WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии

На правах рукописи

БОЧАРОВА Елена Николаевна

Морфологическая и молекулярно-биологическая

характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии

03.00.25 гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва, 2008

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте вирусологии РАМН им. Д.И. Ивановского

Научный консультант:

доктор биологических наук Брагина Елизавета Ефимовна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Лысенко Анатолий Иванович

доктор медицинских наук, профессор Королев Юрий Николаевич

Ведущее учреждение:

ГУ Московский государственный медико-стоматологический

университет

Защита диссертации состоится « » декабря 2008 года в 14-00 часов

на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) ГУ НИИ морфологии

человека РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д. 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии

человека РАМН

Автореферат разослан « » 2008 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Несколько десятилетий назад исследователи стали обращать внимание на роль в этиологии бесплодия человека так называемого мужского фактора По сообщениям из различных источников, примерно в 30% случаев бесплодие супружеских пар обусловлено суб- или инфертильностью супруга. Сравнительный анализ многочисленных данных по показателям спермиологического обследования мужчин, выполненных в 23 странах, показал, что за последние 50 лет уменьшение количества сперматозоидов у населения Европы и Северной Америки составило примерно 50% и представляет собой глобальную проблему (Carlsen E., 1992; Swan et al., 2000). Было показано существенное уменьшение концентрации сперматозоидов (с 113 до 66 млн/мл) и объема эякулята (с 3,4 до 2,75 мл) в период с 1938 по 1990 г.г. Исследование Парижского банка спермы показало, что ежегодно концентрация сперматозоидов у доноров уменьшается на 2,6%, подвижность – на 0,3%, содержание морфологически нормальных сперматозоидов – на 0,7% (Auger J. et al., 1995). По данным Брагиной Е.Е., Абдумаликова Р.А. (2002) в Москве из 1000 мужчин около 10% имеют подвижность сперматозоидов, соответствующую нормативам ВОЗ (WHO, 1992, 2000). При этом около 30% всех случаев мужского бесплодия относят к так называемому идиопатическому бесплодию, то есть бесплодию с невыясненной этиологией.

В информационном письме МЗ РФ от 11 апреля 2003 г. «Современные технологии в сохранении и восстановлении репродуктивной функции» приводятся данные о том, что, согласно данным эпидемиологических исследований, частота бесплодных пар колеблется от 8 до 15%, а в ряде регионов Российской Федерации имеет тенденцию к увеличению. Таким образом, проблема фертильности является одной из актуальных проблем гинекологии и андрологии.

Основным методом первичной диагностики мужского бесплодия является традиционный метод спермиологического обследования, позволяющий поставить предварительный диагноз и наметить пути дальнейшего обследования больных. Определение количества сперматозоидов, характеристика их подвижности и морфологических свойств дает общие представления об оплодотворяющей способности спермы (Menkveld R. et al., 2001). В последние годы предложены компьютерные методы анализа репродуктивной ценности параметров спермограммы (Гончаров Н.П. и соавт., 2006; Calamera J. et al., 1994; Kruger T. et al., 1995; Hofman G. et al., 1996). В случаях так называемого «идиопатического» нарушения фертильности инструкция ВОЗ (WHO, 1992, 2000) рекомендует проведение функциональных тестов, позволяющих выяснить механизмы аномалий сперматозоидов. Метод количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов человека позволяет выявлять первичный или вторичный характер нарушения фертильности, связь нарушения фертильности с генетическими аномалиями либо с действием экзогенных факторов. На основании ретроспективного анализа результатов электронно-микроскопических исследований сперматозоидов большой группы фертильных мужчин (Bartoov B. et al., 1994; Bacetti B. et al., 2002) получены количественные данные о том, какие аномалии сперматозоидов совместимы с фертильностью.

Имеются сведения о выделении вируса простого герпеса из материала спонтанно абортированных плодов человека и животных (Sifakis S. et al., 1998; Rappersberger K., 1999; Mukaiya R. et al., 2000; Spano L. et al., 2002; Moore D. et al., 2003), причем инфицирование эмбриона при спонтанных абортах может быть значимо выше частоты инфицирования матери, что позволяет думать о негативном влиянии на течение беременности каких-либо других факторов помимо генитального герпеса матери (Барановская Е.И. и соавт., 2004). О роли мужского фактора в аномальном течении беременности при генитальном герпесе опубликованы единичные работы. Морфология сперматозоидов была подробно описана в классических работах 70-х годов прошлого столетия (Fawcett D. et al., 1971; Fawcett D., 1975). Однако в последние годы появляются публикации, содержащие сведения о новых деталях структуры мужских половых клеток, не описанных ранее. Брагина Е.Е. (2001) обнаружила в цитоплазматической капле сперматозоидов структуры, идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса и предположила, что такие сперматозоиды могут содержать вирусную ДНК. Было высказано предположение о роли подобных атипичных сперматозоидов в развитии аномальной беременности человека. Однако до настоящего времени отсутствовали доказательства вирусной природы обнаруженных включений. Не была выяснена роль сперматозоидов, содержащих инородные включения, в развитии патологических процессов репродуктивной системы мужчин и женщин.

Цель работы: выявить ультраструктурные, иммунохимические и молекулярно-биологические изменения сперматозоидов при идиопатическом нарушении фертильности, а также доказать наличие внутриклеточного герпетического инфицирования мужских гамет при некоторых формах нарушения репродуктивного здоровья.

Задачи:

провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов у пациентов при различных видах патоспермии (астенозооспермия, тератозооспермия, глобулозооспермия);

провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с идиопатическим бесплодием, результаты традиционного спермиологического обследования которых соответствуют нормативным показателям;

установить природу инородных вирусоподобных включений в сперматозоидах морфологическими, вирусологическими и молекулярно-биологическими методами;

исследовать цитологические закономерности спермограммы пациентов, в эякуляте которых содержатся инфицированные вирусом сперматозоиды;

выявить сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса, в подвижной фракции эякулята;

провести количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов из эякулята пациентов, у которых обнаруживали внутригаметное герпетическое инфицирование;

определить частоту анеуплоидий хромосом 1, X и Y в половых клетках эякулята пациентов, у которых обнаруживали сперматозоиды, инфицированные вирусом простого герпеса;

изучить особенности сперматогенеза с помощью метода количественного анализа незрелых половых клеток эякулята у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами.

Научная новизна

Описан новый тип синдромной патоспермии, при котором выявлена следующая совокупность симптомов: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии, тотальное нарушение ультраструктуры центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью ИКСИ (ICSI, интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов – intracytoplasmic sperm injection) эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.

Методом количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов у пациентов с астенозооспермией выявлены множественные аномалии микротрубочек аксонемы, не носящие синдромного характера.

Методом количественного электронно-микроскопического анализа в эякуляте пациента с идиопатическим бесплодием выявлены множественные аномалии постакросомальной зоны головки сперматозоидов.

Впервые инородные вирусоподобные включения, содержащиеся в сперматозоидах и идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены в кариоплазме ядер сперматозоидов, в перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки. Установлено, что в подвижных сперматозоидах могут выявляться белки всех стадий жизненного цикла вируса простого герпеса (сверхранние, ранние и поздние белки), либо белки одной или двух стадий жизненного цикла.

Впервые методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии. Методом гибридизации in situ установлено, что вирусная ДНК может присутствовать в сперматозоидах как при выявлении белков всех стадий жизненного цикла вируса (, и ), так и при выявлении белков одной или двух стадий, то есть при абортивной форме инфекции. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии позволяет сделать заключение о возможности оплодотворения инфицированными сперматозоидами.

Методом количественного анализа незрелых половых клеток эякулята выявлен выраженный цитопатический эффект, обусловленный присутствием сперматозоидов, содержащих вирус простого герпеса. Изменение количественного состава незрелых половых клеток свидетельствует о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.

Впервые показано, что сперматозоиды с включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены у 68% пациентов, у жен которых в анамнезе отмечено невынашивание беременности. В группе пациентов, у которых вирус простого герпеса выявлен вирусологическими методами, но в анамнезе жен не имелось прерывания беременности, сперматозоиды с вирусными капсидами не обнаружены.

Практическая значимость работы

В эякуляте пациентов с идиопатическим бесплодием с помощью метода количественного электронно-микроскопического исследования половых клеток обнаружены нарушения структуры сперматозоидов, не выявляемые с помощью традиционного спермиологического обследования (повышенное содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином, аномалии акросомы и постакросомальной зоны).

Показано, что причиной идиопатического бесплодия и неудач применения метода репродуктивной технологии могут быть аномалии строения центриоли сперматозоидов.

Установлена герпетическая природа инородных вирусоподобных включений в сперматозоидах человека. Показано, что подвижные сперматозоиды нормальной морфологии могут содержать ДНК вируса простого герпеса, что создает риск вертикальной передачи вируса.

Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов, в эякуляте которых выявлены сперматозоиды, содержащие вирус простого герпеса, свидетельствует о том, что селекция поврежденных при инфицировании клеток происходит на стадии сперматогенеза. Показатели традиционного спермиологического обследования не позволяют сделать заключение о наличии внутригаметного герпетического инфицирования.

Показана взаимосвязь наличия у пациентов сперматозоидов с инородными вирусоподобными включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, и анамнеза жен этих пациентов, у которых регистрировались беременности, не закончившиеся родами.

Полученные данные дают основание рекомендовать проведение количественного электронно-микроскопического исследования и вирусологического исследования половых клеток мужчин при патоспермии, при идиопатическом бесплодии, при использовании репродуктивных технологий и при аномалиях беременности в анамнезе у жен пациентов.

Положения, выносимые на защиту

1. Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может применяться для выявления ультраструктурных нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с патоспермией и для оценки функционального состояния сперматозоидов у пациентов с идиопатическим бесплодием и у пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности. Применение электронно-микроскопического исследования позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, идентифицировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии у пациентов с патоспермией и при идиопатическом нарушении фертильности.

2. У пациентов с идиопатическим бесплодием с помощью количественного электронно-микроскопического анализа выявлено повышенное содержание сперматозоидов с недостаточно конденсированным «незрелым» хроматином и аномалии акросомы и постакросомальной зоны.

3. Выявлен новый тип синдромной патоспермии, при котором имеется следующая совокупность симптомов: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии, тотальное нарушение ультраструктуры центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка на 2-3 сутки развития эмбрионов, полученных с помощью интрацитоплазматиченской инъекции сперматозоидов.

4. Вирусоподобные инородные включения, содержащиеся в сперматозоидах и идентифицированные как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены в кариоплазме ядер сперматозоидов, в перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки.

5. В подвижных сперматозоидах нормальной морфологии выявлена ДНК вируса простого герпеса. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах с нормальной морфологией позволяет сделать заключение о возможности оплодотворения инфицированными сперматозоидами.

6. Изменение количественного состава незрелых половых клеток, отсутствие анеуплоидии и отсутствие выраженных изменений в параметрах традиционного спермиологического обследования и в параметрах количественного электронно-микроскопического анализа сперматозоидов позволяет сделать заключение о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидов с нормальной морфологией.

Внедрение

Результаты исследования сперматозоидов человека при патоспермии и идиопатическом нарушении фертильности; исследование сперматозоидов человека при наличии включений, идентифицированных как капсиды вируса простого герпеса, а также результаты их влияния на фертильность используются в работе лаборатории генетики нарушения репродукции ГУ Медико-генетического научного центра РАМН, а также при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы

Основные результаты исследования были представлены на: 4-ой Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (г. Москва, 2002 г.), втором конгрессе «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (г. Москва, 2003 г.), Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – ХХI век» (г. Саратов, 2004 г.), I-ой Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (г. Москва 2004 г.), 3-ем, 4-ом и 5-ом Российских научных форумах «Мужское здоровье и долголетие» (г. Москва, 2005, 2006, 2007 г.г.), международной конференции по андрологии (г. Дагомыс, 2006 г.), 1-ом региональном научном форуме «Мать и дитя» (г. Казань, 2007 г.), 4-ой конференции с международным участием «Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.), XVII ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (г. Казань, 2007 г.), I международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (г. Москва, 2008 г). Результаты работы были доложены и обсуждены на совместном заседании отдела молекулярной биологии и апробационного совета ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского (май, 2008 г.), межлабораторной конференции ГУ НИИ морфологии человека РАМН (сентябрь, 2008 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликованы 32 работы, из них 8 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ, 2 методические рекомендации.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 215 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 80 рисунками, содержит 17 таблиц. Список литературы включает 518 источников (46 отечественных и 472 зарубежных).

Материал и методы исследования

Исследовали материал от 308 пациентов, обратившихся в клинико-лабораторный центр «Пастер», медико-генетический центр РАМН, Центр планирования семьи и репродукции (г. Рязань). Всем пациентам проводили спермиологическое обследование. В дальнейшем были исключены из исследования 27 пациентов, у которых наблюдали выраженную олигоспермию (количество сперматозоидов в менее 5х106 в образце).

Причины обращения в медицинские учреждения пациенты называли следующие: профилактическое обследование – 103 человека, после перенесенных воспалительных заболеваний урогенитального тракта - 96 человек, по поводу нарушения фертильности (первичное бесплодие) – 46, а также невынашивания беременности, неудач экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов или неудач интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов – 36. Возраст пациентов был от 16 до 48 лет. На момент исследования ни у одного из пациентов не наблюдали клинических проявлений генитального герпеса.

Спермиологическое обследование проводили согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992, 2000). Количественный ультраструктурный анализ проводили по следующим параметрам: 1) состояние хроматина, 2) состояние акросомы, 3) наличие цитоплазматической капли на головке, 4) строение митохондрий, 5) строение аксонемы, 6) состояние фибриллярного слоя. Для трансмиссионной электронной микроскопии материал фиксировали раствором глютарового альдегида на какодилатном буфере. Заливку производили в смесь эпон-аралдит. Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме UltraCutIII, окрашивали уранилацетатом и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе HU11В.

Для ряда исследований (реакции иммунофлюоресценции, быстрого культурального метода, реакции гибридизации in situ) материал разделяли на фракции: цельный эякулят, семенную плазму, общую клеточную фракцию и фракцию подвижных сперматозоидов.

Клетки эякулята пациентов исследовали методом флуоресцентной гибридизации in situ с ДНК-зондами к хромосомам 1, X и Y. по протоколу для трехцветовой флуоресцентной гибридизации (Soloviev I. et al., 1995; 1997; Yurov Y. et al., 1996a, b; 2002) на базе лаборатории цитогенетики (руководитель – профессор Ю.Б. Юров) ГУ Научного центра психического здоровья РАМН.

Количественный анализ состава незрелых половых клеток (Курило Л.Ф., Кулешов Н.П., 1988; Курило Л.Ф., Любашевская И.А., 1990; Курило Л.Ф. и др., 1995; 1997; 2007) проводили в лаборатории генетики нарушения репродукции (руководитель – профессор Л.Ф. Курило) ГУ Медико-генетического научного центра РАМН совместно с ведущим научным сотрудником, к.б.н. Л.В. Шилейко. Для каждого образца эякулята подсчитывали не менее 200-300 незрелых половых клеток.

Выявление антигенов вируса простого герпеса проводили с помощью реакции непрямой иммунофлюоресценции. В качестве специфического иммунного реагента использовали моноклональные антитела к индивидуальным белкам вируса простого герпеса, экспрессируемыми на разных стадиях жизненного цикла вируса, полученные и охарактеризованные в лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии РАМН (руководитель – профессор А.А. Кущ). В качестве вторых антител использовали кроличьи антитела к иммуноглобулинам мыши, меченые ФИТЦ (производство НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН).

Выявление инфекционной активности вирусов в образцах проводили в лаборатории клеточной инженерии ГУ НИИ вирусологии РАМН (руководитель – профессор А.А. Кущ) совместно со старшим научным сотрудником, к.б.н Р.Р. Климовой. Инфекционную активность вирусов в образцах эякулята определяли с помощью быстрого культурального метода. При проведении быстрого культурального метода исследуемый материал сокультивировали с клетками VERO в среде Игла-MEM (ПанЭко, Москва) с 10% эмбриональной телячьей сывороткой. Окраску моноклональными антителами осуществляли как описано выше.

После выделения ДНК из образцов проводили полимеразную цепную реакцию с «горячим» стартом с помощью тест-системы «АмплиСенс-200 HSV-430» (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ, кат. № V-8-200). Эта тест-система позволяет детектировать присутствие ДНК вируса простого герпеса I и II типов по амплификации 430-нуклеотидного фрагмента специфического для него гена gB, кодирующего один из белков оболочки вируса. В качестве положительного контроля использовали продукты амплификации положительного контрольного образца ДНК из тест-системы, а также препарата ДНК, выделенного из суспензии вируса герпеса. В качестве контролей использовали также препараты ДНК, выделенные из культуры клеток, зараженной вирусом герпеса и аналогичной незараженной культуры.

Для выявления ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридидизации in situ использовали зонды и систему детекции производства Enzo Life Sciences, Inc., США. Положительным контролем служили перевиваемые клетки почки зеленой мартышки линии VERO, инфицированные вирусом простого герпеса 1 типа (референс штаммом F) с инфекционной множественностью 0,001 БОЕ/кл. Денатурацию и гибридизацию проводили в гибридайзере «DAKO» (Дания). Визуализацию метки проводили с помощью микроскопа «Leica DMRB»; изображение подвергали компьютерной регистрации и обработке с использованием системы анализа изображения «LeicaQWIN 550 IW» и видеокамеры высокого разрешения «ProgRes 3012». Исследование проведено на базе отделения патологической анатомии (руководитель – профессор, член-корр. РАМН Г.А. Франк, консультант - ведущий научный сотрудник, д.б.н. Л.Э. Завалишина) Московского научно-исследовательского онкологического институт им. П.А. Герцена Минздравсоцразвития РФ.

Для статистической обработки полученных результатов использовали пакет компьютерных программ «STATISTICA 6». Гипотезы о нормальном распределении исследуемых признаков проверяли с помощью критерия Шапиро-Уилка. Статистическую значимость межгрупповых различий по количественным признакам оценивали по непараметрическому критерию Манна-Уитни и по t-критерию для независимых выборок с неравными дисперсиями. Анализ различия частот встречаемости исследуемых признаков в группах пациентов проводили с помощью точного критерия Фишера (двусторонний тест). Статистические гипотезы проверяли при уровне значимости p=0,05. Различия считали статистически значимыми при p<0,05.

Степень личного участия автора: спермиологические и ультраструктурные исследования, исследования с помощью реакции иммунофлюоресценции и гибридизации in situ, а также статистическая обработка материала проведены лично автором.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с нарушением фертильности

1.1. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с «синдромной» спермопатологией

В настоящее время описано 5 типов синдромной патологии: первичная цилиарная дискенезия, синдром ацефалических сперматозоидов (аномалия соединительного участка жгутика), дисплазия фибриллярного слоя, глобулоспермия, аномалия митохондрий. При синдромной патоспермии сперматозоиды с какой-либо характерной атипией строения составляют большую (либо тотальную) часть клеток эякулята конкретного пациента, нарушения структуры сперматозоидов носят семейный характер и имеют доказанное (или предположительное) генетическое происхождение. Эта группа немногочисленна, по разным данным – от 0,1% до 2% среди пациентов с нарушением фертильности (Сhemes H., 2000; Dam A., 2007).

При глобулозооспермии наблюдается агенез акросомы, незрелый хроматин и нарушение укладки митохондрий. C 1971 по 2007 были опубликованы данные всего о 99 случаях глобулоспермии (Dam A., 2007). При выполнении данной работы наблюдали одного пациента с подобной патологией.

Дисплазию фибриллярного слоя обнаруживают у 2% инфертильных пациентов. В настоящем исследовании наблюдали одного пациента с дисплазией фибриллярного слоя, у которого в сперматозоидах при отсутствии центральной пары микротрубочек и соответствующих структур (центрального цилиндра и радиальных спиц) не было нарушено строение периферических дуплетов микротрубочек, динеиновых ручек и нексиновых мостиков. Периаксонемный слой состоял из фибрилл диаметром 50 нм, что соответствует толщине фибрилл поперечных колец фибриллярного слоя. На продольных и поперечных срезах не наблюдалось продольных колонн фибриллярного слоя, т.е. выявлялось нарушение взаимного расположения фибрилл, но не изменение структуры самих фибрилл.

Помимо этого в настоящей работе при проведении дифференциальной диагностики генетически обусловленной и функциональной форм патоспермии с помощью количественного электронно-микроскопического исследования были выявлены пациенты с новой формой синдромной патоспермии – нарушением строения центриоли соединительного отдела жгутика. Эта форма патоспермии была выявлена в сперматозоидах 3 пациентов с диагнозом «идиопатическое бесплодие». По результатам светооптического спермиологического исследования этих пациентов было дано заключение «нормозооспермия». Материал был исследован после неудачных попыток ИКСИ, развитие всех полученных эмбрионов прекращалось на 2-3 сутки после инъекции сперматозоидов в яйцеклетку. У жен пациентов патологии репродуктивной системы не выявлено.

Во всех образцах обнаружены сперматозоиды с атипичным строением центриолей соединительного отдела жгутика – нарушение соединения микротрубочек триплетов центриолей. Атипия строения центриоли имела тотальный характер у каждого из обследованных пациентов. Кроме того, найденные аномалии были схожи у всех пациентов. На основании этого можно предположить, что данное нарушение носит «синдромный» характер и имеет генетическую природу.

1.2. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов пациентов с идиопатическим нарушением фертильности.

Исследовали сперматозоиды 26 пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом – в 18 случаях после естественного зачатия, в 8 случаях – после внутриматочной инсеминации (1-ая группа). В качестве групп сравнения исследовали сперматозоиды 27 инфертильных пациентов (2-ая группа) и 10 пациентов, обратившихся для профилактического обследования (3-я группа). В исследуемые группы были включены пациенты, у которых при спермиологическом обследовании, проводимом согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992; 2000), выявляли нормозооспермию или слабые отклонения от нормативных показателей. Для выбора пациентов с результатами спермиологического обследования, незначительно отличающимися от нормативных, был введен показатель, характеризующий общее количество подвижных сперматозоидов нормальной морфологии – индекс нормальных подвижных сперматозоидов. Индекс вычисляли как произведение объема эякулята (V), концентрации сперматозоидов (C), процентное содержание сперматозоиды с прогрессивной подвижностью (P) и сперматозоидов с типичной морфологией (M). Согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992, 2000), нормативные показатели имеют следующие значения: V=2 мл, С=20 млн/мл, Р=50%, М=30%. В этом случае индекс НПС=2х20х50х30=6х104. В исследуемую группу были включены пациенты, у которых при спермиологическом обследовании индекс нормальных подвижных сперматозоидов6х104.

Были получены следующие результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов с гранулярным хроматином: в 1-ой группе пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом – медиана 46% (минимум=10%, интерквартильный размах от 23 до 58%, максимум=85%); во 2-ой группе инфертильных пациентов – медиана 23% (минимум=6%, интерквартильный размах от 13 до 56%, максимум=88%), в 3-ей группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования – медиана 18% (минимум=7%, интерквартильный размах от 15 до 30%, максимум=30%).

Содержание головок с гранулярным хроматином в 1-ой группе было статистически значимо более высоким, чем в группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования (p=0,002). Во 2-ой группе отличие по содержанию головок сперматозоидов с гранулярным хроматином по сравнению с 3-ей группой не было значимым (уровень значимости p=0,216). Различие по содержанию головок с незрелым хроматином у пациентов 1-ой и 2-ой групп также не было значимым (p=0,116).

Проводили анализ различий частоты встречаемости повышенного содержания головок с гранулярным хроматином в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов (рис. 1).

В 1-ой группе повышенное содержание головок сперматозоидов с гранулярным хроматином наблюдали у 15 (58%) из 26 обследованных, во 2-ой группе – у 10 (37%) из 27. В 3-ей группе не выявили пациентов с такой патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака выявили различие между первой и второй группами с уровнем значимости p=0,031, между первой и третьей группами – различие с уровнем значимости p=0,002. Между второй и третьей группами пациентов различия не были статистически значимыми (p=0,132).

У фертильных мужчин при ультраструктурном исследовании выявляют не менее 40% головок сперматозоидов, имеющих акросомы, типичного строения. Проводили анализ содержания сперматозоидов с головками, имеющими акросомы типичного строения в образцах эякулята пациентов, у жен которых беременность закончилась спонтанным абортом (1-ая группа), инфертильных пациентов (2-ая группа) и лиц, проходивших профилактическое обследование (3-я группа).

 Количество в обследуемых группах пациентов с повышенным содержанием-0

Рис. 1. Количество в обследуемых группах пациентов с повышенным содержанием головок сперматозоидов, содержащих гранулярный «незрелый» хроматин. НХ – доля пациентов с повышенным содержанием головок сперматозоидов, содержащих гранулярный «незрелый» хроматин; ЗХ – доля пациентов, у которых содержание головок сперматозоидов, содержащих гранулярный хроматин, не превышает 30%.

Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов, имеющими типичное строение акросомы, образцах от пациентов были следующими: в 1-ой группе – медиана 65% (минимум=10%, интерквартильный размах от 45 до 78%, максимум=92%); во 2-ой группе – медиана 52% (минимум=16%, интерквартильный размах от 35 до 70%, максимум=88%); в 3-ей группе – медиана 73% (минимум=50%, интерквартильный размах от 56 до 80%, максимум=84%).

Содержание головок сперматозоидов, имеющих типичное строение акросомы, не отличалось статистически значимо у пациентов 1-ой и 3-ей групп (p=0,374). В эякуляте пациентов 2-ой группы содержание головок с типичным строением акросомы было статистически значимо ниже, чем в 3-ей группе (p=0,031). Различие по содержанию головок сперматозоидов с типичным строением акросомы в эякуляте пациентов 1-ой и 2-ой групп не было значимым (p=0,134).

Проводили анализ различий частоты сниженного содержания головок с типичным строением акросомы в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов (рис. 2).

 Количество в обследуемых группах пациентов со сниженным содержанием-1

Рис. 2. Количество в обследуемых группах пациентов со сниженным содержанием головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения. АА – доля пациентов, в образцах от которых содержание головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, составляет менее 40%; ТА – доля пациентов, у которых содержание головок сперматозоидов имеющих акросому типичного строения, составляет не менее 40%.

В 1-ой группе пациентов у 5 (19%) из 26 обследованных наблюдали сниженное содержание головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, во 2-ой группе – у 8 (29%) из 27. В 3-ей группе не выявили пациентов с подобной патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака статистически значимого различия между первой и третьей группами, а также между первой и второй группами не было выявлено (p=0,294 и p=0,526, соответственно). Между 2-ой и 3-ей группами различия не были статистически значимыми (p=0,079).

Процесс оплодотворения включает в себя взаимодействие сперматозоида и яйцеклетки, слияние клеточных мембран и геномов женской и мужской гамет (Primakoff P., Myles D., 2007). Успешное завершение развития эмбриона, по крайне мере, частично, зависит от целостности и полноценности ДНК сперматозоида (Ahmadi A., Ng S., 1999). Имеется порог повреждений ДНК (к которым относятся фрагментация ДНК, нарушение компактной упаковки ДНК, дефицит протаминов), при котором развитие эмбрионов ухудшается (Ahmadi A., Ng S.C., 1999). Компактизация хроматина происходит во время спермиогенеза, при переходе округлых сперматид в удлиненные, когда имеет место замена основных белков – гистонов, на другие основные белки – протамины (Brewer L. et al., 2002; Dadoune J., 2003). Этот процесс визуализируется как появление и прогрессивное возрастание гранулярного характера хроматина, который достигает плотной, компактной консистенции, в которой индивидуальные гранулы не различаются (Holstein A., Roosen-Runge E., 1981). При нарушениях компактизации хроматина в ядрах головок сперматозоидов выявляются гранулярно-фибриллярные или гранулярные структуры (Baccetti B. et al., 1996; Chemes H., 2000; Muratori M. et al., 2000), повышается чувствительность к повреждающим факторам внешней среды (окисление или повышение температуры в женском генитальном тракте) (Kosower N. et al., 1992).

В ряде исследований показано выраженное различие в содержании сперматозоидов с поврежденной ДНК между группами фертильных и инфертильных мужчин (Gandini L. et al., 2000; Host E. et al., 2000b; Spano M. et al., 2000; Zini A. et al., 2001; Saleh R. et al., 2002; Larson-Cook K. et al., 2003). Степень оплодотворения может быть близка к нулевой, если доля сперматозоидов с повреждением ДНК превышает 30% клеток как при естественном зачатии (Evenson D. et al., 1999; Spano M. et al., 2000), так и при внутриматочной инсеминации (Duran E. et al., 2002; Saleh R. et al., 2003; Bungum M. et al., 2004).

Имеются единичные сведения о связи между нарушением упаковки хроматина и повреждением ДНК. Положительная корреляция этих показателей показана в сперматозоидах пациентов с идиопатическим бесплодием при нормальных показателях спермиологического обследования (Piasecka M. et al., 2006).

В настоящей работе показана связь между содержанием сперматозоидов с недостаточной компактизацией хроматина у пациентов с нормативным показателями спермиологического обследования и нарушениями фертильности (спонтанное прерывание беременности у жен пациентов). Имеется также связь между нарушением строения акросомы сперматозоидов и другой формой нарушения фертильности – отсутствием зачатия в течение года у пациентов с нормативными показателями спермиологического обследования. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой разработан ряд функциональных тестов (Aitken R., 2006). Низкий результат пенетрационных тестов соответствует низкой степени оплодотворения яйцеклетки. Показано, что нарушение морфологии акросомы более выражено в группе пациентов, у жен которых не происходит зачатия в срок не менее 1 года. Можно высказать предположение, что метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов сравним по результатам с пенетрационными тестами. Метод электронно-микроскопического исследования, таким образом, может быть использован как альтернативный при оценке пенетрационной функции акросомы сперматозоидов.

2. Ультраструктура сперматозоидов с вирусоподобными инородными включениями

Проводили ультраструктурное исследование сперматозоидов из образцов эякулята 19 пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности и у которых у которых с помощью реакции иммунофлюоресценции выявлены белки вируса простого герпеса и/или обнаружена инфекционная активность вируса простого герпеса с помощью быстрого культурального метода. В сперматозоидах 13 образцов выявили структуры, имеющие вид двухконтурных мембранных пузырьков с диаметром внешнего контура 120-140 нм и диаметром внутреннего контура 90-110 нм. Сердцевина этих структур по электронной плотности не отличалась от пространства между наружной и внутренней мембранами. У части пузырьков прослеживалась гексагональная структура наружного листка. На основании сравнения морфологических данных было сделано заключение о том, что в сперматозоидах выявляются капсиды вирусов группы герпеса.

Возникает вопрос, почему в сперматозоидах наблюдается только одна форма капсидов – двухконтурные структуры с электронно-прозрачной сердцевиной, то есть, почему не происходит инкапсуляция ДНК? Было предположено, что капсиды в цитоплазматической капле сперматозоидов наблюдаются тогда, когда прекращение ядерно-цитоплазматического транспорта совпадает с синтезом и накоплением в цитоплазме поздних структурных белков вируса, формирующих капсид Брагина Е.Е.(2001). Эти белки не могут попасть в ядро, где они должны сформировать капсиды, в которые инкапсулируется ДНК. Если конденсация хроматина совпадает с ранними стадиями жизненного цикла вируса, оформленные герпетические капсиды не выявляются при электронно-микроскопическом изучении, хотя вирусные белки (обнаруживаемые с помощью реакции иммунофлюоресценции) присутствуют.

В настоящей работе показано, что капсиды вируса простого герпеса могут быть обнаружены в ядрах сперматозоидов, наблюдали капсиды в перинуклеарном пространстве ядер и в районе пор ядерной оболочки. Эти данные позволяют считать, что капсиды формируются в ядрах сперматозоидов. Возможно, капсиды в ядрах не выявляются из-за плотности конденсированного хроматина.

3. Идентификация вирусной природы инородных включений в сперматозоидах человека

3.1. Выявление белков вируса простого герпеса с помощью реакции иммунофлюоресценции

Реакцию иммунофлюоресценции проводили с использованием моноклональных антител к сверхранним (МКА 4а – моноклональные антитела к белкам капсида c м.м.32 кД, который появляется в ядре через 45 мин после инфицирования, предположительно ), ранним (МКА 3е5 – появляется в ядре через 1,5 час после инфицирования, предположительно ) и поздним (МКА 2С – поверхностный gB, появляется через 4 час после инфицирования в цитоплазме, предположительно ) белкам вируса простого герпеса. Антигены вируса простого герпеса визуализировались в виде зеленого свечения в головках сперматозоидов.

В этой серии экспериментов исследовали 101 образец эякулята. Из них для спермиологического обследования после лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта различной этиологии (хламидиоз, уреаплазмоз, гонорея) обратились 22 пациента (1-ая группа), 25 пациентов (2-ая группа) проходили спермиологическое обследование по поводу бесплодия, 34 пациента (3-я группа) проходили профилактическое обследование при планировании беременности жены, у 20 пациентов (4-ая группа) в анамнезе жены имелось спонтанное прерывание беременности (табл. 1).

Таблица 1

Выявление белков вируса простого герпеса с помощью

реакции иммунофлюоресценции

группы Причина обращения Количество пациентов Выявлены 3 белка абс.(%) Выявлены 1 или 2 белка абс.(%) Не выявлены белки абс.(%)
1 После лечения воспалительных заболеваний урогенитального тракта 22 9 (41) 6 (27) 7(32)
2 Бесплодие 25 10 (40) 7 (28) 8 (32)
3 Профилактическое обследование 34 9 (26) 12 (35) 13 (39)
4 Спонтанное прерывание беременности у жены 20 10 (50) 5 (25) 5 (25)
Всего: 101 38 30 33

В 1-ой группе пациентов все три вирусных белка выявлена у 9 человек (41%), во 2-ой группе – у 10 человек (40%), в 3-ей группе – у 9 человек (26%), в 4-ой группе – у 10 человек (50%) (рис. 3). Один или два белка в различных сочетаниях выявлены в 1-ой группе у 6 человек (27%), во 2-ой группе у 7 человек (28%), в 3-ей группе у 12 человек (35%), в 4-ой группе – у 4 человек (25%). Вирусные белки не выявлены в 1-ой группе у 7 пациентов (32%), во 2-ой группе – у 8 пациентов (32%), в 3-ей группе – у 13 человек (38%), в 4-ой группе – у 4 человек (25%).

Таким образом, в сперматозоидах могут быть обнаружены как белки всех стадий жизненного цикла вируса простого герпеса (сверхранние, ранние и поздние), так и белки одной или двух стадий жизненного цикла в различных сочетаниях (абортивная форма инфекции).

3.2. Выявление инфекционной активности вируса простого герпеса в эякуляте пациентов

Выявление инфекционной активности вируса простого герпеса проводили с помощью быстрого культурального метода в цельном эякуляте, семенной плазме и общей клеточной фракции эякулята 101 пациента, у которых проводили выявление сверхранних, ранних и поздних белков вируса простого герпеса.

Все три белка выявлены у 38 пациентов. Положительные результаты быстрого культурального метода в этой группе обнаружены у 31 человека (82%). Общая клеточная фракция исследована с помощью быстрого культурального метода у 29 человек, инфекционная активность выявлена у 18 (62%).

Неполная экспрессия вирусных белков выявлена у 30 человек. Только сверхранние белки обнаружены у 7 пациентов (23%), сверхранние и ранние – у 9 (30%), сверхранние и поздние – у 2 (7%). Поздние белки выявлены у 8 человек (27%), ранние и поздние – у 4 (13%). Всего сверхранние белки выявлены у 18 человек (60%), ранние – у 13 (43%), поздние – у 12 (40%). При неполном наборе вирусных белков положительные результаты быстрого культурального метода наблюдали у 15 пациентов (50%), при анализе общей клеточной фракции выявлена инфекционная активность вируса у 5 человек (17 %).

Вирусные белки не обнаружены у 33 пациентов. Положительные результаты быстрого культурального метода наблюдали у 5 пациентов (15%), инфекционная активность вирусов выявлена в общей клеточной фракции у 3 пациентов (9%) (рис. 4).

 Выявление белков вируса простого герпеса в сперматозоидах с помощью-2

Рис. 3. Выявление белков вируса простого герпеса в сперматозоидах с помощью реакции иммунофлюоресценции (в процентах).

1-ая группа – пациенты с воспалительными заболеваниями урогенитального тракта в анамнезе; 2-ая группа – пациенты с нарушениями фертильности; 3-я группа – пациенты, проходившие профилактическое обследование; 4-ая группа – пациенты, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности.

1 – выявление, и белков вируса простого герпеса; 2 – выявление одного или двух белков; 3 – не выявлены вирусные белки

 Определение инфекционной активности вируса простого герпеса в-3

Рис. 4. Определение инфекционной активности вируса простого герпеса в эякуляте пациентов с выявленными, и вирусными белками в сперматозоидах (1-ая группа), пациентов, у которых выявлены один или два белка (2-ая группа), пациентов с отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции (3-я группа)(%).

1 – общие положительные результаты быстрого культурального метода, 2 – положительные результаты быстрого культурального метода в общей клеточной фракции.

Таким образом, инфекционная активность вируса простого герпеса определялась статистически значимо чаще в тех образцах эякулята, в которых выявляли белки всех стадий жизненного цикла вируса (, и белки), чем в образцах с наличием одного или двух белков (p=0, 009).

3.3. Выявление белков вируса простого герпеса и инфекционной активности вируса в подвижной фракции сперматозоидов

Фракцию подвижных сперматозоидов исследовали в 39 образцах. Распределение по группам было следующим: основное количество образцов эякулята было от пациентов, у жен которых в анамнезе спонтанное прерывание беременности (20 образцов), 10 образцов от пациентов с нарушением фертильности, 4 – от пациентов с воспалительными заболеваниями в анамнезе и 5 – от лиц, проходивших профилактическое обследование. Во всех 15 образцах эякулята с отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции в общей клеточной фракции белки вируса простого герпеса не обнаружены и во фракции подвижных сперматозоидов.

Положительные результаты реакции иммунофлюоресценции при исследовании фракции подвижных сперматозоидов получили в 19 образцах: белки трех стадий жизненного цикла вируса обнаружили в 8 образцах (21%), белки одной или 2 стадий – в 11 образцах (28%). Инфекционная активность вируса простого герпеса выявлена в 4 исследованных образцах фракции подвижных сперматозоидов.

Таким образом, показано, что во фракции подвижных сперматозоидов могут быть обнаружены либо белки всех фаз жизненного цикла вируса простого герпеса, либо 1 или 2 белка в различных сочетаниях. Инфекционная активность вируса во фракции подвижных сперматозоидов определяется в 3,5 реже, чем белки вируса.

3.4. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридизации in situ

С помощью метода гибридизации in situ с зондами к ДНК вируса простого герпеса было изучено 37 препаратов от 29 пациентов. У 8 пациентов исследовали общую клеточную фракцию и фракцию подвижных сперматозоидов – результаты, полученные методом гибридизации in situ, совпадали (в образцах от 6 пациентов метка была выявлена, а у 2 – не визуализировалась). У 17 пациентов исследовали только общую клеточную фракцию, у 4 – только подвижные сперматозоиды. Контролем служили клетки неинфицированные VERO и инфицированные референс штаммом F1 вируса простого герпеса в концентрации 0,001БОЕ/клетку. При исследовании сперматозоидов выявляли метку в виде локальных темно-коричневых гранул в головках сперматозоидов. Гранулы имели различный размер и были обнаружены как в сперматозоидах с аморфной формой головок, так и в сперматозоидах нормальной морфологии.

Методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса была обнаружена в 21 образце (13 образцов общей клеточной фракции и 8 образцов подвижных сперматозоидов) от 15 пациентов (табл. 2).

Метка была обнаружена в 7 образцах общей клеточной фракции сперматозоидов, в которых выявляли белки всех стадий жизненного цикла вируса (, и белки) и выявлена инфекционная активность вируса, и в 1 образце с положительными результатами быстрого культурального метода и отрицательными результатами реакции иммунофлюоресценции.

В 3 образцах общей клеточной фракции положительные результаты гибридизации in situ совпадали с положительными результатами реакции иммунофлюоресценции (выявление, и белков), но инфекционной активности вируса простого герпеса не обнаружена ни в одной из фракций образца. В 3 образцах положительные результаты гибридизации in situ получены при выявлении, и белков вируса при отрицательных результатах быстрого культурального метода в исследуемой фракции (инфекционную активность вируса выявляли в цельном эякуляте или спермоплазме).

Таблица 2

Выявление ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ

Исследуемые фракции ГИС (+) ГИС (–)
БКМ (+) в исследуемой фракции БКМ (–) во всех фракциях БКМ (–) в исследуемой фракции БКМ (–)
РИФ (+)* РИФ (+/–)** РИФ (–) РИФ (+) РИФ (+/–) РИФ (+) РИФ (+/–)* РИФ (–)
Общая клеточная фракция 7 1 3 3 7 5
Фракция подвижных сперматозоидов 2 2 1 2 4

Примечания:

РИФ – реакция иммунофлюоресценции,

ГИС – гибридизация in situ.

* приводятся данные по результатам реакции иммунофлюоресценции в исследуемой фракции.

* * с помощью реакции иммунофлюоресценции обнаружены один или два белка в различных сочетаниях.

Исследование фракции подвижных сперматозоидов позволило выявить метку в 4 образцах с полным набором вирусных белков. В 2 образцах инфекционная активность вируса простого герпеса выявлена в исследуемой фракции, в 2 – в цельном эякуляте и спермоплазме, но не выявлена в исследуемой фракции. При неполном наборе вирусных белков во фракции подвижных сперматозоидов положительные результаты гибридизации in situ выявлены в 3 образцах. В 2 из них выявлена инфекционная активность вируса простого герпеса, в 1 инфекционная активность вируса не обнаружена ни в одной из фракций. В 16 (12 образцов общей клеточной фракции и 4 образца фракции подвижных сперматозоидов) препаратах от 14 пациентов ДНК вируса не визуализировалась.

Результаты гибридизации in situ были отрицательными при анализе 7 образцов общей клеточной фракции и 4 образцов фракции подвижных сперматозоидов, в которых были выявлены один или два белка вируса простого герпеса. Ни в одном случае не была показана инфекционная активность вируса в исследуемой фракции сперматозоидов. Не отмечено также ни одного случая визуализации метки у 5 пациентов, результаты обследования которых с помощью реакции иммунофлюоресценции и быстрого культурального метода во всех фракциях были отрицательными.

Таким образом, при исследовании сперматозоидов методом гибридизации in situ показано наличие ДНК вируса простого герпеса в головках сперматозоидов у пациентов как с положительными, так и отрицательными результатами выявления инфекционной активности с помощью быстрого культурального метода. Выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса в головах сперматозоидов нормальной морфологии. Выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса во фракции подвижных сперматозоидов. Не выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса ни в одном из образцов, в которых не обнаружено ни белков вируса, ни инфекционной активности.

4. Особенности сперматогенеза у пациентов, в эякуляте которых выявлено герпетическое инфицирование

4.1. Спермиологическое обследование пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов

Исследование проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 1992, 2000). В настоящей работе не найдено статистически значимых различий по показателям спермиологического исследования между группой пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, выявленным с помощью реакции иммунофлюоресценции и/или быстрого культурального метода, и группой пациентов, в сперматозоидах которых герпетическое инфицирование не определено.

Kotronias D., Kapranos N. (1998) продемонстрировали наличие ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах методом гибридизации in situ. В своей работе авторы подчеркивают связь между наличием ДНК вируса в сперматозоидах и выраженной олигоспермией у пациентов с проблемами фертильности. Позднее теми же авторами (Kapranos N. et al., 2003) в цельном эякуляте пациентов с проблемами фертильности методом гнездовой ПЦР проводилась детекция ДНК вирусов группы герпеса. ДНК вируса простого герпеса обнаружена в 56 образцах эякулята из 113 (50%), вирус Эпштейна-Барр – в 19 (17%), цитомегаловирус – в 8 (7%). Выявление вируса простого герпеса коррелировало с малым объемом эякулята и низкой подвижностью сперматозоидов, в отличие от цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр. Этим же методом El Borai N. и соавт. (1997) исследовали цельный эякулят 154 инфертильных и 24 фертильных мужчин. В группе инфертильных пациентов ДНК вируса простого герпеса обнаружена в 37 (24%) образцах, в контроле вирусы герпеса не обнаружены. Причиной расхождения результатов, полученных в процитированных работах, и результатов данного исследовании, является принцип отбора групп пациентов – из настоящего исследования были исключены пациенты с олигозооспермией.

4.2. Детекция X, Y и 1 хромосом методом FISH в сперматозоидах пациентов с выявленным герпетическим инфицированием

Изучен материал от 17 пациентов, в сперматозоидах которых выявлены белки вируса простого герпеса и/или инфекционная активность вируса. Исследование проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для хромосом 1, X и Y. Выбор ДНК-зондов определялся тем, что при мейотическом делении у человека чаще всего наблюдается нерасхождение хромосом X и Y (Martin R., 2003), в тоже время имеются сообщения о том, при герпетическом инфицировании клеток повреждения затрагивают хромосому 1 (Peat D., Stanley M., 1986).

Показано, что частота полиплоидии по хромосомам 1, Х и Y у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами составляет 0,2±0,1%, анеуплоидии по хромосомам 1, Х и Y – 0,09±0,06, 0,06±0,04, 0,05±0,03% соответственно, частота анеуплоидии ХY – 0,1±0,11%. Определяли также долю общего количества численных хромосомных аномалий в каждом образце. В целом у пациентов с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов в данной группе частоту всех изученных дисомий выявили в 0,48±0,09% ядер клеток.

По данным Chevret E. и соавт. (1994), полученным с помощью двухцветового метода FISH, частота X- и Y-несущих сперматозоидов составляет 49,3% и 49,22% соответственно (соотношение – 1:1), частота XY несущих сперматозоидов достигает 0,42. Используя метод FISH, Van Hummelen P. et al. (1996) продемонстрировали, что нерасхождение хромосом в сперматозоидах здоровых доноров эякулята достигает 1-2%. Показано, что анеуплоидии аутосом встречаются в зрелых половых клетках в пределах 0,05-0,28% (Pellestor F. et al., 1996). Результаты, полученные в данной работе, согласуются с вышеперечисленными данными. Таким образом, частота выявленных нарушений при герпетическом инфицировании сперматозоидов не выше той, которая была обнаружена у здоровых половозрелых мужчин с нормозооспермией (Chevret E. et al., 1994; Pellestor F. et al., 1996; Van Hummelen P. et al. 1996; Shi Q., Martin R., 2000; Martin R., 2003).

4.3. Исследование количественного состава незрелых половых клеток в эякуляте пациентов, в сперматозоидах которых выявлено герпетическое инфицирование

Изучение состояния сперматогенеза проводилось на суховоздушных препаратах ядер половых клеток из суспензии эякулята после окрашивания красителем по Романовскому-Гимза. Подсчитывали ядра клеток на разных стадиях их развития, определяя долю (в процентах) клеток в каждой стадии от общего числа подсчитанных незрелых половых клеток (Курило Л.Ф. и соавт., 1993; 1995; 1997; Курило Л.Ф., 2007).

Было проведено исследование эякулята 24 пациентов, у которых в сперматозоидах выявлены белки вируса простого герпеса. Контрольная группа состояла из 23 мужчин, проходивших обследование в качестве доноров спермы (Курило Л.Ф. и соавт., 1995).

Результаты количественного анализа состава незрелых половых клеток эякулята пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами представлены на рис. 5.

Было установлено статистически значимое (р<0,001) увеличение содержания общей фракции незрелых половых клеток у 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами по сравнению с их содержанием в эякуляте 23 доноров спермы. Индекс незрелых половых клеток в этих группах составлял у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами – медиана 5,75% (минимум=0,00%, интерквартильный размах от 1,85 до 15,20%, максимум=18%), а у доноров – медиана 2,10% (минимум=0,50%, интерквартильный размах от 1,8 до 2,9%, максимум=3,5%) от общего количества подсчитанных половых клеток соответственно. В обследуемой группе обнаружено статистически значимое (р<0,001) увеличение числа клеток, находившихся на стадиях прелептотены, лептотены и зиготены (медиана 1,65% (минимум=0,80%, интерквартильный размах от 1,45 до 2,25%, максимум=3,80%) по сравнению с таковым у доноров спермы (медиана 0,70% (минимум=0,40%, интерквартильный размах от 0,50 до 0,80%, максимум=0,90%). В то же время доли клеток, находившихся в последующих стадиях сперматогенеза, оказались статистически значимо меньшими, чем у доноров. На стадии пахитены этот показатель у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами был – медиана 0,00% (минимум=0,020%, интерквартильный размах от 0,00 до 0,14%, максимум=0,4%), против аналогичного показателя у доноров – медиана 0,40% (минимум=0,20%, интерквартильный размах от 0,40 до 0,60%, максимум=0,8%) (р<0,001). На стадии диплотены у пациентов обследуемой группы – медиана 0,20% (минимум=0,00%, интерквартильный размах от 0,05 до 0,35%, максимум=1,1%), у доноров – медиана 1,00% (минимум=00,00%, интерквартильный размах от 0,40 до 2,00%, максимум=3,00%); p<0,001. Эти отклонения нашли свое отражение в количественных показателях последующих стадий сперматогенеза: наблюдали отсутствие сперматоцитов в метафазе М I и М II, в отличие от доноров (медиана 0,04% (минимум=0%, интерквартильный размах от 0,03 до 0,05%, максимум=0,08%). Количество сперматоцитов II и сперматид (медиана 87,75% (минимум=78,00%, интерквартильный размах от 82,25 до 90,00%, максимум=100,00%)) у пациентов с вирусинфицированыыми сперматозоидами было также статистически значимо меньшим (p<0,001), чем у фертильных мужчин (медиана 92,00% (минимум=86,00%, интерквартильный размах от 90,00 до 93,00%, максимум=96,00%)). Нарушение сперматогенеза выразилось также в статистически значимом (p<0,001) повышении в эякуляте у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами концентрации неидентифицируемых клеток, которые имеют патологически измененную морфологию и представляют собой дегенерирующие половые клетки (медиана 10,10% (минимум=0%, интерквартильный размах от 7,60 до 14,80%, максимум=19,00%)). У доноров этот показатель составлял медиана 5,00% (минимум=2,00%, интерквартильный размах от 4,00 до 80%, максимум=12,00%).

При подсчете неразошедшихся сперматид показано, что средние значения этого параметра для доноров спермы (медиана 23,30% (минимум=9,00%, интерквартильный размах от 18,00 до 28,00%, максимум=36,00%) и для обследуемых лиц (медиана – 22,25% (минимум=0%, интерквартильный размах от 17,30 до 28,25%, максимум=34,00%)) не различались статистически значимо (p=0,744). У пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами возрастает количество неидентифицированных половых клеток, что свидетельствует об интенсивных дегенеративных процессах среди незрелых половых клеток.

Таким образом, при исследовании незрелых половых клеток выявлен выраженный цитопатический эффект вирусного инфицирования сперматозоидов. Изменение количественного состава незрелых половых клеток свидетельствует о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.

Рис. 5. Сравнение индекса незрелых половых клеток (НПК) и показателей состава НПК по стадиям сперматогенеза в эякуляте пациентов с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов и доноров: а – индекс НПК (доля НПК в общем количестве половых клеток, %); б-ж – доля НПК каждой стадии от общего числа подсчитанных НПК): сперматоциты I на стадиях: б прелептотены-зиготены, в пахитены, г диплотены; д – сперматоциты на стадиях МI, МII, е сперматоциты II и сперматиды; ж неидентифицируемые (дегенерирующие) половые клетки; з – доля неразошедшихся сперматоцитов II и сперматид от общего количества сперматоцитов II и сперматид, %. По оси ординат (рис. б–ж) количество НПК исследуемых стадий, %. (1) пациенты с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов, n=24%, (2) доноры, n=23.

Эти данные согласуются с результатами, полученными при экспериментальном герпетическом орхите (Грибенча С.В. и соавт., 2007). Авторы показали, что при инфицировании семенников экспериментальных животных размножение вируса простого герпеса происходит в клетках сперматогенного эпителия. Вопрос о путях проникновения вируса в семенники нуждается в дальнейшем изучении.

Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, продемонстрированное в данной работе, свидетельствует о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время в настоящей работе показано, что не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидов нормальной морфологии.

5. Количественная оценка ультраструктурных нарушений строения сперматозоидов при герпетическом инфицировании

Количественный анализ проводили у 22 пациентов с нарушением фертильности с отрицательными результатами выявления герпетического инфицирования сперматозоидов (1-ая группа) и у 21 пациента с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов (выявлены белки вируса простого герпеса и/или инфекционная активность вируса). У 8 из них в сперматозоидах не обнаружены вирусные капсиды (2-ая группа), у 13 в сперматозоидах обнаружены внутриклеточные вирусные капсиды (3-я группа).

У пациентов 1-ой группы общее количество сперматозоидов в эякуляте у 21 из 22 были не ниже нормативных показателей, согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992, 2000). Содержание подвижных сперматозоидов не соответствовало нормативным у 1 пациента, но было не ниже 22%. Содержание морфологически нормальных сперматозоидов – не ниже 20%.

Во второй и третьей группах у жен пациентов в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности. Спермиологическое обследование пациентов этих групп показало, что у 20 из 21 пациентов общее содержание сперматозоидов было не ниже нормативных показателей. Содержание подвижных сперматозоидов не соответствовало нормативным у 5 пациентов, но было не ниже 20%. Содержание морфологически нормальных сперматозоидов ниже 20% у 1 пациента. Таким образом, в обследуемых группах пациентов не было лиц с выраженными аномалиями спермиологического обследования.

При ультраструктурном анализе статистически значимые различия выявлены между 1 и 3 группами. Содержание сперматозоидов с нормальным строением акросомы и с нормальным строением митохондрий статистически значимо выше в группе пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов и наличием капсидов в цитоплазматической капле по сравнению с группой пациентов с идиопатическим бесплодием. Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов с гранулярным хроматином в образцах от пациентов оказались следующими: в группе пациентов с идиопатическим нарушением фертильности (1-я группа) – медиана 37% (минимум=9%, интерквартильный размах от 20 до 55%, максимум=75%); с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов, у которых не обнаруживали вирусных капсидов (2-ая группа) – медиана 27% (минимум=15%, интерквартильный размах от 19 до 53%, максимум=68%); у пациентов с выявленным герпетическим инфицированием, у которых обнаружены внутригаметные вирусные капсиды (3-я группа) – медиана 27% (минимум=10%, интерквартильный размах от 20 до 50%, максимум=85%).

Содержание головок с гранулярным хроматином в 1-ой группе не отличалось статистически значимо от этого показателя в группе пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов, у которых в цитоплазме не обнаруживали вирусных капсидов (p=0,629). Во 2-ой группе отличие по содержанию головок сперматозоидов с гранулярным хроматином по сравнению с 3-ей группой не было значимым (p=0,674). Различие по содержанию головок с незрелым хроматином у пациентов 1-ой группы и 3-ей группы также не было статистически значимым (p=0,916).

Проводили анализ различий частоты встречаемости повышенного содержания головок с гранулярным хроматином в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов. В 1-ой группе пациентов повышенное содержание головок сперматозоидов с гранулярным хроматином наблюдали у 13 (59%) из 22 обследованных, во 2-й группе 2 – у 3 (37%) из 8, в 3-ей группе – у 6 (46%) из 13 пациентов. При сравнении групп по частоте изучаемого признака различия между первой и второй, между второй и третьей группами, а также между первой и третьей группами не были статистически значимыми (p=0,295, p=0,690 и p=0,461, соответственно).

У фертильных мужчин при ультраструктурном исследовании наблюдают не менее 40% головок сперматозоидов с акросомами типичного строения. Проводили анализ содержания сперматозоидов с головками, имеющими акросомы типичного строения, в образцах эякулята пациентов с идиопатическим нарушением фертильности (1-ая группа), пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов, у которых в цитоплазме не обнаруживали вирусных капсидов (2-ая группа) и пациентов с выявленным герпетическим инфицированием, у которых обнаружены внутригаметные вирусные капсиды (3-я группа).

Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов, имеющими типичное строение акросомы, в образцах от пациентов были следующими: в 1-ой группе – медиана 48% (минимум=10%, интерквартильный размах от 38 до 65%, максимум=87%); во 2-й группе – медиана 65% (минимум=25%, интерквартильный размах от 34 до 79%, максимум=90%); в 3-й группе – медиана 66% (минимум=30%, интерквартильный размах от 62 до 72%, максимум=92%).

Содержание головок сперматозоидов, имеющих типичное строение акросомы, не отличалась статистически значимо у пациентов 1-ой и 2-ой групп (p=0,320). В эякуляте пациентов 3-й группы содержание головок с типичным строением акросомы было статистически значимо ниже, чем в 1-ой группе (уровень значимости – p=0,032). Различие по содержанию головок сперматозоидов с типичным строением акросомы в эякуляте пациентов 2-ой и 3-ей групп не было значимым (p=0,804).

Проводили анализ различий частоты встречаемости сниженного содержания головок с типичным строением акросомы в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов. В 1-ой группе пациентов у 7 (32%) из 22 обследованных наблюдали снижение содержания головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, во 2-ой группе – у 3 (38%) из 8 пациентов, в 3-ей группе выявили 2 (15%) из 13 пациентов с такой патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака статистически значимого различия между первой и второй группами, между первой и третьей группами, а также между второй и третьей группами не были статистически значимыми (p=0,761, p=0,274 и p=0,244, соответственно).

В группе пациентов с идиопатическим нарушением фертильности отмечено статистически значимое снижение содержания сперматозоидов с нормальным строением митохондрий по сравнению (p=0,013) с группой пациентов с выявленным герпетическим инфицированием, у которых обнаружены внутригаметные вирусные капсиды. При проведении анализа частоты встречаемости сниженного содержания сперматозоидов с нормальным строением митохондрий между этими группами также выявлены статистически значимые различия (p=0,028).

Таким образом, установлено, что при идиопатическом бесплодии нарушена структура акросомы и митохондрий сперматозоидов. Аномалии этих структур, не выявляемые на светооптическом уровне исследования, могут быть причиной нарушения фертильности, то есть отсутствия зачатия.

В группе пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами эти факторы не оказывают влияния на фертильность: зачатие может происходить, однако вирусное инфицирование сперматозоидов оказывает отрицательное воздействие на течение беременности.

6. Изучение сперматогенеза у пациентов, у жен которых в анамнезе было спонтанное прерывание беременности

6.1. Выявление вируса простого герпеса

Проводили обследование 36 пациентов, у жен которых в анамнезе был по крайней мере 1 случай спонтанного прерывания беременности невыясненной этиологии. В дальнейшем эта группа будет именоваться основной группой. В этой группе методом иммунофлюоресценции исследованы сперматозоиды в 31 образце эякулята. Белки вируса простого герпеса обнаружены в 23 (74%), образцах, в 8 образцах вирусные белки не обнаружены.

Определение инфекционной активности вируса простого герпеса с помощью быстрого культурального метода проводили в 29 образцах эякулята, в 20 из них (69%) выявлена инфекционная активность вируса. Фракционирование эякулята проводили в 8 из 20 инфицированных образцов. В 3 образцах из 8 инфекционная активность вируса выявлена в цельном эякуляте, спермоплазме и в общей клеточной фракции, в 5 из 8 образцов инфекционная активность вируса обнаружена только в общей клеточной фракции эякулята. Всего вирус простого герпеса выявлен (хотя бы одним из применяемых методов) в 29 образцах из 36 (81%).

В качестве группы сравнения были использованы данные о 222 пациентах, обратившихся в клинико-лабораторный центр «Пастер» или в Медико-генетический научный центр РАМН для профилактического обследования (91 человек), после перенесенных воспалительных заболеваний урогенитального тракта (87 человек) и инфертильные пациенты (44 человека). Пациенты группы сравнения были обследованы за тот же период времени, что и группа пациентов, у жен которых в анамнезе было спонтанное прерывание беременности. В группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования, вирус простого герпеса хотя бы одним из методов выявлен в 47 образцах из 91 (52%). В группе из 87 пациентов, обратившихся для обследования после перенесенных воспалительных заболеваний урогенитального тракта различной этиологии, вирус простого герпеса выявили у 44 человек из 87 (51%). В группе пациентов, обратившихся для обследования по поводу первичного бесплодия, вирус простого герпеса выявлен в 26 образцах из 44 (59%).

Ультраструктурное исследование проводили в 25 образцах эякулята пациентов, у жен которых в анамнезе было спонтанное прерывание беременности. Вирус простого герпеса хотя бы одним методом выявлен у 19 (76%) из них. Вирусные капсиды были выявлены в сперматозоидах 13 из 19 образцов эякулята мужчин этой группы (68%). В 6 образцах из 25, в которых вирус простого герпеса не выявлен вирусологическими методами, капсиды вируса простого герпеса не обнаружены. В группе сравнения проводили исследование 24 образцов эякулята пациентов с нарушениями фертильности или пациентов, обратившихся по поводу профилактического обследования. У 14 пациентов этой группы вирус простого герпеса выявлен хотя бы одним методом. При электронно-микроскопическом изучении вирусные капсиды не обнаружены (рис. 6).

 Частота выявления вируса простого герпеса: методами-12

Рис. 6. Частота выявления вируса простого герпеса: методами иммунофлюоресценции и быстрым культуральным методом (I); методом трансмиссионной электронной микроскопии (II) в группах пациентов.

Таким образом, частота выявления вируса простого герпеса хотя бы одним из методов в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности (81%), была статистически значимо выше, чем в группе пациентов, проходивших профилактическое обследование (52%, p=0,005) и в группе пациентов, обратившихся для обследования после перенесенных воспалительных заболеваний (51%, p=0,004). Различия между основной группой и группой пациентов, обратившихся для обследования по поводу первичного бесплодия (59%), не были статистически значимы (p>0,05). В целом частота выявления вируса простого герпеса в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, была статистически значимо выше (p=0,003), чем в группе сравнения из 222 пациентов.

6.2. Результаты спермиологического обследования

В группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, нормативные или слабо отклоняющиеся от нормативных (при дальнейшем изложении – нормальные) показатели спермограммы выявлены в 24 из 29 образцов (83%) эякулята с вирусинфицированными сперматозоидами (рис. 7). При отсутствии инфицирования нормальные показатели спермограммы обнаружены в 5 из 7 образцов (71%).

При обследовании пациентов групп сравнения получены следующие результаты. У пациентов, проходивших профилактическое обследование, нормальными параметры спермограммы были в 36 из 47 (77%) инфицированных вирусом простого герпеса образцов и в 35 из 44 (80%) неинфицированных. У пациентов, проходящих обследование после лечения воспалительных заболеваний, соответственно в 27 из 44 (61%) инфицированных образцов и в 23 из 43 (53%) неинфицированных. При первичном бесплодии – нормозооспермию выявляли в 13 из 26 (50%) инфицированных и 9 из 18 (50%) неинфицированных образцов (рис. 7).

 Показатели спермиологического обследования, соответствующие-13

Рис. 7. Показатели спермиологического обследования, соответствующие нормативным, в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности (I), в группе пациентов, проходивших профилактическое обследование (II), после терапии воспалительных заболеваний (III) и по поводу первичного бесплодия (IV).

При выявлении герпетического инфицирования сперматозоидов у пациентов, в анамнезе жен которых имелось спонтанное прерывание беременности, и пациентов, проходивших профилактическое обследование, параметры спермограммы статистически значимо чаще соответствовали нормативным, чем у пациентов с первичным бесплодием (p=0,022 и p=0,040 соответственно). При отсутствии инфицирования нормозооспермию статистически значимо чаще наблюдали в группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования по сравнению с группами пациентов после лечения воспалительных заболеваний (p=0,019) или при первичном бесплодии (p=0,044). Различия между группой пациентов, в анамнезе жен которых имелось спонтанное прерывание беременности, и группой сравнения в целом по частоте выявления нормальных параметров спермограммы не были статистически значимыми (p>0,05), как в случаях выявления инфицирования сперматозоидов, так и при отрицательных результатах вирусологического обследования. Таким образом, в присутствии вируса простого герпеса значимых изменений в параметрах спермограммы обнаружено не было.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основными показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, считаются концентрация сперматозоидов (их общее количество), подвижность и содержание сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии (Centola G., Eberly S., 1999; Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А., 2002). Хотя у фертильных мужчин эти показатели в общем выше, однако, в группе фертильных и бесплодных мужчин они могут значительно перекрываться, позволяя предполагать наличие неких других факторов, влияющих на фертильность (Evenson D. et al., 1999; 2000; Sakkas D., Tomlinson M., 2000). Основываясь на показателях спермиологического обследования, нельзя дать достоверный прогноз фертильности, учитывающий не только возможность зачатия, но и исход наступившей беременности (Zini A., Libman J., 2006). В последние годы появились сведения о том, что на исход беременности могут влиять факторы, не выявляющиеся при традиционном спермиологическом обследовании. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой разработан и рекомендуется инструкцией ВОЗ ряд функциональных тестов, таких как: акросомная реакция; тест связывания сперматозоидов с блестящей зоной ооцита (HZA - hemizona assay) (Oehninger S. et al., 1989); тест проникновения сперматозоидов сквозь блестящую зону ооцита (Lanzendorf S. et al., 1994); тест проникновения сперматозоидов в ооцит, лишенный оболочки (Aitken R. et al., 1991); определение деконденсации хроматина ядра сперматозоида методом окраски анилиновым синим (Hoffman N., Hilscher B., 1991). Наряду с вышеупомянутыми тестами для установления природы патоспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа.

Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может применяться для выявления ультраструктурных нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с патоспермией, для оценки функционального состояния сперматозоидов у пациентов с идиопатическим бесплодием и у пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности. Применение электронно-микроскопического исследования сперматозоидов позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, идентифицировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии.

В первом случае, сперматозоиды с каким-либо характерным нарушением строения составляют большую (либо тотальную) часть клеток эякулята данного пациента. Эти нарушения могут быть названы системными, или синдромными, так как ультраструктурные особенности сперматозоидов не меняются со временем, не поддаются терапевтической коррекции, и аналогичны нарушениям морфологии сперматозоидов других пациентов с аналогичными нарушениями фертильности. В этом случае нарушения морфологии сперматозоидов носят семейный характер и имеют доказанное (или предположительное) генетическое происхождение. Специфическая «синдромная» патология выявляется редко, согласно данным литературы – в 0,2 до 2% случаев нарушения фертильности (Chemes H., 2000). Для клинической практики, особенно при использовании репродуктивных технологий, важно, что специфическая «синдромная» патоспермия не корректируется терапевтически, и несет риск наследования аномалий в потомстве.

В настоящей работе был выявлен тип синдромной патоспермии, не описанный ранее и связанный с аномалией строения центриолей сперматозоидов. Совокупность симптомов при данной патологии выражается в следующем: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии у пациентов, тотальное нарушение строения центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.

Значительно более многочисленная группа – это пациенты с так называемыми неспецифическими аномалиями. У каждого пациента в этом случае обнаруживали гетерогенные комбинации различных изменений, индивидуальных для каждого пациента. Неспецифические дефекты сперматозоидов представляют собой гетерогенную группу аномалий со случайным распределением (Chemes H., 2000; Chemes H., Rawe V., 2003). Часто множественные аномалии головки и жгутиков представлены одновременно, их проявления могут варьировать по времени у одного и того же пациента.

В настоящей работе особое внимание было уделено так называемому идиопатическому бесплодию. Основная группа обследованных пациентов – это лица без явно выраженных нарушений спермиологического обследования (за исключением небольшой группы пациентов, где проводили дифференциальную диагностику генетически обусловленной аномалии и нарушений, вызванных экзогенными причинами при астенозооспермии и тератозооспермии). Нарушение фертильности при идиопатическом бесплодии может выражаться как в отсутствии зачатия в срок не менее года, так и в аномальном течении беременности у жены пациента после зачатия.

Показано, что при бесплодии у 81% пациентов выявляли повышенное содержание сперматозоидов с аномальной акросомой. В группе пациентов, проходивших профилактическое обследование, повышенное содержание сперматозоидов с аномальной акросомой не выявлено. Напротив, у 58% пациентов, в анамнезе жен которых имелось спонтанное прерывание беременности, наблюдали повышенное содержание сперматозоидов с нарушением конденсации хроматина. Эта аномалия обнаружена у 37% пациентов с первичным бесплодием, и не выявлялась в группе пациентов, проходивших профилактическое обследование.

Другим фактором, влияющим на фертильность мужчин, является наличие вирусного инфицирования сперматозоидов. Так как данные о вирусном инфицировании сперматозоидов не являются в настоящее время общепризнанными, в настоящей работе были поставлены следующие вопросы: 1) какова форма существования вируса простого герпеса в сперматозоидах, 2) может ли наблюдаться продуктивная вирусная инфекция в сперматозоидах и 3) главный вопрос – могут ли быть инфицированы вирусом герпеса морфологически нормальные сперматозоиды, обладающие так называемой прогрессивной подвижностью и участвующие в оплодотворении?

Работы по выявлению вируса простого герпеса и других вирусов группы герпеса в эякуляте были начаты более 30 лет назад, в связи с интенсивным развитием методов репродуктивных технологий. (Брагина Е.Е. и соавт. 1996; Deture F. et al., 1978; Kulscar G. et. al., 1991; Czata S. и Kulsar G., 1991; Kotronias D., Kapranos N., 1998; Еl Borai et al.,1997; Kapranos et al., 2003). С другой стороны, имелись сведения о выделении вируса простого герпеса из материала спонтанно абортированных плодов человека и животных (Sifakis S. et al., 1998; Rappersberger K., 1999; Mukaiya R. et al., 2000; Spano L. et al., 2002; Moore D. et al., 2003), причем инфицирование эмбриона при спонтанных абортах может быть значимо выше частоты инфицирования матери (Барановская Е.И. и соавт., 2004).

Обычно при аномалиях беременности, связанных с генитальным герпесом, так же, как и при герпетическом инфицировании новорожденных, проводят обследование беременных женщин (Масюкова С.А., ГладькоВ.В., 2002; Bujko M. et al., 1984; Whitley R., 1994). Значительно меньше внимания уделяется роли мужского фактора (Wald A. et al., 2002). О роли мужского фактора в аномальном течении беременности при герпетическом инфицировании опубликованы единичные работы (Csata S., Kulcsar G., 1991; Kulcsar G. et al., 1991). Очень мало сведений о влиянии герпетической инфекции на репродуктивную систему мужчин.

Для решения вопроса о форме существования вируса простого герпеса в сперматозоидах в настоящей работе использовали комплекс методов: 1) реакцию иммунофлюоресценции для анализа белков различных стадий жизненного цикла вируса простого герпеса в сперматозоидах; 2) метод определения ДНК-ДНК гибридизации in situ – для выявления и локализации геномной ДНК вируса простого герпеса; 3) быстрый культуральный метод – для определения инфекционной активности вируса; 4) метод электронной микроскопии – с целью морфологического выявления внутригаметного инфицирования.

Для исследование влияния вируса простого герпеса на сперматогенез использовали следующие методы: 1) традиционное спермиологическое обследование; 2) молекулярно-генетические методы: степень анеуплоидизации сперматозоидов оценивали с помощью хромосомоспецифичных зондов к специфическим последовательностям ДНК хромосом 1, X и Y; 3) количественный анализ незрелых половых клеток эякулята для определения степени блокирования мейоза у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами; 4) количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов при герпетической инфекции.

Для исследования формы существования вируса простого герпеса в сперматозоидах было проведено выявление (сверхраннего), (раннего) и (позднего) белков разных стадий жизненного цикла вируса, и выявление инфекционной активности вируса в образцах общей клеточной фракции спермы 101 пациентов, не имеющих симптомов генитального герпеса. При выявлении в сперматозоидах белков всех стадий жизненного цикла вируса инфекционную активность вируса простого герпеса в клеточной фракции эякулята обнаруживали статистически значимо чаще, чем в тех случаях, когда белки всех стадий цикла не выявляли.

В выделенной фракции подвижных сперматозоидов различных образцов были обнаружены как белки полного жизненного цикла вируса, так и белки одной или двух стадий жизненного цикла, а также выявлена инфекционная активность вируса.

Таким образом, при выявлении вируса простого герпеса в общей клеточной фракции сперматозоидов была обнаружена связь между наличием вирусных белков и выявлением инфекционной активности вирусов – в образцах эякулята с полной экспрессией белков вируса простого герпеса (сверхранних, ранних и поздних) инфекционную активность вируса выявляли чаще, чем в образцах с неполной экспрессией белков в сперматозоидах. Аналогичные факты были получены и другими исследователями, которые объясняли это явление наличием в семени ингибиторов роста клеточных культур (Deture F. et al., 1978; Sherman J., Morgan P., 1989).

Результаты настоящего исследования дают основание утверждать, что в сперматозоидах общей клеточной фракции и во фракции подвижных сперматозоидах может осуществляться как полный, так и неполный жизненный цикл вируса простого герпеса.

Проведение гибридизации in situ с зондами к ДНК вируса простого герпеса показало, что вирусная ДНК может присутствовать, как при полной экспрессии вирусных белков (, и ), так и при неполной их экспрессии. ДНК вируса простого герпеса может быть обнаружена как при наличии, так и при отсутствии инфекционной активности вируса. Следовательно, при неполном жизненном цикле вируса простого герпеса в сперматозоидах ДНК вируса сохраняется.

В настоящей работе впервые выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии. До настоящего времени в литературе имелось лишь одно сообщение о выявлении ДНК вируса простого герпеса в общей клеточной фракции сперматозоидов (Kapranos N. et al., 1998). Полученные данные крайне важны для современной репродуктологии.

Следует подчеркнуть, что полученные результаты, касающиеся выявления ДНК ВПГ в подвижных сперматозоидах, имеющих нормальную морфологию, позволяют высказать предположение о том, что имеется возможность участия инфицированных клеток в оплодотворении.

При ультраструктурном исследовании образцов эякулята с вирусинфицированными сперматозоидами показано, что капсиды вируса простого герпеса могут быть обнаружены в цитоплазме сперматозоидов нормальной морфологии. Выявляли только капсиды с электронно-прозрачной сердцевиной, то есть не содержащие ДНК. На основании морфологического сравнения с опубликованными микрофотографиями (Newcomb W. et al., 1999; Алиева С.А. и соавт., 2006) был сделан вывод, что в сперматозоидах вирус простого герпеса обнаруживается в виде прокапсидов. Капсиды вируса простого герпеса были обнаружены также в нуклеоплазме ядер, в перинуклеарном пространстве ядер сперматозоидов и в районе пор ядерной оболочки. Эти данные позволяют считать, что капсиды формируются в ядрах сперматозоидов.

Можно предположить, что отсутствие инкапсуляции ДНК может быть вызвано каким-либо фактором, присутствующим в сперматозоидах и мешающим синтезу белков, участвующих в инкапсуляции. Так, известен ингибитор репликации вируса простого герпеса, который in vitro мешает контакту между pre-VP22a (UL26.5) (каркасным белком) и порталом (зоной, через которую осуществляется инкапсуляция вирусной ДНК внутрь капсида). В присутствии этого ингибитора (WAY-150138) в инфицированной клетке или в реакционной смеси, формируются морфологически нормальные капсиды, в которых блокирована инкапсуляция ДНК и, соответственно, сборка вируса. (Newcomb W., Brown J., 2002; Newcomb W. et al., 2005).

С другой стороны, возможно, имеет место изменение самих вирусов, например, белка портала, белков, участвующих в интеграции портала в растущий капсид, или белков, участвующих в расщеплении транзитных каркасных белков вируса простого герпеса (Beard P., Baines J., 2004; Beard P. et al., 2004; Singer G. et al., 2005).

Показано, что капсиды выявляются не во всех образцах - при ультраструктурном анализе сперматозоидов у пациентов различных групп внутригаметные капсиды выявлены у большей части пациентов, в анамнезе жен которых отмечено спонтанное прерывание беременности. Капсиды обнаружены в 68% образцов эякулята пациентов этой группы, в которых вирусологическими методами выявлен вирус простого герпеса. При исследовании образцов эякулята пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, но вирус простого герпеса не обнаружен вирусологическими методами, капсиды вируса простого герпеса не были выявлены. Проводили также ультраструктурное исследование 14 образцов эякулята пациентов, у которых выявлены белки и/или инфекционная активность вируса простого герпеса, но в анамнезе жен отсутствовало прерывание беременности. Ни в одном из этих образцов не удалось обнаружить вирусные капсиды.

Другим аспектом проблемы герпетического инфицирования сперматозоидов является выяснение влияния инфицирования на фертильность мужчин.

При исследовании кариотипа с помощью гибридизации с хромосомоспецифичными ДНК-зондами, было показано, что степень анеуплоидии хромосом 1, X и Y в ядрах сперматозоидов эякулята пациентов с герпетическим инфицированием половых клеток не выше таковой у фертильных мужчин (Shi Q., Martin R., 2000). Эти данные свидетельствуют о том, что инфицирование по крайней мере, части сперматозоидов может происходить без выраженных генетических и морфологических повреждений (Shi Q., Martin R., 2000).

Количественный анализ состава незрелых половых клеток показал, что в эякуляте 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами происходит статистически значимое, по сравнению с данными группы сравнения (доноры спермы), увеличение количества сперматоцитов на предпахитенных стадиях профазы I мейоза. Эти стадии характеризуются синтезом ДНК (в прелептотене) и материала для построения специфической структуры мейотических хромосом – синаптонемного комплекса (в лептотене), его формированием и конъюгацией гомологичных родительских хромосом в зиготене.

Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, продемонстрированное в данной работе, свидетельствует о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена в подвижной фракции сперматозоидов нормальной морфологии.

Таким образом, можно считать доказанным существование внутриклеточного инфицирования сперматозоидов мужчин, не имеющих симптомов генитального герпеса, которые не обращаются по поводу генитального герпеса к клиницистам и не получают лечения. Это явление может иметь как эпидемиологическое значение (горизонтальная передача вируса простого герпеса при бессимтомном носительстве), так и играть роль в развитии аномалий беременности при вертикальной передаче вируса.

ВЫВОДЫ

1. Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может быть использован для установления характера патоспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов. Применение электронно-микроскопического исследования позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, дифференцировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии.

2. Описан новый тип синдромной патоспермии. Совокупность симптомов при данной патологии выражается в следующем: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии у пациентов, тотальное нарушение строения центриолей сперматозоидов – разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью ИКСИ эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.

3. Использование метода количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов позволило выделить две принципиально различные группы пациентов с астенозооспермией, различающихся по характеру нарушения ультраструктурных нарушений морфологии аксонемы жгутиков сперматозоидов: а) группа пациентов с тотальной аномалией морфологии аксонемы (пациенты с синдромом первичной цилиарной дискинезии), б) пациенты, у которых выявлены множественные, но не тотальные аномалии микротрубочек аксонемы, что может являться следствием действия экзогенных факторов.

4. Методом количественного электронно-микроскопического сперматозоидов показано, что в эякуляте 15 из 26 (58%) пациентов, у которых показатели спермиологического обследования соответствовали нормативным, и у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, выявлено повышенное содержание сперматозоидов с нарушенной конденсацией хроматина ядер сперматозоидов. В группе пациентов с первичным бесплодием и нормативными показателями спермиологического обследования нарушение конденсации хроматина ядер сперматозоидов выявлено у 10 из 27 пациентов (37%). Различия между этими группами статистически значимы (p=0,031). В группе из 10 пациентов с нормозооспермией, проходивших профилактическое обследование, не выявлено повышенного содержания сперматозоидов с аномальной конденсацией хроматина.

5. Методом количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов показано, что в эякуляте 21 из 26 (81%) инфертильных пациентов, у которых показатели спермиологического обследования соответствовали нормативным, выявлено сниженное содержание сперматозоидов с морфологически нормальной акросомой. В группе из 10 пациентов с нормозооспермией, проходивших профилактическое обследование, не выявлено повышенного содержания сперматозоидов с морфологически аномальной акросомой.

6. Во фракции подвижных сперматозоидов нормальной морфологии из образцов эякулята 19 из 34 (56%) пациентов с нарушением фертильности обнаружена инфекционная активность вируса и с помощью реакции иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител к сверхранним (МКА 4а), ранним (МКА 3е5) и поздним (МКА 2С) белкам вируса простого герпеса выявлены белки вируса простого герпеса. В подвижной фракции сперматозоидов мужчин, проходивших профилактическое обследование, белки вируса простого герпеса не обнаружены.

7. Впервые методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидах нормальной морфологии 7 из 11 пациентов, у которых белки вируса простого герпеса были обнаружены с помощью реакции иммунофлюоресценции. Методом гибридизации in situ установлено, что вирусная ДНК может присутствовать в сперматозоидах как при полном жизненном цикле вируса простого герпеса, так и при неполном жизненном цикле, то есть при абортивной форме инфекции. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии позволяет сделать заключение о возможности вертикальной передачи вируса.

8. Показано, что сперматозоиды с включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены у 13 из 19 пациентов, у жен которых в анамнезе имеется спонтанное прерывание беременности. Капсиды вируса простого герпеса обнаруживались в цитоплазме, кариоплазме, перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки сперматозоидов. У пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности, но вирус простого герпеса в сперматозоидах не был выявлен с помощью реакции иммунофлюоресценции и быстрого культурального метода, а также у пациентов, у которых вирус простого герпеса в сперматозоидах выявлен вирусологическими методами, но в анамнезе жен отсутствовали указания на прерывание беременности, капсиды вируса простого герпеса в сперматозоидах не обнаружены.

9. При количественном анализе состава незрелых половых клеток показано, что в эякуляте 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами выявляется статистически значимое по сравнению с контрольной группой увеличение количества сперматоцитов на предпахитенных стадиях профазы I мейоза: прелептотены, лептотены и зиготены, а также повышение содержания неидентифицируемых незрелых половых клеток. Выраженный цитопатический эффект и изменение количественного состава незрелых половых клеток, обусловленные наличием герпетического инфицирования, свидетельствуют о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.

10. Методом флюоресцентной гибридизации in situ с хромосомоспецифичными ДНК-зондами показано, что степень анеуплоидии хромосом 1, X и Y в ядрах сперматозоидов эякулята 17 пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов не выше таковой в группе фертильных мужчин.

11. Таким образом, можно считать доказанным существование внутриклеточного инфицирования подвижных сперматозоидов нормальной морфологии в эякуляте мужчин, не имеющих симптомов генитального герпеса, которые не обращаются по поводу генитального герпеса к клиницистам и не получают лечения. Это явление может иметь как эпидемиологическое значение (горизонтальная передача вирус простого герпеса при бессимптомном носительстве), так и играть роль в развитии аномалий беременности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В. Использование метода хромосомных зондов (FISH) для выявления генетических аномалий половых клеток при вирусном инфицировании сперматозоидов // «Генодиагностика инфекционных заболеваний». – Материалы 4-ой Всероссийской научно-практ. конф. – М., 2002. – С. 8.
  2. Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А., Бочарова Е.Н., Кущ А.А, Гребенча С.В., Курило Л.Ф. Внутриклеточное инфицирование сперматозоидов человека вирусами группы герпеса //Андрология и генитальная хирургия. – 2002, № 3. – С. 81-82.
  3. Курило Л.Ф., Дмитриев Г.А., Щетинин В.В., Брагина Е.Е., Бушманов А.Ю., Абдумаликов Р.А., Шилейко Л.В., Бочарова Е.Н., Юрасов С.В. Электронномикроскопическое исследование сперматозоидов как функциональный тест при диагностике мужского бесплодия // Методические рекомендации. – М., 2003. – 23 с.
  4. Курило Л.Ф., Масюкова С.А., Щетинин В.В., Брагина Е.Е., Бушманов А.Ю., Гладько В.В., Абдумаликов Р.А., Бармина Г.В., Бочарова Е.Н., Зудин А.Б., Бочарова Е.Н., Шилейко Л.В., Алиева С.Н., Юрасов С.В. Диагностика урогенитального герпеса с помощью реакции иммунофлюоресценции. Выявление сперматозоидов, инфицированных вирусом простого герпеса // Методические рекомендации. – М., 2003. – 19 с.
  5. Бочарова Е.Н., Абдумаликов Р.А., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Адуева С.М., Меджидова М.Г., Курило Л.Ф., Кущ А.А. Обнаружение белков и капсидов вируса простого герпеса в сперматозоидах человека // Доклады академии наук. – 2003. – Т. 391, № 6. – С. 836-841.
  6. Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Адуева С.М., Меджидова М.Г., Курило Л.Ф., Кущ А.А. Выявление вируса простого герпеса в эякуляте у мужчин, не имеющих клинических симптомов урогенитального герпеса // Материалы Первого Российского конгресса дерматовенерологов (23-26 сентября 2003 г.). – С-Пб., 2003. – С. 152.
  7. Брагина Е..Е., Бочарова Е.Н., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г.Использование FISH метода в генетическом консультировании для выявления анеуплоидий хромосом при вирусном инфицировании сперматозоидов // Материалы Второго конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (15-17 октября 2003 г.). – М., 2003. – С. 136.
  8. Брагина Е..Е., Курило Л.Ф., Абдумаликов Р..А., Бочарова Е.Н., Михайлова Е.М., Гришина Е.М., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М. Множественные дефекты ультраструктурной организации жгутика сперматозоида у пациента с абсолютной астенозооспермией // Проблемы репродукции. – 2004. – Т. 10, № 1. – С. 66-69.
  9. Бочарова Е.Н., Климова Р.Р., Завалишина Л.Э., Петров А.Н., Брагина Е.Е., Кущ А.А. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека методом гибридизации in situ // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология – ХХI век». Саратов, (28-30 сентября). – Саратов, 2004. – С. 44-45.
  10. Брагина Е.Е., Бочарова Е.Н., Климова Р.Р., Завалишина Л.Э., Ашапкин В.В., Петров А.Н., Кущ А.А. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека методом гибридизации in situ // Материалы I Международной конф. «Молекулярная медицина и биобезопасность» (26-28 октября 2004г.). – М., 2004. – С. 35-36.
  11. Брагина Е.Е., Шилейко Л.Ф., Курило Л.Ф., Гусак Ю.К., Кущ А.А., Бочарова Е.Н. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов и его прогностическое значение при нарушениях фертильности мужчин // Материалы 3-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие» (16-18 февраля 2005г.). – М., 2005. – С. 38.
  12. Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К., Зыкова М.С., Лихаев Д.Н., Зотов В.В., Терещенко А.Б., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Климова Р.Р., Кущ А.А. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов // Андрология и генитальная хирургия. – 2006. – № 1. – С. 59-65.
  13. Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К., Зыкова М.С., Лихаев Д.Н., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Климова Р.Р., Кущ А.А. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов // Материалы 4-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие» (15-17 февраля 2006г). – М., 2006. – С. 22.
  14. Абдумаликов Р.А. Бочарова Е.Н. Антигерпетическая терапия субклинических форм генитального герпеса с использованием пептидных биорегуляторов // Натуротерапия и гомеопатия. – 2006. – № 2 (9). – С. 16-20.
  15. Абдумаликов Р.А., Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е. Антигерпетическая терапия пептидными биорегуляторами у лиц с герпетическим инфицированием сперматозоидов // Натуротерапия и гомеопатия. – 2006. – № 2 (9). – С. 34-37.
  16. Кущ А.А., Климова Р.Р., Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Зыкова М.С., Лихаев Д.Н., Абдулмеджидова А.Г., Курило Л.Ф., Хилькевич Л.В., Скорова Н.Е. Инфицирование сперматозоидов вирусом простого герпеса при идиопатическом бесплодии в браке // Материалы международной конференции по андрологии (24-26 мая 2006г., Дагомыс) / Андрология и генитальная хирургия. – 2006. – С. 32.
  17. Бочарова Е.Н. Вирусное инфицирование сперматозоидов //Проблемы репродукции. – 2006. – Т. 12, № 5. – С. 75-79.
  18. Алиева П.М., Алиева С.А., Масюкова С.А., Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е. Выявление вирионов вируса простого герпеса в эпителии шейки матки пациенток, страдающих генитальным герпесом, в межрецидивный период //Клиническая дерматология и венерология. – 2006. – № 4. – С. 23-27.
  19. Бочарова Е.Н., Шилейко Л.В., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Кущ А.А., Курило Л.Ф.Нарушение сперматогенеза человека: количественное исследование состава незрелых половых клеток при инфицировании сперматозоидов вирусом простого герпеса // Проблемы репродукции. – 2006. – Т. 12, № 6. – С. 75-80.
  20. Бочарова Е.Н. Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Гусак Ю.К., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Петров А.Н., Франк Г.А., Кущ А.А. Выявление геномной ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ в сперматозоидах человека при нарушении фертильности // Доклады академии наук. – 2007. – Т. 412, № 3. – С.417–421.
  21. Бочарова Е.Н., Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Гусак Ю.К., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Петров А.Н., Франк Г.А., Кущ А.А. Выявление геномной ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ в сперматозоидах человека при бесплодии // Материалы 4-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие» (20-22 февраля 2007г). – М., 2007. – С. 28-29.
  22. Bocharova E.N. Herpesvirus infection of male gametes // International scientific-practical interdisciplinary workshop “New Technology in Medicine and Experimental Biology” (26 February-08 March, 2007). – Pattaya-Bangkok, Thailand, 2007. – P. 16.
  23. Алиева П.М., Алиева С.А., Бочарова Е.Н., Масюкова С.А., Брагина Е.Е. Выявление вируса простого герпеса в цервикальном эпителии женщин в межрецидивный период при генитальном герпесе // Материалы первого регионального научного форума «Мать и дитя» (20-22 марта 2007г.). – Казань, 2007. – С. 196.
  24. Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К. Количественное ультраструктурное исследование сперматозоидов человека при нарушении фертильности // Вестник новых медицинских технологий. – 2007. – Т XIV, № 4. – С. 199-201.
  25. Бочарова Е.Н. Генетически обусловленная ультраструктурная патология сперматозоидов // Вестник новых медицинских технологий. – 2008. – Т XV, № 1. – С. 52-55.
  26. Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К., Зотов В.В., Терещенко А.Б., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Климова Р.Р., Кущ А.А. Герпетическое инфицирование сперматозоидов при неудачах использования репродуктивных технологий и спонтанном прерывании беременности // Урология. – 2007, № 3. – С. 59-63.
  27. Брагина Е.Е., Бочарова Е.Н., Гусак Ю.К. Электронно-микроскопические исследования при нарушениях фертильности // Материалы 4-ой конференции с международным участием "Малоинвазивные методы диагностики и лечения в современной урологии"(26–27 апреля 2007). – С.-Петербург, 2007. – С. 56-58.
  28. Грибенча С.В., Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А., Бочарова Е.Н., Курило Л.Ф. Выявление антигена вируса простого герпеса второго типа в клетках сперматогенного эпителия инфицированных тестикул морских свинок // Бюллетень экспериментальной биологии медицины. – 2007. – № 7. – С. 79-83.
  29. Брагина Е.Е., Бочарова Е.Н., Гусак Ю.К. Прогностическое значение ультраструктурного исследования сперматозоидов при нарушениях фертильности мужчин и при криоконсервации гамет // Материалы XVII ежегодной международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (6-8 сентября 2007 г.). – Казань, 2007. – С. 61.
  30. Бочарова Е.Н., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Брагина Е.Е., Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г., Юров И.Ю., Климова Р.Р., Кущ А.А. Анализ популяции половых клеток в эякуляте мужчин, инфицированных вирусом простого герпеса // Онтогенез. – 2008. – Т. 39, № 1. – С. 47-57.
  31. Бочарова Е.Н., Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Гусак Ю.К., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Петров А.Н., Франк Г.А., Кущ А.А. Использование метода гибридизации in situ для выявления геномной ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека при нарушении фертильности // Материалы I международной конференции «Проблемы диагностики, лечения и профилактики герпесвирусных инфекций» (24-26 марта 2008г.). – М., 2008. – С. 17-19.
  32. Bocharova E.N., Bragina E.E., Gusak Yu.K. Investigation of human sperm cells infertility disorders by quantitative ultrastrutural analysis // International scientific-practical interdisciplinary workshop «New technology in medicine and experimental biology» (07-19 March). – Singapore-Bali, 2008. – P. 12-13.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.