WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Разработка биотехнологических аспектов повышения иммуногенности вакцинного штамма yersinia pestis ev нииэг

На правах рукописи

Голова Алина Борисовна

РАЗРАБОТКА БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ АСПЕКТОВ ПОВЫШЕНИЯ

ИММУНОГЕННОСТИ ВАКЦИННОГО ШТАММА

Yersinia pestis EV НИИЭГ

03.01.06 биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

03.02.03 микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Саратов – 2012

Работа выполнена в Государственном научном учреждении

Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт

Российской академии сельскохозяйственных наук

Научные руководители: доктор медицинских наук, профессор

Федорова Валентина Анатольевна

кандидат биологических наук

Мотин Владимир Леонидович

Официальные оппоненты:

Дыкман Лев Абрамович

доктор биологических наук, старший научный сотрудник

ФГБУН Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН

ведущий научный сотрудник лаборатории иммунохимии

Елисеев Юрий Юрьевич

доктор медицинских наук, профессор

ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет

им. В.И. Разумовского»

заведующий кафедрой общей гигиены и экологии

Ведущая организация: ФБУН Государственный научный центр

прикладной микробиологии и биотехнологии

Защита диссертации состоится « 22 » июня 2012 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.

Автореферат разослан « » мая 2012 г.

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова», ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Как известно, живая чумная вакцина (ЖЧВ) на основе аттенуированного штамма Yersinia pestis EV линии НИИЭГ успешно применяется для специфической профилактики чумы у людей и животных на протяжении более 70 лет в нашей стране и в ряде стран СНГ (Салтыкова, Файбич, 1975; Айкимбаев с соавт., 2003; Feodorova, Corbel, 2009). До настоящего времени эта вакцина остается наиболее эффективным и единственным лицензированным профилактическим противочумным препаратом (Салтыкова, Файбич, 1975; Russell et al., 1995; Titball, Williamson, 2001, 2004; Медуницын, 2004; Бывалов, Кутырев, 2011; Книрель с соавт., 2011; Feodorova, Motin, 2011 и др.). Важным преимуществом ЖЧВ является ее способность уже после однократной прививки относительно быстро (в течение 3-4 дней) индуцировать специфический иммунитет против основных форм (бубонной и легочной) чумной инфекции (Самойлова, 1963; Исупов, Белобородов, 1995).

Выращивание экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для производства ЖЧВ на рутинных питательных средах in vitro, равно как и длительное масштабированное культивирование в биотехнологии производства противочумных профилактических препаратов зачастую обеспечивает выраженное снижение его иммуногенности (Салтыкова, Файбич, 1975; Алимов, 1984; Дятлов, 1986). Это связывают, как правило, с быстрой адаптацией чумных бактерий к условиям существования вне чувствительного макроорганизма и утрата так называемой «остаточной вирулентности» штамма, непосредственно обеспечивающей его иммуногенность (Салтыкова, Файбич, 1975; Анисимова с соавт., 2002; Промышленный регламент № 01897080-01-04 на производство «Вакцины чумной живой»). Восстановление иммуногенности проводится путем анимализации – многократного пассирования субкультур штамма EV НИИЭГ через организм морской свинки (Прядкина, Журба, 1966; Салтыкова, Файбич, 1975; Промышленный регламент № 01897080-01-04), что требует длительного времени, большого количества лабораторных животных и не поддается стандартизации ввиду использования в работе аутбредных биомоделей. Другой важной биотехнологической задачей при экспериментально-производственном выращивании штамма-продуцента ЖЧВ является разработка режимов, обеспечивающих высокий выход бактериальной массы (Шеремет с соавт., 1987). Согласно нормативной документации (Промышленный регламент № 01897080-01-04), для приготовления вакцины EV НИИЭГ микробные клетки данного штамма культивируют in vitro при температуре 28 оС на обычных бактериологических средах, производных гидролизатов Хоттингера (ГХ) или казеина. Однако биосинтез ряда важных для индукции специфического иммунитета антигенов Y. pestis наблюдается при температуре 37 оС, требует наличия в среде выращивания ряда дополнительных питательных компонентов и, в случае их отсутствия, сопровождается при выращивании микробных клеток в рутинных условиях in vitro заметным снижением активности роста чумных бактерий (Алутин, 1974; Наумов, Кондрашин, 1980; Brubaker, 1991). В литературе существуют многочисленные доказательства активизации пролиферации чумных бактерий при температуре 37 оС в условиях in vivo в организме чувствительных к чуме млекопитающих (Бахрах с соавт., 1969; Алутин, 1974; Perry, 1997). Очевидно, что заложенный в биотехнологию производства ЖЧВ режим выращивания штамма-продуцента принципиально отличается от условий внутренней среды макроорганизма млекопитающего, где на стадиях бактериемии и септицемии наблюдается наиболее бурное размножение микробных клеток. Сообщалось об определенных модификациях антигенной структуры чумного микроба в этот период, в частности, снижении продукции капсульного антигена Ф1, как у вирулентных штаммов возбудителя чумы, так и у бактерий Y. pestis EV76 – «прародителя» вакцинного штамма EV НИИЭГ (Burrows, Bacon, 1956; Brubaker, 1991). Остается неизвестным, имеет ли место изменение биосинтеза и других антигенов возбудителя чумы, задействованных в реализацию вирулентности и иммуногенности данного патогена – активатора плазминогена (Pla), «мышиного» токсина (Ymt) и липополисахарида (ЛПС). Вместе с тем, модификация продукции антигенов может объяснить относительно невысокую нейтрализующую активность противочумных антител, образующихся в макроорганизме вакцинируемого в результате иммунизации клетками вакцинного штамма EV НИИЭГ после их выращивания в регламентированном режиме при температуре 28 оС ввиду отсутствия в условиях in vivo на поверхности чумного микроба антигенов, синтезируемых in vitro на обычных бактериологических средах и невозможности индукции к этим антигенам протективных антител. Следовательно, оптимизация композиции протективных антигенов в препарате ЖЧВ должна способствовать повышению ее относительно невысокой иммуногенности.

Цель работы – разработка оптимальных биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, обеспечивающих повышение его иммуногенности благодаря созданию эффективной антигенной композиции препарата живой чумной вакцины.

Задачи исследования:

  1. Разработать оптимальные биотехнологические режимы выращивания in vitro бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ для увеличения выхода микробной биомассы с единицы объема среды и повышения иммуногенности в лабораторных испытаниях (в сравнительных экспериментах с применением регламентированных питательных сред).
  2. Исследовать влияние режимов выращивания на биосинтез и иммунореактивность основных специфических полипептидов и ЛПС вакцинного штамма EV НИИЭГ.
  3. Исследовать биосинтез антигенов Ф1, Pla, Ymt и ЛПС штаммом-продуцентом ЖЧВ при выращивании в биотехнологических режимах, имитирующих условия паразитирования чумных бактерий в организме чувствительного млекопитающего in vivo.
  4. Изучить в сравнительных экспериментах пролиферативную активность, биосинтез и иммунореактивность вакцинного штамма EV НИИЭГ, его изогенных вариантов, авирулентных и вирулентных штаммов чумных бактерий, выращенных в различных биотехнологических режимах.
  5. Разработать более эффективную антигенную композицию препарата ЖЧВ.
  6. Разработать модель экстрацеллюлярной среды млекопитающих in vitro для практического применения в биотехнологии производства ЖЧВ.

Научная новизна. Впервые разработаны и детально изучены биотехнологические режимы выращивания экспериментально-производственного штамма EV

НИИЭГ, основанные на имитации in vitro условий паразитирования чумных бактерий in vivo в сравнении с регламентированными питательными средами. С помощью специфических антител показано, что выращивание микробов вакцинного штамма EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме, приближенном к внутренней среде макроорганизма хозяина, сопровождается у штамма-продуцента модификацией биосинтеза Ф1, Pla, Ymt, ассоциированных с ними фенотипических активностей и ЛПС. Аналогичный феномен обнаружен при культивировании в сходном биотехнологическом режиме природных вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, несущих хотя бы одну из двух плазмид, видоспецифических для чумного микроба, но не изогенных вариантов EV НИИЭГ. Разработанный биотехнологический режим выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ с применением синтетической среды RPMI-1640 (RPMI), симулирующей экстрацеллюлярную среду чувствительных к чуме млекопитающих, обеспечивал значительное повышение иммуногенности штамма-продуцента (не менее 80% выживших от экспериментальной чумы аутбредных мышей) по сравнению с регламентированным режимом культивирования штамма-продуцента (не более 45,5% выживших биомоделей). Новыми являются сведения о направленном биосинтезе бактериями вакцинного штамма EV НИИЭГ в указанных условиях in vitro антигенов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа, способных на мышиной модели индуцировать высокий уровень специфического иммунитета к экспериментальной чуме. По данным иммунохимического анализа указанные полипептиды были локализованы на поверхности микробных клеток EV НИИЭГ и могли активно секретироваться в среду культивирования, обладали серологическим родством с антигеном белковой природы вирулентного штамма Y. pestis 231 с м.м. 26,3-28,8 кДа, но продуцировались бактериями экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ в меньших количествах (в 2-4 раза) по сравнению с клетками вирулентного штамма.

Перспективным является также возможность повышения иммуногенности вакцинного штамма EV НИИЭГ (до 70% выживших мышей) при выращивании его в биотехнологических режимах с применением регламентированных бактериологических сред на основе ГХ, дополненных ионами Са2+ (2,5 мМ).

Разработана модель экстрацеллюлярной среды чувствительных к чуме млекопитающих. Показана принципиальная возможность имитирования in vitro ранней стадии взаимодействия чумных бактерий с макроорганизмом хозяина до контакта с клеткой-мишенью. Приоритетными являются сведения о развитии в этот период капсулонезависимого типа резистентности чумного микроба к фагоцитозу, которые могут служить основополагающим фундаментом усовершенствования ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ равно как и конструирования новых эффективных профилактических противочумных препаратов. Полученные данные являются перспективным для разработки оптимальной антигенной композиции новой субъединичной вакцины для быстрого купирования чумной инфекции у привитых в ранние сроки после заражения путем использования вышеуказанных антигенов.

Практическая значимость работы. Разработаны эффективные биотехнологические режимы выращивания бактерий экспериментально-производственного вакцинного штамма EV НИИЭГ, позволяющие почти четырехкратно повысить выход микробной биомассы в условиях in vitro. Благодаря оптимизации продукции вакцинным штаммом известных полипептидов с иммуногенной активностью, Ф1, Pla, Ymt, эндотоксина (ЛПС) и ряда других антигенных субстанций, а также направленной индукции биосинтеза белков с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа, выявленных только в условиях, приближенных к экстрацеллюлярной среде млекопитающих, и обладающих, по-видимому, высокой протективной активностью, указанный биотехнологический подход позволил почти в два раза повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма-продуцента.

По материалам диссертации разработаны и утверждены директором ГНУ Саратовский НИВИ Россельхозакадемии (от 16 марта 2012 г.) «Методические рекомендации по оптимизации биотехнологического режима выращивания бактерий штамма Y. pestis EV НИИЭГ – продуцента живой чумной вакцины для повышения выхода клеточной биомассы».

Материалы исследований используются при чтении курса лекций по биотехнологии и микробиологии ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».

Связь работы с научными программами. Настоящая работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 03-04-48067 «Молекулярная организация и структурно-функциональная характеристика биомолекул, детерминирующих вирулентность патогенных иерсиний», проектов BII/ISTC #3853 «Живые бактериальные вакцины: сравнительный анализ иммунного ответа человека и биомоделей» и «Изучение антибактериального иммунитета» (Университет Техаса, г. Галвестон, UTMB, субконтракт No. 11-082).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработаны и оптимизированы биотехнологические режимы выращивания бактерий экспериментально-производственного штамма EV НИИЭГ, основанные на имитации in vitro условий паразитирования возбудителя чумы in vivo в организме чувствительных млекопитающих и позволяющие существенно (в 3,5-4,2 раза) повысить клеточный урожай ЖЧВ.

2. Выращивание клеток штамма EV НИИЭГ, продуцента ЖЧВ, в биотехнологических режимах с применением регламентированной среды бульон Хоттингера (БХ), дополненной ионами Са2+ (2,5 мМ) в сочетании с 0,1% глюкозы или только ионами Са2+ (2,5 мМ), обеспечивает больший (в 2,8-3,7 раза) выход биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ, чем при использовании той же среды без указанных ингредиентов.

3. Установлены выраженные различия в составе антигенной композиции и иммуногенности ЖЧВ на основе вакцинного штамма EV НИИЭГ в зависимости от режима его культивирования in vitro.

4. Выращивание штамма-продуцента EV НИИЭГ в биотехнологическом режиме in vitro, приближенном к экстрацеллюлярной среде макроорганизма хозяина in vivo, обусловливает модификацию биосинтеза специфических антигенов чумного микроба – Ф1, Pla, Ymt, изменение фенотипических активностей, ЛПС и направленную продукцию протективных полипептидов с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа. Более эффективная композиция вакцинного препарата позволила существенно (с 45% до 80%) повысить иммуногенность и в восемь раз иммунореактивность штамма EV НИИЭГ.

5. Применение синтетической среды RPMI на основных стадиях биотехнологического процесса приготовления чумной вакцины EV НИИЭГ (этапах подготовки маточной культуры, посевного материала, накопительной культуры и т.д.) в перспективе позволит стандартизировать биотехнологию ее масштабированного производства, направленного на приготовление готового препарата с высокой иммуногенной активностью.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на: Научно-практической конференции «Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика», (Астрахань, 2001); Первой региональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой», (Саратов, 2002); III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины, (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – XXI век», (Саратов, 2004); Научно-практической конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны», (Москва, 2004); II конференции студентов, молодых ученых и специалистов «Современные проблемы науки и образования», (Хургада, Египет, 2005); VI межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях», (Волгоград, 2005); Международном Вакцинном Конгрессе, (Амстердам, Нидерланды, 2007); Германо-Российском форуме по биотехнологии, (Новосибирск, 2009); Международной научно-практической конференции «Современные проблемы инфекционной патологии человека», (Минск, Беларусь, 2009); VI международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» в рамках IV Российского медицинского форума, (Москва, 2009); III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Инфекции, обусловленные иерсиниями», (Санкт-Петербург, 2011).

Личный вклад соискателя заключается в самостоятельном проведении экспериментальных исследований, обработке и интерпретации полученных результатов. Постановка задач исследований осуществлялась научными руководителями д-ром мед. наук, профессором В.А. Федоровой, канд. биол. наук В.Л. Мотиным.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (2 главы), собственных исследований (4 главы), заключения, выводов и списка использованных литературных источников, включающего 416 источников, из них зарубежных – 148. Работа изложена на 200 страницах, содержит 10 таблиц и 16 рисунков.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект, материалы и методы исследований. В работе использовали эталонный экспериментально-производственный вакцинный штамм Y. pestis EV НИИЭГ, полученный из ГИСК им. Л.А. Тарасевича, в отдельных экспериментах (совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича) – пять его изогенных производных (КМ-215, КМ-216, КМ-217, КМ-218, КМ-225, КМ-226), 9 природных и генетически модифицированных штаммов чумного микроба с разным плазмидным составом, в том числе, вирулентный штамм Y. pestis 231 (LD50 для белых мышей = 6 КОЕ).

Для накопления биомассы штамма EV НИИЭГ – продуцента ЖЧВ, применяли различные биотехнологические режимы выращивания с использованием бульона Хоттингера (БХ) (РосНИПЧИ «Микроб», Саратов) или среды RPMI («Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов», Москва). В зависимости от цели эксперимента, питательные среды дополняли 2,5 мМ ионов кальция (CaCl2) и/или 5,5 мМ глюкозы. Посевы инкубировали стационарно при температуре 28 °С в течение 48 ч или при этой же температуре первые 24 ч с последующим культивированием при температуре 37 °С еще 18-24 ч. Взвеси бактерий в концентрации 1 109 м.кл./мл готовили стандартным методом (Наумов, Самойлова, 1992). Пролиферативную активность бактерий оценивали по индексу пролиферации (ИП) (Feodorova, Devdariani, 2001). Для постановки иммуноферментного анализа к бактериальным суспензиям добавляли мертиолят натрия до конечной концентрации 0,002% или 2% формальдегида.

Влияние экспериментальных биотехнологических режимов выращивания на основные биологические свойства бактерий исследовали классическими микробиологическими и иммунохимическими методами. Продукцию основных видоспецифических антигенов с иммуногенной активностью – Ф1, Pla, Ymt, изучали в непрямом варианте дот-иммуноанализа (ДИА) с препаратами коммерческих чумных диагностических иммуноглобулинов (ЧДИ) или моноклональных антител (МКА) к Ф1, к ЛПС (синтезируемых производственными линиями гибридом Y.p.FI.D3.B2.Sp., Y.p.LPS.A6.Sp.) и к Pla как показано ранее (Feodorova, Devdariani, 2000). Реакцию оценивали визуально по наличию и интенсивности цветного сигнала. Формирование капсулоподобной субстанции исследовали методом Бурри-Гинса, у клеток EV НИИЭГ – также методом трансмиссионной электронной микроскопии (эксперименты выполнены совместно с проф., д-ром биол. наук Н.П. Конновым и канд. биол. наук О.С. Кузнецовым). Фибринолитическую активность изучали общепринятым методом лизиса сгустков фибрина (Наумов, Самойлова, 1982), фосфолипазную – методом И.А. Кузьмиченко и Ф.К. Дроздовской (1977). Антигенную активность определяли сравнением в ТИФА титров специфических гомологичных антител в сыворотках мышей BALB/c, иммунизированных цельными клетками Y. pestis EV НИИЭГ или 231, выращенными в различных биотехнологических режимах. Результаты учитывали по оптической плотности образцов при длине волны 405 нм, считая позитивными лунки, в которых интенсивность сигнала в два раза и более превышала контрольные образцы; иммуногенность (лабораторные испытания) осуществляли путем подкожного заражения белых аутбредных мышей весом 18-20 г в возрасте 8-12 недель м. кл. вирулентного штамма Y. pestis 231 в дозе 50 DCL (на базе ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Предварительно биомоделей иммунизировали внутрибрюшинно трехкратно с 14-дневным интервалом возрастающими дозами м. кл. EV НИИЭГ (1 105; 2 105; 4 105 КОЕ), выращенных в соответствующих биотехнологических режимах. Для индукции иммунного ответа к поверхностно локализованным антигенам чумных бактерий и предотвращения дальнейших модификаций антигенной структуры в организме биомоделей в случае вакцинации живыми м. кл. штамма-продуцента ЖЧВ, бактериальную взвесь обрабатывали мертиолатом натрия до конечной концентрации 0,002%. Антигенную композицию и иммунореактивность исследовали в 12,5% ПААГ-SDS (Laemmli, 1970) и методом иммуноблоттинга (Towbin et al., 1984). Электрофоретическое разделение нативных или протеолитически обработанных цельно-клеточных лизатов Y. pestis EV НИИЭГ, 231, КМ-218 (бесплазмидный вариант) проводили с последующей окраской гелей Coomassie Brilliant Blue или ионами серебра (Tsai, Frasch, 1982; Feodorova, Devdariani, 2001).

Статистическую обработку полученных результатов осуществляли по И.П. Ашмарину, А.А. Воробьеву (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Разработка оптимального технологического режима

выращивания in vitro бактерий экспериментально-производственного

вакцинного штамма EV НИИЭГ и его изогенных производных

Начальным этапом нашей работы явилось конструирование питательной среды и оптимизация режима выращивания бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ для повышения его пролиферативной активности. Поскольку и при аппаратном культивировании, и в случае наращивания биомассы в небольших объемах (пробирки, матрацы и т.д.), более быстрый рост микробов этого штамма отмечался на жидких средах (около 18 ч) или бифазных условиях (~ 28 ч), но не на плотных питательных средах (до 34-36 ч), а ростовые качества сред на основе гидролизата Хоттингера были признаны лучшими (Николаев, 1964; Бахрах, 1966; Филиппов, 1970; Муравьева, 1969), первоначально бактерии выращивали в БХ. Для имитации внутренней среды млекопитающих в БХ добавляли ионы Ca2+ (БХС) и/или глюкозы (БХСГ и БХГ, соответственно) в концентрациях, соответствующих физиологическому содержанию этих компонентов в сыворотке крови млекопитающих (Логинов, 1983). БХ без добавок использовали в качестве контроля. Как видно из таблицы 1, присутствие в БХ указанных ингредиентов значительно стимулировало пролиферацию чумных бактерий. Особенно эффективным оказалось добавление ионов Ca2+ - ИП штамма EV НИИЭГ в этих условиях увеличился по сравнению с контролем более, чем в 3,5 раза, а при сочетанном добавлении с глюкозой – почти в 3 раза.

Бактериологические среды по своему составу значительно отличаются от внутренней среды макроорганизма и не могут в полной мере обеспечить питательные потребности чумных бактерий даже при добавлении в них дополнительных питательных компонентов (Николаев, 1964; Бахрах, 1966; Муравьева, 1969; Филиппов, 1970). Поэтому мы использовали среду RPMI с четко сбалансированным составом, изотоничную сыворотке крови чувствительных к чуме млекопитающих, богатую витаминами и содержащую 16 из 17 (кроме аланина) аминокислот, необходимых для обеспечения питательных потребностей чумных бактерий при выращивании in vitro, удвоенную концентрацию глюкозы (11,1 мМ) и 0,42 мМ ионов Ca2+. При культивировании клеток EV НИИЭГ на этой среде ИП штамма возрастал почти в четыре раза по сравнению с рутинной бактериологической средой БХ (без добавок). Добавление в среду культивирования ионов Ca2+ и/или глюкозы также было эффективным. Наибольший стимулирующий эффект наблюдался при совместном использовании указанных ингредиентов в ростовой среде (табл. 1). Иммуногенность вакцинного штамма EV НИИЭГ связывают с его «остаточной вирулентностью», т.е. способностью приживаться и размножаться в месте аппликации и ограниченное время обсеменять регионарные лимфузлы и внутренние органы вакцинируемого (Салтыков, Чалисов, 1974). Поэтому нами исследовалось влияние сходных биотехнологических режимов на пролиферацию типичного вирулентного штамма Y. pestis 231. Судя по полученным данным (табл. 1), выращивание бактерий этого штамма на БХ с добавками и без них выявило ту же закономерность, что была установлена нами на предыдущем этапе для штамма-продуцента ЖЧВ. Так, самый богатый клеточный урожай был зафиксирован на БХC и БХCГ, на БХГ ИП оказался несколько ниже. При выращивании на RPMI с добавками и без них регистрировалось значительное (почти в пять раз) увеличение ИП бактерий Y. pestis 231 по сравнению с контролем (БХ), хотя присутствие добавок в среде RPMI существенно не влияло на клеточный урожай этого штамма чумного микроба. При этом способность вирулентного штамма активно пролиферировать в указанных биотехнологических режимах была в 1,5 – 2 раза выше, чем у вакцинного. Это, видимо, связано с разницей между инфекционным и вакцинальным процессами, вызываемыми этими штаммами в организме чувствительных млекопитающих (Самойлова, 1963).

Выращивание в сходных биотехнологических режимах изогенных производных вакцинного штамма EV НИИЭГ или природных вариантов Y. pestis оказалось менее эффективно (ИП бактерий всех использованных нами штаммов 1,2 – 1,8).

Таким образом, выращивание штамма-продуцента ЖЧВ в биотехнологических режимах, основанных на моделировании in vitro условий, приближенных к экстрацеллюлярной среде организма млекопитающих in vivo, позволило значительно повысить выход микробной биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ. Применение RPMI и/или БХ с добавлением ионов Ca2+/глюкозы в адекватной концентрации в качестве среды культивирования обеспечило выход большей биомассы вакцинного штамма EV НИИЭГ по сравнению с обычной бактериологической средой (БХ) без дополнительных ингредиентов.

Изучение и иммунохимическая характеристика биосинтеза

основных специфических антигенов вакцинным штаммом EV НИИЭГ,

выращенным в различных биотехнологических режимах

Поскольку наиболее важным параметром оценки качества любой вакцины является ее иммуногенность (Фунтикова, 1977; Алимов, 1984; Шеремет с соавт., 1987; Гюлушанян, 1994; Глик, Пастернак, 2002), одним из критериев оптимизации технологического режима выращивания штамма-продуцента является его способность продуцировать протективные антигены. Поэтому мы исследовали продукцию вакцинным штаммом EV НИИЭГ Ф1, Pla и Ymt - основных видоспецифических антигенов, задействованных как в индукции специфического протективного иммунитета, так и в проявлении вирулентных свойств возбудителя чумы (Вейнблат, 1980; Шеремет с соавт., 1987), а также ассоциированные с этими антигенами фенотипические свойства Y. pestis.

А Б Рис. 1. Электронные микрофотографии (негативное контрастирование, ув. 240000) бактерий Y. pestis EV, выращенных на обычной питательной среде (БХ) (А) или RPMI (Б) при температуре 37 °С. Масштаб 0,2 мкм.

В мазках, приготовленных методом Бурри-Гинса из культуры штамма-продуцента ЖЧВ, выращенного на БХ без добавок (контроль), выявлялась типичная капсулоподобная субстанция. При остальных режимах выращивания наблюдалось снижение продукции капсульной субстанции (БХC или БХГ) вплоть до появления в популяции бактерий только бескапсульных вариантов (БХCГ или RPMI с или без добавок). Принципиальных отличий у вирулентного штамма 231 от картины капсулообразования вакцинного штамма не было. Полученные данные были подтверждены методом электронной трансмиссионной микроскопии (рис. 1). В условиях, приближенных к внеклеточной среде макроорганизма, чумные бактерии штамма-продуцента ЖЧВ были практически полностью лишены капсулы, которая сохранялась на наружной клеточной стенке в виде небольших островков (рис. 1Б).

Наличие фосфолипазной активности, характерной для Ymt, регистрировалось только в случае выращивания штамма-продуцента ЖЧВ и бактерий 231 штамма на БХ без дополнительных ингредиентов. Добавление ионов Ca2+ и/или глюкозы или использование RPMI полностью ингибировало указанную активность (табл. 1).

При выращивании на БХ, БХC или БХГ у бактерий штамма EV НИИЭГ практически полностью сохранялась фибринолитическая активность Pla протеазы, которая, однако, не выявлялась на БХСГ или RPMI независимо от дополнительных ингредиентов. Для вирулентного штамма получены сходные данные (табл. 1).

В ДИА с ЧДИ, содержащими в пуле диагностических иммуноглобулинов антитела к продуктам специфических для возбудителя чумы плазмидных репликонов (pFra и pPst) (Титенко, 1985), у штамма-продуцента ЖЧВ было обнаружено снижение биосинтеза одного, двух или всех трех изучаемых антигенов (Ф1, Ymt и Pla) в зависимости от использованного биотехнологического режима. Поскольку Ф1 обнаруживается на поверхности клеточной стенки и в культуральной жидкости (КЖ) бактерий EV НИИЭГ (Кириллина, 1992; Федорова, 2004), объектом исследования в ДИА являлись обе эти субстанции. Так, клетки EV НИИЭГ, выращенные на БХ, БХС или БХСГ, давали положительную реакцию, а на БХГ интенсивность сигнала в ДИА была заметно сниженной. В КЖ антигены обнаруживались только при выращивании бактерий EV НИИЭГ на БХ без добавок (контроль) аналогично экспериментам (Федорова, 2004). При выращивании бактерий на RPMI сигнал отсутствовал полностью как при анализе м. кл., так и в КЖ) бактерий. Сходные результаты, а также доказательства изменения эпитопной специфичности отдельных антигенных детерминант Ф1 и Pla, были получены в ДИА с гомологичными МКА. В этом случае в ДИА использовали только м. кл. бактерий вакцинного или вирулентного штаммов чумного микроба. Для подтверждения данных ДИА мы проводили сравнительный анализ электрофоретических профилей клеточных лизатов бактерий штамма-продуцента ЖЧВ, выращенного в разных биотехнологических режимах в 12,5% ПААГ-SDS. Как и предполагалось, только в клеточном лизате штамма EV НИИЭГ после выращивания на БХ без добавок четко определялись полосы, соответствующие по мол. массе (17,8±2 кДа) мономеру Ф1 (Caf1), Pla (33±2 кДа) и Ymt (61±2 кДа). В остальных треках эти полосы практически отсутствовали или визуализировались как минорные линии, что указывало на значительное снижение биосинтеза каждого из антигенов при выращивании штамма-продуцента ЖЧВ в других биотехнологических режимах.

Таблица 1 - Влияние режимов выращивания на пролиферацию и основные фенотипические свойства штаммов Y. pestis

Штаммы чумного микроба Среда культи-вирования Добавление к среде Количество живых бактерий (n 109), м. кл. Индекс проли-фера- ции* Продукция капсулы Фибринолитическая активность Фосфо- липаз ная актив-ность МКА к ЛПС
2,5 мМ Ca2+ 5,5 мМ глюкозы Бактерио-скопически Реакция с МКА в ДИА Нали- чие сгустка Реакция с МКА в ДИА
EV БХ - - 11,2 1,0 + + - + + +
БХ + - 41,8 3,7 + + - + - +
БХ - + 17,0 1,5 ± + - + - +
БХ + + 31,6 2,8 - ± + - - +
RPMI - - 39,2 3,5 - - + - - ±
RPMI + - 37,4 3,3 - - + - - ±
RPMI - + 37,3 3,3 - - + - - ±
RPMI + + 46,9 4,2 - - + - - ±
231 БХ - - 7,7 1,0 + + - + + +
БХ + - 13,1 1,7 + + - + - +
БХ - + 10,6 1,4 ± + - + - +
БХ + + 12,6 1,6 - -- + - - ±
RPMI - - 39,3 5,1 - - + - - ±
RPMI + - 40,0 5,2 - - + - - ±
RPMI - + 38,0 4,9 - - + - - ±
RPMI + + 40,3 5,23 - - + - - ±

Примечание: * - индекс пролиферации – соотношение концентрации бактерий данного штамма, выращенных на соответствующей среде с или без добавок и на БХ без добавок (контроль);

«+» - положительная реакция;

«» - отрицательная реакция;

«±» - слабая (следовая) положительная реакция чуть выше отрицательного контроля.

При исследовании биосинтеза Ф1, Ymt и Pla в ДИА с ЧДИ аналогичный феномен наблюдался у природных вирулентных и авирулентных штаммов Y. pestis, несущих хотя бы одну из двух плазмид, видоспецифических для возбудителя чумы, но не у изогенных вариантов EV НИИЭГ.

Поскольку повышение температуры с 26-28 оС до 37 оС у Y. pestis сопровождается биосинтезом in vitro преимущественно менее токсичного четырехацильного липида А вместо шестиацильного с большей токсичностью (26-28 оС) (Гремякова с соавт., 1992; Kawahara et al., 2002; Dentovskaya et al., 2008) нами исследовано влияние биотехнологических режимов на иммунореактивность антигенов углеводной природы у штамма-продуцента ЖЧВ (м. кл. и КЖ бактерий вирулентного штамма 231 как контроль) в ДИА с МКА A6, продуцируемых гибридомой и направленных к консервативному эпитопу Y. pestis, общему для коровой части ЛПС, липида А и ОСА (ЕСА) (Федорова, 1994; 2004). Обнаружено, что МКА A6 реагировали позитивно с м. кл. и КЖ штамма EV НИИЭГ, выращенного на БХ, БХС или БХСГ. Более слабый цветной сигнал в ДИА или его полное отсутствие регистрировалось с м. кл. или КЖ бактерий EV НИИЭГ, соответственно, после их роста на RPMI.

1 2 3 4 5 6 Рис. 2. Электрофореграмма депротеинизированных цельноклеточных лизатов Y. pestis EV НИИЭГ (1 - 3) и Y. pestis КМ-218 (4 - 6), выращенных при 37 С на БХ без дополнительных ингредиентов (1; 4), с добавлением 2,5 мМ Ca2+ (3; 6) или RPMI (2; 5).

В 12,5% ПААГ-SDS депротеинизированных клеточных лизатов штамма EV НИИЭГ и его бесплазмидного варианта КМ-218, выращенных на БХ (контроль), БХС или RPMI, только в контрольных электрофоретических профилях бактерий обоих штаммов, помимо низкомолекулярных быстромигрирующих диффузных зон, идентифицированных ранее как липид А – кор (Bengoechea et al., 2002; 2004), обнаруживались, средне- и высокомолекулярные компоненты (рис. 2, дорожки 1, 4), предположительно связанные с ЕСА (Whitfield et al., 1997; Feodorova, Devdariani, 2001; 2002; Prior, Titball, 2002; Raetz, Whietfield, 2002). Добавление Ca2+ в среду частично ингибировало биосинтез последних: на электрофореграмме полностью отсутствовали высокомолекулярные углеводные компоненты (рис. 2, дорожки 3, 6). В режимах, приближенных к внеклеточным условиям in vivo, выявлялись только низкомолекулярные зоны (рис. 2, дорожки 2, 5).

Разработка эффективной антигенной композиции вакцинного

штамма EV НИИЭГ - продуцента ЖЧВ

При сравнении протективного потенциала штамма EV НИИЭГ по способности защищать белых мышей от экспериментальной чумы установлено значительное увеличение иммуногенности штамма-продуцента ЖЧВ после его выращивания в биотехнологических режимах с применением БХС или RPMI – в обоих случаях выживало значительно большее (по крайней мере, в 1,5-1,8 раза) количество животных (табл. 2).

Таблица 2 – Влияние биотехнологического режима на иммуногенные свойства

штамма-продуцента ЖЧВ

Иммунизирующий агент Питательная среда Добавление Са2+ Количество выживших мышей Продолжительность жизни погибших мышей (дни), М ± m
Абс.* %
Бактерии штамма EV НИИЭГ БХ - 5/11 45,5 4,3 ± 0,6
БХ + 7/10 70,0 4,0 ± 0**
RPMI - 8/10 80,0 4,5 ± 0**
Физ. раствор (контроль) - - 0/5 0 4,2 ± 0,97

Примечание: * - в числителе/знаменателе - кол-во выживших мышей/общее

количество зараженных мышей в этой группе;

** - животные погибли в один день.

 Иммунореактивность мышиных антисывороток к клеткам EV НИИЭГ,-2

Рис. 3. Иммунореактивность мышиных антисывороток к клеткам EV НИИЭГ, выращенным на БХ, БХС или на RPMI в непрямом ТИФА с применением гомологичных сенситинов.

При сравнении антигенной активности штамма-продуцента ЖЧВ обнаружено выраженное изменение титров гомологичных антител в сыворотках мышей BALB/c к м. кл. штамма в зависимости от биотехнологических режимов выращивания – повышение в восемь раз на БХС или снижение в четыре раза на RPMI (рис. 3).

С помощью иммуноблоттинга, нами идентифицированы конкретные иммунореактивные антигены штамма-продуцента ЖЧВ, обеспечившие в исследованиях высокий уровень специфического иммунитета против экспериментальной чумы (рис. 4). Положительная реакция в контрольных образцах цельноклеточных лизатов клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенных на БХ, визуализировалась с белковыми полосами, соответствующими по м.м. Caf1 - мономеру ФI (17,5±2 кДа), Pla (33±2 кДа) и Ymt (61±2 кДа), а также дополнительно четырем белкам с м.м. 29,9±2; 63,1±2; 65,31±2 и 77,6±2 кДа (мы обозначили их №№ 3, 8, 9, 10, соответственно).

Рис. 4. Иммуноблоттинг электрофоретически разделенных в 12,5% ПААГ-SDS цельноклеточных лизатов Y. pestis EV НИИЭГ (дорожки 1; 2; 3) и Y. pestis 231 (дорожка 4), выращенных на БХ (дорожка 3), БХС (дорожка 1) или RPMI (дорожки 2; 4) и ЧДИ (А) или 231-RPMI (В).

В блоттограммах цельноклеточных лизатов бактерий, выращенных на БХС, также регистрировалась положительная, но менее выраженная реакция с Caf1 и Pla, а также белками № 8-10. С Ymt и белком № 3 визуазировались более мажорные линии (рис. 4, дорожка 1).В этом же треке выявлялся целый ряд из 6 дополнительных полипептидов с м.м. 21,4±2; 23,9±2; 26,3-28,8±2; 39,8±2; 44,2±2; 48,4±2 кДа (№№ 1, 2, 5, 6, 7, 11, соответственно). Положительной реакции с лизатами бактерий как вакцинного, так и вирулентного штаммов Y. pestis 231 (использован в качестве контрольного), выращенных на среде RPMI, зарегистрировано не было (рис. 4, дорожки 2 и 4, соответственно).

В иммуноблоте с аналогичными лизатами с мышиной антисывороткой к клеткам вирулентного штамма 231, выращенного на RPMI, в треках EV НИИЭГ (контроль – БХ) визуализировались следовая реакция с Caf1 и белком № 7, а также выраженное взаимодействие с белками № 10 и № 12 с м.м. 83,1±2 кДа (рис. 4, дорожка 3). Реакция с другими антигенами отсутствовала. В треках с лизатами EV НИИЭГ после роста БХС и RPMI мы обнаружили положительную реакцию только с белком № 7 (рис. 4, дорожка 1) или, помимо данного антигена, также с белком № 12. С лизатами штамма 231, выращенного на RPMI, выявлялась одна мажорная линия специфического взаимодействия с белком, обладающим м.м. 26,3-28,8 кДа (рис. 4, дорожка 4). Видимо, именно этот антиген обладал серологическим родством у бактерий вакцинного и вирулентного штаммов и был задействован, наряду с белками № 7 и № 12, в обеспечении высокого уровня протекции иммунных мышей от экспериментальной чумы.

Таким образом, сравнительное изучение влияния режимов выращивания на иммуногенность и продукцию штаммом-продуцентом ЖЧВ основных видоспецифических антигенов с протективными свойствами показало существенное преимущество биотехнологических подходов, основанных на моделировании стадии контакта чумных бактерий с клеткой-мишенью в организме чувствительных млекопитающих. При этом повышение иммуногенности сопровождалось изменением продукции иммунореактивных антигенов в зависимости от условий культивирования штамма EV НИИЭГ и появлением специфических антигенных субстанций, способных индуцировать у биомоделей выработку нейтрализующих протективных антител в высоких титрах.

Использованный в настоящей работе биотехнологический режим выращивания вакцинного штамма EV НИИЭГ может способствовать оптимизации антигенной композиции вакцинного препарата для индукции эффективного специфического противочумного иммунитета.

Выводы

1. Продемонстрирована эффективность использования биотехнологических режимов выращивания экспериментально-производственного штамма Y. pestis EV НИИЭГ с применением БХ, обогащенного ионами кальция и/или глюкозой, и синтетической среды RPMI-1640 с аналогичными добавками и без них для получения клеточного урожая вакцинного штамма EV НИИЭГ значительно (в 3,5-4,2 раза) превышающего таковой при использовании рутинных регламентированных условий культивирования на БХ без добавок.

2. Доказана перспективность использования RPMI-1640 для имитации in vitro условий паразитирования чумного микроба in vivo, что позволяет детально исследовать особенности взаимодействия чумного микроба с макроорганизмом и выявить конкретные антигены, синтезируемые клетками вакцинного (белки с м.м. 44,2±2 и 83,1±2 кДа) и вирулентного (белок с м.м. 26,3-28,8 кДа) штаммов Y. pestis на ранних стадиях вакцинного и инфекционного процессов.

3. Охарактеризован антигенный состав вакцинного штамма EV НИИЭГ и изменение продукции основных видоспецифических антигенов с иммуногенной активностью, Ф1, Pla и Ymt, а также ЛПС, при культивировании его в различных биотехнологических режимах с использованием комплекса современных и классических микробиологических и иммунохимических методов.

4. Благодаря использованию нового оригинального биотехнологического режима культивирования вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ, повышены показатели его иммунореактивности (в восемь раз) и иммуногенности (с 45% до 80%) за счет модификации антигенной структуры штамма-продуцента ЖЧВ.

5. Показана эффективность использования для приготовления ЖЧВ синтетической питательной среды RPMI-1640, которая обеспечивает стандартизацию биотехнологии масштабированного производства вакцины и повышение иммуногенности штамма-продуцента.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Влияние условий культивирования на пролиферативную и антигенную активности штаммов Yersinia pestis с различным плазмидным составом / В.А. Федорова, А.Б. Голова, З.Л. Девдариани [и др.] // Природно-очаговые ООИ на юге России, их профилактика и лабораторная диагностика: сборник научных трудов. Астрахань, 2001. С. 165-167.
  2. Федорова В.А., Голова А.Б., Девдариани З.Л. Влияние среды культивирования на синтез Yersinia pestis основных видоспецифических антигенов // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: материалы первой региональной конференции молодых ученых. Саратов. 2002, С. 41-42.
  3. Особенности синтеза капсульной субстанции Yersinia pestis / А.Б. Голова, В.А. Федорова, З.Л. Девдариани [и др.] // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: сборник тезисов НИЦ им. Сеченова III конф. молодых ученых России с международным участием. Москва, 2004. С. 166.
  4. Иммунореактивность штаммов Yersinia pestis с различным плазмидным составом в зависимости от условий культивирования / В.А. Федорова, А.Б. Голова, З.Л. Девдариани [и др.] // Медицинская микробиология – XXI век: материалы всероссийской научно-практической конференции. Саратов, 2004. С. 228-229.
  5. Модификация полисахаридных цепей углеводсодержащих антигенов патогенных иерсиний в зависимости от условий культивирования бактерий / В.А. Федорова, А.В. Петрова, З.Л. Девдариани, А.Б. Голова [и др.] // Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемиологического благополучия населения страны: материалы конференции, посвященной 70-летию Противочумного центра. Москва, 2004. С. 164.
  6. Feodorova V.A., Golova A.B. Antigenic and phenotypic modification of Yersinia

pestis in conditions simulating mammalian bloodstream // Journal of Medical

Microbiology. 2005. Vol. 54. P. 435-441.

  1. Изучение интра- и экстрацеллюлярной резистентности возбудителя чумы: модификация антигенной структуры / В.А. Федорова, А.В. Петрова, А.Б. Голова [и др.] // Современные наукоемкие технологии: материалы II конференции студентов, молодых ученых и специалистов: современные проблемы науки и образования. Хургада (Египет), 2005. № 1. С. 73.
  2. Федорова В.А., Голова А.Б. Внеклеточная резистентность возбудителя чумы к фагоцитозу // Вестник Академии Медицинских Наук. 2005. № 10. С. 19-25.
  3. Голова А.Б., Федорова В.А., Девдариани З.Л. Диагностическая значимость антител к антигенам, синтезируемым Yersinia pestis в экстрацеллюлярных условиях // Проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях: санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: материалы VI межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ. Волгоград, 2005. С. 219-220.
  4. Feodorova V.A., Golova A.B. New Method of Induction of an Enhanced Immunity to Experimental Plague in Mouse Model // Vaccine Congress. 2007. Amsterdam. The Netherlands. Р. 10.
  5. Feodorova V.A., Golova A.B. Biotechnological approach for optimization of plague vaccine production // Материалы Германо-Российского форума по биотехноло­гии. Новосибирск, 2009. С. 19.
  6. Федорова В.А., Голова А.Б. Биотехнологические аспекты создания эффективной антигенной композиции чумной вакцины с повышенной иммуногенностью // Сборник научных трудов: современные проблемы инфекционной патологии. Минск, 2009. Вып. 2. С. 531-535.
  7. Федорова В.А., Панькина Л.Н., Голова А.Б. Перспективы создания эффективных безопасных противочумных вакцин нового поколения // Молекулярная медицина и биобезопасность в рамках IV Российского медицинского форума: сборник материалов VI международной конференции. Москва, 2009. C. 232-234.
  8. Оптимизация биотехнологического режима выращивания вакцинного штамма ЕV НИИЭГ для повышения иммуногенности и иммунореактивности чумной вакцины / В.А. Федорова, А.Б. Голова, В.Л. Мотин [и др.] // Инфекции, обусловленные иерсиниями: III Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием. Санкт-Петербург, 2011. С. 111 – 113.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.