WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Распределение рибосомного материала бактерий в организме животного (радиоизотопное исследование)

На правах рукописи

Кошелева Светлана Владимировна


РАСПРЕДЕЛЕНИЕ РИБОСОМНОГО

МАТЕРИАЛА БАКТЕРИЙ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНОГО

(РАДИОИЗОТОПНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ)



03.00.07 — микробиология

14.00.36 — аллергология и иммунология

Автореферат диссертации

на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Москва

2007

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Кубанский государственный медицинский университет» Росздрава.

Научные руководители:
доктор биологических наук профессор
Орлов Вячеслав Георгиевич
кандидат медицинских наук доцент Крылов Виталий Петрович
Официальные оппоненты:
лауреат Государственной премии РФ в области науки и технологии, доктор медицинских наук профессор, Пашков Евгений Петрович
заслуженный деятель науки РФ, доктор медицинских наук профессор Винницкий Леонид Ильич
Ведущая организация:
ГУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени И. И. Мечникова» РАМН.
Московский городской НИИ скорой помощи имени Н. В. Склифосовского

Защита состоится «____» ____________ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д208.040.08 при ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова» по адресу: 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московская медицинская академия имени И. М. Сеченова» (117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49).

Автореферат разослан «____» ____________ 2007 года.

Учёный секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук

профессор Миронов Андрей Юрьевич

Актуальность темы. Разработка новых иммунобиологических препаратов является важной задачей современной вакцинологии и клинической иммунологии [А. А. Воробьёв, 1999; В. И. Покровский, Б. Ф. Семёнов, 1999; В. М. Манько, Р. В. Петров, Р. М. Хаитов, 2002]. Актуальными задачами современной медицинской науки в области иммунопрофилактики становятся изучение природы и механизмов раннего специфического иммунного ответа, поиск средств, которые могут этот ответ индуцировать и регулировать [В. В. Зверев, Б. Ф. Семенов, 2002]. При этом приоритетным является поиск более эффективных и менее реактогенных иммуногенов. К их числу следует отнести бактериальные рибосомы.

Роль рибосом в биосинтезе белка была окончательно выяснена ещё в середине XX века [Ф. Шапвиль, Э.-Л. Энни, 1977; А. С. Спирин, 1986]. Изучение иммуногенных свойств рибосом, начиная с первого сообщения [A. S. Youmans, G. P. Youmans, 1965], является объектом исследования уже более 40 лет. За это время сформировалось самостоятельное направление в современной вакцинологии [Т. К. Eisenstein et al., 1976; E. Segal, R. Levy, E. Eylan, 1978; M. M. Lieberman, D. C. McKissock, G. L. Wright, 1979; В. И. Левенсон, В. В. Хазанова, 1991; L. Dussourd d’Hinterland, 1980; R. L. Gregory, 1986; R. Cabrera-Contreras, 1990; L. V. Nicolaeva, E. P. Savel’ev, 1991; G. Normier et al., 1992; D. Elad, E. Segal, 1994; M. Eckstein, 1997 и др.].

К иммуногенным особенностям бактериальных рибосом относят высокую и стойкую протективную активность, расширенную специфичность защиты, крайне низкую токсичность, иммунокорригирующую активность [В. И. Левенсон и др., 1988; И. Н. Бакулин, Т. И. Сергеева, 1990; П. В. Оветчин, А. Я. Цыганенко, 1984]. Препараты на основе бактериальных рибосом в настоящее время применяются не только как классические вакцины, но и как иммуномодуляторы [P. M. Хаитов и др., 1994; С. М. Гордиенко, О. И. Ласица, А. Г. Федорчук, 1995]. Всё это позволяет рассматривать их в качестве основы для конструирования вакцинных препаратов нового поколения. Однако до настоящего времени не исследованы в эксперименте особенности фармакокинетики рибосомного материала.

Метод радиоизотопного измерения позволяет дать комплексный анализ распределения и накопления в макроорганизме экспериментальных животных радиоактивной метки, введённой в составе 70S рибосом. Мечение бактериальных рибосом путём биологического синтеза максимально сохраняет их структуру, что необходимо для соблюдения принципа интактности рибосом при реализации их иммунотропной активности [В. П. Крылов, 1996; В. Г. Орлов и др., 1998]. Информация о распределении рибосомного материала в органах и тканях экспериментального животного будет способствовать пониманию механизма действия препаратов на основе бактериальных рибосом, тем более что до настоящего времени этот вопрос остаётся открытым.

Цель исследования — определить закономерность распределения рибосомного материала E. coli MRE600 в организме экспериментальных животных с применением радиоизотопного метода исследования и выявить зависимость иммунотропной активности вводимого препарата от структурной целостности рибосом.

Задачи исследования

  1. Получить препарат 14С-70S рибосом E. coli MRE600 с высокой удельной радиоактивностью.
  2. Оценить характер распределения и накопления меченного радиоактивным углеродом рибосомного материала E. coli MRE600 в органах и тканях экспериментальных животных и динамику его перераспределения в разные сроки от момента введения.
  3. Установить закономерности распределения 70S рибосом E. coli MRE600, меченных изотопом 14С, в зависимости от пути их введения в макроорганизм экспериментального животного.
  4. Оценить влияние структурной целостности рибосом E. coli MRE600 на их иммунотропную активность.

Основные положения, выносимые на защиту

  1. Рибосомы E. coli MRE600 различной степени целостности, вводимые различными способами в макроорганизм белых мышей, неравномерно распределяются в органах и тканях, проявляя тропность к органам иммунной системы.
  2. Рибосомы E. coli MRE600, вводимые парентерально в макроорганизм белых мышей, проявляют тропность к нейтрофильным гранулоцитам.
  3. Иммунотропная активность 70S рибосом E. coli MRE600 формируется под влиянием разнонаправленных иммунотропных эффектов большой и малой рибосомных субъединиц.

Научная новизна. В настоящей работе впервые:

  1. разработана методика получения 14С-70S рибосом E. coli MRE600 с высокой удельной радиоактивностью для исследования фармакокинетики рибосомного материала в макроорганизме;
  2. изучена кинетика распределения рибосомного материала в макроорганизме лабораторного животного и выявлены особенности распределения по органам и тканям в зависимости от внутривенного (в/в), внутрибрюшинного (в/б) и подкожного (п/к) способов введения исследуемого препарата;
  3. установлено, что иммунологическая специфичность антисывороток к 70S рибосомам, определяемая в реакции Ухтерлони, связана с 50S, но не 30S субъединицами;
  4. изучены иммунотропные эффекты 70S, 50S и 30S рибосом E. coli MRE600 в эксперименте на нелинейных мышах.

Научно-практическая значимость. Анализ распределения и накопления рибосомного материала в макроорганизме экспериментальных животных, изучение влияния структурной целостности рибосом на их иммунотропную активность, углубляют представление о механизме действия медицинских иммунобиологических препаратов на основе бактериальных рибосом, экспериментально обосновывают необходимость соблюдения принципа интактности рибосом. Внедрение результатов данного исследования в практику производства рибосомных МИБП позволит получать препараты с более высокой протективной и иммунотропной активностью.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на научно-практической конференции молодых ученых и студентов Краснодарского края (Туапсе, 2002); IX Всероссийской научно-практической конференции «Молодые учёные в медицине» (Казань, 2004); V Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XI веке» (Москва, 2004); второй Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2005), четвёртой Межрегиональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов Юга России «Медицинская наука и здравоохранение» (Анапа, 2006), третьей Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Анапа, 2006).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, в том числе 2 в центральной печати.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 27 таблицами и 14 рисунками; состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, четырёх глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. В работе использовано 105 отечественных и 56 зарубежных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штаммы, полученные из ГИСК им. Л. А. Тарасевича: E. coli MRE600; E. coli DH1 с Hly-плазмидой pRD1, S. aureus 209 Р. Тотальные 70S рибосомы получали в ходе дифференциального ультрацентрифугирования [модификация В. П. Крылова, 1996]. Разделение рибосомных субъединиц проводили в линейном градиенте концентрации сахарозы («Sigma») 5-20% после диссоциации 70S рибосом на 50S и 30S частицы путём диализа в течение 18 часов против буферного раствора с концентрацией Mg2+ 10-3 М. В эксперименте по изучению иммунотропной активности 70S рибосом E. coli in vivo через 1 час после внутрибрюшинного введения использовали рибосомные фракции, полученные методом гель-фильтрации [Н. Э. Скобликов, 2004]. Качество рибосомного материала тестировали методами спектрофотометрического, седиментационного и электрофоретического анализов.

В экспериментах по изучению распределения меченого рибосомного материала в организме животного и распределения радиоактивности среди клеток периферической крови белых мышей после введения 14С-70S рибосом использовали метод радиоизотопного анализа. 14С-70S рибосомы получали дифференциальным центрифугированием из биомассы, выращенной в присутствии 14С-L-лейцина. Радиоактивность измеряли на автоматическом сцинтилляционном счётчике LS 8100 («Beckman», США) в counts per minute (Cpm). Эффективность счёта по 14С составляла 85-90 %. Ошибка счёта 2 не превышала 2%. Использованный нами метод количественного определения даёт сведения о содержании так называемого радиоактивного эквивалента препарата, то есть о суммарном содержании препарата и его метаболитов. Все манипуляции, связанные с использованием радиоактивных веществ выполнялись с учётом норм радиационной безопасности и санитарных правил [НРБ – 99, ОСПОРБ – 99, СанПиН – 2001].

При изучении распределения меченого рибосомного материала в организме животного 14С-70S рибосомы вводили белым беспородным мышам-самцам массой 22-25 г (144 шт.) однократно внутривенно (в/в) в ретроорбитальный синус в дозе 34 мг/кг (70,2 мкКи/кг), внутрибрюшинно (в/б) в левую паховую область в дозе 35,024 мг/кг (71,8 мкКи/кг) и подкожно (п/к) в левое бедро, 35,37 мг/кг (72,5 мкКи/кг). В качестве контроля использовали 14С-L-лейцин в дозе 0,223 мг/кг (73 мкКи/кг). Уровни радиоактивности в органах и тканях животных (грудина, лёгкие, печень, селезёнка, почки, лимфоузлы, тимус, мышца, плазма, форменные элементы) определяли через 0,25, 0,5, 1, 2, 4, 12, 24 и 48 часов после введения меченых веществ. Подготовка проб к анализу проводилась по Л. А. Остерману [1983].

Для оценки распределения 14С-70S рибосом в органах и тканях вычисляли следующие показатели: коэффициент поглощения Q (%), то есть соотношение обнаруженной радиоактивности 1 г органа или ткани к введённой радиоактивности в Cpm на 1 г массы тела животного, умноженного на 100 [У. А. Арипов и др., 1983]; коэффициент дифференциального накопления (КДН), то есть отношение удельной радиоактивности препарата в органе к удельной активности в плазме крови [Т. А. Миронюк, 1992]; площадь под фармакокинетической кривой (ПФК, %·ч) изменения параметра Q во времени от момента первой регистрации радиоактивности – через 15 минут до 4 и 48 часов после введения радиоактивных веществ [М. В. Корсаков, 1988]. ПФК определяли методом численного интегрирования с помощью математического пакета «Matematica 5,0» с подключённым модулем «NumericalMath'List Integrate'». Статистически значимые различия параметров распределения 14С-70S рибосом и 14С-L-лейцина явились косвенным подтверждением того, что радиоактивная метка сохраняет связь с рибосомным материалом после введения в организм экспериментального животного в течение некоторого времени.

При оценке распределения 14С-70S рибосом среди фракций форменных элементов крови растворы радиоактивных веществ вводили внутрибрюшинно, однократно, в объёме 25 мл на 1 кг веса животного. Доза введённой радиоактивности 14С-70S рибосом составила 218 мкКи/кг. Контроль в виде 14С-L-лейцина вводили с эквивалентной радиоактивностью. Через 0,25, 0,5 и 1час после введения меченых веществ животных (всего 18 мышей) забивали путём декапитации и собирали кровь в центрифужные пробирки с 0,04 г/л ЭДТА (рН 7,2-7,4). Фракции клеток получали с помощью фиколл-верографинового градиента по И. В. Нестеровой [1992]. После подсчёта количества клеток в полученных нейтрофильной и эритроцитарной фракциях, проводили их радиометрию. Радиоактивность выражали в импульсах в минуту на 106 клеток.

В эксперименте по изучению иммунотропной активности иммунизацию мышей 70S, 50S и 30S рибосомами проводили внутрибрюшинно в дозе 1 нг на мышь трёхкратно с интервалом в 5 суток по [Ф. Ш. Сиюхова, 1999]. Контрольным животным вводили внутрибрюшинно буферный раствор № 2 в объёме 0,5 мл по той же схеме, что и опытным животным. Оценку иммунотропной активности проводили через 5 суток после завершения курса иммунизации. Определяли общее количество лейкоцитов, относительное и абсолютное число лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов (НГ) по [В. В. Меньшиков и др., 1987]; лимфоцитов, вступающих в реакцию спонтанного розеткообразования с эритроцитами барана (Е-РОК) по [Р. В. Петров и др., 1989]. Реакцию бактериального фагоцитоза проводили по [И. В. Нестерова и др., 1989] с использованием S. aureus 209-Р. Определяли долю фагоцитарно-активных НГ (% ФАН), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ), процент переваривания (ПП), индекс переваривания (ИП). Состояние микробицидных систем НГ оценивали с помощью НСT-теста с использованием среднего цитохимического индекса (СЦИ) и коэффициента мобилизации (КМ) в модификации по [И. В. Нестерова и др., 1989]; миелопероксидазной (МП) активности НГ [J. Sato, L. Selkija, 1928]; уровню катионных белков (КБ) [В. Е. Пигаревский, 1975, 1978]; неспецифической -нафтилацетатэстеразы (АЭ) по [Э. Пирс, 1964].

При изучении иммунотропной активности через 1 час после однократного введения белым мышам 1 нг 70S рибосом определяли % ФАН, ФЧ, ФИ, ПП, ИП, СЦИ образования формазановых гранул и КМ НГ. При этом использовали штаммы E. coli DH1 (Hly+) и E. coli MRE600 (Hly–), а рибосомные фракции выделяли с помощью дифференциального ультрацентрифугирования или гель-фильтрацией.

Исследование иммунологической специфичности препаратов бактериальных рибосом и их субъединиц проводили с помощью антирибосомных кроличьих сывороток, полученных по методике Ю. Л. Субботиной с соавт. [1979]. Реакции преципитации 70S, 50S и 30S рибосом E. coli с сывороточными антирибосомными антителами проводили по Ухтерлони [O. Ouchterlony, 1953].

Весь материал был подвергнут адекватной статистической обработке [A. M. Мерков, 1970] с расчётом средней величины (М), ошибок средних величин (m), средних квадратичных отклонений (). Во всех случаях распределение носило нормальный характер. Достоверность различия между отдельными средними величинами определяли с помощью параметрического критерия Стьюдента. Наблюдаемые различия считались неслучайными, когда вероятность «p» ошибочного принятия нулевой гипотезы не превышала 0,05 [А. М. Мерков, Л. Е. Поляков, 1974]. Характер распределения признака в совокупности оценивали по правилу трёх сигм [А. В. Караулов, А. М. Земсков, 2002]. Математическая обработка результатов проводилась в программной среде «Microsoft Excel».

Планирование и проведение экспериментов проводилось в соответствии с правилами лабораторной практики в Российской Федерации [Приказ МЗ РФ от 19.06.2003 №267]. Микробиологические и иммунологические исследования проводились при технической и методической поддержке Н. Э. Скобликова, Н. Н. Лищенко, С. В. Егоровой, Е. В. Фомичёвой, О. А. Качановой.

Результаты исследований

Получение высокомеченых 14C-70S рибосом Escherichia coli MRE600

Для получения высокомеченых 14С-70S рибосом E. coli MRE600 в ходе предварительных опытов были найдены условия оптимального включения радиоизотопной метки в бактерии штамма E. coli MRE600. 14С-L-Лейцин добавляли в среду культивирования до концентрации 2 мкКи/мл (удельная радиоактивность 14С-L-лейцина 0,328 мКи/мг). Дезинтеграцию и выделение рибосомных фракций бактериальных клеток проводили тем же образом, что и при получении немеченых рибосом. Удельная радиоактивность полученных серий рибосом составляла от 1,9 до 2,05 мкКи/мг, что позволило отнести их к категории высокомеченых рибосом.

В процессе отмывания биомассы и выделения рибосомных фракций, вся не связанная с рибосомами радиоактивная метка удалялась, что дополнительно исследовалось путём измерения радиоактивности супернатантов.

Полученные 14С-70S рибосомы Escherichia coli MRE600 соответствовали нашим требованиям и позволяли изучить распределение рибосомного материала в организме животного.

Распределение радиоактивного эквивалента бактериальных рибосом

в организме экспериментальных животных

Сравнительное исследование поведения 14С-70S рибосом и 14С-L-лейцина в организме мышей в зависимости от в/в, в/б и п/к путей введения препаратов выявило существенные различия фармакокинетики рибосомного материала и контроля. Оказалось, что при введении 14С-70S рибосом радиоактивная метка преимущественно поглощается тканями грудины, тимуса, селезёнки и лимфоузлов, тогда как при введении 14С-лейцина возрастает удельная активность тканей лёгких, почек, печени, крови и мышц. Средние значения коэффициента поглощения (Q, %) тканей, проявляющих высокий тропизм для рибосомного материала, превышали контрольные показатели в 2-5 раз на протяжении периода наблюдения. Напротив, ткани с низким тропизмом для рибосом, поглощали свободный 14С-лейцин в 1,1-1,99 раза активнее, чем рибосомный материал.

Изученные нами в/в, в/б и п/к способы введения препаратов, влияли на особенности распределения рибосомного материала в организме животного незначительно. Различия заключались во времени достижения максимальных значений Q (%) и, соответственно, времени проявления специфичности избирательного накопления препаратов в тканях. Характер распределения меченых веществ в тканях был одинаковым (таблицы 1, 2, 3). При в/в поступлении максимум поглощения наблюдался через 15 минут, при в/б — через 30 минут, при п/к — через 2-4 часа. При в/б и п/к поступлении препаратов экспоненциальному снижению коэффициента поглощения предшествовал период его повышения, что обусловлено преобладанием скорости всасывания меченых веществ в кровеносное русло над скоростью их элиминации при несосудистых способах введения [В. Н. Соловьёв, А. А. Фирсов, В. А. Филов, 1980].

При сравнении Q (%) органов при в/в и в/б способах введения между собой, достоверно выше радиоактивность была при в/в введении: в течение первых 2 часов у грудины, печени, тимуса и на протяжении не более 0,25 и 1 часа у селезёнки, лимфоузлов и мышц соответственно. Удельная активность лёгких, почек, плазмы и форменных элементов статистически значимых различий не имела. Практически во всех органах на протяжении первых 2 часов значения Q (%) были достоверно выше при в/в и в/б способах введения по сравнению с п/к.

Мы считаем, что при п/к поступлении 14С-70S рибосом в точке введения препарата формируется депо, которое определяет дальнейший

Таблица 1

Распределение активности по органам и тканям интактных лабораторных животных (белые беспородные мыши) при внутривенном введении 14С-70S рибосом (Q, % от введённой активности) (M±m; n=3)

Органы и ткани Коэффициент поглощения Q, %
Время после введения 14С-70S рибосом, ч
0,25 0,5 1 2 4 12 24 48
грудина 228,07± 19,20** 225,20± 14,19** 217,17± 19,97* 187,29± 14,26* 113,27± 11,06** 67,70± 6,39* 45,98± 4,56* 33,52± 3,69**
лёгкие 88,46± 10,52 79,89± 8,66 68,83± 8,36 52,97± 4,76 27,82± 3,57 23,90± 2,75 14,11± 2,53 12,64± 3,23
печень 178,57± 11,87 170,90± 9,26 152,34± 7,68 103,83± 4,92 66,94± 7,31 37,57± 3,22 29,38± 3,18 14,04± 2,09
селезёнка 200,38± 11,36*** 189,80± 16,94*** 172,79± 14,13** 118,37± 9,03** 74,18± 6,24*** 40,16± 3,58 31,03± 4,06 22,48± 2,21**
почки 150,81± 14,16 138,04± 11,82 108,71± 10,78 79,71± 10,30 48,41± 3,40 34,37± 3,34 21,89± 3,31 17,48± 1,54
лимфоузлы 195,21± 17,56*** 188,08± 14,88*** 177,67± 10,51* 149,00± 6,85* 97,04± 5,67* 53,21± 3,80* 37,68± 2,68* 26,80± 2,08*
тимус 209,98± 13,58** 207,83± 17,62** 202,73± 17,66* 171,43± 12,32* 104,39± 9,75** 60,01± 4,04* 41,82± 3,94* 32,44± 4,84**
мышца 66,18± 7,43 60,08± 4,22 46,84± 3,74 34,56± 3,07 24,98± 2,41 18,42± 1,61 11,98± 2,12 6,90± 1,38
плазма 208,59± 21,23 156,96± 14,40 119,56± 12,36 69,89± 12,48 35,60± 5,07 21,71± 2,34 14,91± 2,38*** 10,48± 1,88
форменные элементы 120,12± 10,57 110,62± 8,06 90,14± 5,84*** 45,30± 5,12*** 20,01± 3,00 10,02± 0,88 8,06± 1,70 5,20± 1,25

Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (по критериям Стьюдента) при р<0,001 — *; при р<0,01 — **, р<0,05 — ***, (обозначены значения, превышающие контроль).

Таблица 2

Распределение активности по органам и тканям интактных лабораторных животных (белые беспородные мыши) при внутрибрюшинном введении 14С-70S рибосом (Q, % от введённой активности) (M±m; n=3)

Органы и ткани Коэффициент поглощения Q, %
Время после введения 14С-70S рибосом, ч
0,25 0,5 1 2 4 12 24 48
грудина 118,07± 12,52** 159,94± 13,51** 160,60± 9,26* 134,63± 10,21* 99,84± 3,75* 50,77± 4,63* 34,10± 3,54** 31,37± 1,84**
лёгкие 60,57± 3,31 71,77± 5,98 65,51± 4,97 44,10± 3,78 31,68± 2,85 19,57± 2,43 11,50± 2,43 6,40± 2,76
печень 106,38± 11,14 150,62± 12,69 100,66± 5,96 67,83± 4,07 52,56± 5,35 30,17± 2,92 20,33± 4,25 12,00± 2,13
селезёнка 129,79± 9,42 155,64± 10,73 149,27± 8,05** 101,89± 5,40* 66,56± 8,35*** 34,92± 5,10 23,88± 2,79 18,05± 1,72***
почки 117,37± 8,34 140,17± 11,10 104,23± 10,78 70,80± 5,85 48,99± 5,06 21,60± 2,43 16,27± 2,93 13,96± 2,21
лимфоузлы 115,13± 8,59** 151,70± 10,42*** 145,35± 12,23** 123,64± 12,94** 89,99± 8,65** 45,27± 3,92* 30,46± 3,48** 23,52± 4,06*
тимус 59,25± 6,40*** 141,43± 11,99*** 140,66± 10,68** 116,34± 11,66** 83,62± 4,93* 48,03± 3,54* 33,52± 3,29** 27,28± 2,92*
мышца 29,00± 3,65 34,10± 3,05 33,07± 2,80 30,10± 1,88 20,09± 3,12 16,23± 2,34 8,87± 1,44 7,90± 1,72
плазма 150,24± 12,77 151,57± 9,63 108,03± 6,97 46,57± 4,25 29,92± 3,85 15,80± 1,85 10,75± 1,34 8,72± 2,47
форменные элементы 103,80± 6,44* 115,30± 7,85** 78,10± 4,72** 44,83± 2,85*** 22,08± 1,72*** 11,95± 1,72 6,07± 0,84 5,92± 1,65

Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (по критериям Стьюдента) при р<0,001 *; при р<0,01 **, р<0,05 ***, (обозначены значения, превышающие контроль).

Таблица 3

Распределение активности по органам и тканям интактных лабораторных животных (белые беспородные мыши) при подкожном введении 14С-70S рибосом (Q, % от введённой активности) (M±m; n=3)

Органы и ткани Коэффициент поглощения Q, %
Время после введения 14С-70S рибосом, ч
0,25 0,5 1 2 4 12 24 48
грудина 15,73± 1,87*** 29,13± 2,85** 59,24± 4,12*** 86,72± 10,12** 91,94± 5,74* 62,56± 4,14* 46,92± 4,97* 27,55± 2,97**
лёгкие 18,93± 3,39 20,73± 2,15 36,72± 3,14 48,27± 3,97 45,18± 2,93 15,45± 1,49 12,64± 1,27 8,54± 0,88
печень 18,65± 2,15 20,30± 2,12 42,46± 5,21 54,49± 5,72 55,04± 3,65 32,24± 3,70 18,13± 1,50 15,08± 1,50
селезёнка 15,18± 2,29 23,01± 2,86 49,08± 4,27 60,58± 4,95 62,80± 4,11** 41,95± 3,44** 25,14± 2,54** 18,13± 1,93***
почки 20,99± 1,78 23,07± 2,67 40,76± 3,7 59,11± 9,39 41,08± 5,05 25,88± 3,29 14,24± 1,50 13,42± 1,32
лимфоузлы 15,47± 2,23 27,49± 2,49*** 55,72± 4,11*** 80,31± 6,89** 99,28± 12,57** 54,58± 3,02* 39,29± 3,16* 24,69± 2,34*
тимус 18,05± 2,39*** 24,97± 1,96*** 47,92± 3,97*** 71,48± 3,56* 76,04± 5,38* 60,01± 4,50* 42,55± 2,66* 28,56± 2,07*
мышца 8,73± 1,41 10,40± 1,57 21,09± 3,11 25,95± 2,53 22,71± 2,12 12,79± 1,36 8,35± 1,06 4,82± 1,21
плазма 28,35± 4,15 30,91± 2,90 48,08± 3,03 33,42± 3,51 24,18± 2,90 15,79± 1,26 10,05± 0,83 8,38± 0,90
форменные элементы 13,20± 2,00 17,92± 1,49 30,51± 2,77 20,80± 1,88 14,33± 1,13 10,98± 1,62 8,29± 1,51 4,49± 0,35

Примечание. Различия статистически значимы по сравнению с контролем (по критериям Стьюдента) при р<0,001 *; при р<0,01 **, р<0,05 ***, (обозначены значения, превышающие контроль).

характер всасывания и обусловливает достоверно более низкие абсолютные значения Q (%) во всех тканях по сравнению с в/в и в/б способами введения, которые наблюдаются на протяжении только первых 4 часов при повторении тех пропорций распределения метки, которые характерны для в/в и в/б способов введения препаратов.

Соответственно времени достижения максимума накопления метки, время проявления специфичности к органам согласно значениям КДН составило 0,25 часа при в/в, 0,5 часа при в/б и 1 час при п/к способах введения. Однако уже через 2 часа от момента введения препаратов существенных достоверных различий в значениях КДН при изученных способах введения не наблюдалось.

К группе органов с высокой специфичностю накопления радиоактивного эквивалента бактериальных рибосом [классификация по Т. А. Миронюк, 1992] можно отнести грудину, тимус и лимфоузлы. Так, у грудины: при п/к введении КДН > 3 отмечался на протяжении 45 часов (93,8%) времени наблюдения; при в/в введении 44 часа (91,7%) времени наблюдения и 28 часов (58,3%) времени наблюдения при в/б способе введения препарата. У тимуса КДН > 3 отмечался на протяжении 44 часов (91,7%) времени наблюдения при п/к введении и 38 часов (79,2%) времени наблюдения при в/б способе введения препарата. Кроме того, при п/к введении рибосом КДН > 3 отмечался у лимфоузлов на протяжении 45 часов (93,8% времени) наблюдения.

К группе органов со специфическим накоплением радиоактивного эквивалента 14С-70S рибосом относятся селезёнка при всех способах введения и тимус с лимфоузлами при в/в и в/б способах введения 14С-70S рибосом. У тимуса КДН>2<3 отмечался на протяжении 46 часов (95,8%) времени наблюдения при в/в введении и 10 часов (20,8%) при в/б способе введении препарата. У лимфоузлов при в/б введении КДН>2<3 отмечался на протяжении 46,5 часов (96,9%) времени наблюдения, при в/в введении — 46 часов (95,8%) времени наблюдения. Специфическое накопление 14С-70S рибосом в тканях селезёнки было зафиксировано в течение 46 часов (95,8%) при в/б введении, в течение 45,5 часов (94,8%) при п/к введении и в течение 44 часов (91,7%) времени наблюдения при в/в способе введения препарата. При введении животным свободного 14С-лейцина КДН грудины, лимфоузлов и тимуса не превышали единицу при всех способах введения.

Для подтверждения факта активного накопления рибосомного материала в исследуемых тканях определялась экспозиция меченых веществ вычислением площади фармакокинетической кривой (ПФК). На рис. 1 представлены ПФК за весь период наблюдения. (ПФК0,25-48). Опытным и контрольным животным препараты вводились в одинаковых радиоактивных дозах. Однако суммарные значения ПФК органов при введении 14С-L-лейцина были меньше, чем при введении 14С-70S рибосом, что свидетельствует о более быстром выведении метки из организма животного в составе контроля. Независимо от способа введения препарата ПФК0,25-48 грудины свидетельствовали о максимальной кумуляции изотопа в составе рибосомного материала и достоверно отличались от остальных исследованных органов, кроме тимуса и лимфоузлов, которые занимают второе место по уровню кумуляции рибосом.

Рис. 1. ПФК экспозиции 14С-70S рибосом E. coli MRE600 (а) и 14С-лейцина (б) в органах и тканях за период от 0,25 до 48 часов

Следует отметить, что ПФК0,25-48 селезёнки не отличается от ПФК0,25-48 печени при всех способах введения.

Таким образом, характер распределения радиоактивного материала существенно не зависит от изученных способов введения бактериальных рибосом, а п/к способ может быть рекомендован в качестве предпочтительного. Вполне вероятно, что внутримышечный путь поступления рибосомного материала, не использованный нами в данной работе, также будет допустимым.

Распределение радиоактивности среди клеток крови экспериментальных животных после введения 14С-70S рибосом

Проведённые исследования показали, что при внутрибрюшинном введении 14С-70S рибосом в периферической крови мышей радиоактивность обнаруживается как во фракции эритроцитов, так и во фракции нейтрофилов. Однако, если через 0,25 часов после введения радиоактивность 106 эритроцитов составляла 123,10±19,866 Cpm, то у 106 нейтрофилов радиоактивность была в 13,55 раз больше (t=4,743, р < 0,01). Через 0,5 часа и 1 час различия не только не уменьшались, но и увеличивались (t=6,383, р < 0,005; t=7,921, р < 0,005 соответственно). Это связано с тем, что удельная радиоактивность фракции эритроцитов со временем практически не изменялась, тогда как в течение всего периода наблюдения удельная радиоактивность нейтрофилов постоянно увеличивалась. Через 0,25 часа у 106 клеток нейтрофилов было всего 1668,440±325,211 сцинтилляций в минуту, тогда как через 1 час уже 5519,110±681,950 (t=4,528, р < 0,05). Что касается сравнения с контролем (введением 14С-лейцина), то статистически значимые различия удельных радиоактивностей имелись у обеих фракций. Уровень значимости различий с контролем фракции эритроцитов в течение всего периода наблюдения оставался постоянным (р < 0,05), тогда как удельная радиоактивность фракции нейтрофилов через 0,25, 0,5 и 1 час имела отличия с контролем разного уровня значимости (t=4,812, р < 0,01; t=6,465, р < 0,005 и t=8,002, р < 0,005 соответственно). Это может говорить о продолжении взаимодействия 14С-70S рибосом и (или) их фрагментов с нейтрофилами как минимум в течении 1 часа после введения препарата в организм (время периода наблюдения).

При введении 14С-лейцина достоверной разницы между радиоактивностями фракции эритроцитов и фракции нейтрофилов не обнаружилось.

Таким образом, удельная радиоактивность фракции нейтрофильных гранулоцитов белых беспородных мышей значительно преобладает над удельной радиоактивностью других форменных элементов крови при внутрибрюшинном введении 14С-70S рибосом E. coli MRE600, но не 14С-лейцина (таблица 4).

Таблица 4

Удельная радиоактивность фракций форменных элементов периферической крови белых мышей при внутрибрюшинном введении 14С-лейцина и 14С-70S рибосом (Cpm /106 клеток) (M±m)

Препарат, вводимый животному Исследуемые форменные элементы крови Время после введения, ч
0,25 0,5 1
14С-лейцин (контроль) эритроциты 57,440 ± 12,625 60,850 ± 9,211 58,370 ± 9,639
НГ 101,110 ± 18,308 97,780 ± 14,677 60,830 ± 13,889
14С-70S рибосомы эритроциты 123,10 ± 19,866*** 131,68 ± 21,81*** 115,82 ± 16,439***
НГ 1668,440 ± 325,211** 2942,220 ± 439,760* 5519,110 ± 681,950*

Примечание: уровни значимости различий по отношению к контролю:

* p < 0,005; ** p < 0,01; *** p < 0,05.

Иммунотропная активность 70S рибосом E. coli

в эксперименте in vivo через 1 час при однократном введении

Нами была изучена фагоцитарная активность и кислородзависимый антимикробный потенциал нейтрофильных гранулоцитов мышей, которые за 1 час до исследования получали внутрибрюшинную инъекцию 70S рибосом, полученных из Hly+ и Hly– штаммов кишечных палочек.

В результате исследования выяснилось, что фагоцитарная активность НГ практически не изменялась, однако под воздействием 70S рибосом штамма E. coli DH1, полученных методом гель-фильтрации, стимулировались оксидазные микробицидные системы НГ мышей как в НСТ-спонтанном (t=3,153, р < 0,05), так и в НСТ-стимулированном (t=2,441, р < 0,05) тестах соответственно (рис. 2).

 Рис. 2. Иммунотропная активность 70S рибосом E. coli штаммов MRE600 и DH1-5
Рис. 2. Иммунотропная активность 70S рибосом E. coli штаммов MRE600 и DH1 через 1 час при однократном введении Рис. 3. Иммунотропная активность 70S, 50S и 30S рибосом E. coli MRE600 в эксперименте in vivo при трёхкратном введении

Иммунотропная активность70S, 50S и 30S рибосом E. coli MRE600

в эксперименте in vivo при трёхкратном введении

При трёхкратной иммунизации мышей препаратами 70S, 50S и 30S рибосом E. coli MRE600 получены эффекты, свидетельствующие о взаимосвязи иммунотропной активности рибосом с морфологическим типом рибосомных фракций. Оказалось, что иммуностимулирующая активность, которую проявляли 70S рибосомы, трансформировалась в оппозитные иммунотропные эффекты при использовании больших и малых субъединиц. При этом стимулирующая активность 50S рибосом в отношении абсолютного числа лейкоцитов, лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, а также Е-РОК-лимфоцитов была достоверно выше аналогичных показателей в группе животных, иммунизированных 70S рибосомами (t=2,704, p<0,01; t=8,243, p<0,001; t=4,376, p<0,05; t=11,678, p<0,001 соответственно). Напротив, 30S рибосомы угнетающе действовали на перечисленные выше показатели, которые достоверно отличались от соответствующих значений у контрольных животных (t=3,063, p<0,01; t=3,633, p<0,001; t=2,081, p<0,05; t=4,06, p<0,001 соответственно). Под воздействием 70S и 50S рибосом число Е-РОК возрастало в 2,8 и 3,74 раза соответственно, а под влиянием 30S рибосом снижалось в 1,8 раза, тогда как остальные анализируемые в работе показатели колебались менее существенно (в 1,3 1,6 раза) для всех морфологических типов рибосом (рис. 3).

Выраженная стимуляция бактериальными рибосомами уровня НГ в периферической крови сопровождалась усилением их фагоцитарной активности и функции микробицидных систем. Под влиянием 70S и 50S рибосом фагоцитарный индекс НГ мышей возрастал в 5,7 и 7,25 раза, а индекс переваривания в 9,1 и 12,6 раза соответственно. Характерно, что эффекты 70S рибосом и их больших субъединиц были однонаправленными. Причём 50S рибосомы более эффективно стимулировали показатели поглотительной и переваривающей функций НГ: долю фагоцитарно-активных НГ, фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, долю переваренных микробов и индекс переваривания (t=4,444, p<0,05; t=2,245, p<0,05; t=3,414, p<0,05; t=2,431, p<0,05; t=4,1, p<0,05 соответственно). Малые субъединицы рибосом, напротив, достоверно угнетали данные показатели по отношению к контролю (t=2,041, p<0,05; t=2,381, p<0,05; t=2,342, p<0,05; t=2,43, p<0,05; t=2,203, p<0,05 соответственно). Под воздействием 30S рибосом значения фагоцитарного индекса и индекса переваривания снижались в 1,3 и 1,6 раза соответственно.

В ходе изучения влияние рибосом на кислородзависимые микробицидные системы НГ выяснилось, что 70S рибосомы E. coli MRE600, а также их большие субъединицы достоверно стимулировали оксидазные микробицидные системы НГ мышей как в НСТ-спонтанном (t=8,886, p<0,001; t=13,563, p<0,001), так и в НСT-стимулированном (t=3,589, p<0,001; t=6,116, p<0,001) тестах соответственно. У иммунизированных 70S и 50S рибосомами животных СЦИ НГ в НСT-спонтанном тесте возрастал в 2,85 и 3,85 раза, а в НСT-стимулированном тесте в 1,45 и 1,98 раза соответственно по отношению к интактным животным контрольной группы. Однако значения КМ, которые достоверно (t=4,435, p<0,001; t=6,628, p<0,001) уменьшались в 1,9 и 2,2 раза соответственно, свидетельствуют о том, что 70S и 50S рибосомы при неадекватном дозировании способны вызвать истощение ресурсов оксидазных микробицидных систем НГ. Рибосомы 30S, напротив, снижали СЦИ НГ в 1,77 раза и 2,41 раза соответственно по отношению к контролю. Уровень МП НГ у мышей, иммунизированных 70S и 50S рибосомами, достоверно (t=9,573, p<0,001; t=13,598, p<0,001) возрастал в 2,7 и 3,46 раза соответственно. При этом под влиянием 50S субъединиц уровень МП был в 1,28 раза выше по сравнению с влиянием 70S рибосом (t=3,543, p<0,001). У животных, иммунизированных 30S субъединицами, СЦИ МП уменьшался в 1,48 раза (t=2,384, p<0,05).

Результаты исследования состояния кислороднезависимого микробицидного потенциала НГ мышей, иммунизированных 70S, 50S и 30S рибосомами E. coli MRE600, также подтвердили иммуностимулирующую активность 70S и 50S рибосом и депрессивное действие 30S субъединиц. Так СЦИ КБ и АЭ достоверно (t=3,461, p<0,01 и t=3,184, p<0,01) стимулировались при иммунизации 70S рибосомами, возрастая в 1,61 и 1,49 раза соответственно. Под влиянием 50S субъединиц содержание в НГ КБ и АЭ достоверно (t=5,053, p<0,001 и t=6,839, p<0,001) возрастало в 2,13 и 1,88 раза соответственно. При сравнении 70S и 50S субъединиц между собой, в очередной раз 50S рибосомы показали более выраженную стимулирующую активность как в отношении КБ (t=2,11, p<0,05), так и в отношении АЭ (t=2,416, p<0,05). Напротив, 30S субъединицы рибосом E. coli MRE600 способствовали уменьшению содержания указанных выше компонентов кислороднезависимых микробицидных систем НГ по сравнению с контролем более чем в полтора раза: СЦИ КБ в 1,68 раза, t=3,7, p<0,001; СЦИ АЭ в 1,62, t=3,719, p<0,001.

Иммунологическая специфичность препаратов бактериальных рибосом, различной степени целостности

Взаимодействие сывороточных антител с рибосомным материалом определяли в реакции двойной радиальной иммунодиффузии по [O. Ouchterlony, 1950], учитывая взаимодействие двукратных разведений полученных сывороток с препаратом рибосом в концентрации 4 мг/мл. Окрашивание гелей проводи­ли по J. Fairbanks et al. [1971]. Через 18 часов после постановки реакции обнаруживались полосы преципитации только между сывороткой кроликов и 70S и 50S рибосомами в титре 1:8-1:16, в то время как между иммунной сывороткой, и 30S рибосомами полос преципитации не было (рис. 4).

а) б) в)

Рис. 4. Реакция двойной радиальной иммунодиффузии по Ухтерлони 30S (а), 50S (б) и 70S (в) рибосом штамма E. coli MRE 600 с антисывороткой, полученной иммунизацией кролика препаратом 70S рибосом штамма E. coli MRE 600.

Рибосомы внесены в центральные лунки, двукратные разведения (от 1:2 до 1:64) антисыворотки — в периферические лунки.

Таким образом, гипериммунные кроличьи сыворотки к 70S рибосомам E. coli MRE 600 специфически взаимодействуют с 50S, но не 30S рибосомными субъединицами данного штамма. Это позволяет предположить, что антигенные детерминанты находятся на больших субъединицах и отсутствуют на малых.

ВЫВОДЫ

  1. 14С-70S рибосомы E. coli MRE600 и (или) их более мелкие фрагменты, независимо от способа введения в организм, избирательно накапливаются в органах иммунной системы со следующими предпочтениями: прежде всего в грудине (костном мозге), тимусе, затем в лимфоузлах, а также в селезёнке.
  2. Внутривенный, внутрибрюшинный и подкожный способы введения 14С-70S рибосом E. coli MRE600 белым беспородным мышам обеспечивают одинаковую тропность рибосомного материала к органам иммунной системы.
  3. Удельная радиоактивность фракции нейтрофильных гранулоцитов белых беспородных мышей значительно преобладает над удельной радиоактивностью других форменных элементов крови при внутрибрюшинном введении 14С-70S рибосом E. coli MRE600, но не 14С-лейцина.
  4. Гипериммунные кроличьи сыворотки к 70S рибосомам E. coli MRE600 специфически взаимодействуют с 50S, но не 30S рибосомными субъединицами данного штамма.
  5. Рибосомы E. coli MRE600 70S и 50S в эксперименте обладают иммуностимулирующим эффектом, тогда как малые субъединицы 30S оказывают иммуносупрессивный эффект в отношении абсолютного количества лимфоцитов, лимфоцитов, экспрессирующих Е-рецептор и нейтрофильных гранулоцитов периферической крови нелинейных мышей.
  6. Рибосомы E. coli MRE600 70S и 50S обладают иммуностимулирующим эффектом, а малые субъединицы 30S оказывают иммуносупрессивный эффект в отношении фагоцитарной активности (поглотительной и переваривающей функции), компонентов кислородзависимых (активные радикалы кислорода, миелопероксидаза) и кислороднезависимых (катионные белки, неспецифическая эстераза) микробицидных систем нейтрофильных гранулоцитов периферической крови нелинейных мышей.
  7. Иммунотропная активность 70S рибосом E. coli MRE600 формируется под влиянием разнонаправленных иммунотропных эффектов большой и малой рибосомных субъединиц. Рибосомы 50S оказывают достоверно более выраженную иммуностимуляцию, чем 70S рибосомы в экспериментах на нелинейных мышах.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

  1. При изготовлении иммунобиологических препаратов на основе бактериальных рибосом следует использовать рибосомный материал с сохранённой структурной организацией в соответствии с ранее сформулированным принципом интактности рибосомных частиц.
  2. При изготовлении иммунобиологических препаратов на основе бактериальных рибосом следует учитывать, что изолированные 50S субъединицы бактериальных рибосом оказывают иммуностимулирующий, а изолированные 30S иммуносупрессивный эффект.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Крылов В. П., Орлов В. Г., Сиюхова Ф. Ш., Качанова О. А., Скобликов Н. Э., Кошелева С. В., Егорова С. В. Бактериальные рибосомы как новый класс иммунобиологических препаратов иммуногенного и иммунотропного действия // Медицинская наука и здравоохранение: материалы научно-практической конференции молодых учёных и студентов Краснодарского края. – Туапсе, 2002. – С.21-24.
  2. Кошелева С. В., Крылов В. П., Скобликов Н. Э. Фагоцитарная активность и кислородзависимый антимикробный потенциал нейтрофильных гранулоцитов мышей в условиях тахифилаксии, вызванной внутрибрюшинной инъекцией бактериальных 70S рибосом // IX Всероссийская научно-практическая конференция «Молодые учёные в медицине» посвящённая 190-летию Казанского государственного медицинского университета: тезисы докладов. – Казань, 2004. – С. 131.
  3. Скобликов Н. Э., Крылов В. П., Кошелева С. В. Влияние препаратов бактериальных рибосом на фагоцитарную активность и кислородзависимый антимикробный потенциал нейтрофильных гранулоцитов мышей в условиях экспериментальной тахифилаксии // Материалы V Международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке» – Москва, 2004, – С. 347.
  4. Кошелева C. В., Крылов В. П., Орлов В. Г. Получение 70S рибосом Escherichia coli с высоким содержанием радионуклида 14С // Материалы III региональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Медицинская наука и здравоохранение». – Краснодар, 2005. – С. 21-24.
  5. Кошелева С. В., Крылов В. П., Скобликов Н. Э., Орлов В. Г. Влияние 70S, 50S и 30S рибосом Escherichia coli на функционирование системы нейтрофильных гранулоцитов и популяционный состав лейкоцитов периферической крови мышей // Материалы III региональной научно-практической конференции молодых учёных и студентов «Медицинская наука и здравоохранение». – Краснодар, 2005. – С. 24-27.
  6. Крылов В. П., Кошелева С. В., Скобликов Н. Э., Орлов В. Г. Иммунотропная активность 70S, 50S и 30S рибосом Escherichia coli в эксперименте in vivo // Кубанский научный медицинский вестник. – 2006. – №3-4 (84-85). – С. 67-71.
  7. Крылов В. П., Кошелева С. В., Скобликов Н. Э., Орлов В. Г. Распределение бактериальных рибосом, меченных радиоактивным углеродом, в организме экспериментальных животных // Кубанский научный медицинский вестник. – 2006. – №10 (91), – С. 43-50.
  8. Кошелева С. В., Крылов В. П., Скобликов Н. Э., Орлов В. Г. Распределение в органах и тканях лабораторных животных радиоактивного углерода, введённого в составе 70S рибосом Escherichia coli MRE600 // Материалы Четвёртого съезда Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова. – Пущино, 2006, – С. 116-118.
  9. Крылов В. П., Кошелева С. В., Скобликов Н. Э. Распределение радиоактивности среди форменных элементов периферической крови экспериментальных животных после введения меченых 70S рибосом Escherichia coli MRE600 Материалы Четвёртого съезда Общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова. – Пущино, 2006, – С. 121-122.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.