 МДа, а также хромосомных генов ypm суперантигена, HPI и YAPI. Невозможность дифференциации генов ypmA и ypmС методами дот-блот гибридизации или ПЦР из-за различий в их последовательностях друг от друга на один нуклеотид (Carnoy C., 1999) послужило предпосылкой к секвенированию участка генов ypmA/C 23 штаммов, выделенных на различных мировых территориях.

Среди представителей популяции возбудителя псевдотуберкулеза выявлены особенности циркуляции штаммов, содержащих разные генетические детерминанты вирулентности, cвязанные с географическими регионами мира. Данные представлены в таблице 2.

Показано, что в I группе штаммов (выделены на территориях России и Японии) доминируют изоляты серотипа О:1b, несущие ypmA – 95,5±1,4%, L-YAPI – 70±3,2%, а также содержащие плазмиду pVM82 – 58,5±3,4%.

У штаммов II группы (выделены на территориях Южной и Северной Америк, Африки, Австралии и стран Европы) напротив, вышеуказанные гены вирулентности встречаются довольно редко за исключением L-YAPI – 23,8±4%. Среди изолятов II группы превалируют штаммы серотипов О:1а и О:1b, обладающие HPI – 46,7±4,7% штаммов. Такие детерминанты вирулентности как

Таблица 2.Результаты определения генетических детерминант вирулентности

у штаммов Y. pseudotuberculosis, изолированных в различных странах мира.

Генетические детерминанты вирулентности Штаммы I группы, n=200 (Россия, Япония) Штаммы II группы, n=109 (Сев. и Юж. Америки, Африка, Австралия, Европа)
абс. %±m абс. %±m
ypmA 191 95,5±1,4 7 6,4±2,3
ypmВ - - - -
ypmC - - 10 9,1±2,7
HPI 12 6±1,6 51 46,7±4,7
R-HPI - - 10 9,1±2,7
YAPI - - 8 7,3±2,4
L-YAPI 140 70±3,2 26 23,8±4
pVM82 117 58,5±3,4 6 5,5±2,2

полный YAPI, ypmC, R-HPI у штаммов I группы не обнаружены, у штаммов II группы встречаются редко.

Генотипическая характеристика штаммов Y.pseudotuberculosis различного происхождения, выделенных в разных регионах мира

По результатам определения генетических детерминант вирулентности проведено внутривидовое типирование возбудителя псевдотуберкулеза. Все изученные штаммы Y. pseudotuberculosis разделены на генотипы, в соответствии с данными, опубликованными ранее (Fukushima Н., 2001 г.) и дополнены новыми подгруппами, выявленными в настоящем исследовании, за счет ранее не изученных маркеров: хромосомных генов YAPI и плазмиды pVM82. Учитывали содержание штаммами полного YAPI – по наличию генов pilPQ, api 74 и так называемого Left - YAPI (L-YAPI), состоящего из консервативной левой части, в которую входит pil локус; а также содержание полного HPI – по наличию генов irp2, fyuA и Right – HPI (R-HPI), с утраченной левой частью - по наличию гена irp2. В зависимости от содержания генетических детерминант вирулентности впервые выделены 14 генотипов: 1a(HPI + ypmA+), 2a (HPI +), 2b (HPI + L-YAPI+), 2c (HPI + YAPI+), 3a (ypmA+), 3b (ypmA+ L-YAPI+), 3c (ypmA+ L-YAPI+ pVM82+), 3d (ypmA+ L-YAPI+), 4 (ypmB+), 5a (R-HPI + ypmC+), 5b (R-HPI + ypmC+ L-YAPI+), 6a (HPI- ypm- YAPI- pVM82- ), 6b (L-YAPI+), 6c (pVM82+).

Анализ данных распределения штаммов Y. pseudotuberculosis из I и II групп по генотипам выявил различия в их распространенности в различных регионах мира, рисунок 1.

 Генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis Данные распределения-0

Генотипы штаммов Y. pseudotuberculosis

Рисунок 1 - Данные распределения штаммов Y..pseudotuberculosis из I и II групп по генотипам, (%).

Для территорий России и Японии характерно доминирование штаммов Y. pseudotuberculosis генотипов 3a, 3b и 3c – в 21±2,8%, 14,5±2,4% и 55±3,5% соответственно. Штаммы Y. pseudotuberculosis генотипа 1a обнаружены только на территории РФ в единичных случаях (1,5±0,8%), редко встречаются также штаммы генотипа 3d – в 3,5±1,2% случаев. Штаммы вышеперечисленных генотипов вызывают заболевания псевдотуберкулезом с симптомами ДСЛ. На территории остальных стран мира, где были выделены штаммы Y. pseudotuberculosis, напротив, распространены, главным образом, штаммы генотипов: 2a – в 29,3±4,3%; 2b в 10±2,8% и 2c в 7,4±2,5% случаев. Показано, что эти штаммы вызывают псевдотуберкулез с симптомами, характерными для европейских территорий: с гастроинтестинальными проявлениями, лихорадкой, мезаденитом, аппендицитом (Fukushima H., 2001). Так же для этих территорий характерно распространение штаммов возбудителя псевдотуберкулеза генотипов 6a и 6b - в 25,8±4,1 и 9,2±2,7% случаев, соответственно. Только у изолятов II группы определены генотипы 2c, 5a, 5b, 6a, 6b, 6c.

Штаммы 4 генотипа не обнаружены.

Наиболее углубленно изучены характеристики 196 штаммов, выделенных на территориях РФ. Данные распространения штаммов Y..pseudotuberculosis различных генотипов в регионах РФ в сравнении с данными распространения штаммов, выделенных на территории Европы (61 штамм), представлены на рисунке 2. Впервые показано, что на территориях Северо-Западного региона доминируют штаммы Y. pseudotuberculosis серотипа О:1b генотипа3c - в 87,8±5,1% случаев; Сибири - штаммы серотипа О:1b генотипа 3c, 3a и 3b – в 49,3±4,1%, 30±3,7%, и 19,9±3,3%, соответственно.

В Дальневосточном регионе, наряду со штаммами генотипа 3c (11,1±10,4% случаев), часто встречаются штаммы генотипов 3a (55,6±16,5% случаев) и 2a (33,3±15,7% случаев).

Рисунок 2 - Распределение штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов по территориям регионов РФ и Европы, (%).

При сравнении распространения российских и европейских штаммов различных генотипов видно, что на территории Европы широко циркулируют штаммы Y. pseudotuberculosis генотипов 2a, 2b, 6a и 6b – в 15±4,5%, 13±4,3%, 35±6,1% и 13±4,3% соответственно. Напротив, штаммы генотипов 3a и 3d, встречаются редко. Штаммы генотипов 5a, 5b и 6c обнаружены только на территории Европы.

От больных выделены штаммы Y. pseudotuberculosis генотипов 1a, 3a, 3b, 3c и 3d, рисунок 3. Среди них чаще выявлены штаммы генотипа 3c –в 60±3,8%

Рисунок 3 - Распределение штаммов Y. pseudotuberculosis различных генотипов по источникам выделения.

случаев; значительно реже 3a и 3b – в 16,3±2,8 и 17,6±2,9% соответственно. В то же время от одного больного из Северо-Западного региона выделен штамм генотипа 2b. Среди штаммов, выделенных из продуктов питания и от грызунов превалируют типичные для России штаммы генотипов 3a и 3c, но в то же время 40±12,6% штаммов, выделенных от грызунов имеют генотип 2a, что свидетельствует о циркуляции возбудителя псевдотуберкулеза данного генотипа на территориях РФ.

При ретроспективном расследовании 20 вспышек псевдотуберкулеза на территории Сибири (17 вспышек) и Северо-Западного региона РФ (3 вспышки) установлено, что на Северо-Западных территориях РФ и в Сибири наиболее эпидемически значимыми являются штаммы Y. pseudotuberculosis серотипа О:1b генотипа 3c. В ходе вспышек также выделены штаммы генотипов 1a, 3a, 3b, 3d, являющиеся типичными для России. В тоже время обнаружены нехарактерные штаммы бактерий генотипов 2a и 2b. Значимость штаммов этих генотипов в настоящее время, надо полагать, недооценена из-за недостаточного обследования пациентов, так как клинические симптомы псевдотуберкулеза, вызванного этими штаммами весьма близки к проявлениям ОКИ неустановленной этиологии. Наблюдение за генотипической характеристикой Y. pseudotuberculosis позволяет определить циркуляцию доминирующих генотипов и появление на определенной территории штаммов других генетических вариантов, что важно для выявления путей и факторов передачи возбудителя, своевременного выявления заболеваний псевдотуберкулезом при возможной смене генотипа возбудителя.

Характеристика псевдотуберкулезной инфекции, вызванной

Y. pseudotuberculosis различных генотипов

Проведен анализ 142 историй болезни пациентов, от которых были выделены исследованные штаммы. Установлено, что 60±3,8% случаев заболевания обусловлено штаммами генотипа 3c; 17,6±2,9% - генотипа 3b; 16,3±2,8% - генотипа 3a. При проведении сравнительного анализа клинических симптомов псевдотуберкулеза, вызванного штаммами указанных генотипов установлено, что все штаммы обуславливают проявление у пациентов тех или иных симптомов, характерных для ДСЛ: лихорадки, сыпи, симптома «перчаток» и/или «носков», симптома «малинового» языка, проявлений со стороны желудочно-кишечного тракта.

Установлено, что частота отдельных симптомов заболевания, вызванного штаммами разных генотипов существенно различалась. Повышение температуры тела выше 38,5 оС достоверно чаще наблюдалось у больных с заболеванием, обусловленным штаммами генотипов 3b и 3c по сравнению с аналогичной патологией, вызванной штаммами генотипа 3a (72,4±8,4%; 68,9±4,9% и 23,1±8,4%, соответственно); симптомы поражения верхних дыхательных путей достоверно реже наблюдались у больных, от которых выделены штаммы генотипа 3a, по сравнению с больными, от которых выделены штаммы генотипов 3b и 3c (53,8±9,9% и 79,3±7,6%; 80,5±4.2%, соответственно); частое вовлечение в патологический процесс печени, наблюдалось как у больных с заболеваниями, обусловленными штаммами генотипа 3b, так и генотипа 3c - 65.5±8,9%; 57,5±5,3%, по сравнению с пациентами от которых выделены штаммы генотипа 3a – в 7,7±5,3% случаев (р < 0,001). У больных с заболеванием, обусловленным штаммами генотипов 3b или 3c характерна тенденция к увеличению частоты поражения селезенки.

Разработка варианта тест-системы для диагностики иерсиниозов методом иммуноблота

В качестве антигена для нанесения на НЦМ применена композиция рекомбинантных белков (Yops) YopM Y. enterocolitica, YopE Y. enterocolitica, YopH Y. enterocolitica, YopD Y. enterocolitica (Cat. No. #RPY003, #RPY004, #RPY005, #RPY006 «Omnio AB», Швеция). Известно, что Yops встречаются только у патогенных иерсиний (Fukushima H., 1998; Cornelis G.R., 1989).

При разработке условий постановки метода исследован интервал концентраций композиции рекомбинантных белков от 10 мкг до 100 мкг на 1 карман ПААГ шириной 5 мм. Оптимальную концентрацию композиции рекомбинантных белков определяли визуально по наличие четких полос антигенов после окрашивания блотовых стрипов. Установлено, что минимальная концентрация, обеспечивающая достаточную чувствительность набора, составляет 12,5 мкг при внесении в карман ПААГ шириной 5 мм, и, соответственно, 162,5 мкг при внесении в карман шириной 65 мм. Использован 4% концентрирующий и 12% разделяющий ПААГ. После электрофореза белковые профили переносили на НЦМ. Мембрану разрезали на 26 блотовых стрипов. Для контроля переноса белков один стрип из каждой мембраны окрашивали амидо черным; один стрип в дальнейшем инкубировали с кроличьей сывороткой, содержащей суммарные антитела против Yops, и использовали его как контрольный шаблон, по 3 стрипа использовали на исследование одной сыворотки для поиска иммуноглобулинов А, М и G (всего исследовали 8 сывороток на стрипах НЦМ одной серии).

На этапе проведения ИФА определяли специфические антитела, представленные различными классами иммуноглобулинов (А, М и G) и направленные к отдельным антигенам иерсиний. В качестве конъюгатов применены пероксидазные конъюгаты моноклональных антител, направленных к эпитопам иммуноглобулинов человека классов A, M или G; ООО Полигност, Санкт-Петербург (в разведении 1:100 (по прилагаемой инструкции) и 1:50); и конъюгаты антител козы к иммуноглобулинам человека классов A, M и G со щелочной фосфатазой; Invitrogen, Новая Зеландия (в разведении 1:10000 и 1:15000 (по инструкции)). Оценка чувствительности конъюгатов проведена на этапе внесения субстратной смеси, визуально, по появлению четких полос окрашенного комплекса антитиген-антитело на блотовых стрипах. В опыте использован положительный в РНГА с эритроцитарным псевдотуберкулезным диагностикумом человеческий ОСК в титре 1/800. Определена высокая эффективность конъюгатов меченых фосфатазой, положительный результат получен при разведении сыворотки 1:51, тогда как при использовании пероксидазных конъюгатов 1:2,5. В дальнейших лабораторных исследованиях применены конъюгаты антител козы к иммуноглобулинам человека классов А, М и G меченые щелочной фосфатазой; Invitrogen в разведении 1:10000. Все ОСК исследованы в разведении 1:51. В качестве ХС применен раствор - Нитроголубой тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат; Invitrogen, Новая Зеландия. Исследования проведены по инструкции к ХС.

В предварительных опытах с исследованием гипериммунных ОСК кроликов, полученных при иммунизации живой культурой Y. enterocolitica O:3 и ОСК нормальной сыворотки кроликов, показана высокая диагностическая эффективность набора (ИФА проведен с конъюгатом антикроличьих суммарных иммуноглобулинов со щелочной фосфатазой; Invitrogen, Новая Зеландия).

Для оценки чувствительности и специфичности набора Иммуноблот (А) использовано 111 ОСК людей, содержащих специфические антитела по данным одной из реакций: РНГА, РА, ИФА или Иммуноблот (К); контрольной группой служили 42 ОСК, отрицательные по данным РНГА.

При оценке диагностической эффективности показано, что Иммуноблот (А) обладает высокой чувствительностью – 90,9±2,7% и высокой специфичностью – 95,2±3,3% по сравнению с ИФА, РА и РНГА. При оценке диагностической ценности набора в сравнении с импортным исследовано 46 ОСК. Установлено, что при исследовании положительных образцов в Иммуноблот (К), с учетом суммарного содержания антител классов G и А, совпадающие результаты с Иммуноблот (А) получены в 100%, с ИФА в 83,3% с РНГА в 50%, с РА 66,6%.

Выявлены существенные особенности оценки эффективности в использовании набора Иммуноблот (А) при исследовании материала от больных иерсиниозом с ОИ, ЗИ и пациентов с ХИ. Исследовано 89 ОСК от пациентов с ОИ (70 - от больных с диагнозом псевдотуберкулез, 19 - кишечный иерсиниоз); 4 от пациентов с ЗИ; 18 от пациентов с ХИ (9 с хроническим течением псевдотуберкулеза, 9 с хроническим течением кишечного иерсиниоза). Установлено, что при обследовании больных с ОИ и ЗИ (рисунок 4),

Рисунок 4 - Частота лабораторного подтверждения диагноза иерсиниоз различными методами среди пациентов с ОИ и ЗИ.

преимущество имеет Иммуноблот (А) (91,4±2,9% положительных результатов) перед РНГА и РА (82,7±3,9% и 83,9±3,8% положительных результатов соответственно).

При обследовании больных с ХИ частота обнаружения специфических антител в иммуноблоте достоверно превышает частоту обнаружения специфических антител по сравнению с другими методами (р < 0,001 по сравнению с ИФА и РНГА и р < 0,05 по сравнению с РА) и составляет 94,4±5,4% при суммарном определении иммуноглобулинов, рисунок 5. Наиболее часто определены IgG – 88,8±7,6%, IgA в 44,4±12%, IgМ обнаружены у одного пациента (5,5±5,5%).

Рисунок 5 - Частота лабораторного подтверждения диагноза иерсиниоз различными методами среди пациентов с ХИ.

Определение отдельных классов иммуноглобулинов дает дополнительные возможности для постановки правильного диагноза в сочетании с клиническими данными. Частота обнаружения специфических антител другими методами была существенно ниже Иммуноблот (А) (в РА составила 72,2±10,5%, ИФА 38,8±11,8% и РНГА 22,2±10% соответственно).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, при секвенировании плазмиды pVM82 определены гены, оказывающие влияние на проявления вирулентных свойств возбудителя псевдотуберкулеза, основные из них - гены icm/dot системы секреции IVB типа. Методом дот-блот гибридизации у штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружены гены вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа, umuDC.

Установлено, что у штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях России и Японии, преобладают хромосомные генетические детерминанты вирулентности - ypmA (95,5±1,4%), L-YAPI (70±3,2%) и плазмида pVM82 (58,5±3,4%). У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки наиболее часто выявлены HPI (46,7±4,7%) и L-YAPI (23,8±4%).

У штаммов Y. pseudotuberculosis различного географического происхождения определено 14 генотипов. На территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки широко распространены генотипы 2a (HPI+), 2b (HPI+ L-YAPI+) и 6a (HPI- ypm- YAPI- pVM82-), 6b (L-YAPI+). На территориях России, у изученных штаммов, выделенных из различных источников выявлено 7 генотипов, доминирующими являются генотипы 3a (ypmA+), 3b (ypmA+ L-YAPI+) и 3c (ypmA+ L-YAPI+ pVM82+). Обнаружение на территории России штаммов Y..pseudotuberculosis генотипов 2a и 2b обосновывает необходимость расширения групп больных для обследования на псевдотуберкулез, особенно из числа ОКИ.

При изучении клинических проявлений псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами 3а, 3b и 3с генотипов нами установлено, что симптомы, характерные для ДСЛ, наблюдались у больных всех 3-х групп. Штаммы генотипов 3b (ypmA+ L-YAPI+) и 3c (ypmA+ L-YAPI+ pVM82+) по сравнению со штаммами генотипа 3a (ypmA+) вызывают псевдотуберкулез, сопровождающийся более тяжелым течением заболевания, с вовлечением в патологический процесс печени и селезенки, с большей выраженностью симптомов интоксикации. Наличие у штаммов Y..pseudotuberculosis таких генетических детерминант вирулентности как L-YAPI и pVM82 способствует более тяжелому течению заболевания и требует дальнейшего изучения влияния каждого из них. Характерна тенденция более тяжелого течения псевдотуберкулеза, обусловленного штаммами Y..pseudotuberculosis генотипа 3c, содержащего все три генетические детерминанты вирулентности - ypmA+ L-YAPI+ pVM82+.

Нами сконструирован отечественный диагностический набор, состоящий из ингредиентов для иммуноферментного анализа на твердофазном носителе, предназначенный для качественного определения антител классов G, M и A человека к антигенам патогенных Yersinia в образцах сыворотки или плазмы крови методом Лайн-блота; разработана методика производства препарата, подобраны оптимальные условия проведения анализа и физико-химические параметры, обеспечивающие высокую чувствительность, специфичность набора и стандартность метода. Установлена высокая диагностическая эффективность препарата: чувствительность 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%. При обследовании больных с ХИ частота обнаружения специфических антител в иммуноблоте достоверно выше по сравнению с ИФА, РА, РНГА (р<0,001 по сравнению с ИФА и РНГА и р<0,05 по сравнению с РА).

Выводы

  1. Методом дот-блот гибридизации у штаммов Y. pseudotuberculosis обнаружены нуклеотидные последовательности плазмиды pVM82, несущей гены вирулентности icm/dot системы секреции IVB типа, umuDC.
  2. У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях России и Японии, наиболее часто выявлены хромосомные генетические детерминанты вирулентности: ypmA (95,5±1,4%), L-YAPI (70±3,2%) и плазмида pVM82 (58,5±3,4%). У штаммов Y. pseudotuberculosis, выделенных на территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки наиболее часто выявлены HPI (46,7±4,7 %) и L-YAPI (23,8±4 %).
  3. У штаммов Y. pseudotuberculosis различного географического происхождения охарактеризовано 14 генотипов. На территориях Европы, Северной и Южной Америк, Австралии и Африки широко распространены генотипы 2a (HPI+) - 29,3±4,3%, 2b (HPI+ L-YAPI+) - 10±2,8% и 6a (HPI- ypm- YAPI- pVM82-) - 25,8±4,1%, 6b (L-YAPI+) - 9,2±2,7%. На территориях России у изученных штаммов, выделенных их различных источников, выявлено 7 генотипов, доминирующими являются генотипы 3a (ypmA+) - 21±2,8%, 3b (ypmA+ L-YAPI+) - 14,5±2,4% и 3c (ypmA+ L-YAPI+ pVM82+) - 55±3,5%.
  4. На территориях России распространенность штаммов Y..pseudotuberculosis генотипов 2a и 2b (обуславливающих псевдотуберкулез с симптомами мезентериального лимфаденита, острого аппендицита и гастроинтестинальными проявлениями) составляет 6,1±1,7%.
  5. На территориях России от больных псевдотуберкулезом выделены штаммы Y. pseudotuberculosis генотипов 3c в 60±3,8% случаев, 3b в 17,6±2,9%, 3a в 16,3±2,8%. Установлена зависимость частоты развития поражений печени и тяжести течения болезни от генотипа возбудителя. Развитие поражений печени у больных достоверно чаще (p<0,001) в 65,5±8,9% и 57,5±5,3% случаев возникает под влиянием Y..pseudotuberculosis генотипов 3b и 3c по сравнению с Y..pseudotuberculosis генотипа 3a.
  6. Сконструирован отечественный диагностический набор, предназначенный для качественного определения специфических противоиерсиниозных атител G, M и A в сыворотке или плазме крови человека методом Лайн-блот для лабораторной диагностики иерсиниозов с острым и хроническим течением. Чувствительность диагностического набора 90,9±2,7%, специфичность 95,2±3,3%.

Практические рекомендации

  1. Для микробиологического мониторинга за псевдотуберкулезом с целью прогнозирования эпидемической ситуации рекомендуется определять основные генетические детерминанты вируленности (ypmA, ypmB, ypmC, YAPI, L-YAPI, HPI, R-HPI, pVM82, pYV 46 MДа) и определять генотипы у штаммов Y. pseudotuberculosis, циркулирующих на территории наблюдения, методом дот-блот гибридизации или ПЦР.
  2. С целью выявления заболевания, обусловленного штаммами Y..pseudotuberculosis генотипов 2a и 2b, рекомендуется проводить диагностические исследования на псевдотуберкулез у больных с симптомами мезентериального лимфаденита, острого аппендицита и гастроинтестинальными проявлениями.
  3. Для повышения эффективности этиологической диагностики иерсиниозов, особенно с хроническим течением заболевания, рекомендуется использовать диагностический набор для определения специфических противоиерсиниозных IgG, IgM или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Лайн-блота.

Перспективы дальнейшей разработки темы

В дальнейшем планируется продолжить изучение распространения штаммов Y. pseudotuberculosis на не исследованных территориях России с определением генотипа возбудителя псевдотуберкулеза. Необходимо проводить исследования для изучения влияния отдельных генетических детерминант вирулентности на клиническое течение болезни.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Кокорина, Г.И. Применение иммуноблота в диагностике затяжных форм иерсиниозов и изучении вопросов патогенеза (обзор литературы) / Г.И. Кокорина, О.А. Шендерович, Г.Я. Ценева // Журн. клин. лаб. диагностика. 2006. № 11. C. 4750.
  2. Кокорина, Г.И. Патотипы возбудителя псевдотуберкулеза и их значение в инфекционном процессе / Г.И. Кокорина [и др.] // Мат-лы Росс. научно-практ. конф., посвященной 100-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской Академии им. С.М. Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины». – СПб., 2006. – C. 154.
  3. Бургасова, О.А. К вопросу о поражении опорно-двигательного аппарата у больных иерсиниозами / О.А. Бургасова, Г.И. Кокорина, А.А. Яковлев // Мат-лы II-й Всеросс. научно-практ. конф. «Инфекции, обусловленные иерсиниями». – СПб., 2006. – C. 51.
  4. Ценева, Г.Я. Современные возможности лабораторной диагностики псевдотуберкулеза и иерсиниоза / Г.Я. Ценева [и др.] // В кн: Иерсинии и иерсиниозы: под ред. Г.Я. Ценевой. – СПб., 2006.- С. 85-163.
  5. Кокорина, Г.И. Сравнительная оценка вирулентности Y. pseudotuberculosis c разным набором факторов патогенности в опытах in vivo / Г.И. Кокорина, Г.Я. Ценева, Е.А. Воскресенская // Мат-лы II-й Всеросс. научно-практ. конф. «Инфекции, обусловленные иерсиниями». – СПб., 2006, – C. 85-86.
  6. Кокорина, Г.И. К вопросу о генетических маркерах патогенности Y. pseudotuberculosis, циркулирующих в различных географических зонах / Г.И. Кокорина [и др.] // Мат-лы II-й Всеросс. научно-практ. конф. «Инфекции, обусловленные иерсиниями». – СПб., 2006. – C. 87-88.
  7. Eppinger, M. The complete genome sequence of Yersinia pseudotuberculosis IP31758, the causative agent of Far East scarlet-like fever / M. Eppinger [et. al] // PLoS Genet. 2007. Vol. 3, № 8.e142 doi: 10.1371/0030142
  8. Кокорина, Г.И. Новое в диагностике затяжных форм иерсиниозных инфекций / Г.И. Кокорина, Г.Я. Ценева, О.А. Бургасова // Мат-лы IV межд. конф. «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями». – СПб.: ООО «БАСТИОН»,– 2008. – C. 95.
  9. Кокорина, Г.И. Распространение штаммов Yersinia pseudotuberculosis, содержащих плазмиду pVM82 MDa, в Украине и Северо-Западном регионе РФ / Г.И. Кокорина, Выдайко Н.Б. // Мат-лы межд. конф. «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». – СПб., 2010. – C. 99.
  10. Воскресенская, Е.А. Генетические особенности Yersinia pseudotuberculosis, клинические варианты течения псевдотуберкулезной инфекции и оптимизация ее диагностики / Е.А. Воскресенская [и др.] // Мат-лы межд. конф. «Развитие научных исследований и надзор за инфекционными заболеваниями». – СПб., 2010. – C. 92.
  11. Кокорина, Г.И. Разработка тест-системы для серодиагностики иерсиниозов методом иммуноблота / Г.И. Кокорина[и др.] // Эпидемиол. и инфекц. болезни. 2011. № 4. C. 1823.
  12. Шестакова, М.Д. Абдоминальная форма иерсиниозных инфекций у детей на современном этапе / М.Д. Шестакова, Е.А. Воскресенская, Г.И. Кокорина // Мат-лы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Гастроэнтерология. Гепатология. Колопроктология. Фармакотерапия. Питание». – СПб., 2011. – C. 42.
  13. Шестакова, М.Д. Острый аппендицит иерсиниозной этиологии у детей / М.Д. Шестакова, А.А. Денисова, Г.И. Кокорина // Мат-лы 8-й Северо-Западной научной гастроэнтерологической сессии «Гастроэнтерология. Гепатология. Колопроктология. Фармакотерапия. Питание». – СПб., 2011. – C. 43.
  14. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы I» № 2465319 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И.
  15. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы Ia» № 2465321 от 16.09.2011. – Авторы: Ценева Г.Я., Кокорина Г.И., Климов В.Т.
  16. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы II» № 2465317 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Чеснокова М.В.
  17. Патент на изобретение «Тест-штамм Yersinia pseudotuberculosis для дифференциации бактерий Yersinia pseudotuberculosis генетической группы IIa» № 2465318 от 16.09.2011. – Авторы: Кокорина Г.И., Воскресенская Е.А., Климов В.Т.
  18. Шестакова, М.Д. Абдоминальная форма иерсиниозов у детей и возможности лабораторной диагностики / М.Д. Шестакова [и др.] // Педиатрия. 2012. № 4. C. 3742.

Список сокращений:

ДСЛ – Дальневосточная скарлатиноподобная лихорадка

ЗИ – Затяжное течение иерсиниозов

Иммуноблот (А) - Авторский набор для определения IgG, IgM или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Лайн-блота

Иммуноблот (К) - Коммерческий набор для определения IgG или IgA к антигенам патогенных Yersinia методом Вестерн-блота

ИФА – Иммуноферментный анализ

НЦМ – Нитроцеллюлозная мембрана

ОИ – Острое течение иерсиниозов

ОСК – Образцы сыворотки крови

ПААГ – Полиакриламидный гель

ПЦР – Полимеразная цепная реакция

РА – Реакция агглютинации

РНГА – Реакция гемагглютинации

ТБР – Трис-HCl буферный раствор

ФСБ – Фосфатно-солевой буферный раствор

ХИ – Хроническое течение иерсиниозов

ХС – Хромогенный субстрат (нитроголубой тетразолий хлорид/5-бром-4-хлор-3-индолил-фосфат)

HPI – «Остров» высокой патогенности (High Pathogenicity Islаnd)

pVM82 – Плазмида с мол. массой 82 МДа

pYV 46 MДа – Плазмида вирулентности иерсиний (Plasmid associated with Yersinia virulence)

SDS – Додецилсульфат натрия (Sodium dodecyl sulfate)

Yops – Белки наружной мембраны иерсиний (Yersinia outer membrane proteins)

YAPI – Адгезивный «остров» патогенности иерсиний (Yersinia Adhesion Pathogenicity Island)

YPM – Суперантигенный токсин Y. pseudotuberculosis

ОТ АВТОРА

Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю - Галине Яковлевне Ценевой за помощь в организации и выполнении работы и благодарит сотрудников лаборатории бактериальных инфекций ФБУН НИИ им. Пастера за помощь и поддержку.

Автор благодарит сотрудников ФГУЗ «Иркутский НИПЧИ Сибири и Дальнего Востока» д.м.н. Чеснокову М.В. и к.м.н. Климова В.Т. за предоставление штаммов Y pseudotuberculosis, а также всех специалистов, предоставивших штаммы и ОКС для углубленного изучения.

Автор признателен руководителю Национального Yersinia референс-центра Парижского института Пастера Элизабет Карниэль за предоставление базы для выполнения ряда исследований и коллекции штаммов.

Автор благодарит сотрудников ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Куляшову Л.Б. и Мокроусова И.С. за ценные замечания по тексту диссертации.



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.