WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Морфофункциональная оценка и возможность коррекции окислительного стресса у свиней в условиях промышленной технологии

На правах рукописи

МАКЕЕВ АЛЕКСАНДР АЛЕКСАНДРОВИЧ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОЦЕНКА И ВОЗМОЖНОСТЬ КОРРЕКЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА У СВИНЕЙ В УСЛОВИЯХ ПРОМЫШЛЕННОЙ ТЕХНОЛОГИИ

03.00.13 – Физиология

03.00.25 – Гистология, цитология,

клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2007

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор

Жучаев Константин Васильевич

кандидат биологических наук

Сахаров Андрей Валентинович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Осадчук Людмила Владимировна

(ИЦиГ СО РАН);

кандидат биологических наук, доцент

Шмидт Юрий Давыдович

(ФГОУ ВПО «НГАУ»)

Ведущая организация – ФГОУ ВПО «Российский государственный

аграрный университет – МСХА им. К.А.

Тимирязева»

Защита состоится « 6 » ноября на заседании диссертационного совета

Д 220. 048. 03 в ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет» по адресу: 630039, Новосибирск, ул. Добролюбова, 160

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Новосибирский государственный аграрный университет»

Автореферат разослан «___» октября 2007 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета С.П. Князев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. Использование промышленной технологии свиноводства связано с нарушением функционирования сформировавшихся в процессе эволюции основных физиологических систем организма животных. Прежде всего, это обусловлено развитием хронического стресса и его вредных последствий, которые становятся основными факторами снижения продуктивности (Гуськов А.Н., 1994).

Одним из ведущих адаптивных эффектов ответной реакции организма на стресс является активация свободнорадикального окисления (СРО) (Меерсон Ф.З., 1984). Однако длительные стрессовые нагрузки приводят к чрезмерному усилению СРО, что классифицируется как окислительный стресс (ОС) (Пшенникова М.Н., 2000). Образующиеся продукты СРО представляют собой высокотоксичные соединения, которые оказывают повреждающий эффект на клетки тканей и органов, изменяют физические и биологические свойства мембран, разобщают окислительное фосфорилирование и нарушают работу встроенных в мембрану ионных насосов (Зенков Н.К., 2001; Душкин М.И., 2002; Меньщикова Е.Б., 2006; Demiera E.V., 1992).

Наиболее чувствительными к повреждающему эффекту окислительного стресса оказываются органы, содержащие в своей структуре избыточное количество субстрата для свободнорадикального окисления – липидов низкой и очень низкой плотности. Одним из таких органов является кость, представляющая собой вместилище не только для красного, но и желтого костного мозга. Согласно существующему представлению о единстве структуры и функции, повреждение костной ткани свободными радикалами должно найти свое отражение в изменении минерального обмена, что недостаточно представлено в публикациях отечественных и зарубежных авторов.

Принимая во внимание, что основное поступление макро- и микроэлементов в организм происходит через органы желудочно-кишечного тракта, а липидные мембраны энтероцитов могут вовлекаться в свободнорадикальное окисление (Подопригорова В.Г., 2004), кость и кишечник могут рассматриваться в качестве органов-мишеней при окислительном стрессе (Коган А.Х., 1992; Склянская О.А., 1994; Погромов А.П., 1996; Grisham M. B., 1993; Gross V., 1994). Учитывая, что микроэлементы входят в состав активных центров ферментного и неферментного звеньев антиоксидантной системы (Зенков Н.К., 2001; Whiteacre C.A., 1992), обеспечивающей свободнорадикальную защиту (Меньщикова Е.Б., 2006), изучение влияния окислительного стресса на состояние минерального обмена, а также на морфофункциональное состояние органов желудочно-кишечного тракта и опорно-двигательного аппарата представляется актуальным.

Цель исследования: дать морфофункциональную оценку и определить возможность коррекции окислительного стресса у свиней в условиях промышленной технологии с использованием антиоксиданта тиофана.

Задачи исследований:

  1. Провести сравнительный анализ показателей свободнорадикального окисления и активности системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят при экстенсивной и интенсивной технологиях содержания.
  2. Определить показатели свободнорадикального окисления и активность системы антиоксидантной защиты в тканях слизистой оболочки кишечника поросят в условиях промышленного комплекса и влияния на них антиоксиданта тиофана.
  3. Изучить распределение некоторых макро- и микроэлементов в слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника, а также в костной ткани поросят в условиях окислительного стресса и при применении антиоксиданта тиофана.
  4. Представить сравнительную морфофункциональную характеристику слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, а также костной ткани тела позвонка поросят при окислительном стрессе и использовании антиоксиданта тиофана.

Научная новизна. Впервые исследовано влияние антиоксиданта тиофана на показатели свободнорадикального окисления и состояние системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят в условиях экстенсивной и интенсивной технологий содержания.

Установлен свободнорадикальный механизм поражения клеток и межклеточного вещества слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, а также костной ткани поросят в условиях интенсивной технологии содержания.

Доказано, что при окислительном стрессе структурно-функциональные нарушения клеток и межклеточного вещества слизистой оболочки кишечника обусловлены депрессией ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной защиты вследствие нарушения транспорта микроэлементов, входящих в состав их активных центров.

Впервые показано, что использование антиоксиданта тиофана в условиях окислительного стресса снижает содержание продуктов свободнорадикального окисления в сыворотке крови, тканях слизистой оболочки тонкого, толстого кишечника поросят и корректирует показатели минерального обмена.

Практическая значимость. Определены параметры, характеризующие состояние окислительного стресса у поросят в условиях промышленной технологии содержания.

Предложен метод коррекции последствий окислительного стресса антиоксидантом тиофаном.

Результаты исследований используются в учебном процессе при преподавании дисциплин «Физиология» и «Биология свиньи» студентам Биолого-технологического института НГАУ.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. У поросят в условиях промышленной технологии развивается общий окислительный стресс, о чем свидетельствуют повышенное содержание продуктов СРО и снижение активности системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови.
  2. Повышенный уровень содержания диеновых конъюгатов (ДК), малонового диальдегида (МДА) в тканях тонкого, толстого кишечника поросят и снижение активности системы антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и восстановленного глутатиона (ВГ) в условиях промышленного комплекса является проявлением окислительного стресса и корректируется антиоксидантом тиофаном.
  3. В условиях промышленного комплекса нарушение распределения макро- и микроэлементов в слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника, а также костной ткани поросят является следствием окислительного стресса и корректируется антиоксидантом тиофаном.
  4. Структурно-функциональные нарушения клеток и межклеточного вещества костной ткани, слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, обусловленные окислительным стрессом, корректируются антиоксидантом тиофаном.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на II Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы животноводства: наука, производство и образование» (Новосибирск, 2006), II Международной научно-практической конференции «Аграрная наука сельскому хозяйству» (Барнаул, 2007), V Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития АПК в России» (Красноярск, 2007), Международной научно-практической конференции «Роль молодых ученых в реализации национального проекта “Развитие АПК”» (Москва, 2007), XIV Международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирский государственный университет, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследований, результатов исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложения. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста, иллюстрирована 29 рисунками и содержит 15 таблиц. Библиографический список включает 258 источников, в том числе 144 на иностранном языке.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

В соответствии с поставленными целью и задачами исследования эксперимент проведен на поросятах-сосунах в двух сериях.

Первая серия эксперимента выполнена в условиях промышленного комплекса ОАО «Кудряшовское» и фермерского хозяйства «Петраков» Купинского района Новосибирской области. В данной серии эксперимента для доказательства развития ОС у поросят в условиях интенсивной технологии содержания исследовалось содержание в сыворотке крови поросят продуктов СРО – ДК и МДА, а также активность ферментов антиоксидантной защиты – СОД и КАТ.

Вторая серия эксперимента проведена в условиях промышленного комплекса «Малиновский» Красноярского края. Изучалось влияние антиоксиданта тиофана на показатели СРО и активность системы антиоксидантной защиты в плазме крови и гомогенатах тканей кишечника, распределение макро- и микроэлементов в слизистой оболочке кишечника и костной ткани, а также морфофункциональное состояние тонкого и толстого кишечника и костной ткани тела позвонка свиньи в условиях интенсивной технологии содержания.

Экспериментальная часть работы во всех сериях выполнена на помесных животных разной кровности, полученных от свиноматок с двумя и более опоросами. Методом пар-аналогов были сформированы по 3 группы подсосных свиноматок с 10-суточными поросятами по 30 поросят в каждой группе. Опытный период длился 21 сутки.

В каждой серии по 10 поросят из каждой группы на 22-е сутки выводили из эксперимента и забирали материал для проведения исследований.

Поросята контрольной группы находились в стандартных условиях свинокомплекса. Поросята первой опытной группы дополнительно к корму получали фенольный, серосодержащий антиоксидант тиофан, который скармливали с 10 до 31-суточного возраста в дозе 20 мг/кг живой массы растворенным в 5 мл растительного масла. Животные второй опытной группы получали растительное масло без тиофана по 5 мл на голову.

Кровь забирали прижизненно из яремной вены в первые и последние сутки эксперимента, получали плазму, в которой определяли содержание МДА, ДК, СОД и КАТ. Содержание МДА определяли в реакции с 3-хлоруксусной и тиобарбитуровой кислотами в присутствии ионов меди (Рагина Ю.И. и др, 1998). Содержание ДК определяли в реакции с гептан-изопропаноловой смесью (Стальная И.Д., 1977). Активность СОД определяли по степени ингибирования хемилюминесценции в растворе с ксантиноксидазой (Laihia J.K.,1993). Активность каталазы определяли в реакции перекиси водорода с добавлением молибдата аммония (Королюк М.А., 1988; Aebi H., 1984). Cодержание ВГ в гомогенатах тканей слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника определяли в реакции с аллоксаном (Прохорова М.И., 1982).

Биохимические исследования проводили на базе лаборатории иммунологии атеросклероза ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Содержание макро- и микроэлементов в слизистой оболочке тонкого, толстого кишечника и костной ткани определяли методом рентгено-флуоресцентного анализа (Трунова В.А., 1997). Работа выполнена на базе Института ядерной физики СО РАН.

Материалом для проведения морфологического и гистохимического анализов служили фрагменты тощей кишки и дистального отдела толстого кишечника, а также костная ткань грудного отдела позвоночника. Образцы исследуемых тканей фиксировали в 10-% растворе нейтрального формалина. Костную ткань декальцинировали в насыщенном растворе трилона Б. Препараты изготавливали по стандартной методике и для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Пирс Э., 1960; Луппа Х., 1980). В исследуемых образцах тонкого и толстого кишечника определяли высоту ворсин, глубину залегания крипт, высоту эпителиоцитов, а также площадь собственной пластинки ворсин и крипт.

В образцах костной ткани определяли гистоморфометрические параметры интенсивности костеобразования и костной резорбции по стандартной методике (Автандилов Г.Г., 1990, Glorieux F.H., 2000). Измерение морфометрических параметров проводили с помощью комплекса программ AxioVision (Karl Zeiss, Германия).

Кислые гликозаминогликаны (ГАГ) выявляли альциановым синим по Стидмену, гликоген определяли постановкой ШИК-реакции по Мак-Манусу, коллаген окрашивали по Маллори (Пирс Э., 1960; Луппа Х., 1980)

Для иммуногистохимического определения экспрессии белков гена р 53 и Bcl-2 ставили реакцию с вторичными антителами. Исследование проводили на базе НПО «Вектор», в лаборатории ультраструктурных исследований и патоморфологии.

Статистическую обработку данных проводили по стандартным методикам (Лакин Г.Ф., 1980).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительный анализ активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят в условиях экстенсивной и интенсивной технологий содержания

В первые сутки наблюдения уровень ДК в сыворотке крови поросят контрольной группы свинокомплекса ОАО «Кудряшовское» в 1,8 раз превышает аналогичный показатель поросят контрольной группы фермерского хозяйства. Содержание МДА в сыворотке крови на 57,14 % статически достоверно превышает соответствующий показатель сыворотки крови поросят фермерского хозяйства (табл. 1, 2).

Активность СОД на 15,97 % снижена относительно аналогичного показателя поросят, находившихся в условиях фермы. Уровень активности КАТ на 37,23 % ниже, по сравнению с активностью соответствующего фермента у поросят фермерского хозяйства (табл. 1, 2).

Превышение содержания продуктов свободнорадикального окисления и депрессия ферментов антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят на промышленном комплексе являются доказательством развития окислительного стресса.

Для исключения влияния географических, климатических и возрастных факторов на состояние показателей СРО и активности ферментов антиоксидантной системы был проведен сравнительный анализ этих показателей отдельно по каждому из хозяйств.

У поросят всех групп, находившихся в условиях фермерского хозяйства, показатели МДА и ДК, а также активность ферментов антиоксидантной системы не имеют достоверных различий в течение всего периода наблюдения. Таким образом, у поросят в условиях фермерского хозяйства развитие симптомов окислительного стресса в исследуемый период не обнаружено (табл. 1).

Уровень ДК в сыворотке крови поросят контрольной группы в условиях промышленного комплекса к 21 суткам эксперимента возрастает на 52,72 %, а МДА на 45,45 % относительно первых суток наблюдения. В сыворотке крови поросят контрольной группы уровень активности СОД к концу периода наблюдения уменьшился на 40,02 %, а КАТ более чем на 40 % (табл.2). На 21 сутки эксперимента на промышленном комплексе в сыворотке крови у поросят, получавших антиоксидант тиофан, уровень продуктов СРО был статистически достоверно снижен по сравнению с первыми сутками эксперимента.

Таблица 1. Содержание продуктов свободнорадикального окисления и показатели активности ферментов антиоксидантной защиты в сыворотке крови свиней в условиях фермерского хозяйства 2-я опытная 21-е сутки 11,94±0,49 0,22±0,12 3,87±1,11 329,66±1,52 Таблица 2. Содержание продуктов свободнорадикального окисления и показатели активности ферментов антиоксидантной защиты в сыворотке крови свиней в условиях промышленного комплекса ОАО «Кудряшовское» 2-я опытная 21-е сутки 30,17±1,04 0,41±0,02 172,42±139 1,71±0,09 * Достоверные различия с контролем Р < 0,05 Таблица 3. Содержание продуктов свободнорадикального окисления и показатели активности ферментов антиоксидантной защиты в сыворотке крови свиней в условиях промышленного комплекса «Малиновкий» 2-я опытная 21-е сутки 26,42±0,19 0,56±0,03 187,48±3,41 1,43±0,18 * Достоверные различия с контролем Р < 0,05
1-е сутки 11,97±0,81 0,25±0,11 3,48±1,53 328,46±1,28 1-е сутки 18,96±1,01 0,33±0,03 273,28±1,52 2,08±0,05 1-е сутки 18,15±1,24 0,36±0,04 207,44±5,03 1,92±0,13
1-я опытная 21-е сутки 12,26±0,92 0,25±0,11 4,09±0,85 328,46±0,13 1-я опытная 21-е сутки 11,48±1,21* 0,23±0,03* 373,74±2,5* 3,18±0,05* 1-я опытная 21-е сутки 19,34±1,47* 0,38±0,04* 395,13±4,0* 4,47±0,04*
1-е сутки 12,07±1,24 0,23±0,21 316,92±1,07 3,66±0,13 1-е сутки 19,74±0,71 0,34±0,04 271,52±3,46 2,35±0,05 1-е сутки 19,03±1,83 0,33±0,03 217,94±2,77 1,93±0,05
Контрольная 21-е сутки 12,42±0,74 0,22±0,03 334,85±1,04 3,42±0,76 Контрольная 21-е сутки 29,81±1,08 0,48±0,03 165,07±1,92 1,22±0,24 Контрольная 21-е сутки 24,53±1,08 0,53±0,01 191,25±3,21 1,72±0,17
1-е сутки 11,03±1,03 0,21±0,11 339,38±2,03 3,25±0,17 1-е сутки 19,52±1,35 0,33±0,05 275,19±2,04 2,04±0,33 1-е сутки 17,47±1,01 0,34±0,04 215,69±6,36 1,96±0,21
Показатель ДК, моль/г белка МДА, нмоль/г белка Суммарная СОД, нг/г КАТ, моль/мин/мг белка Показатель ДК, моль/г белка МДА, нмоль/г белка Суммарная СОД, нг/г КАТ, моль/мин/мг белка Показатель ДК, моль/г белка МДА, нмоль/г белка Суммарная СОД, нг/г КАТ, моль/мин/мг белка





















Содержание ДК с 1 по 21 сутки наблюдения снизилось на 41,84 %, а МДА – на 32,35 % (табл. 2). Уровень активности СОД с 1 по 21 сутки эксперимента увеличился на 37,46 %, КАТ – на 35,32 % (табл. 2).

В сыворотке крови поросят второй опытной группы, получавших только масло, с 1 по 21 сутки наблюдения уровень ДК увеличился на 59,12 %, а МДА на 90,63 %.

Исследование активности системы антиоксидантной защиты показало, что уровень активности СОД с 1 по 21 сутки периода наблюдения уменьшился на 36,91 %, каталазы на 17,79 % (табл. 2).

Таким образом, в условиях интенсивной технологии содержания у поросят развивается окислительный стресс. Повышенное содержание продуктов СРО и депрессия ферментативного звена антиоксидантной системы у поросят контрольной и второй опытной групп в течение исследуемого периода не является возрастной особенностью. Применение антиоксиданта тиофана приводит к снижению показателей СРО и повышению активности системы антиоксидантной защиты в сыворотке крови поросят первой опытной группы.

Функциональное состояние системы антиоксидантной защиты и свободнорадикального окисления в сыворотке крови и гомогенатах тканей тонкого и толстого отделов кишечника поросят в условиях интенсивной технологии содержания и применения антиоксиданта тиофана

В 1-е сутки эксперимента уровень интегральных показателей СРО и активность системы антиоксидантной защиты у поросят всех групп не имели статистически достоверных различий (табл. 3). На 21 сутки эксперимента уровень ДК в сыворотке крови поросят контрольной группы на 26,84 %, а в тонком и толстом кишечнике на 48,59 и 28,86 % соответственно, превышал аналогичные показатели поросят первой опытной группы (табл. 4, 5).

В сыворотке крови содержание МДА, было выше по сравнению с соответствующими образцами поросят первой опытной группы в 1,4 раза.

В гомогенатах тканей тонкого и толстого отделов кишечника этот показатель увеличился на 26,8 и 44,89 % соответственно (табл. 4, 5). Активность СОД в сыворотке крови поросят контрольной группы снизилась на 51,59 %, а в гомогенатах тканей тонкого и толстого отделов кишечника на 31,7 и 39,85 % соответственно, по сравнению с аналогичными показателями поросят первой опытной группы.

Уровень активности КАТ в сыворотке крови поросят контрольной группы в 2,6 раза, а в гомогенатах тканей тонкого и толстого кишечника – на 47,24 и 55,66 % ниже относительно данных показателей поросят первой опытной группы.

Таблица 4. Содержание продуктов свободнорадикального окисления и показатели активности системы антиоксидантной защиты в гомогенатах тканей тонкого кишечника свиней в условиях свинокомплекса «Малиновский»

Показатель Группа животных
контрольная 1-я опытная 2-я опытная
ДК, мкмоль/г белка 392,75±52,74 264,32±23,07* 401,26±21,08
МДА, нмоль/мг белка 33,02±2,45 26,04±2,02* 36,05±1,92
Суммарная СОД активность, нг/г белка 116,02±14,43 169,88±24,06* 98,73±5,33
КАТ, моль/мин/мг белка 31,92±6,78 60,65±8,12* 32,74±3,82
Восстановленный глутатион в мг/г белка 35,91±4,6 54,18±2,27* 32,07±2,83

*Достоверные различия с контролем Р < 0,05.

Содержание ВГ в тканях тонкого кишечника поросят контрольной группы было на 33,72 %, а в толстом кишечнике в 2,7 раза ниже, чем в образцах аналогичной ткани поросят первой опытной группы.

Таблица 5. Содержание конечных продуктов свободнорадикального окисления и показатели активности ферментов антиоксидантной защиты в гомогенатах тканей толстого кишечника свиней в условиях свинокомплекса «Малиновский»

Показатель Группа животных
контрольная 1-я опытная 2-я опытная
ДК, мкмоль/г белка 263,72±21,01 204,65±5,23* 278,03±11,04
МДА, нмоль/мг белка 39,76±4,55 27,44±1,33* 43,16±2,73
Суммарная СОД активность, нг/г ткани 114,18±7,04 189,82±16,26* 109,63±2,03
КАТ, моль/мин/м белка 45,03±5,1 101,56±33,37* 42,97±3,41
Восстановленный глутатион в мг/г белка 17,59±1,99 48,12±6,87* 15,72±1,03

*Достоверные различия с контролем Р < 0,05.

Статистически достоверных различий по содержанию ДК, МДА, а также активности ферментов антиоксидантной защиты в сыворотке крови и гомогенатах тканей тонкого и толстого отделов кишечника поросят контрольной и второй опытной групп не обнаружено (табл. 3-5). Это доказывает, что растворитель тиофана – масло не оказывает влияния на изучаемые показатели.

Таким образом, окислительный стресс проявляется не только на организменном уровне, но имеет и локальное проявление. Об этом свидетельствуют повышенное содержание продуктов СРО и депрессия системы антиоксидантной защиты как в сыворотке крови, так и в тканях кишечника поросят контрольной и второй опытной групп. Следует отметить, что применение антиоксиданта тиофана снижает общее и локальное проявление окислительного стресса.

Особенности распределения некоторых макро- и микроэлементов у свиней в условиях промышленной технологии содержания и применения антиоксиданта тиофана

При анализе элементного состава тканей наибольший интерес представляют макроэлементы – Са, Р содержание которых имеет наибольший процент в костной ткани, а также микроэлементы Zn, Cu, Fe, Mn, Se, входящие в состав активных центров ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы (Биленко М.В., 1996; Wendel A., 1992; Olin K.L., 1995).

У поросят контрольной группы на участке основного поступления Са в организм – в слизистой оболочке тонкого кишечника его содержание достоверно, на 51,95 % ниже концентрации этого иона у поросят первой опытной группы и на 33,33 % (Р < 0,05) - у поросят второй опытной группы. Концентрация Са в дистальном отделе толстого кишечника поросят контрольной группы достоверно на 37,15 % ниже аналогичного показателя поросят первой опытной группы и на 13,96 % (Р < 0,05) - второй опытной группы. Анализ полученных данных свидетельствует, что у поросят контрольной и второй опытной групп вследствие влияния окислительного стресса на структурные элементы слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника происходит снижение как поступления Са, так и его выведения из организма. У поросят, получавших антиоксидант тиофан, уровень поступления и выведения Са был соответственно выше, что может объясняться нормализацией обмена Са вследствие протективного эффекта антиоксиданта тиофана на структуру и функцию мембран эпителиоцитов и колоноцитов. Для доказательства нормализации функционирования в мембране клеток каналов и транспортеров Са исследовалось соотношение этого иона с фосфором

Содержание Са в костной ткани тела позвонка у поросят контрольной группы было статистически достоверно в 2,1 раза выше, чем в аналогичных образцах от поросят первой опытной группы и в 1,8 раз (Р < 0,05), чем у поросят второй опытной группы.

В тонком кишечнике содержание Р не имеет достоверных различий между поросятами всех групп. На основном участке выведения – в толстом кишечнике – у поросят контрольной группы уровень Р статистически достоверно на 24,64 % ниже аналогичного показателя поросят первой опытной группы, но на 40,87 % (Р < 0,05) выше, чем у поросят второй опытной группы. Показатель кальций-фосфорного отношения в костной ткани животных контрольной группы составляет 1 / 7,29, у поросят первой опытной группы – 1 / 2,20, а у поросят второй опытной группы 1/ 5,49 (у свиньи в норме этот показатель соответствует 1 / 2,14 (Чечеткин А.В., 1982)).

Рассмотрение особенностей содержания ионов Cu, Zn и Mn в образцах тканей имеет смысл в совокупности, поскольку ионы этих металлов входят в состав активных центров нескольких изоформ одного и того же фермента – супероксиддисмутазы.

В слизистой оболочке тонкого кишечника поросят всех групп уровень ионов Cu, а в толстом Zn не имеет достоверных различий. Это может означать, что окислительный стресс не оказывает влияние на транспорт Сu в тонком, а Zn в толстом кишечнике и соответствующие Сu- и Zn-зависимые изоформы супероксиддисмутазы осуществляют свободнорадикальную защиту эпителиальных клеток при окислительном стрессе в штатном режиме.

Увеличение содержания в толстом кишечнике поросят контрольной группы ионов Mn в 8,9 раз, а Сu в 3,1 (Р < 0,05) раза может свидетельствовать о том, что на соответствующие изоформы СОД в толстом отделе кишечника приходится максимальная нагрузка при ОС и они адаптивно реагируют их синтезом. Поскольку суммарная СОД достоверно ниже как в тонком, так и толстом кишечнике, то общая антиоксидантная активность СОД согласно результатом собственных исследований недостаточна для обеспечения защиты клеток кишечника от свободнорадикального поражения, что может быть доказано при проведении морфологического анализа.

Содержание ионов Zn в эпителии тощей кишки поросят контрольной группы на 45,31 % (Р < 0,05) превышает аналогичное значение у поросят первой опытной группы. Это может быть объяснено адаптивным синтезом эпителиоцитами Zn-зависимой формы супероксиддисмутазы в ответ на повреждающее воздействие продуктов СРО. Снижение содержания Mn в слизистой оболочке тощей кишки у поросят контрольной группы на 75 % (Р < 0,05) по сравнению с поросятами первой опытной группы, вероятно, возникает вследствие его меньшего поступления в результате повреждения свободными радикалами соответствующих каналов и транспортеров.

Несмотря на то, что содержание Сu и Mn в образцах толстого кишечника поросят контрольной и второй опытной группы было более высоким по сравнению с поросятами первой опытной группы (получавших тиофан), это не гарантирует защиты клеток эпителия Mn- и Сu зависимыми изоформами супероксиддисмутазы от свободнорадикального поражения. Их избыточная локализация может быть связана с повышенной эвакуацией вследствие свободнорадикального повреждения колоноцитов и дополнительно требует проведения морфологического исследования.

Содержание ионов Fe в тонком кишечнике поросят контрольной группы на 30,3 % (Р < 0,05) ниже, а в толстом не имеет достоверных различий по сравнению с аналогичным показателем поросят первой опытной группы. Это означает, что в условиях ОС нарушается поступление железа в организм, что находит подтверждение в низкой активности фермента каталазы, в состав активных центров которого входит этот элемент.

Распределение Mn, Сu и Zn в костной ткани не имеет четких закономерностей.

Содержание Fe в костной ткани тела позвонка у поросят контрольной группы статистически достоверно на 25,64 % выше по сравнению с поросятами первой опытной группы, но в 1,8 раз ниже (Р < 0,05) по сравнению с поросятами второй опытной группы. Это может объясняться тем, что Fe является металлом переменной валентности и, по данным литературы, вовлекается в общий свободнорадикальный процесс. Окисленное Fe не удовлетворяет физиологические потребности клеток, что приводит к нарушению гомеостаза. По принципу обратной связи происходит его усиленный транспорт в костную ткань. Следует отметить, что механизмы поддержания гомеостаза этого микроэлемента остаются до конца не выясненными.

Содержание Se в слизистой оболочке тонкого кишечника у поросят контрольной группы на 88 % ниже аналогичного показателя поросят первой опытной группы и на 38,24 % (Р < 0,05), чем у поросят второй опытной группы. Выведение не имеет достоверных различий по сравнению с образцами тканей кишечника животных других групп. При одинаковом выведении Se у поросят всех групп, его повышенное поступление у поросят контрольной и второй опытной групп может рассматриваться как адаптивный признак в ответ на свободнорадикальное повреждение клеток и межклеточного вещества при окислительном стрессе. Однако это требует морфологического подтверждения. Содержание Se в костной ткани поросят контрольной группы на 39,47 % (Р < 0,05) выше соответствующего показателя поросят первой опытной группы, и не имеет достоверных различий с соответствующим значением поросят второй опытной группы. Рассматривая кость как одно из депо Se, можно предположить, что его повышенное содержание у поросят контрольной и второй опытных групп, по сравнению с поросятами, получавшими тиофан, отражает их более высокую потребность в нем в связи с нагрузкой окислительного стресса на неферментативное звено.

У поросят контрольной и второй опытной группы локализация Sr и Pb выше в тканях органов поступления (тонкий отдел кишечника), выведения (толстый кишечник) и его депо – костной ткани по сравнению с аналогичными образцами поросят, получавших антиоксидант тиофан. Повышенное содержание этих тяжелых металлов в костной ткани у поросят контрольной и второй опытной групп будет оказывать цитотоксический эффект на клетки и матрикс костной ткани. Учитывая, что Se является антогонистом Pb, его низкое содержание в костной ткани поросят, получавших тиофан, отражает участие в конкурентном вытеснении Pb из костной ткани и тканей толстого кишечника.

Морфофункциональное состояние тонкого и толстого кишечника свиньи в условиях окислительного стресса и использования

антиоксиданта тиофана

Результаты исследования образцов тканей тонкого и толстого кишечника поросят всех групп показали, что основные изменения структурной организации кишечника касались преимущественно слизистой оболочки.

Высота ворсин в тонком кишечнике поросят контрольной и второй опытной групп достоверно меньше, а глубина крипт - выше соответствующего показателя поросят первой опытной группы, получавших антиоксидант тиофан (табл. 6). Уменьшение высоты ворсин является отражением гибели значительной части эпителиоцитов. О нарушении функциональной активности эпителиальных клеток в слизистой оболочке может свидетельствовать отсутствие положительной реакции в области щеточной каемки при постановке гистохимической реакции на гликопротеиды и кислые гликозоминогликаны в образцах тонкого кишечника поросят контрольной и второй опытной групп. Эти признаки характерны также и для бокаловидных клеток – их содержимое заполнено бледноокрашенным альциан - и ШИК-позитивным веществом, в отличие от бокаловидных клеток кишечных ворсин поросят первой опытной группы. Результаты морфометрического и иммунохимического анализов показали, что увеличение высоты ворсин тонкого кишечника поросят, получавших тиофан, связано с увеличением содержания клеток и снижения индекса апоптоза среди эпителиальных клеток ворсин, по сравнению с соответствующими образцами животных контрольной и второй опытной групп. Это можно рассматривать как следствие того, что использование антиоксиданта тиофана снижает эффекты окислительного стресса и позволяет клеткам выполнять специфические функции. В условиях хронического стрессирования нарушение структуры и функции эпителиоцитов ворсин кишечника связано, главным образом, не с прямым эффектом глюкокортикоидов (ГК) на клетки, а с цитотоксическим эффектом свободных радикалов. Следует отметить, что коррекция антиоксидантом позволила снизить индекс апоптоза в клетках эпителия ворсин и крипт слизистой оболочки тонкого кишечника поросят первой опытной группы на 59,86 и 46,63 %, соответственно, а в клетках эпителия крипт дистального отдела толстого кишечника на 55,36 % по сравнению с аналогичными показателями поросят контрольной и второй опытной группами

Таблица 6. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки тонкого кишечника свиней

Показатель Группа животных
контрольная 1-я опытная 2-я опытная
Высота ворсин, мк 226,38±5,86 315,12±8,94* 229,93±3,21
Высота эпителиоцитов, мк 17,91±0,24 23,14±0,29* 16,52±0,21
Глубина залегания крипт, мк 134,03±1,24 93,58±1,32* 128,04±1,17
Количество эпителиоцитов 32±1,32 49±2,06* 30±3,91
Площадь стромы ворсин, % 52,36±0,29 29,71±1,01* 59,85±0,83

*Достоверные различия с контролем Р < 0,05.

Увеличение глубины залегания крипт в тонком кишечнике поросят контрольной и второй опытной групп, по сравнению с поросятами, получавшими антиоксидант тиофан, можно объяснить усиленной пролиферацией клеток в ответ на повреждение.

Поскольку ответная реакция клеток на стресс имеет универсальный характер, сходная закономерность прослеживается и в собственной пластинке слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника. В связи с тем, что клетки фибробластического дифферона собственной пластинки являются преобладающими в данной структуре, и их активность связывается с синтезом коллагеновых волокон и протеогликанов, действие поражающих факторов безусловно отражается на них. Сравнение результатов морфогистохимического анализа клеток и межклеточного вещества собственной пластинки слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника поросят, получавших антиоксидант, с аналогичными структурами животных контрольной и второй опытной групп, убедительно продемонстрировало, что введение тиофана приводит к коррекции структурно-функциональных нарушений в ткани данного региона. Морфологическим проявлением этого являлись нормализация микроциркуляции и усиление синтетической активности клеток по сравнению с животными других групп, снижение отека межклеточного вещества, интенсивное окрашивание основного вещества альциановым синим на суммарные кислые гликозаминогликаны и гликопротеиды при постановке ШИК-реакции. Коллагеновые волокна принимали характерную морфологию и восстанавливали тинкториальные свойства. Это является еще одним подтверждением преобладающего свободнорадикального механизма поражения клеток и межклеточного вещества у животных при промышленной технологии содержания.

Деструктивным изменениям в большей степени подвержен толстый отдел кишечника. Возможно, это связано с тем, что эволюционно передний отдел кишечника приспособлен исключительно для осуществления процессов пищеварения и всасывания, дистальный отдел - главным образом, для всасывания и выделения продуктов метаболизма. Поскольку процесс полостного, мембранного и внутриклеточного пищеварения сопряжен с деградацией органических соединений, в результате их окисления образуются продукты свободнорадикального окисления в рамках физиологических пределов. В результате клетки отвечают адаптивной реакцией – синтезом ферментов антиоксидантной защиты. Поскольку дистальный отдел толстого кишечника непосредственно не принимает участие в деградации пищи, эти клетки оказываются менее приспособленными к инактивации свободнорадикальных продуктов. Именно с этих позиций можно объяснить их наибольшее поражение при окислительном стрессе.

Наличие деструктивных изменений в эпителиальных клетках, а также в собственной пластинке слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника, явилось основанием для предположения о том, что в результате длительного воздействия окислительного стресса энтероциты и колоноциты вследствие перенапряжения синтеза ферментов антиоксидантной защиты теряют способность к адаптации, изменяется их структура и функция, что приводит к развитию нарушений пищеварения, всасывания и выделения. Для животных, которые получали антиоксидант тиофан, эти морфологические изменения в слизистой оболочке не являлись характерными.

Морфофункциональная характеристика костной ткани тела позвонка свиньи в условиях окислительного стресса и при использовании антиоксиданта тиофана

Морфологические исследования тела позвонка поросят контрольной и второй опытной группы позволяют выявить некоторые особенности организации его компактной и губчатой костной ткани.

Со стороны вентральной поверхности тела позвонка кортикальная пластинка имеет признаки спонгизации: Гаверсовы каналы неравномерно расширены, вокруг лакун остеоцитов отмечается лизис межклеточного вещества.

С дорсальной поверхности тела позвонка кортикальная пластинка на всем протяжении истончена. В поле зрения определяются немногочисленные остеобласты, а также остеокласты в гаушиповых лакунах. Межклеточное вещество костной ткани характеризуется неравномерным интенсивно базофильным окрашиванием. Линии склеивания расширены, имеют извитые прерывистые контуры.

Как с вентральной, так и дорсальной поверхности тела позвонка, при постановке реакции на коллаген по Маллори, выявляются обширные участки костного матрикса, межклеточное вещество которого окрашивается в различные оттенки синего цвета.

На светооптическом уровне в губчатом слое пластинчатой костной ткани отмечается нарушение костной микроархитектоники. Морфологически это проявляется истончением костных перекладин, частичным или полным исчезновение вертикальных трабекул. Сохранившиеся костные балки резко истончены, теряют характерную векториальную направленность. На поверхности костных балок определяется тонкий слой остеоида. Остеобласты не многочисленны и располагаются прерывистой цепочкой. Остеоциты в толще костного матрикса локализуются в широких лакунах полигональной формы. Их цитоплазма слабо выражена, неравномерно окрашивается гематоксилином. Вокруг отдельных остеоцитов костный матрикс теряет характерные для зрелой кости тинкториальные свойства – появляются обширные участки, не воспринимающие кислый краситель.

В межклеточном веществе костных балок линии склеивания расширены, интенсивно базофильны. В некоторых костных балках определяются продольные трещины. Матрикс неравномерно окрашивается гематоксилином.

На микропрепаратах, окрашенных по Маллори, костный матрикс характеризуется неравномерным окрашиванием – от ярко-желтого до темно-фиолетового.

При окрашивании альциановым синим в межклеточном веществе костных балок определяются обширные участки хрящевой ткани, которые проявляют интенсивную реакцию на суммарные кислые ГАГ. При постановке ШИК – реакции межклеточное вещество характеризуется ярко выраженной неравномерностью окрашивания реактивом Шиффа.

Указанные изменения свидетельствуют о глубоком нарушении структурно-функциональной организации костной ткани. Следует отметить, что резорбция матрикса костной ткани приводит к истончению трабекул в результате чего они не выдерживают вектора нагрузки и возникают микропереломы. На препаратах отчетливо заметно, что костный матрикс в области микропереломов в состоянии некроза имеет вид бесструктурного интенсивно базофильного вещества.

В костном мозге кровеносные сосуды расширены, заполнены плазмой и клетками крови, при этом определяются эритроциты с признаками сладж-феномена. На препаратах, окрашенных по Маллори, отчетливо заметно, что стенки сосудов чрезмерно утолщены за счет мощных пучков коллагеновых волокон. Среди клеток миелоидного костного мозга встречаются единичные мегакариоциты и многочисленные жировые клетки.

Костная ткань тела позвонка поросят первой опытной группы имеет некоторые морфологические отличия, по сравнению с животными контрольной и второй опытной группами.

В кортикальной пластинке со стороны вентральной поверхности тела позвонка отсутствуют признаки ее спонгизации. На внутренней поверхности кортикальной пластинки отмечаются множественные скопления остеобластов, которые представлены крупными клетками кубической формы. В местах контакта остеобластов и кости определяются отложения остеоида.

На дорсальной поверхности тела позвонка определяется слой активных остеогенных клеток. Остеобласты характеризуются умеренно базофильной цитоплазмой и эксцентрично расположенным ядром с большим количеством эухроматина, в отличие от клеток поросят первой опытной группы. В области их контакта с костью определяются отложения вновь образованного остеоида. Межтерриториальный матрикс кости равномерно воспринимает кислый краситель. Некоторое усиление базофильной окраски отмечается по периферии лакун остеоцитов.

По данным морфометрического анализа, площадь компактного слоя пластинчатой костной ткани со стороны дорсальной продольной связки увеличена на 18,43 %, с вентральной - на 21,22 % (Р < 0,05) по сравнению с соответствующим показателем поросят контрольной группы.

В отличие от образцов исследуемой ткани поросят контрольной и второй опытной групп в губчатом слое пластинчатой костной ткани отмечается наличие вертикальных трабекул, что придает кости ячеистое строение. Матрикс кости равномерно окрашивается эозином. В межклеточном веществе кости остеоциты располагаются в лакунах уплощенной формы. Клетки имеют крупное овальное ядро с преимущественным содержанием эухроматина. Цитоплазма равномерно окрашивается гематоксилином. При постановке реакции на суммарные кислые ГАГ в цитоплазме остеоцитов определяется гомогенное альцианпозитивное вещество. В отличие от соответствующих препаратов поросят первой опытной группы остеобласты на периферии костных балок располагаются непрерывной цепочкой, в области их контакта с костью определяются отложения остеоида. Его ширина на 47,80 % (Р<0,05) превышает аналогичный показатель животных контрольной группы.

При постановке реакции на коллаген по Маллори межклеточное вещество преимущественно окрашивается в бледные оттенки красного цвета. На периферии трабекул матрикс в виде тонкого слоя интенсивно воспринимает синий краситель. При окрашивании реактивом Шиффа матрикс трабекул проявляет умеренное ШИК – позитивное окрашивание. В отличие от соответствующих образцов поросят контрольной и второй опытной групп, при постановке реакции на суммарные кислые ГАГ положительная реакция отмечается лишь на периферии костных балок и в виде единичных фрагментов в толще трабекул.

Результаты морфометрического анализа показали, что по сравнению с препаратами костной ткани поросят контрольной группы отмечается увеличение площади губчатой костной ткани на 56,69 %, а ширины трабекул на 53,38 % (Р<0,05).

В костном мозге площадь, занимаемая жировыми клетками, статистически достоверно снижена на 42,16% (Р<0,05) по сравнению с соответствующим показателем животных первой опытной группы. Кровеносные сосуды умеренно кровенаполнены, капилляры не имеют признаков нарушения микроциркуляции. Вокруг сосудов располагаются крупные остеогенные клетки овальной или округлой формы. Их ядро содержит большое количество эухроматина, цитоплазма гомогенно окрашивается гематоксилином. При окрашивании по Маллори, вокруг сосудов определяется тонкий слой коллагеновых волокон.

Совокупность выявленных морфогистохимических признаков позволяет заключить, что в условиях окислительного стресса использование антиоксиданта тиофана приводит к коррекции структурно-функциональных нарушений костной ткани поросят.

ВЫВОДЫ

  1. Признаки окислительного стресса у поросят в условиях промышленной технологии проявляются с 10 суточного возраста, о чем свидетельствуют превышение малонового диальдегида на 57,14 %, диеновых конъюгатов на 63,54 %, снижение активности супероксиддисмутазы на 15,97 %, а каталазы на 37,23 % над соответствующими показателями поросят фермерского хозяйства. К концу 1-го месяца жизни уровень малонового диальдегида увеличился на 45,45 %, диеновых конъюгатов на 52,72 %, активность супероксиддисмутазы снизилась на 40,02 %, каталазы на 40,19 % (Р<0,05). Изучаемые признаки не подвержены возрастной динамике в указанный период, что подтверждают результаты исследований в фермерском хозяйстве.
  2. Применение антиоксиданта тиофана в условиях промышленного комплекса приводит к снижению уровня малонового диальдегида на 32,35 %, диеновых конъюгатов на 41,84 %, увеличению активности супероксиддисмутазы на 37,46 %, каталазы на 35,32 % (Р<0,05), что свидетельствует о коррекции общего окислительного стресса у поросят.
  3. Повышенный уровень малонового диальдегида на 26,8 и 44,89 %, диеновых коньюгатов на 48,59 и 28,84 % (Р<0,05) в гомогенатах тканей слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника поросят соответственно и снижение активности системы антиоксидантной защиты – супероксиддисмутазы на 31,7 и 39,85 %, каталазы на 47,24 и 55,66 % (Р<0,05), соответственно, в условиях промышленного комплекса является локальным проявлением окислительного стресса, и поддается коррекции антиоксидантом тиофаном.
  4. В условиях промышленной технологии у поросят происходит нарушение кальций-фосфорного отношения (1/7,29 по сравнению с нормой 1/2,14), а также обмена микроэлементов, входящих в состав активных центров антиоксидантных систем – марганца, меди, цинка и селена в костной ткани, слизистой оболочке тонкого и толстого кишечника, что обуславливает депрессию ферментативного и неферментативного звеньев антиоксидантной системы.
  5. У поросят в условиях промышленной технологии под влиянием окислительного стресса нарушается структурно-функциональная организация эпителия и собственной пластинки в тонком и толстом кишечнике, что выражается в свободнорадикальном повреждении эпителиоцитов их апоптозе, деструкции компонентов межклеточного вещества. Использование антиоксиданта тиофана приводит к коррекции выявленных нарушений.
  6. Окислительный стресс приводит к нарушению микроархитектоники и структурной организации межклеточного вещества костной ткани, пролиферации и дифференцировки клеток остеобластического дифферона. Использование антиоксиданта тиофана предупреждает развитие структурно-функциональных нарушений в костной ткани поросят, способствует увеличению площади губчатой костной ткани на 56,66 % и ширины компактной костной ткани на 20 % (Р<0,05).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для коррекции структурно-функциональных нарушений в органах желудочно-кишечного тракта и кости при окислительном стрессе у поросят в условиях промышленной технологии рекомендуется использовать антиоксидант тиофан в дозе 20 мг/кг в течение 3 недель с 10 суточного возраста.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Макеев А.А. Коррекция антиоксидантом тиофаном структурно-функциональных нарушений костной ткани/ А.А. Макеев, А.В. Сахаров, А.Е. Просенко // Материалы II Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию зооинженер. фак-та НГАУ. Изд-во «Юпитер», Новосибирск, 2006. – С. 194 – 195.
  2. Макеев А.А. Изучение возможности использования антиоксиданта тиофана для коррекции структурно-функциональных нарушений костной ткани при глюкокортикоидном остеопорозе / А.А. Макеев //Сб. науч. работ студентов и молодых ученых. Изд-во ФГОУ ВПО НГПУ, Новосибирск, 2006. – Вып. VIII, ч. I. – С. 154 – 160.
  3. Макеев А.А. Использование антиоксиданта тиофана для коррекции метаболических нарушений костной ткани тела позвонка свиньи при окислительном стрессе // А.А. Макеев, А.В. Сахаров, К.В. Жучаев // Материалы V Междунар. науч.-практ. конф. «Современные тенденции развития АПК в России». Изд-во ФГОУ ВПО Крас.ГАУ, Красноярск, 2007. – С. 323 – 326.
  4. Макеев А.А. Влияние окислительного стресса на состояние костной ткани тела позвонка свиньи / А.А. Макеев, А.В. Сахаров, К.В. Жучаев и др. // Сиб. вестн. с.-х. науки. – 2007. – № 6. – С. 81 – 86.
  5. Макеев А.А. Морфофункциональная организация костной ткани тела позвонка свиньи в условиях окислительного стресса и при использовании антиоксиданта тиофана / А.А. Макеев // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Роль молодых ученых в реализации национального проекта “Развитие АПК”». Изд-во ФГОУ ВПО МГАУ, М., 2007. – ч. II. – С. 265 – 268.
  6. Макеев А.А. Использование антиоксиданта тиофана для коррекции структурно-функциональных нарушений костной ткани тела позвонка свиньи при окислительном стрессе / А.А. Макеев // Материалы II Междунар. науч.-практ. конф. «Аграрная наука сельскому хозяйству». Изд-во ФГОУ ВПО АГАУ, Барнаул, 2007. – к. II – C. 99 – 101.
  7. Макеев А.А. Изучение возможности использования антиоксиданта тиофана для коррекции структурно-функциональных нарушений костной ткани при остеопорозе / А.А. Макеев // Материалы XLV Междунар. науч. студенч. конф. «Студент и научно-технический прогресс», «Биология», Изд-во ФГОУ ВПО НГУ, Новосибирск, 2007. – С. 20.

Подписано к печати «24» сентября 2007 г. Формат 60х84/16

Печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 386.

Отпечатано в копировальном центре НГАУ

г. Новосибирск, ул. Никитина, 155, к. 208б



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.