WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Получение инсулин – продуцирующи х клет ок из мультипотентных стромальных клеток человека

На правах рукописи

ФЕДЮНИНА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

Получение инсулин продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток человека

03.02.07 Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в лаборатории генетики стволовых клеток Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН

Научный руководитель – доктор биологических наук, профессор, Гольдштейн Дмитрий Вадимович
Официальные оппоненты – доктор биологических наук, Климов Евгений Александрович доктор биологических наук, профессор, Поляков Александр Владимирович
Ведущая организация – Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова

Защита состоится « 04 » апреля 2011г. в ______ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,1)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

Автореферат разослан «______»___________________ 2011 г.

Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01

по защите докторских и кандидатских диссертаций,

доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.

Актуальность темы

Распространение диабета в мире постепенно достигает эпидемических масштабов. Согласно прогнозам, в течение следующих 25 лет произойдет увеличение количества больных диабетом почти в два раза (до 300 миллионов человек). Сегодня более 5 миллионов человек по всему миру больны диабетом первого типа (наиболее жесткая форма заболевания), 395 тысяч из них – дети. Сахарный диабет 1 типа (СД 1) характеризуется разрушением - клеток путем аутоиммунной атаки. Недостатки современных методов лечения СД 1 – инсулинотерапии и трансплантации ткани поджелудочной железы (ПЖ) - стимулируют развитие и совершенствование клеточной терапии, в частности, поиск новых альтернативных источников - клеток.

В связи с этим, в последние годы стали активно разрабатываться и изучаться новые методы регенерационной терапии, предусматривающие выделение и ex vivo предифференцировку эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Эти клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем зрелые дифференцированные островки ПЖ и поэтому могут оказаться хорошим материалом для получения достаточных количеств функционально-активной массы - клеток.

Дифференцировка в инсулин-продуцирующие клетки должна включать индукцию регуляции секреции, которая подразумевает накопление инсулина в клетках и быстрое выделение его в ответ на различные физиологические сигналы. Чтобы достичь этого, в клетках должен быть активирован комплекс панкреатических генов, очень сходный с таковым в нормальных - клетках. Получение просто продуцирующих инсулин клеток, без обратной связи и какого-либо контроля его секреции не дает никаких преимуществ по сравнению с простыми методами введения инсулина. Мультипотентные стромальные клетки (МСК) взрослого организма привлекают внимание исследователей и практических врачей по следующим причинам: они наилучшим образом подходят для аутологичной трансплантации; высокая скорость пролиферации позволяет нарастить достаточное количество клеток для трансплантации; обладают способностью к дифференцировке в разные клеточные линии.

Существует предположение, что для эффективной направленной дифференцировки в инсулин – продуцирующие клетки, необходима экспрессия клетками нестина (Lee S., 2000), т.к. показано, что нестин-экспрессирующие клетки, изолированные из человеческих или крысиных островков поджелудочной железы могут дифференцироваться в эндокринные и экзокринные клетки in vitro (Zulewski H., 2001; Blyszczuk P., 2003; Zhang L., 2005). И авторы многих работ для получения таких клеток используют стадию селекции нестин-экспрессирующих клеток, описанную ранее для генерации нейронов (Blyszczuk P., 2003). До сих пор остается неясным, является ли необходимой экспрессия нестина для эффективной трансдифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки.

В настоящее время активно развивается тема о происхождении МСК из предшественников перицитов, имеющих фенотип CD146+CD31- и обладающих более широким спектром дифференцировки по сравнению со стандартно пассированными МСК. Работ по получению инсулин-продуцирующих клеток из популяций данного фенотипа не обнаружено. Опубликовано несколько первых исследований, демонстрирующих возможность использования МСК из костного мозга в качестве источника получения инсулин-продуцирующих клеток, в том числе аутологичных (Karnieli O., 2007; Li Y., 2007). Эффективная трансдифференцировка МСК из жировой ткани и сосудов пупочного канатика в инсулин-продуцирующие клетки в литературе не описана.



Цель исследования

Получение инсулин-продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и пупочного канатика человека.

Задачи исследования

  1. Выделить и охарактеризовать популяции МСК из сосудистой стенки пупочного канатика и жировой ткани.
  2. Подобрать метод доставки гена, кодирующего транскрипционный фактор Pdx1, играющий ключевую роль в дифференцировании клеток поджелудочной железы.
  3. Оптимизировать условия трансфекции, культивирования и состав дифференцировочной среды.
  4. Трансфицировать МСК из пупочного канатика и жировой ткани геном Pdx1 и проанализировать транскрипцию ключевых генов панкреатической дифференцировки: NGN3, NeuroD, MafA, Insulin.
  5. Показать способность полученных инсулин-продуцирующих клеток изменять уровень секреции инсулина в ответ на изменение концентрации глюкозы (тест на толерантность) к глюкозе.
  6. Проанализировать экспрессию нестина в полученных популяциях МСК и проследить корреляцию между уровнем экспрессии нестина и способностью к эффективной дифференцировке в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки.

Научная новизна и практическая значимость

Впервые показано, что эффективная дифференцировка в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки преимущественно происходит в CD146+CD31- популяциях МСК жировой ткани и пупочного канатика человека.

Подобраны оптимальные условия трансфекции (необходимая концентрация аденовирусной конструкции, время сорбции, а так же эффективность трансфекции) CD146+CD31- и CD146-CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека.

Подобраны условия культивирования трансфицированных клеток, а так же состав дифференцировочной среды. Показано, что добавление этапа культивирования в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к увеличению транскрипции инсулина в 7 раз в трансфицированных CD146+ популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM.

В результате проведенного исследования установлено, что транскрипция инсулина сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.

Показано, что полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.

Проведен анализ зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин. Корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдали экспрессию нестина на высоком уровне, к активации транскрипции инсулина не приводила.

В настоящей работе впервые разработан метод получения функционально-активных инсулин-продуцирующих клеток из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека путем транзиентной трансфекции геном Pdx1.

Положения, выносимые на защиту

  1. Популяции МСК из пупочного канатика и жировой ткани периваскулярного фенотипа, несущие на поверхности маркер CD146 эффективно дифференцируются в функционально-активные инсулин-продуцирующие клетки путем транзиентной трансфекции геном Pdx1. Трансфекция популяций МСК, не имеющих маркер CD146, к эффективной дифференцировке в панкреатическом направлении не приводит.
  2. Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к значительному увеличению транскрипции гена Insulin в трансфицированных CD146+CD31- популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM. Транскрипция гена Insulin сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.
  3. Полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.
  4. В процессе анализа зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдалась экспрессия нестина на высоком уровне, к активации транскрипции Insulin не приводила.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по аутологичным стволовым клеткам (Москва, 2009); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов на Дону, 2010); Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по стволовым клеткам и регенеративной медицине (Москва, 2010).

Личный вклад автора в проведение исследования

Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен лично. Протоколы исследования разработаны автором. Публикации работы, а также описание исследования выполнены автором самостоятельно.

Публикации

Результаты диссертационной работы отражены в 6-ти печатных работах: 3-х статьях и 3-х тезисах. Три статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.

Внедрение результатов работы

Результаты исследования внедрены в курс лекций «Соединительные ткани» кафедры гистологии и эмбриологии РГМУ и в работу МГНЦ РАМН.

Объем и структура работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 109 стр. машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 163 источника отечественной и зарубежной литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы исследования

Получение культуры клеток

Стромально-васкулярную фракцию жировой ткани получали из липоаспирата 10 здоровых доноров на основании добровольного согласия. Возраст доноров составил 39±13,97 лет. Жировую ткань дезагрегировали с помощью коллагеназы 1 (1мг/мл) типа («ПанЭко», Россия) и диспазы (200 мг/мл) («ПанЭко», Россия) в течение часа при 37оС, постоянно встряхивая пробирку. Пупочные канатики получали от здоровых рожениц (8 образцов) на основании их добровольного согласия. Из пупочного канатика выделяли сосуды, измельчали их с помощью ножниц, затем дезагрегировали смесью ферментов диспазы (200 мг/мл) и коллагеназы 1 типа (1мг/мл).

Полученные суспензии центрифугировали 10 минут при 1100 об./мин, супернатант отбирали. Клеточный осадок ресуспендировали в небольшом объеме среды DMEM/F12 («ПанЭко», Россия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия), 2 mM L-глутамина («ПанЭко», Россия), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (ФРФ-2) («Prospec»), гепарина 8 Е/мл («BRAUN», Испания), амикацина 100мг/л («Красфарма», Россия). Клетки высевали на пластиковые чашки Петри (Corning) диаметром 90 мм, затем помещали в СО2-инкубатор (37 С, 5% СО2) и инкубировали до достижения 70% конфлюентности, затем снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду в плотности 1500-2000 клеток\см2.


Выделение CD146+ популяции клеток

Часть клеток культивировали согласно опубликованному ранее оригинальному протоколу получения CD146+ популяций клеток, имеющих периваскулярный фенотип (Ржанинова А., 2010). Для этого клетки высаживали на среду DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, 10 нг/мл ФРФ-2, гепарина 8 Е/мл, амикацина 100мг/л с добавлением рекомбинантного человеческого инсулина, который растворяли в 1М соляной кислоте и использовали в конечной концентрации 5нг/мл. После 3-х дневной инкубации неприкрепившиеся клетки переносили на новые чашки, ростовую среду полностью заменяли. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности, затем снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду в плотности 1500-2000 клеток/см2.

В течение 2-3 пассажей преимущественно выделялась фибробластоподобная популяция клеток. Но рост этих клеток ингибировался присутствующим в среде инсулином. Через несколько недель (2-4) после посева культур на среду с инсулином наблюдали участки плотного роста мелких эпетелиоподобных клеток, отличающихся по морфологии от основной популяции (рис.1).

Эти клетки характеризовались высокой митотической активностью в присутствии инсулина и ФРФ-2. Колонии мелких эпителиоподобных клеток были выделены механически и культивированы отдельно в присутствии инсулина. Культура характеризовалась очень быстрым ростом: время удвоения составляло не более 18 часов, в то время как популяции, культивируемые параллельно по стандартному протоколу (CD146), удваивались за 32-45 часов.



 





<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.