WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Особенности токсического действия 2,4,6-тринитротолуола на штаммы escherichia coli

На правах рукописи

Дениварова Наталья Александровна

ОСОБЕННОСТИ ТОКСИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

2,4,6-ТРИНИТРОТОЛУОЛА НА ШТАММЫ ESCHERICHIA COLI

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань - 2006

Работа выполнена в лаборатории инженерной энзимологии кафедры микробиологии ГОУВПО “Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина”

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Куриненко Борис Михайлович
Официальные оппоненты: кандидат биологических наук, старший преподаватель КГМА Кипенская Лариса Викторовна (Казанская медицинская академия, г. Казань) доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник Галина Ивановна Эль-Регистан (Институт микробиологии РАН, г. Москва)
Ведущая организация: Казанский институт биохимии и биофизики РАН, г. Казань

Защита состоится ___________ 2006 г в ____ на заседании диссертационного совета Д.212.081.08 при Казанском государственном университете им. В.И. Ульянова-Ленина, 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного университета.

Автореферат разослан ____________________ 2006 г.

И.о. ученого секретаря

диссертационного Совета,

доктор биологических наук З.И. Абрамова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Нитроароматические соединения традиционно используют в качестве взрывчатых веществ и сырья для производства красителей, синтетических полимеров и растворителей. Они известны так же как избирательно действующие лекарственные препараты и пестициды. Большинство из них высокотоксичные и трудноразлагаемые неприродные соединения, относящиеся к числу экологически опасных веществ.

Одним из представителей полинитроароматических соединений является 2,4,6-тринитротолуол (ТНТ) - вещество, отличающееся выраженными токсическими свойствами и устойчивостью к биодеградации. Как следствие деятельности военных отраслей промышленности и военных объектов в различных регионах мира выявлены большие территории, загрязненные остатками взрывчатых смесей, основным компонентом которых является ТНТ [Fernando et al., 1990; Comfort et al., 1995; Scheibner et al., 1997]. С увеличением уровня производства ТНТ, вызванного потребностями военных, возрастает значение ремедиации мест производства ТНТ, оказывающего вредное влияние на окружающую среду.

В настоящее время наряду с физическими и физико-химическими способами детоксикации отходов, загрязненных ТНТ, разрабатываются подходы для их биоремедиации с использованием микроорганизмов: грибов [Fernando et al., 1990; Hawarl et al., 1999], анаэробных [Boopathy, Kulpaing, 1992; Boopathy et al., 1993] и аэробных бактерий [Наумова с соавт., 1979; Наумова с соавт., 1988; Boopathy et al., 1994; Kalafut et al., 1998]. Механизм биотрансформации ТНТ аэробными и аэротолерантными микроорганизмами интенсивно исследуется [Boopathy еt а1., 1994; Fuller, Manning, 1997; French еt а1., 1998; Kalafut еt а1., 1998; Наумов с соавт., 1998, 1999; Hawari еt а1., 2000; Esteve-Nunez еt а1., 2001; Зарипов с соавт., 2002; Zaripov et al., 2002].

Известно, что аэробные грамотрицательные и грамположительные бактерии различаются по чувствительности к токсическому действию ТНТ [Наумова с соавт., 1982 а] и по стратегии трансформации ксенобиотика [Kalafut et al., 1998]. Отмечается высокая устойчивость к токсическому действию ксенобиотика у грамотрицательных микроорганизмов по сравнению с грамположительными. Вероятно, это является причиной преобладания грамотрицательных бактерий в почвах загрязненных ксенобиотиком. Механизм такой устойчивости может быть обусловлен различными причинами. В том числе наличием в структуре клеточной стенки внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ), выполняющей функцию дополнительного защитного барьера клетки и препятствующего одномоментному поступлению в клетку высоких концентраций ксенобиотика. Однако известно, что стабильность и проницаемость ВЛПМ штаммов грамотрицательных видов может существенно различаться. Следствием этого возможны внутривидовые отличия в устойчивости штаммов к токсическому действию ксенобиотиков, в том числе и ТНТ. Нельзя исключить, что подобные различия могут сказаться и на особенностях стратегии трансформации ксенобиотика устойчивыми и чувствительными штаммами. В частности, стратегия трансформации чувствительными штаммами грамотрицательных бактерий может быть зависима от токсического пресса ксенобиотика, подобно стратегии, описанной нами ранее для аэробной Bacillus subtilis SK1, чувствительной к токсическому действию ТНТ. Несмотря на привлекательность высказанных предположений, мы не нашли их экспериментального подтверждения.

Токсическое действие различных веществ может не только подавлять жизнеспособность микроорганизмов, но и вызывать их адаптацию к новым условиям существования, механизмы которой могут быть разнообразными. В основе адаптации микроорганизмов к токсическим веществам нередко лежит использование как специальных ферментов детоксикации, так и различных ферментных систем обмена веществ клетки. Количество и последовательность использования ферментных систем обмена веществ клетки для детоксикации будут зависеть от совокупности их свойств и, в частности, от устойчивости ферментов к инактивирующему (ингибирующему) действию ксенобиотика и от значения каталитической константы в реакциях превращения ксенобиотика как субстрата. Исходя из этого, логично предположить, что концентрация ТНТ может оказать решающее значение на его трансформацию той или иной ферментной системой клетки, что, возможно, и определяет особенности так называемой стратегии трансформации. Адаптационные процессы к неблагоприятным условиям среды обитания не ограничиваются реакциями детоксикации, а затрагивают целый ряд морфофизиологических показателей клеток [Пронин с соавт., 1982; Мулюкин с соавт., 1996; Мулюкин с соавт., 1997; Мулюкин, 1998; Головлев, 1998; Куриненко с соавт., 2003]. Влияние высоких концентраций ТНТ на адаптационные изменения метаболизма и морфофизиологические показатели клеток грамотрицательных бактерий – деструкторов практически не исследованы, несмотря на то, что такие исследования имеют несомненное теоретическое и практическое значение.

Цель и задачи исследования. В связи с выше изложенным, цель работы - установить различия в чувствительности к токсическому действию 2,4,6- тринитротолуола штаммов Escherichia coli, отличающихся барьерными свойствами внешней липопротеидной мембраны, и оценить адаптационные изменения штамма Escherichia coli, способного к полной элиминации ксенобиотика, в ответ на токсический стресс.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи исследования:

  1. Разработать метод определения барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий. Провести сравнение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны исследуемых штаммов Escherichia coli.
  2. Оценить способность штаммов, различающихся стабильностью и проницаемостью внешней липопротеидной мембраны, к деструкции ксенобиотика.
  3. Определить влияние различных концентраций 2,4,6-тринитротолуола на изменение стратегии его трансформации штаммами Escherichia coli, различающимися стабильностью и проницаемостью внешней липопротеидной мембраны.
  4. Используя традиционные методы микробиологических исследований и проточную цитофлуориметрию установить характер воздействия высоких концентраций 2,4,6-тринитротолуола на морфофизиологические свойства клеток штамма Escherichia coli К12, способного к полной элиминации ксенобиотика.

Научная новизна работы. Разработан метод оценки барьерных свойств ВЛПМ грамотрицательных бактерий, основанный на различии в чувствительности штаммов E. coli к анионному поверхностно активному веществу - натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ, АОТ) и основному фуксину.

Впервые установлено, что штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающиеся по чувствительности к токсическому действию ксенобиотика, адаптируются к токсическим концентрациям, используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритации. С увеличением концентрации ксенобиотика происходило изменение стратегии его трансформации с образования продуктов нитровосстановления на образование нитритов, как у изученной ранее грамположительной B. subtilis SK1, чувствительной к токсическому действию ТНТ [Куриненко с соавт., 2003].

Впервые установлено, что изменение стратегии трансформации ксенобиотика различными штаммами одного и того же вида грамотрицательных бактерий, различающихся барьерными свойствами внешней липопротеидной мембраны, зависит от концентрации ТНТ. Смена образования продуктов нитровосстановления на продукты денитритации происходит при более низкой концентрации ксенобиотика у штамма, обладающего менее стабильной и более проницаемой ВЛПМ.

Впервые, на примере штамма E. coli К12, обладающего наиболее стабильной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, установлено, что действие высокой концентрации ТНТ(200мг/л) в аэробных условиях сопровождается изменением морфологических показателей клеток: уменьшением размеров, увеличением их плотности и изменением морфологии части клеток популяции с палочковидной на кокковидную.

Впервые, с помощью метода проточной цитофлуориметрии, установлено, что ТНТ оказывает ингибирующее действие на механизмы, ответственные за энергетический статус клеток E. coli, что проявляется в снижении их трансмембранного потенциала ().

Впервые также установлено различие в так называемом энергетическом профиле популяции - в количественном распределении клеток популяций контроля и «ТНТ-клеток» по значению. В обеих популяциях, в зависимости от фазы роста в контроле и концентрации ТНТ в «ТНТ-клетках», имелись субпопуляции с высоким и низким значением. В контроле бимодальное распределение клеток по значению имело место в лаг-фазе и при переходе в стационарную фазу роста. Для «ТНТ-клеток» бимодальное распределение по значению определялось во всем диапазоне высоких концентраций ТНТ.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены доказательства того, что изменение стратегии трансформации ТНТ зависящее от концентрации ксенобиотика и впервые описанное нами для аэробной грамположительной B. subtilis SK1 [Куриненко с соавт., 2003], получило подтверждение для грамотрицательной E. coli. Это обосновывает необходимость выяснения механизма переключения стратегии нитровосстановления на денитритацию и выяснения молекулярного механизма денитритации, который до сих пор не известен. Знание деталей этих механизмов представляет интерес для фундаментальной науки, в частности раздела, изучающего регуляцию метаболизма микроорганизмов в экстремальных условиях жизнеобеспечения.

Установлено, что ТНТ в токсических концентрациях вызывает структурно-функциональные перестройки клеток E. coli, что проявляется в уменьшении размеров, и увеличении удельной плотности, подавлении аккумуляции энергии. Эти перестройки обратимы и со снижением концентрации ксенобиотика происходит нормализация морфофизиологических показателей клеток. Эти данные имеют практическое значение. Их целесообразно учитывать при определении кинетических параметров роста бактерий в условиях токсического стресса. Пренебрежение этими данными при определении кинетических параметров роста бактерий, культивируемых в условиях токсического стресса, может привести к некорректным выводам, если эти параметры сформулированы на основе оптической плотности культуры.

Переключение стратегии трансформации ТНТ имеет не только научное, но и практическое значение. Его необходимо учитывать при использовании аэробных грамотрицательных бактерий или сообщества микроорганизмов для биодеградации отходов, содержащих ксенобиотик.

Основные положения, выносимые не защиту.

1. Вид E. coli демонстрирует высокую вариабельность барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны.

2. Штамм E. coli К12 со стабильной внешней липопротеидной мембраной по сравнению со штаммом E. coli 055 с более проницаемой и менее стабильной ВЛПМ обладает способностью к более быстрой и полной элиминации ТНТ из среды культивирования.

3. Токсическое действие ТНТ по отношению к шт. E. coli К12 проявляется в диссоциации культуры на две жизнеспособные субпопуляции, характеризующиеся выраженными морфологическими и физиолого-биохимическими отличиями.

4. Клетки E. coli К12, культивируемые в присутствии высоких концентраций ТНТ, отличается более мелкими размерами, увеличением удельной плотности, повышенной проницаемостью ВЛПМ.

5. Высокая концентрация ТНТ приводит к снижению скорости утилизации глюкозы штаммом E. coli К12, уменьшению в клетках штамма количества восстановленных никотинамидадениндинуклеотидов и увеличению восстановленных флавопротеидов.

Связь работы с научными программами и собственный вклад автора в исследования. Работа в течение 2001-2005гг. проводится в соответствии с планом НИР Казанского государственного университета «Молекулярные механизмы ответа клетки на раздражение. Влияние природы и силы раздражителя, функционального состояния клетки и степени ее дифференцированности на содержание клеточного ответа» (№ гос. регистрации 01.2.00.1.15733, научный руководитель д.б.н. проф. Б.М. Куриненко). Постановка задачи диссертационного исследования принадлежит научному руководителю работы д.б.н. проф. Б.М. Куриненко. Научные положения диссертации и выводы базируются на результатах собственных исследований автора. Трансмембранную разность электрических потенциалов (трансмембранный потенциал ) бактерий, проницаемость внутренней плазматической мембраны, прямое светорассеяние FSC (показатель размера клетки) и боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности цитоплазмы) определяли совместно с д.м.н. проф. Г.В. Черепневым и врачом-лаборантом Т.А. Велижинской, на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA) на базе лаборатории иммунологии Республиканской Клинической Больницы № 2 Министерства Здравоохранения Республики Татарстан. Определение количества окисленных и восстановленных кофакторов проводили совместно с к.б.н. Р.Э. Давыдовым на спектрофлуориметре «SIGNE - 4M» на базе лаборатории инженерной энзимологии Казанского Государственного Университета им. В.И. Ульянова-Ленина.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях КГУ (Казань, 2001, 2002, 2003, 2004), школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2004), XII и XIII юбилейной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Благодарности. Автор выражает глубокую признательность: научному руководителю доктору биологических наук профессору Б.М. Куриненко, за чуткое руководство; кандидату биологических наук Г.Ю. Яковлевой за поддержку, помощь в выполнении и внимательное отношение к работе; кандидату биологических наук Р.Э. Давыдову за определение количества окисленных и восстановленных кофакторов и участие в обсуждении результатов; доктору медицинских наук Г.В. Черепневу и врачу-лаборанту Т.А. Велижинской; за возможность осуществления цитофлуориметрии на базе лаборатории иммунологии РКБ №2 МЗ РТ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 109 страницах машинописного текста, включает 4 таблицы, 18 рисунков. Библиография содержит 173 источника, из них 120 зарубежных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Микроорганизмы, среды и условия культивирования

Объектом исследования служили штаммы E. coli К12, E. coli 055, E. coli 020, E. coli 25927, E. coli В12, E. coli 0124, E. coli К2KS, E. coli 209, E. coli 168, E. coli 026 из коллекции музея Казанской государственной медицинской академии.

Инокулят выращивали в колбах на 100 мл на мясопептонном бульоне (МПБ) 16-18 ч при 300С в условиях принудительной аэрации и вносили в среду до конечной концентрации 3,4·107 клеток/мл. Культивирование вели в колбах на 250 мл на качалке при 120 об./мин на синтетической среде следующего состава (г/л): (NH4)2SO4 – 0.5; MgSO4·7H2O – 0.25; NaCl – 0.5; глюкоза – 3.0; ТНТ - 0.2; фосфатный буфер (0.2 M KH2PO4 / Na2HPO4, pH 7.0)- 4 % (об./об.).

ТНТ, предварительно растворенный в этаноле, вносили перед автоклавированием в подогретую до 800С среду до конечной концентрации 20 - 200 мг/л.

2. Микробиологические методы

2.1. Определение концентрации биомассы. Концентрацию биомассы определяли нефелометрическим методом, измеряя светорассеяние, вызываемое суспензией клеток микроорганизмов, на фотоколориметре КФК-2-УХЛ4.2 с красным светофильтром, при длине волны 670 нм [Методы общей бактериологии, 1983].

2.2. Подсчет общего количества бактериальных клеток. Подсчет велся в счетной камере Горяева-Тома [Методы общей бактериологии, 1983].

2.3. Определение количества живых клеток микроорганизмов. Жизнеспособность определяли путем высева на плотные питательные среды и подсчета числа колониеобразующих единиц (КОЕ) [Методы общей бактериологии, 1983].

2.4. Микроскопическое наблюдение. Проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Jena (ГДР) с фазово-контрастным устройством. Фотографировали цифровой фотокамерой NIKON Coolpix S1 с использованием иммерсионной системы, с объективом x 100, и окуляром x 15.

2.5. Определение размеров клеток. Определение размеров клеток популяции проводили с помощью микроскопа Carl Zeiss Jena (ГДР) и окулярного винтового микрометра МОВ-1-15X [Методы общей бактериологии, 1983].

2.6. Определение показателя преломления бактериальных клеток. Для расчета удельной плотности клеток использовали фотометрическое определение показателя преломления бактерий экстраполяционно-графическим методом [Фихман, 1967].

2.7. Определение барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ). Барьерные свойства ВЛПМ оценивали по разнице в КОЕ, выросших на мясопептонном агаре (МПА) и МПА с добавлением фуксина в концентрации аналогичной его количеству в дифференциально-диагностической среде Эндо (0,2 г/л), а также по разнице в КОЕ, выросших на МПА и МПА с АОТ в концентрации 10-3 % и МПА с АОТ в той же концентрации, но с добавлением фуксина [Оригинальный метод автора].

3. Химические и биохимические методы

3.1. Определение эффективности трансформации ТНТ. Эффективность трансформации оценивали по убыванию концентрации ТНТ в культуральной жидкости. Для определения ТНТ использовали метод, основанный на цветной реакции ТНТ с Na2SO3 в щелочных условиях [Лурье, Рыбникова, 1974].

3.2. Интегральная оценка количества продуктов нитровосстановления (ПНВ). Суммарное количество ПНВ определяли с помощью цветной реакции с п-диметиламинобензальдегидом по методике, описанной Наумовой с соавт. [1983].

3.3. Выделение и идентификация метаболитов трансформации ТНТ. Идентификацию продуктов превращения ТНТ проводили, сравнивая величины Rf в двух системах растворителей с аналогичными параметрами метчиков, синтезированных и предоставленных Наумовым А.В.: 2-амино-4,6-динитротолуол (2-А), 4-амино-2,6-динитротолуол (4-А) и 2,4-диамино-6-нитротолуол (2,4-ДА).

3.4. Определение количества нитритов. Определение проводили по общепринятой методике с реактивом Грисса [Hanson, Phillips, 1981].

3.5. Определение концентрации глюкозы. Определение осуществляли ферментативным методом [Bergmeyer et al.,1974].

3.6. Определение количества окисленных и восстановленных кофакторов. Определение проводили спектрофлуориметрически [Лукьянова с соавт., 1982; Harrison, Chance,. 1970] на спектрофлуориметре «SIGNE - 4M» (г. Рига).

4. Метод проточной цитофлуориметрии

Трансмембранную разность электрических потенциалов (трансмембранный потенциал - ) бактерий, прямое светорассеяние FSC (показатель размера клетки) и боковое светорассеяние SSC (показатель гранулярности цитоплазмы) [Muller et al., 2000], проницаемость плазматической мембраны [Herrera et al., 2002] определяли на проточном цитофлуориметре Facs Calibur (Becton Dickinson, USA).

5. Статистическая обработка результатов

Математическую обработку данных проводили в стандартной компьютерной программе «Microsoft Excel». В работе все эксперименты были проведены не менее чем в пяти повторностях. Группу данных считали однородной, если среднеквадратическое отклонение в ней не превышало 13 %. Различие между группами считали достоверным при критерии вероятности Р<0,05.

Результаты проточной цитофлуориметрии анализировали на рабочей станции Macintosh Quadra 650 в программе Cell Quest (Becton Dickinson) с применением статистики Колмогорова-Смирнова. Для корректного сопоставления в клетках неодинакового размера сравнивали только нормированные «сигнал минус шум»-гистограммы.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Оценка барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны штаммов E. coli. Для оценки барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ) исследуемых штаммов E. coli мы использовали различие в их чувствительности к АОТ [Hancock et al., 1984; Tomlins et al., 1972] и основному фуксину.

С этой целью мы сравнивали способность различных штаммов E. coli расти на МПА содержащем фуксин в концентрации 0,2 г/л, 0,5 г/л, 1 г/л и на средах, содержащих фуксин 0,2 г/л и АОТ в концентрации 10-1 %, 10-3 %, 10-5 %. С помощью этих тестов был проведен скрининг 10 штаммов E. coli. Из них было отобрано два штамма - E. coli К12 и E. coli 055.

Как видно из рис. 1, фуксин вплоть до концентрации 2 г/л не оказывал влияния на количество КОЕ штамма E. coli К12. Количество КОЕ штамма E. coli 055 достоверно уменьшалось, начиная с концентрации 0,2 г/л, а при 1-2 г/л полностью подавлялось.

Рис.1. Количество колониеобразующих единиц клеток E. coli штаммов К12 (а) и 055 (б), выросших на МПА с различной концентрацией фуксина (г/л). За 100 % принимали количество КОЕ выросших на МПА без фуксина. На этом и на последующих рисунках достоверные отличия от контроля (P<0.05) обозначается *.

Добавление к МПА с фуксином (0,2 г/л) АОТ в концентрациях от 10-5% до 10-1 % (рис. 2) не влияло на количество КОЕ штамма E. coli К12, но оказывало синергидный с фуксином подавляющий эффект на клетки штамма E. coli 055.

Рис. 2. Количество колониеобразующих единиц клеток E. coli штаммов К12 (а) и 055 (б), выросших на МПА и на МПА с фуксином (0,2 г/л) в присутствии различных концентраций АОТ. За 100 % принимали количество КОЕ выросших на МПА без фуксина и АОТ.

Влияние ТНТ на рост и деструктивные свойства E. coli К12 и E. coli 055

В экспериментах использовался широкий диапазон концентраций ТНТ - от 20 мг/л до 200 мг/л. Штамм E. coli К12 в присутствии высоких концентраций ксенобиотика способен расти на среде с ТНТ во всем диапазоне исследуемых нами концентраций нитроарила, и к 8ч культивирования оптическая плотность культур в опытных вариантах вплоть до концентрации 200 мг/л достоверно не отличалась от контроля (рис.3 а).

Рис. 3. Динамика роста клеток E. coli штаммов К12 (а) и 055 (б) на синтетической среде с различными концентрациями ТНТ: 1 - 20 мг/л; 2 - 50 мг/л; 3 - 100 мг/л; 4 - 150 мг/л; 5 - 200 мг/л.

Штамм E. coli К12 к 8ч полностью элиминировал ТНТ из среды культивирования с исходной концентрацией 20 мг/л, 50 мг/л и 100 мг/л, и на 94 % и 83 % при начальной концентрации 150 мг/л и 200 мг/л соответственно.

Внесение ксенобиотика в среду культивирования оказывало ингибирующее действие на рост E. coli 055 (рис.3 б). При внесении в среду культивирования ТНТ в концентрации 20 мг/л и 50 мг/л, рост E. coli 055 наблюдался на 4ч культивирования, когда ксенобиотик в среде практически не определялся. Штамм E. coli 055, как и описанная нами ранее B. subtilis SK1 [Куриненко с соавт., 2003], элиминировал ксенобиотик из среды культивирования, при исходной концентрации 20 мг/л и 50 мг/л в значительно меньшей степени чем E. coli К12, то же касается и концентрации 100 мг/л, 150 мг/л и 200 мг/л.

Ранее мы высказали предположение о том, что в метаболической адаптации микроорганизмов к токсическому действию ксенобиотиков значительную роль может играть смена ферментных систем детоксикации [Куриненко с соавт., 2003]. Основываясь на этом предположении, мы определили особенности стратегии трансформации ТНТ двумя штаммами E. coli, определив природу образующихся продуктов нитровосстановления и способность к образованию нитритов.

Как видно из рис. 4, при концентрациях ксенобиотика до 50 мг/л для штамма E. coli 055 и до 100 мг/л для E. coli К12 происходила трансформация ТНТ с образованием ПНВ. При дальнейшем увеличении концентрации ТНТ количество ПНВ снижалось, и в среде начинали накапливаться нитриты. То есть оба штамма способны трансформировать ТНТ, используя стратегию нитровосстановления и денитритации ксенобиотика. Вместе с тем, система редукции, ответственная за образование ПНВ, у клеток штамма E. coli 055 инактивировалась раньше, чем у штамма E. coli К12. Соответственно в процесс трансформации ТНТ у штамма E. coli 055 раньше, чем у штамма E. coli К12 включалась система денитритации ксенобиотика.

Рис. 4. Динамика образования продуктов трансформации ТНТ через 8ч культивирования E. coli штаммов К12 (а) и 055 (б) на синтетической среде с различными концентрациями ксенобиотика.

Представленные нами данные свидетельствуют о том, что различные штаммы одного и того же вида грамотрицательных бактерий могут различаться по чувствительности к токсическому действию ТНТ. Они способны адаптироваться к токсическим концентрациям ТНТ, используя как стратегию нитровосстановления, так и денитритации ксенобиотика, как и ранее изученная нами B. subtilis SK1 [Куриненко с соавт., 2003]. Более высокая чувствительность к токсическому действию ТНТ клеток штамма E. coli 055 и переключение метаболизма со стратегии нитровосстановления на денитритацию при более низких концентрациях ксенобиотика по сравнению со штаммом E. coli К12, находятся в соответствии с нарушением барьерной функции его ВЛПМ. А переключение стратегии трансформации у обоих штаммов с увеличением концентрации ТНТ является доказательством роли токсического пресса в этом переключении. Очевидно, что переключение стратегии трансформации ТНТ штаммом E. coli К12 с образования ПНВ на денитритацию, свидетельствует о подавлении ксенобиотиком системы редукции, что следует рассматривать как проявление токсического действия ТНТ в отношении и этого штамма E. coli.

Ранее нами было показано, что адаптационные механизмы чувствительной к токсическому действию ТНТ B. subtilis SK1, наряду с переключением стратегии нитровосстановления на денитритацию ксенобиотика, также включают в себя целый ряд морфофизиологических изменений клеток [Куриненко с соавт., 2003]. Следует ожидать, что подобные изменения либо отсутствуют, либо носят другой характер у бактерий, способных трансформировать высокие концентрации ксенобиотика. Учитывая это обстоятельство, дальнейшая работа велась со штаммом E. coli К12, с использованием ТНТ в концентрации 200 мг/л.

Влияние ТНТ на морфологию и размеры клеток E. coli К12. Мы определили интенсивность роста E. coli K12, оценивая его по изменению D670, общему количеству клеток и количеству колониеобразующих клеток (КОЕ) культуры в присутствии 200 мг/л ТНТ.

Полученные данные свидетельствуют о том, что D670 культуры в присутствии ТНТ на 2ч и 4ч роста были выше, чем в контроле, и становились равными контролю, начиная с 6ч культивирования (рис.5 а). Более высокие значения D670 отмечались при высоких концентрациях ТНТ в среде культивирования (100 - 150 мг/л). Снижение D670 в опыте до значений в контроле происходило при значительном снижении концентрации ксенобиотика до 18 ± 2 мг/л и ниже.

В отличие от D670, общее количество клеток в контроле в течение всего времени культивирования достоверно превышало количество клеток в опыте. Это же относилось и к количеству КОЕ (рис. 9 б).

Рис. 5. а- рост E. coli K12 в единицах D670 (А) и изменение концентрации ТНТ (Б): 1,А – без ТНТ; 2,А – с ТНТ (200 мг/л); б - общее количество (А) и количество колониеобразующих клеток (Б) E. coli K12: 1 – без ТНТ; 2 – с ТНТ (200 мг/л).

Таким образом, увеличение D670 культуры E. coli K12, растущей в присутствии высоких концентраций ТНТ, не было связано с увеличением количества клеток, а вероятнее всего, как и в случае с B. subtilis SK1 [Куриненко с соавт., 2003], связано с изменением морфологии или физических свойств клеток.

Микроскопическое исследование показало, что в контроле клетки сохраняли палочковидную форму и подвижность в течение всего срока культивирования. На фиксированных окрашенных препаратах они были представлены в виде одиночных палочек или коротких цепочек. Клетки, растущие в присутствии ТНТ («ТНТ-клетки») претерпевали морфологические изменения. Начиная со 2ч культивирования, клетки были представлены двумя формами: 85-90% - палочки, хорошо окрашивались фуксином, как и клетки в контроле, и 10-15% - круглые (кокковидные) клетки, мельче контрольных в нативных препаратах, мало подвижны и хорошо преломляли свет. К 4ч количество палочковидных форм значительно снижалось и составляло 25-30%, а количество кокковидных форм возрастало до 70-75%. Палочковидные формы «ТНТ-клеток» преимущественно одиночны, тогда как в контроле наоборот, значительная часть клеток была представлена цепочками. К 6ч в среде с ТНТ было обнаружено 60-70% палочковидных форм клеток и 30-40% кокковидных. На 8ч в опытном варианте сохранялось около 5-10% кокковидных клеток, остальные 90-95% - палочковидные клетки и цепочки палочковидных клеток, хорошо окрашиваемых, подвижных.

Наряду с изменением формы, клетки опытных вариантов отличались от контроля своими размерами. Размер клеток оценивали микрометрически, а также методом проточной цитометрии. Полученные при этом результаты совпадают. На рис. 6 представлены данные по изменению размеров клеток, полученные методом проточной цитометрии. Размер контрольных клеток уменьшается лишь к 8ч культивирования. «ТНТ-клетки» уже через 15 мин. культивирования при сохранении палочковидной формы становились мельче контрольных, еще более уменьшаясь ко 2ч и 4ч культивирования, но к 6ч размер их несколько увеличивался и к 8ч превышал размер клеток в контроле.

Рис. 6. Изменение размеров клеток E. coli К12: 1 - без ТНТ; 2 - с ТНТ (200 мг/л). Данные полученные методом проточной цитометрии, представленные в условных единицах (у.е.).

Так как изменение морфологии и размеров «ТНТ-клеток» в процессе культивирования не подчинялось принципу «все или ничего» это свидетельствует о гетерогенности популяции E. coli K12. Эта гетерогенность проявлялась в различном отношении, по крайней мере, двух субпопуляций клеток к токсическому действию ТНТ. Вероятно, палочковидные формы «ТНТ-клеток», обнаруживаемые при микроскопическом исследовании, о чем говорилось ранее, по неизвестной причине более устойчивы к токсическому действию ксенобиотика.

Изменение показателя преломления и гранулярности клеток E. coli К12, культивируемых с ТНТ. Изменение морфологии и уменьшение размеров клеток не могли объяснить отмеченную выше неадекватность изменений оптической плотности и количества клеток E. coli K12, культивируемых в присутствии ТНТ (рис. 5 а,б).

В связи с этим представлялось необходимым определить показатель преломления клеток E. coli K12. Показатель преломления клеток контроля достигает максимума ко 2ч культивирования, после чего начинает снижаться. Показатель преломления «ТНТ-клеток» также увеличивается со 2ч, к 4ч достоверно превышая показатель преломления клеток контроля, достигая значений, которые сохраняются на 6 - 8ч культивирования. Подобное изменение показателя преломления бактериальных клеток, культивируемых в присутствии 200 мг/л ТНТ, наблюдалось и у исследуемой ранее B. subtilis SK1, культивируемой в аналогичных условиях [Куриненко с соавт., 2003]. Показателем, адекватным показателю светопреломления, при методе проточной цитометрии, является гранулярность (боковое светорассеяние) клетки (рис. 7). Причиной увеличения показателя преломления, как и гранулярности, может быть увеличение концентрации клеточных макромолекул, конденсация внутриклеточных структур или появление новых внутриклеточных образований. Каждое из этих равновероятных изменений структуры клеток приведет к увеличению их оптической плотности.

Рис. 7. Изменение гранулярности клеток E. coli К12: 1 - без ТНТ; 2 - с ТНТ (200 мг/л). Данные полученные методом проточной цитометрии, представленные в условных единицах (у.е.).

Влияние ТНТ на проницаемость внешней липопротеидной мембраны (ВЛПМ) и плазматической мембраны клеток E. coli К12.

Морфофизиологические изменения клеток E.coli K12 в присутствии высоких концентраций ТНТ позволяют предположить, что они вызваны массивным поступлением ксенобиотика или продуктов его метаболизма к чувствительным к токсическому действию клеточным мишеням. В этом случае следовало ожидать ослабления барьерной функции внешней липопротеидной мембран и плазматической мембраны в процессе культивирования с ксенобиотиком. На рис.8 представлены результаты проверки этого предположения.

Рис. 8. Количество колониеобразующих единиц E. coli К12, выросших на МПА, МПА с АОТ (10-3 %), МПА с фуксином (0,2 г/л) и МПА с АОТ (10-3 %), и фуксином (0,2 г/л) (а - без ТНТ; б - с ТНТ (200 мг/л)). За 100 % принимали количество КОЕ, выросших на МПА.

Как видно из представленных данных в присутствии АОТ и фуксина количество КОЕ со 2ч культивирования с ТНТ уменьшалось по сравнению с контролем. Изменение чувствительности к фуксину у клеток, культивируемых в присутствии ТНТ, вызвано увеличением проницаемости ВЛПМ, однако появление чувствительности к АОТ не позволяет исключить и структурные перестройки ВЛПМ.

Так как нельзя исключить влияния ТНТ на проницаемость плазматической мембраны, мы оценили ее с помощью проточной цитофлуориметрии. Доля клеток контроля и «ТНТ-клеток», окрашенных пропидиум йодидом, - т.е. клеток с проницаемой плазматической мембраной, не превышает 2-4%.

Известно, что одним из критериев жизнеспособности клеток бактерий является целостность ее плазматической мембраны. Отсутствие влияния ксенобиотика (продуктов его метаболизма) на проницаемость плазматической мембраны свидетельствует о том, что клетки E. coli K12, несмотря на токсическое действие ксенобиотика, сохраняют жизнеспособность. Однако, увеличение 2,4,6-тринитротолуолом проницаемости ВЛПМ и отсутствие влияния ксенобиотика (продуктов его метаболизма) на проницаемость плазматической мембраны позволяют предположить, что мишень(и) действия ксенобиотика на клетку локализована(ы) в компартментах, ограниченных ВЛПМ и плазматической мембраной клетки.

Влияние ТНТ на содержание кофакторов клеток E. coli К12 культивируемых в присутствии ТНТ и на катаболизм глюкозы. Отмеченное ранее изменение стратегии трансформации высоких концентраций ТНТ E. coli K12 с образования продуктов нитровосстановления на продукты денитритации ксенобиотика вероятнее всего связано с нарушением функционирования системы ответственной за восстановление нитрогрупп ароматического кольца. В особенности с таким её элементом, как восстановленные кофакторы, необходимые для нитровосстановления ТНТ [Наумова с соавт., 1982а, Kalafut et al., 1998].

Влияние ТНТ на количество восстановленных никотинамидадениндинуклеотидов - НАД (НАДФ) - и окисленных флавопротеидов (ФП) - в «ТНТ-клетках» представлено на рис. 9. Динамика исследуемых кофакторов в контрольном варианте характерна для метаболизирующей культуры в период активного роста [Евтодиенко, Акименко, 1998]. Из рис. 9 следует, что количество восстановленных НАД (НАДФ) в «ТНТ клетках» значительно снижается после 4ч культивирования. Количество окисленных ФП также снижается, что свидетельствует об увеличении их восстановленных форм. Но поскольку это не приводило к смене стратегии трансформации ТНТ, увеличение количества восстановленных флавиновых нуклеотидов свидетельствует о том, что они не участвуют в образовании продуктов нитровосстановления.

Рис. 9. Содержание восстановленных НАД (НАДФ) (а) и окисленных ФП (б) в клетках E. coli K12 на синтетической среде: 1 – без ТНТ; 2 – с ТНТ (200 мг/л).

Образование восстановленных кофакторов зависит от эффективности катаболизма глюкозы. На рис. 10 представлены данные по удельной скорости утилизации глюкозы. Более высокая скорость утилизации на 2ч культивирования по сравнению с контролем, вероятно, связана с использованием кофакторов для интенсификации процессов жизнеобеспечения клеток и максимальной скорости элиминации ТНТ.

Рис. 10. Удельная скорость утилизации глюкозы E. coli K12: 1 - без ТНТ; 2 - с ТНТ(200 мг/л).

Падение удельной скорости утилизации глюкозы на 4ч совпадает с тем, что между 4ч и 6ч количество НАДН (НАДФН) (рис. 9 а) уменьшается. Это коррелирует со снижением скорости образования продуктов нитровосстановления ТНТ и свидетельствует о подавлении ключевых элементов системы редукции. Однако при этом продолжается процесс элиминации нитрогрупп ксенобиотика. Увеличение скорости утилизации глюкозы на 6ч не приводит к увеличению количества восстановленных НАД (НАДФ). Количество продуктов нитровостановления практически не увеличивается. Однако при этом увеличивается как количество КОЕ, так и общее количество клеток (рис. 9 б). Вероятно, после уменьшения количества ТНТ (до 50 мг/л) интенсивно функционирующей системой денитритации ксенобиотика, остаточное количество восстановленных НАД (НАДФ) используется для обеспечения процессов, необходимых для деления и роста клеток.

Подавление 2,4,6-тринитротолуолом аккумуляции энергии и изменение энергетического профиля популяции клеток E. coli К12. Следствием подавления ТНТ восстановительных систем бактерий помимо подавления освобождения энергии в дыхательной цепи следует ожидать подавления работы Н- генераторов которые у E. сoli представлены: НАДН (НАДФН) - СоQ - редуктазой и цитохром оксидазой [Cкулачев, 1989]. Уменьшение н+ сопровождается снижением трансмембранного потенциала, которое можно определить с помощью потенциал-чувствительного флуорохрома 3,3-дигексилоксакарбоцианин йодида (DiOC6(3)).

На рис. 11 представлены данные по изменению значений в клетках контроля E. coli К12 и в клетках, культивируемых в присутствии ТНТ («ТНТ-клетках»). В клетках контроля достигает максимального значения на 2ч культивирования, после чего начинает снижаться. Однако вплоть до 6ч его уровень сохраняет более высокое значение по сравнению с клетками начала лаг-фазы. Только в клетках 8 часовой культуры становится ниже, чем в клетках начала лаг-фазы. ТНТ изменяет динамику клеток на 2ч, как и в контроле, увеличивается. Однако, если в клетках контроля это увеличение составляет 2,4 раза, то в «ТНТ-клетках» 1,6. На 4ч и 6ч значительно ниже, чем в клетках начала лаг-фазы.

Рис. 11. Влияние ТНТ на мембранный потенциал E. coli К12, нормированный к размеру клеток: 1 - без ТНТ; 2 - с ТНТ(200 мг/л).

Представляет интерес факт неоднородности популяции клеток контроля и «ТНТ клеток» по значению. В обеих популяциях имелись субпопуляции с более высоким значением (рис. 12; в левых пиках гистограмм -«низкие» клетки, в правых -«высокие» клетки). В момент внесения инокулята как клетки контроля, так и «ТНТ-клетки» представляли собой клетки начала лаг-фазы. Таким образом, клетки начала лаг-фазы неоднородны по энергетическому статусу. Мы предположили, что в лаг-фазе к размножению готова лишь небольшая часть клеток - -«высокие» клетки, возможно они же и колониеобразующие клетки. При переходе популяции клеток в контроле к экспоненциальному росту (с 2ч по 6ч) соотношение между -«низкими» и -«высокими» клетками смещалось в сторону последних. Гистограммы приобретают унимодальный характер и смещаются вправо, в сторону более высоких значений. К 8ч культивирования (фаза замедления роста и переход к ранней стационарной фазе) гистограмма снова приобретает бимодальный характер. Таким образом, в стационарной, как и в лаг-фазе клетки представлены двумя субпопуляциями, различающимися величиной.

Гистограммы «ТНТ-клеток», в отличие от клеток контроля, сохраняют бимодальный характер по 6ч культивирования включительно. И только на 8ч смещаются вправо, в сторону больших значений. Гистограмма приобретает унимодальный характер, что совпадает с элиминацией ТНТ из среды культивирования и увеличением размеров клеток.

Рис. 12. Изменение мембранного потенциала клеток E. coli К12: а - за первые 15 мин.; б - на 2ч; в - на 4ч; г - на 6ч; д – на 8ч культивирования; 1 - клетки без ТНТ; 2 – с ТНТ (200 мг/л). На оси ординат - количество клеток; на оси абсцисс - мембранный потенциал, выраженный в условных единицах флуоресценции красителя DiOC6(3).

Таким образом, ТНТ оказывает ингибирующее действие на механизмы, ответственные за энергетический статус бактерий. Это проявляется в снижении их мембранного потенциала, о чем свидетельствует смещение с 4ч по 6ч пиков гистограмм -«низких» и -«высоких» «ТНТ-клеток» влево. Вместе с тем, в условиях периодического культивирования ингибирование механизмов, обеспечивающих высокий уровень, не летально. Оно носит транзиторный характер - после элиминации ксенобиотика эти механизмы активируются, обеспечивая восстановление в зоне - «высоких» «ТНТ - клеток» гистограммы.

Ранее было показано, что на ряду с уменьшением размеров часть «ТНТ-клеток» претерпевает морфологические изменения, превращаясь в округлые кокковидные клетки. При этом часть клеток, сохраняющая палочковидную форму, увеличивается по мере снижения в среде концентрации ТНТ. Мы расценили это как гетерогенность культуры, причина которой, возможно связана с различием в чувствительности к токсическому действию ТНТ. В условиях токсического пресса культура гетерогенна также по величине, четко разделяясь на -«низкие» и -«высокие» «ТНТ-клетки». Возможно, это не частный случай, клетки контроля также гетерогенны по величине, но эта гетерогенность выражена меньше, чем в клетках опыта, и проявляется в начале лаг фазы при переходе к стационарной фазе роста культуры. Можно предположить, что неблагоприятные для роста и размножения клеток условия независимо от их природы могут индуцировать гетерогенизацию популяции с целью ее сохранения при помощи части клеток, наиболее устойчивых к гибельным для большинства членов популяции условиям.

ВЫВОДЫ

  1. Среди проанализированных штаммов Escherichia coli барьерные свойства внешней липопротеидной мембраны варьируют от штамма Escherichia coli К12, характеризующегося наиболее стабильной и наименее проницаемой внешней липопротеидной мембраной, до штамма Escherichia coli 055, с наименее стабильной и наиболее проницаемой внешней липопротеидной мембраной.
  2. Штамм Escherichia coli К12 в условиях периодического восьмичасового культивирования способен практически полностью трансформировать максимальную концентрацию 2,4,6-тринитротолуола (200мг/л), тогда как штамм Escherichia coli 055 трансформировал 2,4,6-тринитротолуол в этих условиях на 42 %.
  3. Для трансформации 2,4,6-тринитротолуола штаммы Escherichia coli К12 и Escherichia coli 055 используют стратегии нитровосстановления и денитритации. У штамма Escherichia coli 055 переключение стратегии нитровосстановления на денитритацию происходит при более низкой концентрации 2,4,6-тринитротолуола, чем у штамма Escherichia coli К12, что совпадает с различиями в барьерных свойствах внешней липопротеидной мембраны, определяющей чувствительность к токсическому действию 2,4,6-тринитротолуола.
  4. Токсическое действие 2,4,6-тринитротолуола в отношении штамма Escherichia coli К12, сопровождается морфологическими изменениями: уменьшением размеров клеток, увеличением удельной плотности и переходом части клеток популяции с палочковидной на кокковидную форму; физиологическими изменениями: снижением скорости утилизации глюкозы, уменьшением уровня восстановленных пиридиновых и окисленных флавиновых кофакторов
  5. В присутствии 2,4,6-тринитротолуола у клеток Eschеrichia coli К12 зафиксировано снижение трансмембранного потенциала и изменение энергетического профиля популяции в целом. Тем не менее, на фоне выраженного токсического эффекта, популяция эффективно элиминирует ксенобиотик, нормализуя не только морфофизические характеристики, но и трансмембранный потенциал и его популяционный профиль.
  6. Разработан метод определения барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны грамотрицательных бактерий, основанный на различии в чувствительности штаммов Eschеrichia coli к анионному поверхностно активному веществу – натриевой соли ди-2-этилгексилового эфира сульфоянтарной кислоты (Аэрозоль ОТ, АОТ) и основному фуксину.

Работы, опубликованные по теме диссертации

  1. Куриненко Б.М. Особенности токсического действия 2,4,6 – тринитротолуола в отношении Escherichia coli К12 / Б.М. Куриненко, Н.А. Дениварова, Р.Э. Давыдов, Г.Ю. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология.- 2006.- Т.42.- № 4.
  2. Куриненко Б.М. Чувствительность различных штаммов Escherichia coli к токсическому действию 2,4,6 – тринитротолуола / Б.М. Куриненко, Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева // Прикл. биохимия и микробиология.- 2005.- Т.41.- № 1.- С.53-57.
  3. Куриненко Б.М. Особенности токсического эффекта 2,4,6 – тринитротолуола в отношении Bacillus subtilis SK1 / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова, Ю.В. Абреимова // Прикл. биохимия и микробиология.-2003.- Т.39.- № 2.-С.194-198.
  4. Куриненко Б.М. Влияние токсических концентраций 2,4,6 – тринитротолуола на физические свойства и морфологию клеток Bacillus subtilis SK1 / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова, Ю.В. Абреимова // Прикл. биохимия и микробиология.- 2003.- Т.39.- № 3.- С.313-317.
  5. Куриненко Б.М. Влияние различных концентраций 2,4,6 – тринитротолуола на стратегию его трансформации штаммом Bacillus sp. SK1 / Б.М. Куриненко, Г.Ю. Яковлева, Н.А. Дениварова, Ю.В. Абреимова; Казанский гос.ун-т.-Казань, 2002.- 19с.- Деп. В ВИНИТИ 14.01.2002; № 59-В2002.
  6. Дениварова Н.А. Влияние концентрации 2,4,6- тринитротолуола на использование Bacillus sp. SK1 различных ферментативных систем его трансформации / Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева, Ю.В. Абреимова, Б. М. Куриненко // Ферменты микроорганизмов: Сборник докладов ХII юбилейной конференции, Казань 2001г.-Казань,2001.-С.108-109.
  7. Дениварова Н.А. Влияние барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны Еscherichia coli на стратегию трансформации 2,4,6-тринитротолуола / Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева, Б.М. Куриненко // Биология наука XXI века: Сборник тезисов / 7-ая Пущинская конференция молодых ученых, Пущино 14-18 апреля 2003 г. - Пущино, 2003. - С.272.
  8. Дениварова Н.А. Влияние 2,4,6-тринитротолуола на физические свойства и морфологию клеток Escherichia coli K12 / Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева, Б.М. Куриненко // Биология наука XXI века: Сборник тезисов / 8-ая Пущинская конференция молодых ученых, Пущино 17-21 мая 2004 г. - Пущино,2004. - С.147.
  9. Дениварова Н.А. Влияние барьерных свойств внешней липопротеидной мембраны на использование Escherichia coli различных ферментативных систем для детоксикации 2,4,6-тринитротолуола/ Н.А. Дениварова, Г.Ю. Яковлева, Б.М. Куриненко //“Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение” ХШ международная конференция, Казань 4-8 апреля, сб. тезисов Казань 2005 - с. 27-28.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.