WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Комплексный анализ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников: молекулярно-генетические и фенотипические характеристики



На правах рукописи








Поспехова Наталья Ивановна






КОМПЛЕКСНЫЙ АНАЛИЗ наследственной формы рака молочной железы и/или яичников: Молекулярно-генетическиЕ и фенотипические ХАРАКТЕРИСТИКИ


03.02.07 генетика



Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Карпухин Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Мазуренко Наталья Николаевна

доктор биологических наук

Наседкина Татьяна Васильевна

доктор биологических наук, профессор

Залетаев Дмитрий Владимирович

Ведущая организация: Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится «___16_»____мая________ 2011 г. в _______часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Актуальность исследования.

В структуре онкологической заболеваемости лидирующее положение занимают опухоли органов женской репродуктивной системы. Наиболее распространенным онкологическим заболеванием является рак молочной железы (РМЖ). РМЖ занимает 1-е ранговое место (19,8%) в структуре онкологической заболеваемости среди женщин в России (Давыдов М.И. и Аксель Е.М., 2008). Рак яичников (РЯ) встречается реже и занимает 6-е ранговое место (4,9%) в структуре онкологической заболеваемости среди женщин. За пятилетний период 2001-2006 гг. отмечен заметный прирост заболеваемости опухолями яичников в России – на 5,8% (Давыдов М.И.и Аксель Е.М., 2008). Одновременно с ростом заболеваемости растёт и смертность от РМЖ и РЯ.

Самым распространённым онкологическим синдромом является наследственный рак молочной железы и/или яичников (НРМЖ/РЯ). Одним из достижений молекулярной генетики явилось картирование генов, ответственных за наследственную предрасположенность к НРМЖ/РЯ - генов BRCA1 и BRCA2. Герминальные мутации генов BRCA1/2 являются высокопенетрантными и приводят к 50-90% риску возникновения заболевания. Пенетрантность мутаций гена BRCA2 ниже в отношении опухолей яичника. Особенностью гена BRCA2 является повышенный риск возникновения рака молочной железы у мужчин – носителей мутации в этом гене. За прошедший после выделения генов период накоплена значительная информация о герминальных мутациях в генах BRCA1/2. Наблюдаются значительные различия в распределении мутаций в разных популяциях. В связи с этим, определение спектра мутаций в популяциях важно как с фундаментальной точки зрения, так и для решения практических задач медицинской генетики. Изучение характеристик мутаций на выборках из разных популяций позволяет получить научную информацию по возникновению и распространению мутаций, их связи с клиническими проявлениями. Особенности структуры генов предрасположенности дают информацию о взаимосвязи генотипа и фенотипа, важны для выяснения вариации риска возникновения рака в разных органах.

Рак молочной железы является наиболее частой онкопатологией при синдроме Ли-Фраумени, включающего также такие злокачественные новообразования, как мягкотканые саркомы, опухоли головного мозга, адренокортикальный рак и некоторые другие. Молекулярно-генетической основой в этом случае являются герминальные мутации в гене ТР53. Пенетрантность мутаций в гене ТР53 очень высока и достигает у женщин почти 100% за счёт значительного риска возникновения РМЖ в молодом (20-40 лет) возрасте. В тоже время, частоты мутаций в гене ТР53 в выборках РМЖ вне синдрома Ли-Фраумени недостаточно определены, и вклад ТР53-мутаций в развитие РМЖ молодого возраста не изучен.

Вместе с тем, мутации в известных генах не охватывают весь спектр семейного рака молочной железы. В связи с этим проводятся исследования по идентификации дополнительных генов. Имеются основания полагать, что наследственную предрасположенность к этому заболеванию могут обусловливать варианты в нескольких генах (полигены), приводящих в отдельности к невысокому риску, но с высокой частотой представленных в популяции. Такие генетические варианты могут действовать совместно, обеспечивая мультипликативный эффект в отношении риска развития рака.

Семьи с наследственной предрасположенностью, обусловленной наследованием BRCA-мутации, гетерогенны как по отягощенности раком молочной железы наряду с раком яичников, так и по числу пораженных заболеванием членов семьи. Эти характеристики семей могут определяться носительством мутации в одном из генов предрасположенности, свойством самой мутации, а также наследованием других низкопенетрантных генетических вариантов. Весьма актуальным является изучение генетических причин модификации риска возникновения РМЖ либо РЯ. Механизмом такой модификации может быть влияние аллелей других генов, продукт которых обладает изменённой функциональной активностью. Идентификация и выяснение роли вариантов известных генов является важной задачей. В качестве таких аллелей могут выступать полиморфные варианты в самих генах-супрессорах BRCA1 и BRCA2, ТР53, а также в генах, продукты которых функционально взаимодействуют с белками BRCA. Несмотря на наличие ряда работ в этом направлении, исследование данного вопроса нельзя признать достаточным. Выявление корреляции генотип-фенотип существенно для углубления понимания молекулярных механизмов действия генов-супрессоров в злокачественной трансформации клеток и важно для прогнозирования риска возникновения рака определенной локализации.

Возможности ранней диагностики РМЖ и РЯ в значительной степени не реализованы. Особенно это актуально для России, где до 40% первичных больных выявляется с III-IV стадиями заболевания. Обнаружение мутации в гене предрасположенности является объективным критерием для формирования групп риска в отношении развития рака той или иной локализации, такая информация необходима в практической онкологии для индивидуализации диагностической, лечебной и профилактической тактики. Более ранний возраст развития наследственного рака молочной железы и яичников, его значительная доля в структуре заболеваемости дополнительно акцентирует важность изучения генов, ассоциированных с риском развития РМЖ/РЯ, и практического использования полученных результатов. Создание алгоритма проведения ДНК-диагностики с учетом индивидуального и семейного анамнеза для выявления наследственной предрасположенности к раку молочной железы и яичников создает базу для медико-генетического консультирования на принципиально новой основе.

Цель исследования комплексный анализ молекулярно-генетических механизмов развития наследственной формы рака молочной железы и яичников и гетерогенности фенотипических характеристик наследственного рака.

Задачи исследования:

  1. изучить спектр, характеристики и частоты мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в генах BRCA1/2 у больных с наследственной формой рака молочной железы и яичников;
  2. изучить свойства конкретных повторяющихся мутаций в отношении развития рака определённой локализации;
  3. для выяснения происхождения мутаций определить гаплотипы гена, сцепленные с повторяющимися мутациями;
  4. изучить частоты BRCA1/2-мутаций в семьях, различных по структуре онкологической заболеваемости;
  5. среди BRCA1/2-негативных семей изучить мутации в других генах, ассоциированных с наследственной формой рака молочной железы и яичников;
  6. определить роль мутаций разных генов в формировании фенотипической гетерогенности рака молочной железы;
  7. изучить связь полиморфных вариантов генов с раком определённой локализации (яичники или молочная железа) при мутациях в гене BRCA1.

Научная новизна полученных результатов.

  • Впервые изучен спектр мутаций в гене BRCA1 на значительной выборке наследственного рака молочной железы и яичников в России. Показано, что частота мутации 5382insC в гене BRCA1 является наибольшей по сравнению с выборками из других популяций. На основании данных о высокой частоте (68%) мутации 5382insC в российской популяции, анализа частот её встречаемости в европейских и азиатских странах и результатов гаплотипирования гена BRCA1 по микросателлитным маркёрам обосновано вероятное происхождение мутации на территории России, связанное с эффектом основателя. Установлены особенности спектра мутаций в гене BRCA1 – наличие наиболее распространённых мутаций и низкая частота впервые выявленных вариантов. Мутации 2080delA и 4154delA в гене BRCA1 обладают специфическими свойствами, обусловливающими предрасположенность к развитию в основном рака яичников.
  • Впервые в России определён спектр мутаций в гене BRCA2, характеризующийся уникальностью мутаций и высокой частотой новых вариантов.
  • Впервые определены мутации в генах ТР53, CHEK2 и MLH1/MSH2/MSH6 среди больных РМЖ, имеющих в семейном анамнезе соответствующую синдромальную патологию. Показана существенная частота герминальных мутаций в гене ТР53 среди BRCA1-негативных больных очень молодого возраста.
  • Определены частоты мутаций в генах BRCA1/2 в семьях, различных по структуре онкологической заболеваемости. Установлено, что частоты BRCA1/2-мутаций различны среди семей с наследственным односторонним РМЖ, двухсторонним РМЖ и раком яичников. Часть семей с наследуемой BRCA1-мутацией характеризуются накоплением рака определенной локализации, вне зависимости от характеристик мутации.
  • Показано, что генотип 203А/A в гене BRCA2 и гаплотипы гена PGR ассоциированы с развитием РЯ или РМЖ у BRCA1-носителя; генотипы R72Р и P72P гена ТР53 ассоциированы с раком при мутации C61G в гене BRCA1.

Научно-практическая значимость работы.

В результате работы разработан и внедрён в клиническую практику алгоритм исследования генов, ассоциированных с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы и/или яичников. В ходе выполнения работы создан банк образцов ДНК больных РМЖ и/или РЯ и их родственников (n=1088); пациенты охарактеризованы по мутациям в генах BRCA1/2, ТР53, CHEK2, MLH1/MSH2/MSH6 и ряду полиморфных генетических вариантов. Выявлен спектр и частоты мутаций в генах предрасположенности при одно- и двухстороннем раке молочной железы, раке яичников, сочетанной формы заболевания, а также некоторых клинических формах РМЖ – РМЖ молодого возраста, РМЖ, ассоциированном с беременностью, РМЖ у мужчин; полученные результаты могут быть использованы для индивидуализации диагностики, лечения и профилактики с целью снижения заболеваемости и смертности.

Существенное значение для практической ДНК-диагностики наследственной предрасположенности имеет определение характеристик и частот мутаций в гене BRCA1. Особенность спектра мутаций в России заключается в преобладании пяти повторяющихся мутаций (5382insC, С61G, 185delAG, 4154delA, 2080delA), которые охватывают до 90% всего спектра. С наибольшей частотой (68%) встречается одна из этих мутаций - 5382insC. Редкие BRCA1-мутации встречаются преимущественно в определённом участке 11 экзона гена - с.3360-4215 п.н. Эти данные обеспечивают возможность проведения скрининговых исследований для определения наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ и формирования групп повышенного риска. Выявленные характеристики некоторых BRCA1-мутаций и идентификация генотипов повышенного риска рака яичников и рака молочной железы создают предпосылки для разработки способа идентификации предрасположенности к возникновению рака определённой локализации при наличии мутации в гене BRCA1.

Результаты исследования необходимы в службе медико-генетического консультирования пациентов с онкологически отягощенным анамнезом.



Основные положения, выносимые на защиту:

  1. В спектре мутаций в гене BRCA1 среди российских больных преобладают три мутации - 5382insC, C61G, 185delAG. С наибольшей частотой в группах наследственного РМЖ, наследственного двРМЖ и/или РЯ встречается мутация 5382insC.
  2. Спектр мутаций в гене BRCA2 характеризуется уникальностью мутаций.
  3. Семьи с раком молочной железы и яичников гетерогенны по частотам встречаемости мутаций в генах BRCA1/2. Частота BRCA1/2-мутаций наименьшая в семьях с наследственным односторонним РМЖ и наиболее высока семьях с раком яичников.
  4. Возникновение повторяющихся BRCA1-мутаций - 2080delA, 4154delA и 5382insC связано с эффектом основателя.
  5. Ранний возраст возникновения РМЖ в значительной степени обусловлен мутациями в генах BRCA1/2 и ТР53.
  6. Генотип 203А/A в гене BRCA2 и генотипы гена PGR, образованные двумя ОНП (G/T, rs1042838 и T/A, rs608995), ассоциированы с РМЖ или РЯ у BRCA1-носителя.

Апробация работы

Основные положения и результаты работы были представлены и обсуждены на российских и международных научно-практических конференциях и съездах: VII–IX, XII, XIII, XIV Российских Онкологических Конгрессах (Москва, 2003–2005; 2008-2010 гг.), III–V Съездах Онкологов и Радиологов стран СНГ (Минск, 2004; Баку, 2006, Ташкент 2008), V-VI Съездах Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005; Ростов, 2010), 10th International Congress Of Human Genetics (Вена, 2001); Всероссийской научно-практической конференции «Молекулярные методы диагностики моногенных заболеваний: возможности и перспективы» (Москва 2006); 4 Российской конференции по фундаментальной онкологии (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); I–II Российских Интернациональных симпозиумах «Молекулярно-генетическая диагностика злокачественных опухолей человека», Москва 2005; 2009), European Human Genetics Conferences 2001-2009 (Бирмингем; Mюнхен; Прага; Амстердам; Барселона; Вена), 14th General Meeting of the Breast Cancer Linkage Consortium (Мадрид, 2003); Familial Cancer Conference (Мадрид 2004; 2008); 3 съезде Всероссийского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004); Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (Новосибирск, 2008); IMPAKT Breast Cancer Conference (Брюссель, 2009); 7-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009).

Работа апробирована и рекомендована к защите на заседании научного семинара МГНЦ РАМН 1 ноября 2010 года.

Личное участие диссертанта.

Все использованные в работе данные получены при непосредственном участии автора: на этапах постановки цели и задач, разработки методов и их выполнения, проведения исследований, обработки, анализа и обобщения полученных результатов, написания и оформления рукописи.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, из них 18 – в журналах, рекомендуемых ВАК МОН РФ для опубликования основных научных результатов диссертации на соискание учёной степени доктора наук.

Структура и объём работы.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов, результатов исследований и обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Диссертация изложена на 260 страницах машинописного текста, содержит 41 рисунок и 56 таблиц. Список цитируемой литературы включает 406 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Пациенты.

Критерием отбора при семейном раке молочной железы и яичников было наличие у пробанда одного или более родственников I/II степени родства, страдающего каким-либо из указанных заболеваний. Сбор образцов крови пациентов, в основном из Москвы и Центрального региона России, и выяснение индивидуального и семейного анамнеза осуществлялся в Российском Онкологическом Научном Центре им. Блохина сотрудниками лаборатории онкологической генетики (руководитель лаборатории д.м.н. Л.Н. Любченко).

В работе исследованы разные выборки больных РМЖ и/или РЯ, подробные характеристики которых приведены в табл. 1.

Табл. 1. Исследованные выборки пациентов.

№№ Характеристика выборки Размер выборки, человек
1 пациенты с наследственной формой РМЖ/РЯ, из них: 224
- больные РМЖ 122
- больные двРМЖ 44
- больные РЯ 29
- больные РМЖ и РЯ 29

2 пациенты с диагнозом РЯ (неотобранная выборка РЯ) 101

3 пациенты с диагнозом РМЖ (спорадический РМЖ) 122

4 пациенты с ранней манифестацией РМЖ (возраст диагноза до 31 года) 22

5 пациенты с диагнозом РМЖ на фоне беременности (РМЖ-АБ) 88

6 пациенты молодого возраста с диагнозом РМЖ, не связанного с беременностью 90

7 пациенты с листовидной опухолью молочной железы 7

8 мужчины с диагнозом РМЖ 8

9 контрольная группа онкологически здоровых женщин, семьи которых не отягощены РМЖ и РЯ 120

10 ДНК-диагностика 426

Всего 1208

2. Анализ первичной структуры генов.

Определение мутантных фрагментов ДНК генов BRCA1, BRCA2, TP53, MLH1, MSH2, MSH6, CHEK2 проводили с помощью электрофоретического метода с последующим подтверждением наличия мутации и выявлением ее характеристик путем секвенирования.

При выполнении указанной схемы проводили следующие процедуры: выделение ДНК из образцов крови пациентов; амплификацию экзонов изучаемых генов; электрофоретический анализ продуктов амплификации; секвенирование фрагментов ДНК, идентифицированных в качестве мутантных.

Выделение ДНК. ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови пациентов. Выделение ДНК проводили стандартным методом фенол-хлороформой экстракции.

Полимеразная цепная реакция. При проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР) был использован набор синтезированных праймеров (“Синтол”, Россия), обеспечивающих амплификацию экзонов с примыкающими частями интронов (50-100 п.н.). Были определены оптимальные условия ПЦР, экспериментально отработанные для всех синтезированных праймеров, такие как температура отжига, параметры циклов амплификации, состав буфера. Вследствие больших размеров 11 экзон BRCA1 был разбит на 18 более коротких фрагментов, 10 и 11 экзоны BRCA2 – на 5 и 15 фрагментов.

После завершения ПЦР проверяли качество реакции, осуществляя электрофорез продуктов амплификации в 1,8% агарозном геле. Электрофорез проводили в горизонтальном аппарате для электрофореза SUB CELL 96 BIO-RAD (США) при постоянной силе тока 130 мА в течение 15 мин. Амплифицированные фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и анализировали на трансиллюминаторе Whatman-Biometra TL-3 в ультрафиолетовом свете.

После амплификации пробы инкубировали при 68,0 оС в течение 50 мин для образования гетеродуплексов.

Электрофорез. Для электрофоретического определения мутантных фрагментов ДНК был использован конформационно - чувствительный гель электрофорез (Conformation Sensitive Gel Electrophoresis - CSGE), обладающий высокой чувствительностью и универсальностью. Разделение гомо- и гетеродуплексов происходит за счёт конформационных различий, которые возникают при добавлении в гель денатурирующих растворителей. Основными преимуществами используемого метода являются независимость от природы исследуемого фрагмента ДНК и его высокая чувствительность. То есть, исследование фрагментов ДНК разной длины и разного нуклеотидного состава можно проводить в одних и тех же условиях.

Основная работа по определению мутаций в генах проводилась с использованием гелей большой протяженности на аппаратах для секвенирования (Macrophor).

В работе были использованы следующие параметры электрофореза: состав геля: 10% полиакриламид, 10% этиленгликоль, 15% формамид в 1-кратном ТТЕ буфере; толщина геля 0,8 мм. Электрофорез проводили при 550 В в течение 24 часов.

Часть работы проводилась с использованием коротких гелей на стандартных аппаратах для электрофореза VE-3 (Хеликон). Найдены условия, позволяющие достигать в коротком геле необходимой чувствительности для разделения гомо- и гетеродуплексов.

Метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК - SSCP. В ряде случаев использовали метод SSCP. Cостав геля: 6%- или 10% акриламид, метилен-бис-акриламид (соотношение акриламида и метилен-бис-акриламида 39:1), ТBЕ буфер (рН 8,9). Толщина геля 0,8 мм. Электрофорез проводили при 120-280 В в течение 6-16 часов (в зависимости от размеров фрагмента).

Окраска геля. Окрашивание геля проводилась методом серебрения, в некоторых случаях использовали окрашивание бромистым этидием.

ПЦР в реальном времени. ПЦР-РВ проводили на термоциклере Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Australia) в 25 мкл реакционной смеси. Состав реакционной смеси: по 0,25 мкМ каждого оригинального праймера; по 200 мкМ нуклеозидтрифосфата; 1,0 единица активности Тaq-полимеразы (СибЭнзим, Россия); буфер для ПЦР (670 мМ трис pH 8,4, 166 мМ сульфата аммония, 20 мМ MgCl2 и 100 мМ - меркаптоэтанол); интеркалирующий краситель SYBR Green1 0,1 мкл (100x). Оптимальные условия для проведения ПЦР были подобраны экспериментально.

Для вычисления числа копий использовали сравнительный дельта-дельта-Сt метод, который позволяет трансформировать значения Сt в относительное количество ДНК и таким образом сравнить число копий определяемого гена и гена сравнения. При этом единице соответствует диплоидное число копий ДНК, а значению 0,5 – вдвое уменьшенное количество копий (гетерозиготная делеция).

Анализ полиморфизма R72P в гене ТР53. ОНП R72P (rs1042522) в 4 экзоне гена проводили с помощью ПЦР геномной ДНК с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов (RFLP). Полученный фрагмент ДНК длиной 152 п.н. подвергали рестрикции с помощью фермента BstFN1 (Fermentas) при 60о в течение ночи. Аллель R72 имеет длины 50 и 102 п.н., редкий аллель 72Р – 152 п.н. Разделение фрагментов проводили при помощи электрофореза в 8% акриламидном геле.

Анализ полиморфизма Int3dup16 в гене ТР53. Изучение варианта Int3dup16 в 3 интроне гена проводили с помощью ПЦР фрагмента ДНК, включающего 3-4 экзоны и короткий 3 интрон гена. Длина разных аллелей гена отличается на 16 нуклеотидов. Анализ проводили при помощи электрофореза в 8% акриламидном геле.

Анализ полиморфизма V660L в гене PGR. ОНП V660L в 4 экзоне гена проводили с помощью PCR геномной ДНК с последующим анализом длины рестрикционных фрагментов (RFLP). Полученный фрагмент ДНК длиной 306 п.н. подвергали рестрикции с помощью фермента BsrI (Fermentas) при 65о в течение ночи. После рестрикции аллель V660 характеризуется 4 фрагментами длиной 47, 22, 157 и 80 п.н., редкий аллель 660L – 3 фрагментами: 47, 179 и 80 п.н. Разделение фрагментов проводили при помощи электрофореза в 8% акриламидном геле.

Анализ полиморфизма 3 (rs608995) в гене PGR. Анализ 3 ОНП проводили с помощью ПЦР геномной ДНК. Для анализа продуктов ПЦР использовали метод SSCP.

Анализ гаплотипов гена BRCA1 по микросателлитным маркёрам. Гаплотипы гена определяли по 5 микросателлитным маркёрам, локализованных на хромосоме 17q внутри гена или близлежащих локусах. От центромере к теломере маркёры расположены в следующем порядке: D17S1320, D17S855, D17S1322, D17S1323, D17S1325 (National Center for Biotechnology Information (NCBI) Database, ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov). Праймеры для амплификации фрагментов ДНК получены из базы NCBI. ПЦР проводили по стандартной схеме с добавлением в буфер 4% ДМСО. Для анализа длины аллелей использовали электрофорез в 8% полиакриламидном геле. Пробег красителя (ксиленцианол) составлял не менее 40 см.

Секвенирование. Очистку амплифицированной ДНК для секвенирования проводили с помощью наборов Wizard (Promega, США). Секвенирование проводилось при помощи автоматического секвенатора совместно с сотрудниками Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта РАН. Анализ результатов секвенирования осуществляли с помощью программ Chromas и BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast).

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку результатов проводили с использованием критерия 2 на основе четырехклеточных таблиц. При необходимости был использован точный критерий Фишера. Статистический анализ выполняли с помощью стандартного пакета «Statistica» (версия 6.0, «Statsoft Inc.», США).


РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ


  1. Герминальные мутации в генах-супрессорах, ассоциированные с РМЖ и/или РЯ

В настоящее время известно, что наследственная предрасположенность к РМЖ и/или РЯ в значительной части обусловлена наследуемыми мутациями в генах, в основном являющихся генами-супрессорами опухолевого роста. В большинстве случаев наследственная предрасположенность к РМЖ и РЯ связана с мутациями в двух высокопенетрантных генах-супрессорах - BRCA1 и BRCA2. Некоторая часть заболеваний обусловлена мутациями в других генах – TP53, MLH1/MSH2/MSH6, CHEK2 и др. Несмотря на значительные усилия многочисленных исследовательских групп, некоторая доля даже очень высокоотягощённых РМЖ/РЯ-семей не имеет охарактеризованной молекулярно-генетической патологии. В работе на выборке больных, наблюдавшихся в РОНЦ им. Н.Н. Блохина, проведена оценка частот и характеристик герминальных мутаций в генах (BRCA1, BRCA2, TP53, MLH1, MSH2, MSH6, CHEK2), ассоциированных с наследственной предрасположенностью к РМЖ и/или РЯ.

Молекулярно-генетический анализ генов BRCA1 и BRCA2 проведён для 224 больных с наследственной формой РМЖ и/или РЯ. Идентифицировано 104 пациента (46,4%) с мутацией в одном из генов. В гене BRCA1 обнаружено 93 мутации (13 различных – табл. 2), в гене BRCA2 - 11 мутаций (10 различных – табл. 3).

Одиннадцать мутаций из 13 являются мутациями со сдвигом рамки считывания в результате делеции или вставки 1, 2 или 5 нуклеотидов. Вследствие образования преждевременного стоп-кодона синтезируется укороченный нефункциональный белок, теряющий свои свойства в отношении супрессии опухоли. Миссенс-мутация C61G локализуется в высококонсервативном участке ДНК. Кодируемый им участок RING домена BRCA1 содержит консервативные Zn2+-связывающие цистеиновые остатки (С3GС4), критические для димеризации белка с BARD1. Мутация C61G приводит к потере убиквитин-лигазной активности белка и вызывает радиочувствительность к радиации (Brzovik P. et al., 2001; Ruffner H. et al., 2001). Была обнаружена также мутация с делецией 14-17 экзонов гена BRCA1 – обозначенная нами, как exon14-17del. Первоначально была выявлена потеря гетерозиготности полиморфного гаплотипа гена в 15 и 16 экзонах гена. С помощью ПЦР в режиме реального времени обнаружена делеция одного аллеля, включающая 14-17 экзоны. Делеция подтверждена ПЦР с помощью найденных окаймляющих её праймеров. Три мутации - 2297delT, 3366del5 и exon14-17del (3,2%) не описаны в Международной базе данных BIC database (Breast Cancer Information Core Database) для каких-либо других популяций и являются новыми, впервые выявленными в российской выборке больных.

Табл. 2. Спектр мутаций в гене BRCA1.

экзон название мутации используемое в тексте название число пациентов
ДНК белок
2 c.185delAG p.Glu23fsX39 185delAG 7
5 c.300T/G p.Cys61Gly C61G 8
11 c.2297delT p.Leu726fsX735 2297delT 1
11 c.2080insA p.Lys654fsX 672 2080insA 1
11 c.2080delA p.Lys654fsX700 2080delA 3
11 c.3366_3370del5 p.Met1083fsX1084 3366del5 1
11 c.3411_12delCT p.Leu1098fsX1101 3411delCT 1
11 c.3448insA p.Lys1110fsX1114 3448insA 1
11 c.3747insA p.Glu1210fsX1219 3747insA 1
11 c.3819_3823del5 p.Val1234fsX1241 3819del5 1
11 c.4154delA p.Glu1345fsX1365 4154delA 3
20 c.5382insC p.Gln1756fsX1829 5382insC 64
14-17 exon14-17del ? exon14-17del 1

жирным шрифтом выделены мутации, не значащиеся в базе данных BIC.

В гене BRCA2 идентифицировано 10 различных мутаций (табл.3): 6 различных мутаций со сдвигом рамки считывания, 3 различных нонсенс-варианта и 1 мутация сплайсинга - P3039P.

Табл. 3. Спектр мутаций в гене BRCA2.

экзон название мутации используемое в тексте название число пациентов
ДНК белок
8 c.886_887delGT p.Val220fsX223 886delGT 1
10 с.1642С/T p.Gln472X Q472X 1
10 c.2001_2004delTTAT p.Ile591fsX612 2001del4 1
11 c.3295insT p.Asn1023fsX1023 3295insT 1
11 c.6174delT p.Ser1982fsX2003 6174delT 2
11 c.6352C/T p.Gln2042X Q2042X 1
21 с.8908C/T p. Gln2894X Q2894X 1
23 c.9345G/A p.Pro3039Pro P3039P 1
25 c.9498delC p.Fhe3090fsX3103 9498delC 1
25 c.9643delTTT delPhe F3090del 1

жирным шрифтом выделены мутации, не значащиеся в базе данных BIC.

В случае мутации P3039P вследствие нуклеотидной замены гуанина на аденин в последней позиции 23 экзона происходит разрушение донорского участка сплайсинга. Среди BRCA2-мутаций четыре (40%) - 3295insT, Q2894X, 9498delC и F3090del не описаны в базе данных BIC.


  1. Частота мутаций в генах BRCA1/2

В зависимости от локализации опухоли пробанды были разделены на 4 группы: больные раком молочной железы - РМЖ (n=122), больные двухсторонним раком молочной железы - двРМЖ (n=44), больные раком яичников - РЯ (n=29) и больные с обеими опухолями - РМЖ+РЯ (n=29). Частоты мутаций изучали отдельно для каждой группы.

Наследственный РМЖ. Среди 122 семейно-отягощенных больных РМЖ выявлено 39 (32%) носителей герминальной мутации в генах BRCA1/2, из них 33 (27%) человека имели мутацию в гене BRCA1 и 6 (5%) - в гене BRCA2. Доля мутаций в гене BRCA1 составила 84,6% (33/39). Спектр выявленных изменений в гене BRCA1 характеризуется преобладанием одной частой мутации в 20 экзоне - 5382insC. Её частота составила 84,8% от всех BRCA1-мутаций (28 из 33). Дважды повторялись мутации 185delAG и C61G, в одной семье обнаружена делеция 5 нуклеотидов в 11 экзоне гена - 3819del5. BRCA2-мутации были уникальными: 2001delTTAT, Q472X, Q2894X, 6174delT, 3295insT и F3090del. Спектр BRCA1-мутаций представлен на рис. 1а.

Двухсторонний РМЖ. Другую группу больных наследственным раком составили 44 пациентки, страдающих двухсторонним поражением молочной железы – группа двРМЖ. Мутации выявлены в 23 случаях (52,3%): 19 BRCA1 (43,2%) и 4 BRCA2 (9,1%). Доля мутаций в гене BRCA1 составила 82,6% (19/23). В спектре BRCA1-вариантов по сравнению с группой РМЖ доля мутации 5382insC (12/19; 63%) численно меньше, но различие статистически незначимо (Р=0,07). Дважды повторялись мутации 185delAG и C61G. Уникальными явились мутации 4154delA, 3411delCT, 3747insA, а также все 4 BRCA2-варианта: Q2042X, 886delGT, 9498delC, P3039P. Спектр BRCA1-мутаций представлен на рис. 1б.

Наследственный РЯ. Среди 29 семейно-отягощенных больных РЯ выявлено 20 носителей герминальной мутации в гене BRCA1. Мутаций в гене BRCA2 не обнаружено. Частота BRCA1-мутаций среди таких больных составила 69%. Спектр выявленных изменений в гене BRCA1 подобен, но не идентичен таковому среди больных с РМЖ: наиболее частой (50%) является мутация 5382insC, также повторяются 185delAG, C61G. Выявлены другие повторяющиеся мутации - 2080delA и 4154delA. Уникальными являются мутации 2080insA (11 экзон гена) и exon14-17del (Рис.1в).

Наследственный РМЖ+РЯ. Анализ генов BRCA1/2 проведён для 29 семейно-отягощенных больных, страдающих и РМЖ и РЯ. В 75,9% (22/29) случаев мутация была обнаружена. Только у одной больной изменение касалось гена BRCA2 (6174delT), 21 человек имел мутацию в BRCA1. Среди пациентов было 6 человек с диагнозом двухсторонний РМЖ и РЯ (двРМЖ+РЯ) – у всех мутация была идентифицирована (5 BRCA1 и 1 BRCA2). Спектр выявленных BRCA1-вариантов также характеризуется наиболее частой мутацией 5382insC (65%), встречаются 185delAG, C61G и 2080delA. Уникальными являются мутации 2297delT, 3448insA и 3366del5 (Рис. 1г).

АБ

ВГ


Рис. 1. Спектр мутаций в гене BRCA1

Сравнение частот мутаций в разных группах больных. Встречаемость BRCA1/2-мутаций варьировала в разных группах больных, составляя от 32% в группе РМЖ до 75,9% в группе РМЖ+РЯ (табл. 4). Различия в частотах мутаций во всех группах по сравнению с группой РМЖ статистически значимы.

Полученные частоты относятся к наиболее высоким значениям по сравнению с данными, полученными в других странах (Meindl A. et al., 2002; Bergman A. et al., 2005; Weitzel J.N. et al., 2005; Nanda R. et al., 2005). Для славянских популяций характерны следующие частоты. В Польше мутации были найдены в 67% высокоотягощенных семей (Ratajska M. et al., 2008). В Словении частота BRCA-мутаций в семьях, отобранных по менее жестким критериям, составила 39%, а среди семей с РЯ – 52% (Krajc M. et al., 2008). В Чехии частота мутаций в выборке семей с РМЖ составила 23,3%, а среди семей с РМЖ/РЯ – 59,4% (Pohlreich P. et al., 2005). Частота мутаций генов BRCA среди больных с двРМЖ в нашем исследовании составила 52,3%, что соответствует данным, полученных другими авторами (Rogozinska-Szczepka J. et al., 2004; Gershoni-Baruch R. et al., 1999).

Табл. 4. Количество и частота (%) BRCA1/2-мутаций в различных группах больных.

РМЖ n=122 двРМЖ n=44 РЯ n=29 РМЖ+ РЯ n=29
Число мутаций % Число мутаций % Число мутаций % Число мутаций %
мутации BRCA1 33 27 19 43,2 20 69 21 72,4
мутации BRCA2 6 5 4 9,1 - - 1 3,5
всего 39 32 23* p=0,017 52,3 20* p=0,0002 69 22* p=0,0000 75,9

* - статистически значимые различия

Вместе с тем, частоты мутаций варьируют и внутри групп больных, в зависимости от накопления случаев онкологических заболеваний в семье. Изучение частот мутаций среди больных РМЖ с разным числом поражённых родственников показало, что наибольшая частота мутаций наблюдается среди больных, в семье которых был диагностирован хотя бы один случай рака яичников (р=0,012 по сравнению с остальными семьями). Было отмечено также, что мутации чаще обнаруживаются у больных с 3 и более родственниками, страдающих РМЖ (т.е. в семье 4 и более случаев рака молочной железы). Это наиболее выражено в отношении гена BRCA2. При анализе частоты BRCA1-мутаций среди больных РЯ с разной семейной отягощённостью показано увеличение этого показателя с ростом числа больных РЯ в семье.

Таким образом, наблюдается взаимосвязь частоты мутаций с количеством больных в семье; при этом РЯ наиболее значим как показатель носительства мутации в BRCA1, а значительное число случаев РЯ в семье почти всегда обусловлено мутацией в этом гене. Накопление случаев только РМЖ примерно в 30% связано с наличием мутации либо в BRCA1, либо в BRCA2. Наличие значительного количества случаев семейного РМЖ/РЯ без BRCA-мутаций может объясняться иным механизмом инактивации BRCA-генов или свидетельствует об ассоциации заболевания с молекулярной патологией в других генах.

Вместе с тем, различается соотношение числа мутаций в BRCA1 и в BRCA2 среди пациентов с разным раком. Как и в других исследованиях, частота мутаций достоверно выше среди пациентов с РЯ, при этом почти все, за исключением одного случая, мутации были обнаружены в гене BRCA1. Значительное преобладание BRCA1-мутаций в семьях, отягощённых РЯ, характерно для некоторых выборок (Sinilnikova О. et al., 2006; Capalbo C. et al., 2006). Таким образом, для российской популяции наличие РЯ в семье является индикатором наследственной предрасположенности, связанной с носительством мутации преимущественно в гене BRCA1.

В тоже время 10 из 11 (91%) обнаруженных BRCA2-мутаций были идентифицированы у больных РМЖ или двРМЖ. Доля BRCA2-мутаций в объединённой выборке больных только РМЖ (РМЖ и двРМЖ: 10 из 62 мутаций; 16,1%) значимо отличается от их доли среди больных РЯ (РЯ и РЖМ+РЯ: 1 из 42 мутаций; 2,4%), p<0,05. Следует отметить, что риск заболевания раком яичников вследствие мутации BRCA1 или BRCA2 значительно варьирует. РЯ характерен для семьи с мутацией в гене BRCA1.

BRCA1-мутации. Основную долю обнаруженных нами мутаций (89,4%) составили мутации в гене BRCA1. В табл.5 представлены частоты различных BRCA1-мутаций среди групп больных.

Табл. 5. BRCA1-мутации в различных группах больных.

РМЖ n=122 двРМЖ n=44 РЯ n=29 РМЖ+ РЯ n=29
Число мутаций Доля (%) Число мутаций Доля (%) Число мутаций Доля (%) Число мутаций Доля (%)
5382insC 28 84,8 12 63,2 10* Р=0,0063 50 14 66,7
C61G 2 6,1 2 10,5 2 10 2 9,5
185delAG 2 6,1 2 10,5 2 10 1 4,8
остальные мутации BRCA1 1 3 3 Р=0,0964 15,8 6* Р=0,0049 30 4* Р=0,048 19
всего 33 100 19 100 20 100 21 100

* - статистически значимые различия

Примечательным фактом является преобладание в гене BRCA1 одной мутации - 5382insC в 20 экзоне гена, её частота составляет 68% от всех выявленных BRCA1-мутаций. По данным литературы, также как и в нашем случае, во многих популяциях встречаются повторяющиеся мутации. Хотя частота 5382insC статистически значимо варьирует в различных группах больных – от 84,8% в группе РМЖ и до 50% в группе РЯ (p<0,05), в целом это значение наиболее высокое среди различных популяций, в том числе и славянских (рис.2). Превалирование этой мутации отмечено также в других регионах России, например на Северо-Западе страны (С.-Петербург), на Юге (Краснодар) (Suspitsin E. et al., 2009), в Сибири (Томск) (Tereschenko I. et al., 2002). Как следует из рис.2, частота мутации 5382insC, характерной для большинства европейских стран, убывает в западном, северном и южном направлениях от России.

С высокой частотой среди пациентов встречались ещё две повторяющиеся BRCA1-мутации – 185delAG (7/93, 7,5%) и C61G (8/93, 8,6%). Обе мутации мы обнаруживали во всех группах больных с близкой частотой (6,1-10,5% для C61G и 4,8-10,5% для 185delAG). Мутация C61G характерна для славянских стран, также встречается она и в других центрально-европейских странах, например, в Венгрии и Германии. Следует отметить, что частота мутации 185delAG – самой частой мутации среди евреев-ашкенази – в нашей работе несколько выше, чем в других славянских популяциях (от 0% в Словении до 7% в Польше). В целом три наиболее частые повторяющиеся мутации (5382insC, C61G и 185delAG) охватывают 85% всего спектра BRCA1-мутаций среди российских больных.

 Встречаемость мутации 5382insC в европейских странах. У 14-4

 Встречаемость мутации 5382insC в европейских странах. У 14 пациентов-5

Рис. 2. Встречаемость мутации 5382insC в европейских странах.

У 14 пациентов были обнаружены иные, редкие варианты гена BRCA1. Частота редких мутаций в гене отличалась у пробандов разных групп: от 0,82% (1 мутация) среди больных РМЖ до 20,7% (6 мутаций) среди РЯ (при сравнении РМЖ с: двРМЖ, р=0,026; РЯ, р=0,0000; РМЖ+РЯ, р=0,0004).

BRCA2-мутации. Частота BRCA2-мутаций в общей выборке составила 4,9%. Среди BRCA1-негативных семей (n=131) этот показатель равен 8,4%. Это значение совпадает с результатами других исследований. Частоты герминальных BRCA2-мутаций в европейских популяциях близки и находятся на уровне 10%. Не было обнаружено ни одной повторяющейся BRCA2-мутации, за исключением 6174delT в 11 экзоне гена, являющейся одной из мутации с эффектом основателя для евреев-ашкенази. Двое носителей этой мутации также имели еврейское происхождение. Остальные BRCA2-мутации были уникальными. Таким образом, в российской популяции спектр мутаций в гене BRCA2 характеризуется уникальностью вариантов и высокой частотой впервые выявленных мутаций - 40%.

  1. Частота мутаций среди семей с разной онкологической отягощЁнностью.

Больные с разной локализацией рака происходят из семей, неодинаковых по заболеваемости различными типами рака. Проанализирована частота мутаций в семьях, сгруппированных по принципу встречаемости того или иного рака. Первую группу образовали семьи, в которых все поражённые родственники болели только односторонним РМЖ (n=88). Во вторую группу вошли те семьи, в которых наряду с РМЖ встречался двРМЖ, но не было РЯ (n=41). Остальные семьи помимо РМЖ включали больных РЯ и первично-множественными злокачественными новообразованиями (ПМЗН – РМЖ+РЯ) (n=95). Частота BRCA1/2-мутаций в разных семьях составила: 25% среди РМЖ-семей, 46,3% среди семей с двРМЖ и 66,3% в группе с РЯ (табл. 6).

Табл. 6. Частота BRCA1/2-мутаций в семьях различного типа.

Только РМЖ n=88 Семьи с двРМЖ n=41 Семьи РМЖ/РЯ n=95
Число мутаций % Число мутаций % Число мутаций %
все мутации BRCA1 16 18,2 15* 36,6 62* 65,3
все мутации BRCA2 6 6,8 4 9,7 1* 1
всего 22* 25 19* 46,3 63* 66,3

* - статистически значимые различия

Наиболее высокое значение частоты мутаций - 66,3% среди семей РМЖ/РЯ достоверно отличается и от двРМЖ-семей (р=0,029) и от семей с односторонним РМЖ (р=0,0000). Следует отметить, что семьи РМЖ/РЯ различны по количеству случаев РЯ. В выборке была 31 высокоотягощенная семья с 2 и более случаями РЯ – мутации среди них были обнаружены в 24 семьях (77,4%). Также, среди 10 семей, в которых были более одного случая двРМЖ, мутации были обнаружены в 6 (60%; 3 BRCA1 и 3 BRCA2). Таким образом, различия частот мутаций в разных по структуре заболеваемости семьях имеет такой же характер, как и при изучении различных групп пробандов. Близки также абсолютные значения. Появление в семье больного двРМЖ, РЯ или РМЖ+РЯ является более значимой характеристикой наследственной предрасположенности к онкологическим заболеваниям, ассоциированной с BRCA-мутацией, чем накопление случаев только РМЖ. Возможное объяснение этого наблюдения заключается в том, что семейное накопление РМЖ может быть связано с наследованием изменений в других генах с меньшей пенетрантностью.

Таким образом, наличие в семье РЯ в 60-70% случаев связано с наследованием мутации BRCA1 вне зависимости от других характеристик семьи. Двухсторонний РМЖ примерно в 50% обусловлен наследованием мутации в генах BRCA1 или BRCA2.

Вклад мутаций двух разных генов среди различных семей неодинаков. Доля BRCA1-мутаций также имеет достоверные различия при сравнении трёх групп друг с другом (РМЖ и двРМЖ: р=0,023; РМЖ и РМЖ/РЯ: р=0,0000; двРМЖ и РМЖ/РЯ: р=0,002) и наиболее высока среди семей с РЯ (98,4% от всех мутаций). Среди семей с РМЖ и двРМЖ это значение заметно ниже – 72,3% и 79%, соответственно, (р=0,0002 и р=0,002). Верно и обратное - мутации BRCA2 достоверно чаще встречаются в семьях с РМЖ и двРМЖ. Соотношение частот мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 может быть различным для разных популяций. Частота мутаций в гене BRCA2 в российской популяции относительно невысока, и основной вклад в наследственную предрасположенность к РМЖ (и РЯ) вносит ген BRCA1.

Таким образом, распределение BRCA-мутаций в семьях имеет характер аналогичный тому, который наблюдается при анализе пробандов. Среди мутаций в гене BRCA1 преобладает 5382insC, причём значения её частот близки и не имеют значимых различий (60-75%). Две мутации 185delAG и C61G встречаются во всех группах, их частота несколько выше среди РМЖ-семей. Редкие варианты гена наблюдались только среди семей с двРМЖ и РМЖ/РЯ. Их частота в двРМЖ-семьях (9,8%) и семьях РМЖ/РЯ (10,5%) значимо отлична от РМЖ, среди которых редкие мутации не встречались (р=0,009 и р=0,0016, соответственно).

  1. характеристика и частота миссенс-мутаций в генах BRCA1/2

В генах BRCA1 и BRCA2 обнаружено несколько миссенс-мутаций, функциональное значение которых в настоящее время не определено (табл. 7).

Обнаруженные миссенс-мутации могут быть как и незначимыми, нейтральными аллелями гена, так и мутациями, ассоциированными с повышенным риском рака, а также иметь модифицирующий риск развития рака эффект. Такие варианты могут встречаться с относительно высокой частотой и обнаруживаться также у здоровых женщин (Phelan C. et al., 2005; Wu K. et al., 2005). Все выявленные нами миссенс-мутации обнаружены у больных без какой-либо другой мутации в генах BRCA1/2. Вариант BRCA1 S1040N обнаружен у 4 больных (2%), в семьях которых отмечено 2-3 случая РМЖ. Мутация R1347G в исследованной выборке встречается с частотой 0,75%. По данным базы BIC значение этого варианта не определено окончательно, однако имеются данные, позволяющие считать его нейтральным полиморфизмом (Deffenbaugh A.M. et al., 2002).

Табл. 7. Спектр миссенс-мутаций в генах BRCA1/2.

ген экзон название варианта количество случаев (частота)
ДНК белок
BRCA1 11 с.1054G/C G312A 1 (0,75%)
11 с.3238G/A S1040N 4 (2%)
11 с.4158A/G R1347G 1 (0,75%)
BRCA2 10 с.1342A/C N372H 47 (39%) гетерозиготы; 11 (9,2%) гомозиготы по минорному аллелю
10 c.1409A/C E394A 1 (0,75%)
11 c.5577A/C N1784H 1 (0,75%)
11 c.5652T/G I1808M 1 (0,75%)
25 c.9530T/C L3101P 1 (0,75%)
26 c.9733A/G I3169V 1 (0,75%)

жирным шрифтом выделены варианты, не значащиеся в базе данных BIC.

Редкий вариант E394A в гене BRCA2 описан для ряда европейских популяций, случаев сочетания его с другой мутацией не отмечено. Частоты этих миссенс-мутаций в больших контрольных выборках не известны. Пять миссенс-мутаций (1 – в BRCA1 и 4 - в BRCA2) являются новыми, они не значатся в базе данных BIC и не описаны в литературе. Все они обнаружены в семьях с 3-4 случаями РМЖ. Проследить сегрегацию заболевания в семьях с носительством миссенс-мутации не удалось.

До сих пор большинство миссенс-мутаций остаются неклассифицированными в отношении риска заболевания. При медико-генетическом консультировании такая ситуация является наиболее проблематичной, поскольку не позволяет адекватно оценить риск возникновения рака.

  1. полиморфные варианты генов BRCA1/2

Помимо мутаций и миссенс-вариантов неизвестной значимости в генах BRCA1/2 выявлено значительное количество полиморфных вариантов. Некоторые ОНП в BRCA1, расположенные в интронах и экзонах на протяжении всего гена, находятся в строгом неравновесии по сцеплению, образуя несколько гаплотипов гена (обозначенных как A, B, C, D), табл. 8. Значимых различий в распределении частот гаплотипов среди больных РМЖ и/или РЯ и в контрольной группе не было.

Табл. 8. Полиморфные гаплотипы гена BRCA1.

Варианты экзон/ интрон гаплотип
A B C D
IVS1-103T/C 1 T C C C
IVS1-115T/C 1 T C C C
IVS8-58delT 8 T delT delT delT
D693N (2196G/A) 11 G G G A
S694S (2201C/T) 11 C T T T
L771L (2430T/C) 11 T C C C
P871L (2731C/T) 11 C T T T
E1038G (3232A/G) 11 A G G G
K1183R (3668 A/G) 11 A G G G
S1436S (4427С/Т) 13 С Т Т Т
IVS14-63C/G 14 C G G G
S1613G (4956A/G) 16 A G G G
IVS20+60ins12 20 - - ins12 -
частота гаплотипа (%) 62,5 28 1,5 8

Среди больных также обнаружены единичные ОНП в обоих генах. Частоты вариантов среди больных приведены в табл. 9.

Табл. 9. Полиморфизмы в генах BRCA1/2.

ген Экзон/ интрон название варианта число больных (%)
ДНК белок
BRCA1 1 IVS1-21insAT - 2 (0,9%)
2 IVS2-55T/C - 1 (0,4%)
7 IVS7-34T/C - 8 (3,6%)
8 INV8-58delT - 1 (0,4%)
11 c.
1186A/G
Q356R 16 (12%)
16 c.4956A/G S1613G 1 (0,4%)
16 c.5002T/C M1628T 1 (0,4%)
16 c.5075G/A М1652I 1 (0,4%)
18 IVS18+72G/A - 1 (0,4%)
BRCA2 2 203G/A -
3 c.353A/G Y42C 2 (1,5%)
4 IVS4-89T/C - 1 (0,7%)
8 IVS8+56C/T -
10 c.1206C/A S326R 1 (0,7%)
10 c.1379С/T S384F 1 (0,7%)
10 c.1395G/A P389P 1 (0,7%)
11 c.3624A/G K1132K 25 (19%)
11 c.3744G/A S1172S 1 (0,7%)
11 c.4035T/C V1269V 28 (22%)
11 c.4296G/A L1356L 1 (0,7%)
11 c.4486G/T D1420Y 3 (2,3%)
11 c.5972C/T T1915M 4 (3%)
11 IVS11+80delTTAA - 42 (32%) – гетерозиготы, 36 (28%) –гомозиготы по минорному аллелю
14 c.7470A/G S2414S 26 (20%)
16 IVS16-14Т/С - 15 (12%)
21 IVS21-66T/C - 15 (12%)
24 IVS24-16T/C - 2 (1,5%)
24 IVS24-49T/C - 1 (0,7%)
27 c.10204A/T K3326X 1 (0,7%)
BRCA2 10 10 11 1093A/G 1593A/G 3199A/G N289Н S455S N991D 8 (6%)

По данным литературы, базы данных BIC перечисленные в табл. 9 миссенс-мутации и интронные варианты не имеют клинического значения. Однако нельзя исключить, что они могут оказывать влияние на предрасположенность к онкологическим заболеваниям при сочетании с вариантами в каких-то других генах.

  1. ГАПЛОТИПИРОВАНИЕ ПОВТОРЯЮЩИХСЯ МУТАЦИЙ В ГЕНЕ BRCA1

Частота и тип разных мутаций в генах BRCA1/2 варьирует в широких пределах, и их распределение характеризуется географическими и этническими различиями. Ряд BRCA-мутаций в определённых популяциях распространились вследствие эффекта основателя (founder mutation) (Neuhausen S. et al., 1996). Примером такой мутации является 185delAG (BRCA1) у евреев-ашкенази. Мутация расположена на определённом консервативном гаплотипе гена. В тоже время некоторые частые мутации встречаются в составе разных гаплотипов, что свидетельствует о неоднократном их возникновении. Например, мутация 1135insA в гене BRCA1, распространнённая в Норвегии, Дании и Италии, находится в составе трёх разных гаплотипов (Rudkin T. et al., 2006).

В работе было обнаружено несколько повторяющихся BRCA1-мутаций – 5382insC, 185delAG, C61G, 2080delA, 4154delA. Мутации были идентифицированы у неродственных пациентов различной национальности: 5382insC – у русских, евреев и татар, 4154delA – у русских и пациентки еврейской национальности, C61G – у русских и польки, 2080delA – только у русских. Все больные с мутацией 185delAG имели еврейское происхождение. Было проведено генотипирование пациентов с 4 мутациями по 5 микросателлитным маркёрам, расположенных внутри гена BRCA1 (D17S855, D17S1322, D17S1323) и в прилегающем к BRCA1 локусе (D17S1320, D17S1325). Генотипирование 185delAG-носителей не проводили.

Установлено, что мутации 2080delA, 4154delA и 5382insC находятся каждая на определённом гаплотипе гена по микросателлитным маркерам. Эти гаплотипы не были обнаружены у других пациентов (n=10) и в контрольной группе (n=10), что свидетельствует о сцеплении каждого гаплотипа именно с мутацией (Р=0,0000, двухсторонний критерий Фишера).

Гаплотип гена при мутации 5382insC идентичен гаплотипу, выявленному в других работах (Neuhausen S. et al., 1996; Hamel N. et al., 2010). Результаты доказывают происхождение мутации вследствие эффекта основателя. Данные о частотах 5382insC в разных популяциях свидетельствуют об её происхождении на территории России. Возраст мутации в работе N. Hamel с соавт. (2010) оценен в 1800 лет. Носители мутации 2080delA также имеют общий гаплотип гена. Наибольшее число случаев этой мутации выявлено в России, в других славянских популяциях её нет, однако 2080delA известна в некоторых европейских странах, в частности в Голландии. Возможно, 2080delA является мутацией с эффектом основателя для русских. Общий гаплотип гена при 4154delA также свидетельствует об её происхождении вследствие эффекта основателя. Недавно при исследовании неродственных индивидуумов с 4154delA из Латвии, Польши и России была установлена ассоциация мутации с аналогичным гаплотипом гена (Ozolina S. et al., 2009). Таким образом, мутация 4154delA имеет общее, скорее всего славянское происхождение.

  1. герминальные Мутации в гене ТР53

Большинство исследованных семей были отягощены РМЖ и/или РЯ, а также другими опухолями, характерными для наследственного синдрома РМЖ/РЯ – рак предстательной железы, рак желудка, рак тела матки. Однако в семьях 6 больных РМЖ были отмечены другие онкологические заболевания – мягкотканые саркомы или опухоли головного мозга (ОГМ). Мутации BRCA1/2 ни в одном случае обнаружено не было. Хотя ни одна семья не соответствовала критериям синдромов Ли-Фраумени (СЛФ) или Ли-Фраумени подобного (СЛФП), больных исследовали на наличие герминальной мутации в гене ТР53. Ни у одного больного мутации не было выявлено. В двух случаях обнаружен полиморфный вариант ТР53-гена - Int3dup16 в гомозиготном состоянии. Аллельная частота этого варианта в европейской популяции составляет около 16%. Частота гомозигот по редкому аллелю не превышает 1%. В некоторых работах показано, что этот полиморфизм ассоциирован с повышенным риском развития - РМЖ (Wang-Gohrke S. et al., 2002; Costa S. et al., 2008), колоректального рака (Germignani F. et al., 2004), рака легкого (Wu X. et al., 2002). Гомозиготный вариант гена Int3dup16 приводит к снижению уровня мРНК (Germignani F. et al., 2004), возможно изменяя функциональную активность белка. Вариант Int3dup16 гена ТР53 является аллелем низкой пенетрантности и в определённых случаях повышает риск развития некоторых типов рака и, в частности, РМЖ.

Для определения вклада гена ТР53 в наследственную предрасположенность к РМЖ проведен поиск герминальных ТР53-мутаций среди больных с ранней манифестацией РМЖ. Исследовали все кодирующие экзоны гена ТР53 среди 22 молодых больных РМЖ, у которых не было обнаружено мутаций 5382insC, C61G и 185delAG в гене BRCA1 и отобранных только по возрасту заболевания – моложе 31 года. Среди них выявлено 3 носителя герминальной мутации в гене ТР53: в 5 экзоне - 532delC, в 6 экзоне – Y220C, в 8 - R306X (табл. 10). Частота ТР53-мутаций в группе составила 13,6%.

Табл. 10. Герминальные мутации в гене ТР53 у пациенток РМЖ раннего возраста.

Экзон ТР53 Название мутации диагноз возраст диагноза семейная отягощенность
ДНК белок
5 532delC H178TfsX68 1.синхронный двРМЖ 2.адренокортикальный рак 30 31 Нет
6 659A/G Y220C РМЖ 24 Нет
8 916C/T R306X РМЖ на фоне беременности 26 мать – РМЖ на фоне беременности в возрасте 26 лет

РМЖ - наиболее частая опухоль, встречающаяся у женщин-носителей ТР53-мутации, и в таком молодом возрасте является фенотипическим маркёром синдрома Ли-Фраумени (Birch J.M. et al., 2001). Ни одна из исследованных семей не соответствовала критериям СЛФ. Только у 10 из 22 больных были случаи онкологических заболеваний в семье.

Частота мутаций в ТР53 (13,6%) в изученной группе довольно высока. Значения частот ТР53-мутаций в подобных выборках остаются не определенными. В других исследованиях BRCA-негативных семей с РМЖ частота ТР53-мутаций находится в пределах 0-6,3% (Balz V. et al., 2002; Martin A. et al., 2003; Lalloo F. et al., 2006; Blanco А. et al., 2009). В работе G.Bougeard с соавт. частота ТР53-мутаций была аналогична – 13,1% (5/38) в группе больных РМЖ моложе 36 лет (Bougeard G. et al., 2008). По-видимому, частота обнаружения мутаций в соответствующем гене среди больных РМЖ зависит от способа формирования исследуемой выборки и, возможно, имеет популяционные различия.

В тоже время все ТР53-носители не имеют никаких характеристик, позволяющих предположить синдром Ли-Фраумени, кроме ранней манифестации РМЖ. Для одной больной доказано происхождение мутации de novo. Высокая частота мутаций de novo в ТР53 подтверждается результатами ряда исследований спорадического РМЖ молодого возраста. Вклад герминальных мутаций гена ТР53 в развитие РМЖ раннего возраста недооценен вследствие высокой частоты мутаций de novo или наличия в семейном анамнезе нехарактерной синдромальной патологии. Только в последние годы исследователи стали уделять внимание вкладу гена ТР53 в формирование синдрома наследственного РМЖ/РЯ. Как правило, такие ТР53-позитивные семьи не соответствуют критериям СЛФ или СЛФП. Учитывая достаточно высокую частоту мутаций среди РМЖ раннего возраста, предложено тестировать ген ТР53 у всех женщин с ранней манифестацией заболевания (моложе 36 лет).

  1. ГЕРМИНАЛЬНая МУТАЦИя 1100delC В ГЕНЕ CHEK2

Диагностика мутации 1100delC в гене СHEK2 была проведена среди 107 BRCA-негативных больных наследственным РМЖ или двРМЖ. Было обнаружено двое носителей этой мутации (1,8%). Подобное значение частоты этой мутации - 2,1% - показало исследование смешанной выборки российских пациентов (Chekmareva Е.V. et al., 2006). Частоты мутантного гена среди больных РМЖ в некоторых популяциях выше – примерно 5% по сравнению с 1% в контроле (Vahteristo P. et al., 2002). Для носителей мутации 1100delC показано примерно двукратное увеличение риска развития РМЖ (CHEK2 Breast Cancer Case-Control Consortium, 2004). В целом, вклад мутации 1100delC в гене СHEK2 в предрасположенность к РМЖ в российской выборке больных невелик. 1100delC не является высокопенетрантной мутацией, и, возможно, проявляет синергическое взаимодействие с другими генетическими факторами в отношении риска развития заболевания. Например, ассоциация у носителей мутации в гене CHEK2 с вариантом T1915M в гене BRCA2 приводит к неожиданно высокому риску РМЖ, превышающему риск заболевания вследствие только одной CHEK2-мутации (Serrano-Fernandez P. et al., 2008).

  1. ГЕРМИНАЛЬНЫЕ МУТАЦИИ В ГЕНах репарации неспаренных нуклеодитов - MLH1/MSH2/MSH6

Развитие РМЖ/РЯ в некоторых семьях обусловлено наследованием герминальных мутаций в генах mismatch-репарации. Как правило, в таких семьях идет накопление онкологических заболеваний, характерных для соответствующего синдрома (наследственный неполипозный колоректальный рак– ННКРР, синдром Линча) – РТК, рак желудка (РЖ), рак тела матки (РТМ). ДНК-диагностика генов MLH1, MSH2, MSH6 была проведена для 6 BRCA-негативных больных, страдающих РЯ и/или РМЖ в составе ПМЗН, в семье которых были отмечены случаи РТК. Мутации обнаружены у 2 пациенток. У одной больной была выявлена мутация в 16 экзоне гена MLH1 – 618del3. Во втором случае больная наследовала мутацию в 4 экзоне гена MSH6 – T764N. Интересным является факт накопления в этой семье случаев РМЖ. Сайт-специфичность проявления герминальных мутаций в генах, белки которых участвуют в репарации неспаренных нуклеотидов, достаточно определена – РТК и РЖ, однако следует учитывать повышенный риск развития рака других локализаций, особенно у женщин.

Таким образом, только небольшая часть РМЖ и РЯ связана с иными синдромами, чем наследственный РМЖ/РЯ, в том числе и ННКРР.

  1. Частоты мутаций в неотобранных выборках и выборках спорадического РМЖ и РЯ

Семейное накопление РМЖ и/или РЯ обнаруживается не у всех больных с мутацией в генах BRCA1/2. Доля семейных случаев значительно варьирует для разных популяций. В тоже время для групп больных из разных популяций, сформированных без учета семейной истории, характерна и разная частота мутаций в генах BRCA1/2. Для оценки значений частот мутаций среди российских больных была проведена диагностика 3-х мутаций гена BRCA1 (5382insC, 185delAG и C61G) среди больных РМЖ (n=76), двРМЖ (n=32) без семейной истории заболевания, а также диагностика гена BRCA1 среди неотобранной выборки больных РЯ (n=101). Значения частот мутаций приведены в табл. 11.

Частота BRCA1-ассоциированного РМЖ среди больных без семейного отягощения значительно варьирует среди популяций - 0,7-8,9%. Полученные для российских больных результаты соответствуют значениям частот, характерным для европейцев. Доля носителей BRCA1-мутации среди больных двРМЖ (спорадические случаи) значимо превышает таковую среди больных односторонним РМЖ (12,5% и 1,3%, соответственно; р=0,012). Значение частоты BRCA1-мутаций в неотобранной выборке РЯ – 14,8% - является одним из наиболее высоких среди европейских стран.

Табл. 11. Частоты BRCA1-мутаций в различных выборках больных.

РМЖ (%) двРМЖ (%) РЯ (%)
семейно-отягощённые больные (частота BRCA1-мутаций) 27 43,2 69
неотобранная выборка - - 14,8
спорадические случаи 1,3 12,5 2,5

Положительная семейная история РМЖ/РЯ является несомненным показателем генетической природы заболевания. Вместе с этим, о генетической предрасположенности может свидетельствовать и диагноз заболевания. Двухсторонний РМЖ наиболее часто свидетельствует о наследственной предрасположенности даже в отсутствие онкологически отягощенного анамнеза у больных.

  1. Встречаемость РМЖ и РЯ в семьях С

BRCA1-мутациЕй

В семьях с BRCA1-мутацией было отмечено преимущественное накопление рака определённой локализации – РМЖ или РЯ. Было предположено, что риск развития РМЖ и РЯ отличается для разных мутаций.

Случаи РМЖ и РЯ в семьях при 5 различных мутациях. Существует ли генотип-фенотипическая корреляция для определённых BRCA1-мутаций? Был проведен анализ количества случаев РМЖ и РЯ в семьях с наследуемой BRCA1-мутацией. В исследование вошли неродственные семьи с 5 повторяющимися мутациями (5382insC, C61G, 185delAG, 2080delA и 4154delA), табл. 12.

Табл. 12. Число случаев РМЖ и РЯ в семьях с разными мутациями.

мутация количество семей число случаев РМЖ число случаев РЯ соотношение РМЖ:РЯ
5382insC 32 55 26 2,1:1
185delAG 9 17 10 1,7:1
C61G 10 20 8 2,5:1
2080delA 4 5* 9* 0,56:1
4154delA 4 7 7 1:1

* - статистически значимые различия

Наблюдаются сходные, статистически неразличающиеся значения в соотношении случаев РМЖ:РЯ при трёх мутациях - 5382insC, C61G и 185delAG. Число случаев РМЖ примерно в два раза выше РЯ, что соответствует общепринятым представлениям о двукратном превышении риска развития РМЖ нежели РЯ при BRCA1-мутациях. При этом мутации расположены на разных концах гена – на 5’ конце во 2, 5 экзонах (185delAG и C61G) и на 3’ конце в 20 экзоне (5382insC), что не соответствует данным S.Gayther с соавт. (1995) об увеличенном риске РЯ при 5’ мутациях. В случае 4154delA количество случаев РЯ увеличивается. В семьях с 2080delA преобладает РЯ (РМЖ:РЯ – 0,56). Различия в количестве случаев разного типа рака при этой мутации достоверны при сравнении с семьями, наследующими 5382insC (р=0,021) и C61G (р=0,026).

Таким образом, существует некоторая фенотипическая вариабельность проявления мутаций, прямо не связанная с её положением в гене, но являющаяся характеристикой мутации. Т.е. некоторые конкретные BRCA1-мутации (в нашем исследовании 2080delA и 4154delA) обладают специфическими свойствами в отношении риска развития рака яичников.

Однако наблюдается накопление определённого рака внутри разных семей и при одной и той же мутации - 5382insC.

Число случаев РМЖ и РЯ в семьях с мутацией 5382insC. Были проанализированы семьи пробандов по наличию случаев рака разной локализации, считая при этом двухсторонний РМЖ за два события. Оказалось, что среднее число РМЖ и РЯ в расчёте на одну семью значительно варьирует. Без учёта заболевания самого пробанда среднее число случаев РМЖ в семьях пробандов с РМЖ и двРМЖ значительно превышает таковое для группы пробандов с РЯ, а для четвертой группы (РМЖ+РЯ) имеет промежуточное значение. И, наоборот, РЯ преимущественно встречается в семьях пробандов с РЯ (табл.13). Число случаев РМЖ и РЯ в таких семьях достоверно отличается от семей пробандов с РМЖ.

Табл. 13. Число случаев рака в семьях с мутацией 5382insC среди различных групп.

заболевание пробанда РМЖ двРМЖ РЯ РМЖ+РЯ
число семей n=28 n=12 n=10 n=14
число РМЖ в семьях 46 17 5* 19
число РЯ в семьях 19 7 9* 13
соотношение РМЖ:РЯ 2,42:1 2,43:1 0,56:1 1,46:1
число семей с РЯ (без пробанда) 12 (43%) 7 (58%) 8* (80%) 9 (64%)

* - статистически значимые различия

Таким образом, наблюдается разделение семей по сайту локализации рака у больных.

Распределение семей с мутацией 5382insC по числу случаев рака разной локализации. Описываемые семьи различны не только по структуре заболеваемости, но отличаются по количеству больных родственников I-II степени родства – это значение варьирует от 2 до 6. Была проведена оценка распределения различных по отягощенности семей (2, 3, 4 случая рака) по типу рака отдельно для семей пробандов с РМЖ и РЯ.

Семьи с 2 случаями рака. В выборке было 13 больных РМЖ, в семье которых отмечен ещё один случай рака. Теоретически, при условии, что риск РМЖ в 2 раза выше, в 67% таких семей обе больные будут страдать РМЖ, а в 33% семей второй человек будет болен РЯ (вероятность заболевания РМЖ - 0,67, РЯ – 0,33). Во всех изученных семьях обе родственницы болели раком молочной железы, т.е. семьи с 2-мя случаями РМЖ составили 100%. Отклонение фактического распределения семей по заболеваемости от предполагаемого статистически значимо (точный критерий Фишера, р=0,039). В случае больного РЯ было 10 семей с 2 случаями рака, из них в 8-ми семьях второй больной также страдал РЯ (80%) и только в двух - РМЖ (20%). Теоретическое распределение семей должно быть таково: семьи с 2 РЯ – 33%, с 1 РЯ и 1 РМЖ – 67% (2, p=0,0246). Фактические данные указывают на увеличение числа семей с накоплением рака той же локализации, что и у пробанда по сравнению с ожидаемым.

Семьи с 3 и более случаями рака. Как и для семей с меньшей заболеваемостью в распределении наблюдается сдвиг в сторону увеличения доли семей с преобладанием РМЖ, и почти полное отсутствие семей с накоплением РЯ в случае пробанда с РМЖ. Вследствие небольшой выборки отклонения от теоретического распределения семей не могут быть статистически доказаны.

В исследованных семьях с наследуемой BRCA1-мутацией наблюдается накопление у родственников преимущественно одного типа рака. Даже при одной и той же мутации 5382insC семья пробанда с РМЖ характеризуется преимущественно накоплением случаев рака этой локализации, и аналогично при РЯ. Статистически значимые различия по количеству случаев рака различной локализации выявлены для семей больных РМЖ и больных РЯ. В BRCA1-позитивных семьях риск развития того или иного рака у родственников коррелирует с заболеванием самого пробанда (Lee J. et al., 2006). Однако наблюдается определённый фенотип разных семей и при одной и той же мутации - 5382insC. Различные репродуктивные факторы, например количество и возраст родов, применение оральных контрацептивов, а также характеристики образа жизни (курение), могут изменять риск развития РМЖ у женщин с BRCA-мутаций, но вряд ли подобные факторы сохраняются в семье в разных поколениях. Наиболее вероятным объяснением подобных данных представляется гипотеза наследования других генетических вариантов, влияющих на пенетрантность мутации BRCA1 (и BRCA2) и модифицирующих риск возникновения РМЖ и/или РЯ.

  1. некоторые клинические формы РМЖ

Рак молочной железы у молодых женщин. Ранний возраст возникновения опухоли часто свидетельствует о генетической природе заболевания. Частота BRCA-ассоциированного заболевания среди групп больных РМЖ и двРМЖ разного возраста (n=166) значительно увеличивалась при более раннем возрасте диагноза, составляя 70,6% для больных моложе 31 года (табл. 16).

Помимо генов BRCA1/2 в развитие РМЖ молодого возраста в определенной степени определенный вклад вносит ген ТР53. В нашем исследовании частота герминальных ТР53-мутаций среди российских BRCA1-негативных больных с ранней манифестацией РМЖ (до 31 года) составляет 13,6% (3/22). Таким образом, ранний возраст возникновения РМЖ наряду с положительной семейной историей служит ещё одним критерием генетической природы заболевания, ассоциированной в значительной степени с мутациями в генах BRCA1/2 и ТР53.

Табл. 16. Частота BRCA-мутаций среди больных РМЖ разного возраста.

число больных число больных с мутацией число больных с мутацией BRCA1 число больных с мутацией BRCA2
n % n % n %
до 31 года 17 12 70,6 10 58,8 2 11,8
31-40 лет 55 31 56,4 29 52,7 2 3,6
41 год и старше 94 19* 20,2 12* 12,8 7 7,4

* - статистически значимые различия

Вклад мутаций в генах BRCA1/2 среди больных молодого возраста был оценен отдельно для двРМЖ (возраст диагноза 1-го РМЖ меньше 41 года). Доля носителей BRCA1-мутаций среди больных с семейной отягощённостью составила 71% (12/17), что превышает этот показатель среди больных односторонним РМЖ того же возраста (56%). Среди больных со спорадической формой заболевания мутации обнаружены у 25% (3/12). Одна из пациенток моложе 31 года без BRCA-мутации оказалась носителем мутации в гене ТР53 - 532delC. Такие данные свидетельствуют о значительной ассоциации двРМЖ, особенно молодого возраста, с молекулярной патологией в генах BRCA и в меньшей степени ТР53.

Рак молочной железы, ассоциированный с беременностью. Рак молочной железы, ассоциированный с беременностью (РМЖ-АБ; Pregnancy-associated breast cancer – PABC), довольно редкое событие и составляет 0,2-3,8% всех случаев РМЖ.

Среди 88 больных РМЖ, диагностированным во время беременности или в течение лактации, и 90 больных РМЖ соответствующего возраста, не ассоциированного с беременностью, частота мутаций (BRCA1 – 5382insC, C61G, 185delAG) составила 15,9% и 6,7% соответственно (р=0,05). Средний возраст больных с мутациями в группах был 31,18±2,99 (26-35) лет и 37,17±4,96 (33-46) лет, соответственно. Помимо BRCA1-мутаций в случае РМЖ-АБ чаще, чем в семейном и спорадическом РМЖ, встречаются некоторые варианты генов: S1040N (4,5%) в BRCA1; 203АА (6,8%), S384F (1,3%) в BRCA2, редкие аллели гена PGR (8%).

Девять больных РМЖ-АБ без BRCA1-мутации вошли в группу «молодого» РМЖ, в которой исследовали первичную структуру гена TP53. У одной больной обнаружена герминальная TP53-мутация R306X в 8 экзоне гена. Значительным представляется факт заболевания её матери раком молочной железы также на фоне беременности. У пяти пациенток присутствовал вариант в 3 интроне гена - Int3dup16 в гетерозиготном состоянии, у одной был обнаружен редкий вариант в 6 интроне - IVS6-37G/T. То есть у 7 из 9 больных были выявлены варианты нуклеотидной последовательности в гене ТР53.

Таким образом, выявляется некоторая группа носителей мутации BRCA1 и ТР53, характеризующаяся очень молодым возрастом возникновения рака на фоне беременности. По-видимому, существует вариация персонального риска развития рака у женщин с мутацией в течение беременности и последующего кормления ребёнка.

Рак молочной железы у мужчин. Рак молочной железы у мужчин (МРМЖ) – редкое заболевание, и составляет примерно 1% всех случаев РМЖ. Основными генетическими факторами, ассоциированными с повышенным риском МРМЖ, являются герминальные мутации в гене BRCA2, и в меньшей степени в BRCA1. ДНК-диагностика генов BRCA1/2 проведена у 8 мужчин с диагнозом РМЖ. Гермнальные BRCA1/2-мутации обнаружены у 3 (38%) больных - в одном случае мутация 185delAG в гене BRCA1 и 2 мутации в 11 экзоне гена BRCA2 - 6174delT и 6640del7. BRCA2-мутация 6640del7 является уникальной и выявлена впервые. Один из пациентов с 5 первично-множественными опухолями (2 случая РТК, меланома, РМЖ и РПЖ) по клиническим характеристикам соответствовал критериям синдрома Линч (ННКРР). Поскольку в анамнезе присутствовали РМЖ и РПЖ, проведён анализ генов BRCA1/2 и MLH1/MSH2. Обнаружена герминальная мутация в гене MLH1 – 618del3.

Злокачественные листовидные опухоли молочной железы. Листовидные опухоли молочной железы - редкие фиброэпителиальные опухоли, как правило, имеющие доброкачественный характер. Злокачественные листовидные опухоли состоят из мезенхимальных и эпителиальных клеток в различных пропорциях. Вклад генетических изменений в развитие этого типа опухолей недостаточно изучен.

ДНК-диагностика генов BRCA1 и ТР53 была проведена среди 7 пациенток с листовидной опухолью молочной железы в возрасте от 25 до 51 года. Герминальных мутаций в этих генах обнаружено не было. У одной из пациенток с диагнозом двухсторонняя листовидная саркома молочной железы был выявлен вариант в гене ТР53 - Int3dup16 в гомозиготном состоянии. Ассоциация листовидных опухолей молочной железы с мутациями в гене BRCA1 не очевидна. Только в одной работе у больной с таким типом заболевания была выявлена BRCA1-мутация R1699W (Rhiem K. et al., 2007). Листовидные опухоли довольно часто встречаются у женщин-носителей ТР53-мутации. В одном случае мы идентифицировали в этом гене гомозиготный вариант Int3dup16 (14,3%). Возможно, вариант Int3dup16 как аллель низкой пенетрантности ассоциирован с риском развития не только некоторых типов рака, но также листовидных опухолей молочной железы.

  1. ассоциация вариантов генов BRCA1, BRCa2, Tp53 и PGR с развитием РМЖ и РЯ

Женщины, несущие мутацию в гене BRCA1 или BRCA2, имеют очень высокий риск развития рака на протяжении жизни, особенно РМЖ. Имеются значительные различия в оценке риска развития заболевания для BRCA-носителей. По данным Breast Cancer Linkage Consortium для женщин из высокоотягощённых семей риск развития РМЖ составляет 85-87% (BRCA1) и 77-84% (BRCA2). В тоже время рассчитанный на основании популяционных данных риск РМЖ заметно ниже – 28-60% для BRCA1 и ещё ниже для BRCA2-мутаций. Риск возникновения заболевания зависит также от возраста диагноза и сайта локализации рака у родственников. Такие факты подтверждают гипотезу модифицирующего влияния на риск развития РМЖ и РЯ определённых генетических вариантов, кластеризующихся в семье. Существование таких вариантов подтверждается наличием фенокопий в BRCA1/2-позитивных семьях (Smith A. et al., 2007).

Был исследован ряд однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в генах, как возможных генетических факторов, модифицирующих риск развития рака у носителей BRCA1-мутации: 3232A/G (E1038G) в гене BRCA1; 203G/A, 1342A/C (N372H) в гене BRCA2; R72P и Int3dup16 в гене ТР53; миссенс-мутация V660L (G/T, rs1042838) и ОНП на 3’-конце гена (T/A, rs608995) в гене PGR.

Частоты редких аллелей по полиморфизмам E1038G, 203G/A и N372H среди всех больных с мутацией не отличались от контрольных значений. Среди больных РМЖ и РЯ частота гомозиготного генотипа 372HH была ниже – 1,87% (2/107) по сравнению с контрольной группой – 5%. Это различие статистически значимо при сравнении с группами спорадического РМЖ (7,4%; р=0,05) и семейного BRCA-негативного РМЖ (9,5%; р=0,015). В тоже время среди больных обоими типами рака РМЖ+РЯ частота 372НН составляет 8,7% (2/23) - подобный генотип может быть фактором, связанным с более тяжелой формой заболевания (РМЖ+РЯ). Генотип 203A/A достоверно чаще встречался в группе РЯ (10,8%) по сравнению с группой РМЖ (1,43%).

Частоты редких аллелей по полиморфизмам R72P и Int3dup16 среди больных с мутацией не отличались от значений в контрольной выборке. Наблюдалось увеличение количества редких гомозиготных генотипов (72РР и Int3dup16+/+), однако различие с контрольными значениями статистически не достоверно. Данных в пользу модифицирующего влияния ТР53-генотипов на риск развития рака различной локализации не получено. В тоже время среди носителей мутации C61G отмечается преобладание генотипов R72P и 72РР. Хотя число пациентов с этой мутацией не велико (n=10), аллельная частота 72Р (OR=2,7; p=0,028) и частота минорного генотипа 72РР (3/10; OR=5,57; p=0,016) значительно выше и достоверно отличается от контрольных значений. В тоже время распределение генотипов ТР53 среди пациентов с мутацией 5382insC и 185delAG аналогично контролю. Таким образом, аллель 72Р, возможно, ассоциирован с развитием рака у носителей мутации C61G.

Два ОНП в гене PGR (ген рецептора прогестерона) - V660L (G/T, rs1042838) и T/A, rs608995 образуют 4 гаплотипа, обозначенные как A, B, Р и Т. Гаплотип Р соответствует аллелю PROGINS, связанному по данным ряда работ с повышенным риском развития РЯ. Частота гаплотипа B была значительно выше среди носителей мутации BRCA1, страдающих РМЖ (2=7,37; p=0,0066). При этом частоты в группе спорадического РМЖ идентичны контрольным значениям. В случае больных РЯ наблюдается превышение гаплотипа P (т.е. PROGINS), не достигающее достоверности. Наиболее распространенный гаплотип А встречается в контроле и в других группах примерно с одинаковой частотой.

При изучении распределения генотипов гена PGR получены следующие данные. В группе РМЖ встречаемость генотипов гетеро- и гомозиготных по аллелю В (АВ и ВВ), значительно превалировала по сравнению как с контролем (2=9,67; р=0,0019; OR=3,29), так и с группой больных РЯ с мутацией (2=4,54; р=0,033). Среди больных двРМЖ также повышено число генотипов, содержащих аллель В, причём обе пациентки с генотипом ВВ страдали двРМЖ. И, наоборот, у больных РЯ по сравнению с контролем выше частота генотипов, включающего аллель P (AP и PP). Эта различие становится статистически значимым при сравнении двух групп больных – РЯ и РМЖ (2=4,58; р=0,032). Отметим, что среди больных гомозиготный вариант PP был обнаружен только у пациентов с РЯ. Распределение генотипов среди больных со спорадическим заболеванием аналогично контрольным значениям.

Для носителей мутации 5382insC получены аналогичные результаты. Встречаемость генотипов АВ и ВВ значительно превалировала среди РМЖ и, особенно двРМЖ, по сравнению как с контролем (2=8,43; р=0,0037), так и с группой больных РЯ. Среди больных РЯ значительно возрастает частота AP и PP.

Чем могут объясняться такие данные? У женщин с PROGINS повышен риск развития онкопатологии в тех тканях, на которые воздействие прогестерона оказывает протективный эффект – рака яичника, рака эндометрия (Modugno F., 2004; Romano A. et al., 2006). Однако в случае молочной железы, где прогестерон не оказывает протективного действия в отношении опухолевого развития и, наоборот, стимулирует клеточную пролиферацию, женщины-носители PROGINS имеют сниженный риск развития РМЖ (Pearсe C. et al., 2005). Повышенная активность рецептора прогестерона PGR в ткани молочной железы у женщин с мутантным BRCA1, стимулирует избыточную пролиферацию клеток эпителия. PROGINS как менее стабильный и менее активный рецептор (Romano A. et al., 2007) в такой ситуации играет защитную роль в отношении риска развития РМЖ, но не РЯ.

  1. клинические и Патоморфологические характеристики наследственного РМЖ и РЯ

Возрастные характеристики BRCA-ассоциированного РМЖ и РЯ. РМЖ и РЯ у женщин с BRCA-мутациями возникает значительно раньше по сравнению со спорадическими случаями. Средний возраст диагноза у BRCA1-носителей ниже, чем у больных с мутацией в BRCA2. В нашем исследовании получены следующие характеристики возраста диагноза РМЖ и РЯ для наследственной группы больных (BRCA1: средний возраст заболеваемости РМЖ - 41,6 год; BRCA2: 45,3 лет; BRCA1: РЯ – 47,5 лет). В тоже время средний возраст семейного РМЖ – без мутаций в BRCA-генах – также ниже по сравнению с общепопуляционными значениями (47,5 лет и 54 г.) Это свидетельствует об участии в этиологии семейного РМЖ других генетических факторов. Больные двРМЖ с мутациями характеризовались ещё более ранним возрастом диагноза 1-го РМЖ (37,5 лет) по сравнению с BRCA1-ассоциированными случаями одностороннего РМЖ. Эти данные подтверждают связь риска развития контралатерального РМЖ с ранней манифестацией первичного рака, как в случае BRCA1-носителей, так и семейного и спорадического РМЖ

Гистологические и иммуногистохимические характеристики BRCA-ассоциированных опухолей молочной железы и яичников. Анализ гистологических и иммуногистохимических характеристик опухолей молочной железы показал типичный «портрет» как в случае BRCA1/2-ассоциированных опухолей, так и спорадических. Среди BRCA1-ассоциированных опухолей преобладает инфильтративно-протоковый рак, отмечается РЭ-, РП-, HЕR2-neu--статус опухоли, чаще встречается медуллярный рак, во всех случаях наблюдается выраженный терапевтический эффект. Характерным для больных с мутацией BRCA2 было преобладание инфильтративно-долькового рака (ИДР) - 54,5%, по сравнению с встречаемостью этого вида опухоли у носителей мутаций BRCA1 и больных спорадическим РМЖ. Спорадические опухоли чаще имеют РЭ+, РП+, HЕR2-neu+-статус, выше доля инфильтративно-долькового, смешанного и редких типов рака. В случае двРМЖ отмечается высокая конкордантность обеих опухолей, как по гистологии рака, так и по рецепторному статусу, особенно в группе с BRCA-мутацией. Такая ситуация может быть следствием генетических факторов риска и/или возникновения общих пренеопластических изменений в ткани обеих молочных желёз, что подтверждается недавними результатами S. de Brakeleer с соавт. (de Brakeleer S. et al., 2007), показавших нестабильность генома и в лейкоцитах и в нормальных клетках молочной железы носителей мутаций BRCA1 и BRCA2.


  1. АЛГОРИТМ молекулярно-генетической диагностики

В ходе выполнения работы создан банк образцов ДНК больных РМЖ и/или РЯ и их родственников (n=1088) и всесторонне исследована значительная группа пациентов. Изучение спектра и частот мутаций в генах предрасположенности в разных группах больных с учетом индивидуального и семейного анамнеза, в т.ч. диагноза заболевания и возраста его возникновения, диагноза заболеваний у родственников, степени онкологической отягощённости в семье, предоставило фундаментальную информацию о природе наследственной формы РМЖ и/или РЯ в российской популяции. Это знание позволило разработать алгоритм исследования генов BRCA1/2, ТР53, MLH1/MSH2/MSH6 и CHEK2, рис.3. ДНК-диагностика генов предрасположенности с применением разработанного алгоритма внедрена в практику МГНЦ РАМН и РОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина. Такой алгоритм применим для российских регионов с преобладанием русского населения – Центрального, Северо-Западного, Южного регионов, Сибири. В тоже время для регионов с другим этническим составом требуется дальнейшее изучение спектра мутаций в генах, поскольку высока вероятность существования иных мутаций с эффектом основателя для определённых этнических групп.

Определение и изучение генов, ответственных за наследственную предрасположенность к РМЖ/РЯ, создало принципиально новые возможности медико-генетического консультирования - ДНК-диагностика с целью выявления мутаций обеспечивает подтверждение формально-генетического диагноза, расчёт риска развития заболевания, возможность ранней диагностики, выбор тактики лечения и профилактики, а также решение проблем планирования семьи. Идентифицированная наследуемая мутация является объективным критерием формирования групп риска в отношении развития рака той или иной локализации для динамического наблюдения пациентов в условиях онкодиспансера.


Рис.3. Алгоритм проведения ДНК-диагностики для пациентов с онкологически отягощённым семейным анамнезом.

ВЫВОДЫ

  1. В спектре мутаций в гене BRCA1 в Центральном регионе России преобладают три мутации (85%), из них наиболее частая мутация 5382insC (68%). На долю редких вариантов гена приходится около 15%. Частота впервые выявленных вариантов составляет 3,2% от всех BRCA1-мутаций.
  2. Спектр мутаций в гене BRCA2 характеризуется уникальностью вариантов и высокой частотой новых мутаций (40%).
  3. Ген BRCA1 играет основную роль в наследственной предрасположенности к РМЖ и РЯ – доля BRCA1-мутаций составляет 89,4%. Мутации в гене BRCA2 обусловливают предрасположенность преимущественно к одно- и двухстороннему РМЖ.
  4. Повторяющиеся BRCA1-мутации - 2080delA, 4154delA и 5382insC находятся каждая на определённом гаплотипе гена по микросателлитным маркерам. Данные указывают на распространение этих мутаций вследствие эффекта основателя.
  5. Возникновение рака различной локализации – РМЖ или РЯ – не связано с положением мутации в гене BRCA1. В то же время конкретные мутации в гене BRCA1 (2080delA и 4154delA) обладают сайт-специфическими свойствами, обусловливающими предрасположенность к развитию преимущественно рака яичников.
  6. В группах больных РМЖ, двухсторонним РМЖ и РЯ мутации в генах BRCA1/2 встречаются с разной частотой – 32%, 52,3%, 69% соответственно (р<0,05). Подобные закономерности сохраняются в выборках, сформированных по наличию в семье разных типов рака: частоты BRCA1/2-мутаций в семьях с наследственным односторонним РМЖ, двухсторонним РМЖ и раком яичников составляют 25%, 46,3% и 66,3%, соответственно. Спектры мутаций во всех этих семьях характеризуются преобладанием одних и тех же трёх наиболее частых мутаций.
  7. В семьях с мутацией в гене BRCA1 наблюдается преимущественное накопление случаев рака той же локализации, что и у пробанда. Соотношение случаев РМЖ и РЯ значимо отличается в семьях пробандов с РМЖ или РЯ. Это характерно и для семей, наследующих одну мутацию 5382insC. Накопление преимущественно одного типа рака в семье может быть обусловлено наследованием генетических вариантов, модифицирующих риск возникновения РМЖ и/или РЯ при мутации в гене BRCA1.
  8. Наличие в семье случаев рака яичников служит показателем высокой вероятности присутствия мутации в гене BRCA1 (70%). Двухсторонний РМЖ примерно в 2 раза чаще, чем односторонний, обусловлен мутациями в генах BRCA1 и BRCA2 и характеризуется ранним возрастом диагноза первичного РМЖ.
  9. Часть наследственного РМЖ и/или РЯ (оценочно 2%) ассоциирована с мутациями в гене CHEK2 и генах MLH1, MSH2, MSH6. В таких семьях кроме РМЖ и РЯ наблюдается накопление соответствующей синдромальной патологии.
  10. Больные с наследственной формой РМЖ при ранней манифестации заболевания характеризуются высокой частотой мутаций в генах BRCA1/2 (70,6%). Среди BRCA-негативных больных с ранней манифестацией РМЖ (до 31 года) отмечается существенная частота мутаций в гене ТР53 - 13,6%, часть из которых являются мутациями de novo. Ранний возраст возникновения РМЖ свидетельствует о генетической природе заболевания, ассоциированного преимущественно с мутациями в генах BRCA1/2 и ТР53.
  11. При мутации в гене BRCA1 обнаружена ассоциация рака яичников с генотипом 203A/A гена BRCA2. Разные генотипы гена PGR, образованные двумя ОНП (G/T, rs1042838 и T/A, rs608995), ассоциированы с развитием либо РМЖ, либо РЯ. Генотипы R72Р и P72P гена ТР53 ассоциированы с раком при мутации C61G в гене BRCA1, при других BRCA1-мутациях такой связи не наблюдается.
  12. Наличие герминальной мутации в гене BRCA1 обусловливает определённую клиническую картину заболевания: ранний возраст манифестации заболевания, выраженный терапевтический эффект (100%) и определяет фенотип BRCA1-ассоциированных опухолей молочной железы, характеризующихся преобладанием инфильтративно-протокового рака (80%), высокой частотой медуллярного рака (8%), высокой степенью злокачественности, низкой частотой мультицентричности (3%); РЭ, РП, HЕR2-neu-статус опухоли является трижды отрицательным (80%).
  13. На основе полученных данных разработан и внедрен в практику алгоритм исследования генов BRCA1/2, ТР53, CHЕK2, MLH1, MSH2, MSH6 с целью изучения природы и диагностики наследственных форм РМЖ и/или РЯ. В ходе исследования создан банк образцов ДНК больных РМЖ и/или РЯ и их родственников (n=1088); пациенты охарактеризованы по мутациям в генах BRCA1/2, ТР53, CHEK2, MLH1/MSH2/MSH6 и ряду полиморфных генетических вариантов.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ


  1. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Петрова Н.И. и др. Определение мутации гена BRCA 1 при наследственной предрасположенности к раку молочной железы// Тезисы Конференции «Геном человека-99». – Москва, 1999. - С. 99.
  2. Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Хомич Е.В., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е. К., Карпухин А.В. Структурные особенности гена BRCA 1, связанные с предрасположенностью к раку молочной железы или яичников// II Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». – Москва, 2001. - С. 253
  3. Хомич Е.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.И., Логинова А.Н., Гинтер Е.К., Гарькавцева Р.Ф., Карпухин А.В. Характеристика структуры кодирующих участков гена BRCA2 при наследственном раке молочной железы среди пациентов московского региона. II Конференция молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». - Москва, 2001. - С.256
  4. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Mutations and Sequence Variations of BRCA1 Gene in Breast/Ovarian Cancer Families from Russia// Abstract Of 10th International Congress Of Human Genetics. - Eur. J. Human Genet. – 2001. – V. 9. - P.115.
  5. Pospekhova N.I., Khomich E.V., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Sequence Variations of BRCA2 Gene in Breast/Ovarian Cancer Families from Russia// Abstract Of 10th International Congress Of Human Genetics. - Eur. J. Human Genet. – 2001. – V. 9. - P.115.
  6. Karpukhin A.V., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Khomich E.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Garkavtseva R.F., Ginter E.K.. The Occurrence Of Breast Or Ovarian Cancer In Families Under Inherited Predisposition Is Associated With Single Nucleotide Polymorphisms Of BRCA1 Gene// Abstract Of 10th International Congress Of Human Genetics. - Eur. J. Human Genet. – 2001. - V. 9. - P.114-115.
  7. Гарькавцева Р.Ф., Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Брюзгин В.В., Хайленко В.А., Карпухин А.В. Возможности клинического применения генодиагностики предрасположенности к раку молочной железы и профилактического лечения носителя этого заболевания// Матер. I всероссийской научно-практической конференции с международным участием, сборник статей "Актуальные вопросы маммологии". – Москва, 2001. - С.127-132
  8. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Khomich E.V., Kuzmina I.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V.. Аssociation of 5382insС mutation with SNPs of BRCA1 gene and the mutation frequency in Russia// Abstract Of European Human Genetics Conference. - Eur. J. Human Genet. – 2002. - V. 10, Suppl. 1. - P.85.
  9. Khomich E.V., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Kuzmina I.V., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. BRCA2 mutations and polymorphisms in Russian patients with familial breast/ovarian cancer// Abstract Of European Human Genetics Conference - Eur. J. Human Genet. – 2002. - V. 10, Suppl. 1. - P.85.
  10. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Логинова А.Н., Хомич Е.В., Будилов А.В., Сергеев А.С., Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К. Частоты однонуклеотидных полиморфизмов и мутаций в гене BRCA1 при наследственно обусловленном раке молочной железы и яичников// ДАН. - 2002. – Т. 383, N5. - С. 1-4.
  11. Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Поспехова Н.И., Карпухин А.В., Шабанов М.А. Генодиагностика наследственной предрасположенности к раку молочной железы и разработка индивидуального прогнозирования развития заболевания// Материалы III научно-практической конференции "Проблемы онкогенетики: научные и прикладные аспекты". - Украина, Киев, 2002. – Онкология. - Т. 4, Suppl. - С.26-27.
  12. Liubchenko L., Pospekhova N., Shabanov M., Rotobelskaya L., Brusgin V., Khailenko V., Karpukhin A., Garcavtseva R. Fenotypic characteristics BRCA 1-associated breast cancer amoung Russian families// 18th UICC International Cancer Congress. - Int. J. Cancer. - 2002, Suppl.13. - P.327-328.
  13. Osmanova L., Liubchenko L., Pospekhova N., Portnoy S., Zhordania K., Brusgin V., Khailenko V., Karpukhin A., Garcavtseva R., Tjulandin S. Frequency of BRCA 1/2 mutations in high-risk breast/ovarian cancer families from Russian population// 27th ESMO Congress. – Ann. Oncology. – 2002. - V.13, Suppl. 5. - P.34-35.
  14. Карпухин А.В., Логинова А.Н., Хомич Е.А., Поспехова Н.И. Наследственная предрасположенность к раку молочной железы// Медицинская генетика. - 2002. -Т.1, № 6. - С. 254-261.
  15. Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Budilov A.V., Zakharyev V.M., Ginter E.K., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Analysis of genetic heterogeneity breast cancer families by BRCA1/2 gene mutations and single nucleotide polymorphisms// Eur.J.Hum.Gen. – 2003. - V. 11, Suppl.1. - P.66.
  16. Karpukhin A.V., Loginova A.N., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K. The combination of BRCA1 and BRCA2 variants is associated with risk of familial breast cancer among probands without BRCA1/2 mutations// 14th General Meeting of the BCLC/ICG-FBOC - The Breast Cancer Linkage Consortium. - Madrid, Spain, 2003. - P.41.
  17. Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Поспехова Н.И., Брюзгин В.В., Карпухин А.В. ДНК-диагностика и медико-генетическое консультирование при наследственной предрасположенности к раку молочной железы. //В сбор. «Возможности современной онкологии в диагностике и лечении злокачественных заболеваний» - Москва, 2003. - С.44-47.
  18. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Портной С.М., Брюзгин В.В., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Наследственные формы рака молочной железы и/или яичников: прогноз, тактика лечения и профилактики. //Материалы VII Российского Онкологического Конгресса. – Москва, 2003. - C.134-136.
  19. Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Будилов А.В., Гарькавцева Р.Ф., Крпухин А.В. Спектр мутаций в гене BRCA 1 при наследственных формах рака молочной железы и яичников в российских семьях// Бюлл. экспер. биол. мед. – 2003. - Т. 136, № 9. - С. 276-178.
  20. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Гетерогенность семей с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы по встречаемости мутаций в гене BRCA1// Медицинская Генетика. – 2003. - Т. 2, № 11. - С. 459-463.
  21. Lubchenko L.N., Pospekhova N.I., Bryuzgin V.V., Zharkov S.A., Podistov Y.I., Makhova E.E., Lushnikova A.A., Karpukhin A.V., Garkavtseva R.F.. Clinical and molecular characteristics of hereditary breast or/and ovarian cancer in Russian population// Eur. J. Hum. Gen. – 2004. - V. 12, Suppl.1. - P.171.
  22. Pospekhova N.I., Loginova A.N., Lubchenko L.N., Portnoy S.M., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V.. The BRCA1 and BRCA2 association among patients with sporadic and familial breast cancer without the gene mutations// Eur. J. Hum. Gen. – 2004. - V. 12, Suppl.1. - P.181.
  23. Карпухин А.В., Логинова А.Н., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., А.В. Будилов, Захарьев В.М., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К. Анализ мутаций и однонуклеотидных полиморфизмов в генах BRCA1/2 при семейном раке молочной железы и яичников: преобладание в России мутации 5382insC. Тезисы  3 съезда Всероссийского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». – Москва, 2004. - Т. 2. - С. 25.
  24. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Хомич Е.В., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Генетическая гетерогенность семей с наследственной предрасположенностью к раку молочной железы и яичников по встречаемости мутаций в генах BRCA1/2 и ассоциация вариантов этих генов с риском заболевания среди пробандов без мутаций в указанных генах// Тезисы  3 съезда Всероссийского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». – Москва, 2004. - Т. 2. - С. 90.
  25. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Портной С.М., Летягин В.П., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Генотипические варианты семей с раком молочной железы// 1 Международная онкологическая конференция «Проблемы диагностики и лечения рака молочной железы». - Санкт-Петербург, 2004. - С. 127-128.
  26. Lubchenko L.N., Pospekhova N.I., Portnoy S.M., Zordania K.I., Bryuzgin V.V., Tjulandin S.A., Karpukhin A.V., Garkavtseva R.F.. Genotypic characteristics of of hereditary breast or/and ovarian cancer in Russian population// Abstracts of the ESO Inside Track Conference on Familial Cancer. - Madrid, Spain, 2004. - Familial Cancer. – V. 3, N.2. – P. 168.
  27. Lyubchenko L., Pospekhova N., Lushnikova A., Portnoy S., Karpukhin A., Garkavtseva R. Tumor characteristics of BRCA1-associated familial breast cancer from Russian population// Eur. J. Hum. Genetics – 2005. - V. 13, Sup. 1. - P.212.
  28. Любченко Л.Н, Поспехова Н.И., Попов А.С, Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Наследственные формы рака молочной железы и яичников: ДНК-диагностика, клинико-молекулярная патология и медико-генетическое консультирование // Медицинская Генетика. – 2005. - Т.4, №5. - С.220-221.
  29. Lyubchenko L., Pospekhova N., Lushnikova A. et al., Portnoy S., Karpukhin A.V., Garkavtseva R.F. Prognostic factors for BRCA1-associated familial breast cancer from Russian population//Eur. J. Cancer. – 2005. - V. 3, N. 2. - P. 322.
  30. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Молекулярно-генетические аспекты наследственной предрасположенности к раку молочной железы и/или яичников I. Что обуславливает риск при мутациях в гене BRCA1? //Медицинская Генетика. – 2005. - № 1. - С. 23-27.
  31. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Сергеев А.С., Гинтер Е.К., Карпухин А.В.. Молекулярно-генетические аспекты наследственной предрасположенности к раку молочной железы и/или яичников. II. Что обусловливает риск семейного рака молочной железы без мутаций в генах BRCA1/2? // Медицинская Генетика. - 2005. - № 2.- С.71-75.
  32. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Музаффарова Т.А., Захаров С.Ф., Смирнова Т.Ю., Цуканов А.С., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Гончарова Е.А., Апанович П.В., Апанович Н.В. и др. Молекулярная диагностика моногенных форм рака// Медицинская Генетика. - 2006. - №5, прил.2. - С. 1-6.
  33. Pospekhova N.I., Smirnova T.Yu., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V.. BRCA 2 variant associated with modification of ovarian cancer occurrence among Russian carriers with BRCA1 mutations// Eur. J. Hum. Gen. – 2006. – V. 14, Suppl. –Р. 209.
  34. Smirnova T.Yu., Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V.. Analysis of BRCA1 and BRCA 2 genes among unselected ovarian cancer cases in Russia// Eur. J. Hum. Gen. – 2006. – V. 14, Suppl. –Р. 225.
  35. Smirnova T.Y., Pospekhova N.I., Loginova A.N., Lуubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V. Different profiles of BRCA1 and BRCA2 SNPs association with breast/ovarian cancer risk among sporadic cases and BRCA1 mutation carriers// Eur. J. Hum. Genet. – 2007. - V.15, Sup. 1. - P.166.  
  36. Смирнова Т.Ю., Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Портной С.М., Жорданиа К.И., Гарькавцева Р.Ф., Карпухин А.В. Рак молочной железы и яичников. Роль наследственных факторов//Опухоли женской репродуктивной системы. – 2007. - №4. - С. 90-96.
  37. Lyubchenko L.N., Pospekhova N.I., Lushnikova A.A., Portnoy S.M., Bryzgin V.V., Karpukhin A.V., Garkavtseva R.F. Prognostiс factors for BRCA1/2 – associated familial breast cancer from Russian population// Breast Cancer Res. Treat. – 2007. - V.106. - Р. 62.
  38. Смирнова Т.Ю., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н.,Тюляндин С.А., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Высокая частота мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 при раке яичников. //Бюлл. Эксп. Биол. Мед. – 2007. - №144 (1). - С. 83-85.
  39. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И. Медико-генетическое консультирование онкологических больных молодого возраста// Материалы XII Российского онкологического конгресса. – Москва, 2008. - С. 57-59.
  40. Пароконная А.А., Нечушкин М.И., Воротников И.К., Лушникова А.А., Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Ермилова В.Д.. Неэпителиальная опухоль молочной железы на фоне существующей беременности. Клинико-генетические особенности// Вестник РОНЦ им. Н.Н. Блохина. – 2008. - Т. 19, №1. - С. 71-75.
  41. Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Поспехова Н.И., Карпухин A.В. Медико-генетическое консультирование при наследственном раке молочной железы// Медицинская Генетика. – 2008. - № 10. - С.30-34.
  42. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Лушникова А.А., Пароконная А.А., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Клинико-генетический скрининг при опухолях женской репродуктивной системы// Вопросы онкологии. – 2008. - Т.54, №2. - С.17-18.
  43. Пароконная А.А., Лушникова А.А., Любченко Л.Н., Полевая Е.Б., Поспехова Н.И. Прогноз и течение рака молочной железы на фоне беременности и лактации: вирусно-генетические особенности// Сибирский онкологический журнал. – 2008. - №2. - С.15-20.
  44. Smirnova T.Yu., Pospekhova N.I., Loginova A.N., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V. Complex BRCA1 and BRCA2 SNP combinations are associated with breast and ovarian cancer risk modification// Eur. J. Hum. Gen.- 2008. - V.16, Suppl. 2. - P.204.
  45. Loginova A.N., Lubchenko L.N., Parokonnaya A.A., Lushnykova A.A., Garkavtseva R.F., Pospekhova N.I., Karpukhin A.V. High frequency of BRCА1 gene mutations among patients with pregnancy associated breast cancer// Eur. J. Hum. Gen. – 2008. – V. 16, Suppl. 2. - P.204.
  46. Pospekhova N.I., Lubchenko L.N., Loginova A.N., Poddubskaya E.V., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. Genetic peculiarities of families with inherited bilateral breast cancer// Eur. J. Hum. Gen. – 2008. – V.16, Suppl. 2. - P.203.
  47. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Музаффарова Т.А., Смирнова Т.Ю., Цуканов А.С., Апанович Н.В., Коротаева А.А., Любченко Л.Н., Гинтер Е.К. Молекулярные особенности генов-супрессоров наследственных форм ряда частых онкологических заболеваний// Сборник матер. Всеросс. конф. с международным участием «Молекулярная онкология». - Новосибирск, 2008. – С. 112-113.
  48. Смирнова Т.Ю., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Модификация риска локализации рака при мутациях в гене BRCA// Сборник матер. Всеросс. конф. с международным участием «Молекулярная онкология». - Новосибирск, 2008. – С. 158-159.
  49. Смирнова Т.Ю., Поспехова Н.И., Любченко Л.Н., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Молекулярные причины предрасположенности к раку яичников// Сборник матер. Всеросс. конф. с международным участием «Молекулярная онкология». - Новосибирск, 2008. – С. 156-157.
  50. Lyubchenko L., Pospekhova N., Parokonnaya A., Loginova A., Lushnikova A., Karpukhin A., Garkavtseva R.. Clinical-genetic characteristics of pregnancy associated breast cancer in Russian patients// 3-th Familial Cancer Conference. - Madrid, Spain, 2008. - Р.96.
  51. Апанович Н.В., Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Апанович П.В., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Определение протяженных делеций в гене BRCA1 при семейной форме рака молочной железы/яичников среди российских больных// Медицинская Генетика. - 2009. - №9. - С.25-31.
  52. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Пароконная А.А., Лушникова А.А., Чевкина Е.М. Рак молочной железы и /или яичников в составе наследственного онкологического синдрома. //Опухоли женской репродуктивной системы. - 2009, № 1-2. - С. 59-63.
  53. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Пароконная А.А., Стенина М.Б., Тюляндин С.А. Брюзгин В.В., Карпухин А.В., Гарькавцева Р.Ф. Редкие наследственные онкологические синдромы. Значение клинико-молекулярной диагностики// Вестник РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. – 2009. - Т. 2, № 1. - С. 93-94.
  54. Карпухин А.В., Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Музаффарова Т.А., Цуканов А.С., Смирнова Т.Ю., Апанович Н.В., Коротаева А.А., Гончарова Е.А., Любченко Л.Н., Новикова О.В., Гинтер Е.К. Генетическая гетерогенность проявления мутаций в генах-супрессорах наследственных форм онкологических заболеваний// Матер. 7-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». - Звенигород, 2009. - С.16-17.
  55. Апанович Н.В., Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Апанович П.В., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В.. Исследование перестроек генов: новая протяженная делеция в гене BRCA1 при семейной форме рака молочной железы/яичников// Матер. 7-ой Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток». - Звенигород, 2009. - С. 47-48.
  56. Pospekhova N.I., Loginova A.N., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Karpukhin A.V. The BRCA1/2 and TP53 mutations among patients with bilateral breast cancer// Eur. J. Hum.Gen. – 2009. - V.17, Suppl. 2. – P. 192.
  57. Lyubchenko L., Pospekhova N., Parokonnaya A., Portnoy S, Lushnykova A., Karpukhin A., Garkavtseva R. BRCA1 and TP53 mutations in pregnancy-associated breast cancer in Russian Patients// Abs. IMPAKT Breast Cancer Conference. - Brussels, Belgium, 2009. – Ann. Oncology. - V. 20, Suppl.2. – ii39.
  58. Smirnova T.Y., Pospekhova N.I., Loginova A.N., Lubchenko L.N., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V. The BRCA1/2 mutations and SNPs in ovarian cancer risk// Eur. J. Hum.Gen. – 2009. - V.17, Suppl. 2. – P. 191.
  59. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Шубин В.П., Портной С.М., Лушникова А.А., Анурова О.А., Любченко Л.Н., Карпухин А.В.. Двухсторонний рак молочной железы в российской популяции: молекулярно-генетические, семейные и клинические характеристики// Молекулярная медицина. - 2010.- № 3. - С. 38-42.
  60. Апанович Н.В., Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Любченко Л.Н., Апанович П.В., Гарькавцева Р.Ф., Гинтер Е.К., Карпухин А.В. Исследование наследуемых протяженных делеций в гене BRCA1 при раке молочной железы/яичников// Матер. VI съезда мед. генетиков. - Медицинская генетика. - 2010. - С.10.
  61. Поспехова Н.И., Логинова А.Н., Крохина О.В., Соболевский В.А., Любченко Л.Н., Карпухин А.В.. Наследственный рак молочной железы и/или яичников: молекулярно-генетический и семейный анализ// Матер. VI съезда мед. генетиков. - Медицинская генетика. - 2010.- С.146.
  62. Apanovich N.V., Pospekhova N.I., Loginova A.N., Lubchenko L.N., Apanovich P.V., Garkavtseva R.F., Ginter E.K., Karpukhin A.V.. The large BRCA1 new deletion revelation among Russian families with breast/ovarian cancer// Eur. J. Hum. Gen. – 2010. - V.18, Suppl. - P.164-165.

Список сокращений

ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота

ИДР – инфильтративно-дольковый рак

ЛФС – синдром Ли-Фраумени

МРМЖ – мужской рак молочной железы

ННКРР – синдром наследственного неполипозного колоректального рака

НРМЖ/РЯ - наследственный рак молочной железы и/или яичников

ОГМ – опухоль головного мозга

ОНП – однонуклеотидный полиморфизм

ПМЗН - первично-множественные злокачественные новообразования

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в реальном времени

РЖ – рак желудка

РМЖ – рак молочной железы

РМЖ-АБ - рак молочной железы, ассоциированный с беременностью

двРМЖ – двухсторонний рак молочной железы

РП – рецептор прогестерона

РПЖ – рак предстательной железы

РТК – рак толстой кишки

РТМ – рак тела матки

РЭ – рецептор эстрогена

РЯ – рак яичников

СЛФП - синдром Ли-Фраумени подобный

BIC database - Breast Cancer Information Core Database

CSGE – метод конформационно-чувствительного электрофореза

RFLP – метод анализа длины рестрикционных фрагментов

SSCP – метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.