WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Полногеномныеподходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и

Ю. А. Овчинникова

На правах рукописи

УДК 577.152

БУЗДИН Антон Александрович

Полногеномныеподходы к функциональному анализу повторяющихся элементов

03.00.03 - Молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора биологических наук

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории структуры и функций генов человека Института биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН

Официальные оппоненты:

Доктор биол. наук М.Б. Евгеньев

Доктор биол. наук К.А.Лукьянов

Член-корреспондент РАН, доктор биол. наук профессор Н.В.Томилин

Научный консультант:

Академик РАН, доктор биол. наук профессор Е.Д.Свердлов

Ведущая организация:

Институт молекулярной биологии РАН

Защита состоится "24" сентября 2008 г. в часов на заседании

Специализированного совета при Институте биоорганической химии

им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН по адресу: 117997,

г. Москва, ул. Миклухо-Маклая 16/10.

С текстом диссертации можно ознакомиться в библиотеке Института

биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН.

Автореферат разослан " " 2008 г.

Учёный секретарь

Специализированного совета

доктор химических наук В. А. Олейников

Актуальность темы.

Выход молекулярной генетики на качественно новый уровень – уровень исследования и сопоставления структуры и функций целых геномов - возможен лишь при развитии арсенала соответствующих экспериментальных подходов. Первым этапом могло бы являться получение исчерпывающих структурных данных, вторым – расшифровка на их основе функциональной роли тех либо иных участков генома. Возможно, наилучшим из имеющихся структурных подходов с точки зрения полноты охвата проблемы является тотальное секвенирование геномной ДНК и библиотек транскриптов различных тканей исследуемого организма. Вместе с тем, регуляторные участки генома таким способом выявить невозможно. Кроме того, подход очень дорог и требует огромного напряжения усилий множества учёных. Применение технологии микрочипов не может быть полноценной заменой полного секвенирования, так как не позволяет различать слабодивергировавших представителей мультигенных семейств, а также те последовательности, в состав которых входят повторяющиеся элементы.

Изменения в структуре ДНК, прямо или косвенно связанные с изменением количества копий геномных повторов, являются одним из важнейших факторов эволюции геномов и, соответственно, видообразования. Мобильные элементы обладают значительным регуляторным потенциалом, обеспечивающим контроль экспрессии их собственных генов. В то же время, известно, что активность многих уникальных функциональных участков генома, например, многих генов, модулируется располагающимися по соседству вставками мобильных элементов.

Кроме того, изучение геномных повторов, в особенности – мобильных элементов и их фракции, активной у позвоночных, ретроэлементов - может дать исследователям новые полиморфные маркёры, которые могут быть использованы как для филогенетических, так и для медико- и популяционно-генетических исследований.Поэтому сравнение распределения ретроэлементов между геномами представляется одной из важнейших задач молекулярной генетики.

Применяемые для решения этой задачи большинством исследователей экспериментальные подходы не дают возможности проводить анализ на уровне целых геномов. Казалось бы, наилучшим выходом могла бы стать тотальная идентификация геномных повторов в базах данных. Однако этот подход имеет важный недостаток: все данные о наличии повторов в различных локусах генома берутся из баз данных и, учитывая, что для всех крупных проектов секвенируют ДНК лишь небольшого количества представителей исследуемого вида, подавляющее большинство информации о полиморфных в популяции повторах теряется. Кроме того, прицентромерные и прителомерные участки с трудом поддаются анализу и недопредставлены во всех опубликованных последовательностях ДНК эукариот со сложным геномом. Таким образом, базы данных содержат неполную информацию. К тому же, таким способом можно исследовать только те объекты, геномная последовательность которых частично или же почти полностью установлена.

Поэтому актуальной представляется задача создания экспериментальных методов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения повторяющихся элементов между организмами и их функциональной характеристики независимо от информации, содержащейся в базах данных.

Цель работы.

Основной целью настоящей работы являлась разработка экспериментальных подходов, позволяющих проводить полногеномное сравнение распределения геномных повторов в ДНК представителей разных видов или между различными особями одного вида. Разработанные методики предполагалось применить для идентификации и структурно-функциональной полногеномной характеристики ретроэлементов, специфичных для генома человека. Такие ретроэлементы присутствуют только в ДНК человека, но не в геномах других наиболее родственных видов (шимпанзе Pan paniscus u Pan troglodytes) и других организмов. На основе обнаруженных функционально активных человек-специфичных ретроэлементов планировалось выявить потенциальные регуляторы активности известных генов, которые могли выступать как важные факторы в ходе молекулярной эволюции генома человека.

Научная новизна и практическая ценность. В ходе выполнения работы были разработаны методы прямого экспериментального сравнения участков интеграции геномных повторов между ДНК близкородственных видов. Методы являются уникальными и не имеют аналогов в опубликованной литературе. Первый метод, TGDA (англ. Targeted Genomic Differences Analysis), основан на вычитающей гибридизации геномных последовательностей, фланкирующих повторы, а второй, Diffir (англ. Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique) – на дифференциальной гибридиазации фланкирующих участков генома на фильтре.

В ходе разработки вышеуказанных методов оказалось, что неспецифическая гибридизация нуклеиновых кислот в значительной мере осложняет создание и анализ получаемых клонотек. Для повышения специфичности отбора совершенных дуплексов при гибридизации нами был разработан новый методический подход, названный MDR (англ. Мispaired DNA Rejection), основанный на селективной энзиматической деградации некорректно спаренных ДНК-дуплексов. MDR потенциально применим для повышения специфичности целого семейства методов, основанных на гибридизации нуклеиновых кислот в растворе с последующей ПЦР-амплификацией, например, вычитающей гибридизации и метода клонирования совпадений.

Для функциональной характеристики геномных повторов мы разработали новый экспериментальный подход, впервые позволяющий проводить полногеномные исследования промоторной активности геномных повторов как на качественном, так и на количественном уровне. Этот подход, названный GREM (англ. Genomic Repeat Expression Monitor), основан на гибридизации геномных последовательностей, фланкирующих повторы, с 5’-концевыми фрагментами кДНК.

Разработанные подходы были успешно применены для полногеномной идентификации специфичных для генома человека представителей ретроэлементов семейств HERV-K (HML-2) u L1. Был проведён детальный структурный анализ человек-специфичных ретроэлементов. В составе последовательности длинных концевых повторов элементов группы HERV-K (HML-2) найдена ранее неизвестная точка начала транскрипции, расположенная на границе областей R и U5 - в участке, отличающемся от канонического для экзогенных ретровирусов (граница областей U3 и R). По-видимому, появление новой точки начала транскрипции связано с адаптивной эволюцией данного семейства эндогенных ретровирусов человека. Также было установлено, что человек-специфичные представители HERV-K (HML-2) обладают значительным сходством нуклеотидной последовательности и для них была выведена консенсусная последовательность.

Было обнаружено новое семейство ретроэлементов, состоящее из химерных последовательностей, образованных при однократной или двукратной смене матрицы в ходе обратной транскрипции. Представители нового семейства были найдены в геномах млекопитающих и у нитчатого гриба Magnaporthe grisea. Это позволяет сделать вывод о высокой эволюционной консервативности обнаруженного явления.

Кроме того, в интронах двух генов человека – SLC u SLB – выявлены человек-специфичные представители HERV-K (HML-2), инициирующие транскрипцию антисмысловых РНК, перекрывающихся с последовательностями экзонов этих генов. В системе in vitro показано, что экспрессия этих антисмысловых транскриптов на физиологическом уровне, наблюдаемом для эмбриональных и герминогенных тканей, приводит к 2-3 –кратному снижению концентрации мРНК соответствующих генов. Таким образом, обнаружены первые два случая человек-специфичной регуляции экспрессии генов за счет антисмысловой транскрипции, регулируемой ретроэлементами.

1. Повышение специфичности гибридизации в растворе

Работа была проведена Е.В.Гогвадзе, Т.В.Чалой, Е.Д.Свердловым и А.А.Буздиным.

Хорошо известный недостаток гибридизации сложных смесей ДНК – побочная гибридизация ДНК геномных повторов, присутствующих в сравниваемых образцах. В результате такого «неспецифического» отжига, итоговые клонотеки изобилуют химерными последовательностями, получившимися при гибридизации повторяющихся частей из неортологичных локусов (Рис. 1). Такие химеры абсолютно бесполезны при анализе клонотек и даже вредны, поскольку для того, чтобы понять, является ли последовательность химерой или же целевым продуктом гибридизации, приходится проводить достаточно трудоёмкий анализ каждой последовательности поотдельности. Химеры в среднем могут занимать 40–60% библиотек ДНК. Хотя ситуация может быть несколько улучшена при добавлении к гибридизационной смеси конкурирующей фракции геномной ДНК, обогащённой последовательностями повторов, количество нежелательных химерных клонов в библиотеках всё же остаётся высоким (см. ниже). Для того, чтобы улучшить создавшуюся ситуацию, нашей группой был разработан метод, названный Mispaired DNA Rejection (MDR), позволяющий свести к минимуму содержание химер в конечных библиотеках. Метод основан на том, что подавляющее большинство взаимно-отжигающихся геномных повторов, хотя и содержат значительную гомологию нуклеотидной последовательности, но всё же не полностью идентичны друг другу. Поэтому их ДНК-дуплексы не являются совершенными и содержат протяжённые или же короткие участки неспаренных нуклеотидов. Это могут быть как одиночные нуклеотиды, так и значительные по длине выпетливания. Все такие структурные отклонения от нормы, то есть совершенных ДНК-дуплексов, могут узнаваться и расщепляться особыми нуклеазами, названными здесь мисмэтч-специфическими нуклеазами (МСН). МСН служат in vivo как участники репарации геномной ДНК или в ходе прохождения жизненного цикла вирусов. В настоящее время МСН широко применяются для поиска и детекции мутаций (детально рассмотрено в литературном обзоре). В настоящем разделе речь пойдёт об использовании МСН для селективного расщепления химерных дуплексов в гибридизационных смесях, что позволяет снизить число побочных химерных клонов с 44–60 до 0–4%.

Рисунок 1. Образование химерных клонов в гибридизационных библиотеках.

1.1 Метод MDR: селективная деградация неправильно спаренных гетеродуплексов

Для тестирования эффективности MDR была разработана тест-система (Рис. 2), включающая (1) расщепление геномной ДНК частощепящей рестриктазой, (2) лигирование различных олигонуклеотидных супрессионных адапторов, (3) денатурацию-гибридизацию двух порций ДНК, содержащих разные супрессионные адапторы, (4) заполнение концов дуплексов ДНК-полимеразой, (5) обработка МСН и (6) ПЦР-амплификацию (с использованием эффекта ПЦР супрессии, детально описан в литературном обзоре) тех гетеродуплексов, которые не были расщеплены на предыдущей стадии. Nested ПЦР с праймерами A2 и B2 повышает специфичность процедуры так, что в результате амплифицируется исключительно ДНК гетеродуплексов. Контрольные эксперименты содержали все те же самые стадии, помимо этапа (5), то есть обработки гибридов нуклеазами.

 Схема метода MDR, использованная для тестирования эффективности-1

Рисунок 2. Схема метода MDR, использованная для тестирования эффективности обработки гетерогибридов МСН.

Для того, чтобы исследовать эффект от применения конкурирующей фракции ДНК, обогащенной геномными повторами, на процесс гибридизации и на качество итоговых библиотек, в некоторых экспериментах на стадии гибридизации добавляли 100-кратный избыток быстро реассоциирующей фракции геномной ДНК человека CotA, сильно обогащённой геномными повторами. На стадии (5) использовались две МСН: нуклеаза Surveyor, расщепляющая неспаренные участки в составе гетеродуплексов, а также нуклеаза Mung Bean, расщепляющая участки одноцепочечной ДНК, и, следовательно, способная атаковать петлевые структуры в составе химерных гибридов. Эксперименты проводили на ДНК млекопитающих, поскольку они относятся к одним из наиболее сложных геномов эукариот и дают чрезвычайно сложные гибридизационные смеси, гораздо более сложные, чем, например, ампликоны кДНК. Поэтому, в случае успеха для геномных ДНК млекопитающих, можно быть уверенными в применимости метода для более простых смесей (кДНК или геномы меньшей сложности). Проводили шесть различных гибридизаций при следующих условиях: (H1), две порции геномной ДНК человека гибридизовали при 65°C (T65) без добавления фракции CotA (CotA–) и без расщепления МСН (N–); (H2), ДНК человека и шимпанзе гибридизовали при T65, CotA–, N–; (H3), ДНК человека, T65, CotA+, N–; (H4), ДНК человека, T85, CotA+, N–; (H5), ДНК человека и шимпанзе, T65, CotA–, с добавлением нуклеазы Surveyor; (H6), ДНК человека, T65, CotA+, с добавлением нуклеазы Mung bean.

Получившиеся библиотеки клонировали в E.coli, и из каждой из них отсеквенировали по 50 вставок (всего 300 последовательностей). Для определения химерных клонов мы использовали следующие критерии: вся последовательность целиком не должна иметь гомологов в геномных базах данных, а её 5'- и 3'- концевые фрагменты должны идеально соответствовать геномным последовательностям. На рисунке 3 приведены результаты анализа полученных шести библиотек. Видно, что добавление фракции CotA и повышение гибридизационной температуры с 65 до 85°C практически не оказывают никакого эффекта на количество химерных клонов, в отличие от действия МСН. Как Mung bean, так и Surveyor показали мощный анти-химерный эффект, выразившийся в снижении их количества с 44–60% до 0–4% клонов.

Рисунок 3. Сравнение шести библиотек ДНК, полученных при разных условиях гибридизации без и с использованием МСН. H1, гибридизация ДНК человек-человек, 65°C (T65), без конкурентной фракции CotA (CotA-), без добавления МСН (N-); H2, ДНК человек-шимпанзе, T65, CotA-, N-; H3, ДНК человек-человек, T65, CotA добавлена (CotA+), N-; H4, ДНК человек-человек, T85, CotA+, N-; H5, ДНК человек-шимпанзе, T65, Cot A-, добавлена нуклеаза Surveyor; H6, ДНК человек-человек, T65, CotA+, добавлена нуклеаза Mung bean. (A) Высота цветных столбцов соответствует доле химерных клонов в полученных библиотеках. (Б) Высота столбцов соответствует доле клонов, содержащих последовательности геномных повторов.

Многие отсеквенированные вставки содержали геномные повторы, что неудивительно, поскольку повторы занимают порядка 50% ДНК млекопитающих. Повторяющиеся последовательности со 100% идентичностью могут соответствовать нескольким геномным локусам в ДНК хозяина, что существенно осложняет задачу их картирования. Поэтому часто встаёт задача минимизации содержания последовательностей повторов в библиотеках. В наших экспериментах получилось, что доля повторов значительно различалась в разных библиотеках: CotA– библиотеки содержали много повторяющихся последовательностей независимо от добавления МСН (87–93% всех отсеквенированных клонов), CotA+/N– библиотеки—несколько меньшую долю повторов (76–78%), тогда как CotA+/N+ библиотека (H6, с добавлением нуклеазы Mung bean) содержала всего 44% вставок с повторяющейся ДНК. Результаты свидетельствуют, что наилучшие результаты могут быть получены при конструировании библиотек с одновременным использованием МСН и конкурентных фракций вроде CotA.

1.2 Приложение MDR для поиска эволюционно консервативных последовательностей в геномах человека и обезьян

Нами было проведено исследование применимости метода MDR для межвидовой ДНК-гибридизации. Для этого, в двух гибридизационных экспериментах (H2 и H5) гибридизовались ДНК человека и шимпанзе. Геномы человека и шимпанзе являются наиболее близкородственными и показывают 98% идентичность нуклеотидной последовательности. Получилось, что использование MDR снизило количество химерных последовательностей с 44% практически до нуля. Все отсеквенированные вставки из библиотеки, обработанной нуклеазой Surveyor (H5), содержали последовательности, высоко консервативные для этих двух геномов (средняя идентичность 98.3%). Некоторые вставки содержали участки, эволюционно консервативные для всех отсеквенированных на тот момент (ноябрь 2004) геномов млекопитающих – человека, шимпанзе, мыши и крысы. Из этого следовало, что MDR можно применять для поиска эволюционно консервативных последовательностей в различных геномах. Для исследования этого предположения, мы провели ещё одну межвидовую гибридизацию (H7), между геномами человека и обезьяны Нового света мармозеткой Callithrix pygmaea, при 65°C, с обработкой нуклеазой Surveyor. Геном мармозетки гораздо сильнее дивергировал от генома человека, чем ДНК шимпанзе [предковые линии гоминид и обезьян Нового света разошлись около 45 миллионов лет назад], дивергенция в среднем составляет 20% последовательности ДНК. 71% вставок библиотеки содержал умеренно (14%) дивергировавшие повторяющиеся элементы, присутствующие как в геноме мармозетки, так и у человека. Оставшиеся 29% представляли уникальные последовательности.

Десять из них были консервативны среди геномов человека, шимпанзе, мыши и крысы, а три других были консервативны между ДНК человека и шимпанзе. Для того, чтобы подтвердить высокую степень консервативности этих последовательностей между человеком и мармозеткой экспериментально, была проведена ПЦР-амплификация и секвенирование соответствующих локусов для трёх таких последовательностей. Оказалось, что действительно все отсеквенированные локусы показывали высокую степень консервативности между геномами со средним значением межвидовой гомологии 95%, что говорит о примерно 4-кратном понижении средней скорости мутирования для этих локусов.

Представленные результаты убедительно свидетельствуют о том, что метод MDR может быть полезен для улучшения качества самых разных библиотек, получаемых при реассоциации ДНК, включая вычтенные или нормализованные геномные и кДНК-библиотеки. Хотя в наших экспериментах нуклеаза Surveyor оказалась более эффективной, чем Mung Bean, в других случаях последняя может быть также весьма полезна. В частности, обработка Mung Bean может помочь при гибридизации кДНК, когда образуется значительное количество несовершенных дуплексов при отжиге друг на друга в целом негомологичных последовательностей с похожими нуклеотидными мотивами. Поэтому, для рутинного применения можно рекомендовать смесь обеих нуклеаз. Метод также может значительно упростить решение задачи экспериментального поиска эволюционно консервативных последовательностей в несеквенированных геномах. Указанные особенности позволяют надеяться на широкую применимость метода для нужд молекулярной генетики.

2. Метод TGDA: вычитающая гибридизация участков, фланкирующих геномные повторы

Метод TGDA (от англ. Targeted Genomic Differences Analysis) разрабатывался совместно с Е.Д. Свердловым, Ю. Б. Лебедевым, С. В. Устюговой, К. В. Ходосевичем и И. З. Мамедовым. TGDA позволяет проводить полногеномный сравнительный анализ геномных повторов в ДНК изучаемых организмов.

Принцип метода. TGDA состоит из трёх основных стадий :

(1) Селективная амплификация последовательностей ДНК, фланкирующих повторяющиеся элементы в сравниваемых геномах, с использованием универсального праймера к последовательности повтора и при помощи эффекта “ПЦР-супрессии”.

(2) Обработка полученных ампликонов экзонуклеазой ExoIII для получения 5’-выступающих концов (эта стадия критична для всего процесса; она призвана убрать из ампликонов, полученных после (1) стадии, остающиеся в них последовательности мобильных элементов.

(3) Основанная на ПЦР вычитающая гибридизация (ВГ) обработанных ампликонов.

Для вычитания один из ампликонов (так называемый драйвер, англ. driver) берётся в значительном избытке над другим, называемым трейсер, англ. tracer. ВГ (подробно описана в литературном обзоре) позволяет напрямую идентифицировать последовательности (назовём их мишени), присутствующие в трейсере, но отсутствующие в драйвере.

Мы применили TGDA для поиска вставок мобильных элементов, специфичных для генома человека. Сейчас известны 5 таких семейств мобильных элементов, все они относятся к ретроэлементам. Это некоторые представители эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2), и ретропозонов LINE L1, Alu, SINE-R и SVA. Для проведения экспериментов мы выбрали два семейства ретротранспозонов: HERV-K (HML-2) и L1, которые, в отличие от остальных трёх семейств, обладают гораздо более сложной структурой и большим спектром потенциальных воздействий на функционирование генома. В качестве трейсера использовались ампликоны, полученные из ДНК человека, а в качестве драйвера – ампликоны, полученные из ДНК шимпанзе.

Для того, чтобы количественно охарактеризовать эффективность метода, мы нашли экспериментальное значение обогащения результирующей смеси по фланкам человек-специфичного (чс) LTR: определяли концентрацию фланкирующей последовательности известного чсLTR из локуса 19q13.2 (258) в исходном трейсере и в смеси, полученной в ходе ВГ. При этом, если метод TGDA работает, должно было происходить обогащение смеси по этой последовательности.

Действительно, в случае использования матрицы смеси после вычитания, видимый чс ПЦР продукт появлялся на 4 цикла раньше, чем в случае использования исходного трейсера, что свидетельствует о 16-кратном обогащении вычтенной библиотеки фланками чсLTR. Это значение хорошо согласуется с теоретически ожидаемым (~20-кратное обогащение), что свидетельствует о высокой эффективности метода.

Высокая специфичность селекции на первой стадии TGDA продемонстрирована определением первичной структуры вставок в случайно выбранных клонах полученной библиотеки. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты LTR.

Выводы о наличии или отсутствии индивидуальных LTR, выявленных с помощью TAGDА в соответствующих геномных локусах, делали на основании результатов ПЦР со специфическими праймерами, фланкирующими исследуемое внедрение ретроэлемента. При этом ДНК, содержащая LTR в соответствующем локусе, должна давать продукт примерно на 970 пн длиннее, чем продукт, полученный с матрицы, не содержащей LTR.

Всего нами было найдено в библиотеке 25 чс LTR, 23 из них были идентифицированы впервые. Полученная с помощью TGDA библиотека содержала 60% клонов, несущих вставки, специфичные для генома человека.

3. Метод Diffir: дифференциальная гибридизация фланков геномных повторов на фильтре

Альтернативный метод, названный «Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique » (DiffIR), был разработан для тех же целей, что и TGDA.. Его отличием является возможность исследовать специфичность интеграции повторов в формате чипа, в ходе гибридизации иммобилизованных на твердофазном носителе фланков исследуемого типа геномных повторов со сравниваемыми геномными ДНК. Метод был применён для того же объекта – семейства эндогенных ретровирусов человека HERV-K (HML-2), для поиска специфичных для генома человека интеграций этих ретроэлементов. Метод можно использовать для идентификации любых дифференциальных внедрений геномных повторов при сравнении близкородственных геномов. Принцип DiffIR – комбинирование селективной амплификации геномных фрагментов, фланкирующих исследуемую группу повторов, и дифференциальной гибридизации клонов полученных библиотек (метод детально описан в тексте диссертации).

При этом стадия селективной амплификации, включающая в себя фрагментацию геномной ДНК частощепящей эндонуклеазой рестрикции, лигирование супрессионных адапторов и nested ПЦР, идентична первому этапу TGDA. Получающиеся ампликоны клонируют в плазмидный вектор и анализируют при помощи дифференциальной гибридизации. Зондами для гибридизации служат те же ампликоны фланков геномных повторов, но полученные с использованием других супрессионных адапторов. Например, при поиске повторов, специфичных для генома человека, ДНК клонов, несущих вставки амплифицированных фланков повторов человека наносят на фильтр, а гибридизуют их с меченными ампликонами фланков человека и шимпанзе. Эти последние ампликоны получают с использованием других супрессионных адапторов – для того, чтобы одинаковые адапторные последовательности не вызывали «неспецифической» кросс-гибридизации клонов и зонда. Дифференциально гибридизующиеся клоны секвенируют и каким-либо независимым способом проверяют, действительно ли они уникальны для того или иного генома (например, при помощи локус-специфической ПЦР, как описано в предыдущем разделе).

В ходе модельного эксперимента была проанализирована лишь небольшая часть библиотеки. При этом отсеквенировали 40 как дифференциальных, так и недифференциальных клонов. Все они содержали ожидаемые фрагменты адапторов и действительно являлись фланками эндогенных ретровирусов исследуемого семейства. 22 из отсеквенированных 40 клонов были дифференциальными и гибридизовались с зондами на фланки ЭРВ человека, но не шимпанзе. Локус-специфическая ПЦР показала, что 16 из этих 22 клонов действительно соответствовали человек-специфичным ЭРВ. Таким образом, специфичность дифференциальной гибридизации была оценена как 73%. Наличие ложно-дифференциальных клонов (6 из 22) может быть связано с появлением или исчезновением рестриктных сайтов в одном из сравниваемых геномов (для фрагментации геномной ДНК используются рестриктазы) и, соответственно, с артефактной недопредставленностью некоторых локусов в анализируемых ампликонах.

4. Приложение методов TGDA и Diffir для молекулярной генетики человека

Работа выполнялась коллективом авторов, включавшим С. В. Устюгову, Е.В. Гогвадзе, К. В. Ходосевича, Ю. Б. Лебедева, Е.А. Ковальскую, Е.Д.Свердлова и А. А. Буздина. Химерные ретроэлементы грибов исследовались в сотрудничестве с Марк-Анри Лебраном и Кристель Барбизан из совместной лаборатории CNRS u фирмы Bayer (Лион, Франция).

4.1 Идентификация человек-специфичных инсерций эндогенных ретровирусов

Структурный анализ известных чс LTR. Проанализировав последовательности человек-специфичных LTR, найденные нами и другими авторами (всего 41 последовательность), мы обратили внимание, что все они, за исключением одного LTR, обладают значительной структурной гомологией и формируют один кластер на филогенетическом древе.

Основываясь на 40 последовательностях высоко гомологичных чс LTR, мы создали консенсусную последовательность (HS консенсус) для эволюционно молодого семейства HS. Эта последовательность содержит 9 характеристических нуклеотидных позиций (приведены в тексте диссертации). Проведённый поиск выявил в геномных базах данных 142 индивидуальные полноразмерные (длиной ~970 пн) последовательности, от 100 дo 97% идентичные HS консенсусу (приведены в Табл. 1 раздела Supplementary Material на web сайте http://humgen.siobc.ras.ru). Мы выбрали этот диапозон идентичности, поскольку степень взаимной идентичности среди 40 LTR, использованных для создания консенсуса, варьировала от 99.8 дo 97.6% со средним значением 98.1%. Единственный чс LTR из контига AC022567, который не мог быть отнесён к семейству HS (см. выше), не имел высокоподобных (более 97% идентичности) последовательностей в геномных базах данных.

Для того, чтобы найти частоты встречаемости характеристических нуклеотидных позиций HS консенсуса во всех членах HS семейства, а также в LTR, не являющихся членами группы HS, мы сделали множественное выравнивание найденных в этой работе 142 HS и 89 известных не-HS LTR (выравнивание помещено в разделе Supplementary Material на сайте http://humgen.siobc.ras.ru). Результаты показали, что 8 диагностических позиций консенсусной последовательности действительно являются уникальными характеристиками семейства HS.

Дальнейший анализ последовательностей представителей семейства HS позволил выделить в его составе два подсемейства, названные нами HS-a и HS-b, представленные, соответственно, 63% и 37% последовательностями LTR. Подсемейство HS-a высоко гомологично консенсусной последовательности HS и характеризуется внутригрупповой дивергенцией 1.5%, что соответствует возрасту 5.8 миллионов лет. Все LTR семейства HS-a, для которых это известно, являются специфичными для генома человека. Представители подсемейства HS-b несут 5 характеристических сцепленных однонуклеотидных замен в положениях 907, 909, 912, 921 и 950 консенсусной последовательности HS (дана в тексте диссертации).

Подсемейство HS-b эволюционно старше, чем HS-a, для него значение внутригрупповой дивергенции составляет 2.6%, соответственно, возраст 10.3 миллиона лет. По крайней мере 3 члена подсемейства HS-b не являются человек-специфичными, а присутствуют также в геноме шимпанзе.

По всей вероятности, материнские последовательности HS семейства возникли в геноме общего предка линий гориллы, шимпанзе и человека около 10.7 миллионов лет назад, дав группу HS-b. Эта группа, оставаясь активной, 5.8 миллионов лет назад, то есть примерно во время расхождения предковых линий человека и шимпанзе, в свою очередь, дала начало группе HS-a, которая на настоящий момент составляет большую часть (63%) всего семейства HS, по-видимому, в силу большей ретропозиционной активности. Интересно, что группа HS-a оказалась наиболее активной также и в геноме шимпанзе, как следует из результатов недавно проведённого группой Скотта Девина (Scott Devine) анализа шимпанзе-специфичных элементов.

Анализ чс LTR HERV-K (HML-2), картированных в интронах генов. С помощью сервера UCSC Browser (http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway), мы обнаружили 30 представителей семейства в интронах известных человеческих генов (Рис. 4).

 Распределение вставок человек-специфичных LTR в интронах генов.-3

Рисунок 4. Распределение вставок человек-специфичных LTR в интронах генов. Гены сгруппированы согласно функции своих продуктов (данные о представленности генов в различных группах для генома человека взяты с сайта http://www.geneontology.org/ компании Celera).

Было установлено, что LTR в интронах генов имеют неслучайную ориентацию: в 29 из 30 генов LTR направлен в сторону, противоположную направлению транскрипции гена.

Это может быть объяснено тем, что внедрение LTR, обладающих сильным сигналом терминации транскрипции, в интроны генов в прямой ориентации вызывало бы преждевременную терминацию транскрипции этих генов, и, как следствие, приводило бы к их инактивации. Поэтому аллели, несущие в интронах LTR в прямой ориентации, должны были неизбежно отбрасываться в ходе эволюции генома человека. Сохранение аллеля, содержащего LTR в прямой ориентации в интроне одного гена, возможно, связано с инактивацией терминатора этого LTR. Из рисунка 4 видно, что вставки чсLTR имеют тенденцию к избыточной представленности в интронах генов, кодирующих белки, участвующие во внутриклеточной передаче сигнала, а также среди генов белков, обладающих ферментативной активностью (~2-кратное отклонение от среднестатистического распределения). Такая «избирательность» эволюционно недавних внедрений LTR в интроны некоторых групп генов на настоящий момент остаётся необъяснённой. Избыточное содержание вставок в генах – участниках систем передачи сигнала может быть связано с регуляторной ролью этих систем и согласуется с моделью эволюции геномов, выдвинутой Кингом и Уилсоном, согласно которой основной движущей силой фенотипических изменений являются прежде всего изменения регуляторных систем организма. Также возможно, что наблюдаемая предпочтительность интеграции связана с наиболее активным функциональным статусом именно этих групп генов и, как следствие, с большей открытостью хроматина в соответствующих локусах.

4.2 Идентификация человек-специфичных вставок ретроэлементов L1

Следующим объектом, для которого был применён метод TGDA, стало семейство ретротранспозонов L1, содержащее чс элементы, а также около 50 до сих пор активных представителей в геноме человека. Как и в случае HERV-K(HML-2), искали чс интеграции ретроэлементов. Работа проводилась в 2002-2003 годах, когда в базах данных не содержалось информации по геному шимпанзе, и единственным способом поиска чс элементов являлся экспериментальный анализ.

Продукты ВГ клонировали в E. coli, затем секвенировали последовательности вставок из случайно отобранных клонов. Все вставки содержали ожидаемые фрагменты L1 семейств L1PA2 и L1Hs, что, как и в случае LTR HERV-K (HML-2), демонстрировало высокую селективность метода. Как и в случае LTR HERV-K(HML-2), с целью определения специфичности данных L1 для генома человека, проводился ПЦР-анализ со специфичными геномными праймерами, фланкирующими интеграцию ретроэлемента. Из 29 отобранных клонов видоспецифичность интеграции определили для 26 последовательностей, 24 из них были чс, а 2 клона содержались также в геноме шимпанзе. Это говорит о том, что чс (целевые) последовательности содержатся приблизительно в 92% клонов библиотеки.

Все найденные в данной работе чс L1 принадлежали к группам L1PA2 и L1Hs. Лишь небольшая часть (26%) этих чс L1 принадлежала к группе Ta, которая известна как единственная транспозиционно активная в настоящее время группа L1. В этой работе нами было найдено внедрение L1, принадлежащего к группе L1PA2, которое является полиморфным в человеческой популяции. Следовательно, (i) по крайней мере два семейства L1 были активны в предковой линии человека после расхождения её с предковой линией шимпанзе и (ii) при поиске полиморфных интеграций L1 не следует ограничивать поиск группой L1 Ta. Один чс L1 являлся представителем открытого в данной работе химерного семейства ретроэлементов U6-L1, детально описанного в заключительном разделе. К сожалению, количество найденных в интронах генов чс L1 было мало, что не дало возможности проанализировать распределение вставок по функциональным группам генов.

5. Анализ транскрипционной активности геномных повторов

Работа по этому проекту выполнялась группой, включающей Е.В.Гогвадзе, Е.А.Ковальскую-Александрову, Т.В.Чалую, Е.Д.Свердлова, А.А.Буздина.

В нашей группе был разработан метод, названный GREM (Genomic Repeat Expression Monitor), основанный на гибридизации тотальных пулов 5’-концевых частей кДНК с полногеномными пулами ДНК, фланкирующей повторяющиеся элементы, с последующей селективной ПЦР амплификацией получающихся гибридных дуплексов геномной ДНК и кДНК. Библиотека гибридных молекул кДНК\геномной ДНК, полученная таким образом, может использоваться как набор маркеров для индивидуальных транскрипционно активных повторов. Метод является как качественным, так и количественным, поскольку частота встречаемости тех или иных маркёров пропорциональна промоторным активностям соответствующих им повторяющихся элементов.

Мы применили GREM для полногеномной идентификации промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека (чсЭРВ). Как указано выше, HERV-K (HML-2) - единственное семейство эндогенных ретровирусов, содержащее членов, уникальных для генома человека. Основная часть ЭРВ претерпела гомологичную рекомбинацию по последовательностям своих LTR, так что в настоящее время это семейство представлено, в основном, одиночными LTR. LTR обладают значительным сходством первичной структуры и образуют отдельное семейство (названное HS). Ниже дано описание метода GREM и результатов, полученных при помощи этого экспериментального подхода для характеристики транскрипционной активности чсЭРВ in vivo.

5.1 Метод GREM: полногеномный поиск промоторно-активных повторов

Особенности метода GREM. GREM (Genomic Repeat Expression Monitor) является единственным на сегодняшний день полно-транскриптомным подходом, позволяющим детально исследовать собственную промоторную активность повторяющихся элементов и отбросить фон «сквозной» транскрипции через последовательность повтора. Получаемая при помощи GREM клонотека может использоваться как набор маркёров индивидуальных транскрипционно активных повторяющихся элементов. GREM объединяет преимущества метода 5’ RACE и гибридизации нуклеиновых кислот. Метод основан на том, что промоторно-активные геномные повторы инициируют транскрипцию со своих собственных внутренних последовательностей, так что соответствующие транскрипты содержат фрагмент последовательности повтора на своих 5’-концах. Это выполняется для всех основных классов ретроэлементов: LTR-содержащих, LINE и SINE. Поэтому мы старались специфично выделить фракцию транскриптов, содержащих последовательность повтора на 5’ конце. Было показано, что количество индивидуальных маркёров в библиотеке пропорционально содержанию мРНК, считываемой с соответствующего промоторно активного повтора. В наших модельных экспериментах, GREM использовался для полногеномного исследования особенностей транскрипционной активности LTR семейства HS в клетках зародышевого пути человека (паренхима яичка) и в соответствующем злокачественном новообразовании (семинома).

Транскрипция LTR полноразмерного провируса может приводить к образованию двух видов продуктов: РНК вирусных генов (если инициируется на 5’ LTR, см. Рис.5), либо, в случае промоторной активности 3’ LTR, РНК уникальных не-вирусных последовательностей, которые фланкируют провирус с 3’ конца.

Рис. 5. Схема транскрипционной активности одиночных (слева) и провирусных (справа) LTR. Транскрипция с провирусного 5’ LTR даёт РНК вирусных генов, тогда как экспрессия одиночных или 3’ провирусных LTR приводит к транскрипции геномных последовательностей хозяина, фланкирующих 3’ конец ретроэлемента.

Метод GREM, детально описанный в тексте диссертации, состоит из трёх основных стадий: (1) синтез полноразмерной библиотеки кДНК, молекулы которой несут специфическую маркёную последовательность, введённую на 5’ конец кДНК, (2) селективная ПЦР-амплификация геномных последовательностей, фланкирующих повтор, и (3) гибридизация кДНК и фрагментов, фланкирующих повторы, с последующей ПЦР-амплификацией гетеродуплексов геномной ДНК\кДНК.

Первая стадия GREM нацелена на амплификацию полноразмерных молекул кДНК, маркированных с 5’ конца введённой последовательностью адапторного олигонуклеотида. Такое мечение достигается благодаря применению эффекта “cap-switch” в ходе синтеза кДНК. Достигнув 5’ конца мРНК-матрицы, олиго(dT)-праймированная ревертаза нематрично добавляет несколько добавочных дезоксицитидиновых нуклеотидов на 3' конец кДНК. При этом олигонуклеотид, содержащий олиго-рибо(G) последовательность на 3' конце, гибридизуется на дезоксицитидиновый трэк, что образует праймер, позволяющий ревертазе сменить матрицу и дополнительно досинтезировать на 3’ конец первой цепи кДНК последовательность адаптора. Этот подход позволяет достаточно точно помечать 5’-концы кДНК, соответствующие точкам старта транскрипции (Рис. 6). Затем на матрице первых цепей получают вторые цепи кДНК.

На второй стадии проводилась селективная ПЦР-амплификация геномных локусов, фланкирующих 3’ концы HS LTR. Гибридизация кДНК с получаемым ампликоном используется для селекции именно тех молекул кДНК, которые содержат последовательность HS LTRs на 5’ конце. Амплификация геномных фланков – это критически важный шаг, обеспечивающий специфичность всей процедуры в целом.

На последней стадии, кДНК гибридизуется с 3’-геномными фланками LTR. Для того, чтобы селективно амплифицировать гетеродуплексы, содержащие как геномные фланки LTR, так и 5’ концевые фрагменты кДНК, образованных благодаря промоторной активности LTR, мы проводили ПЦР с праймером на 5’маркёрную последовательность в составе кДНК и праймер, специфичный для адаптора, лигированного к геномной ДНК.

В результате амплифицировались только целевые гетеродуплексы.

Полученные в ходе последней амплификации гетеродуплексы, названные Expressed LTR Tags (ELT), далее клонировали и секвенировали. Каждый ELT содержал 3’-концевой фрагмент HS LTR, участок 3’ –фланкирующей геномной ДНК, а также адапторную последовательность.

Детекция промоторной активности HS LTR при помощи GREM.

Анализ последовательностей ELT позволял однозначно картировать соответствующие им одиночные и 3’ провирусные LTR. Однако же, картирование невозможно в случае провирусных 5’ LTR, поскольку транскрибируемые с них провирусные последовательности многократно повторены в геноме и обладают высокой степенью идентичности (Рис. 5). Результаты анализа библиотек ELT, полученные для двух тканей: паренхимы яичка и семиномы, а также созданная на их основе первая в мире карта промоторно активных геномных повторов семейства HS LTR, представлены в следующем разделе. Для пяти случайно отобранных одиночных LTR, обладающих промоторной активностью согласно данным GREM, нам удалось при помощи метода 5’RACE с точностью до нуклеотида картировать точку начала транскрипции (Рис. 6). Во всех случаях, транскрипция инициировалась с одного и того же неканонического промотора, расположенного на границе участков R и U5 последовательности HS LTR.

Рисунок 6. Картирование точки начала транскрипции в составе последовательнсти LTR. A), картирование 5’-концевых частей кДНК, полученных в ходе ПЦР с праймером CS на 5’ конец кДНК и с уникальными геномными праймерами G, на консенсусной последовательности семейства HS группы LTR HERV-K (HML-2). Последовательности потенциальных регуляторных участков даны курсивом. Б), схема ОТ-ПЦР-подхода к определению провирусной точки инициации транскрипции в составе LTR transcription. LTRfor3 и LTRfor4 –это LTR-специфичные праймеры на участки ниже и выше картированной точки начала транскрипции у одиночных LTR, соответственно. Gag – праймер, специфичный для вирусного гена gag. В), выравнивание фрагмента LTR длиной ~300 пн, который обладал промоторной активностью в экспериментах с экспрессией репортёрного гена, и консенсусной последовательности HS HERV-K LTR.

Транскрипционный уровень LTR линейно коррелирует с представленностью соответствующих ELT. Для исследования зависимости между представленностью ELT в библиотеках и транскрипционной активностью LTR, проводили ОТ-ПЦР с парами праймеров, один из которых, направленный наружу от LTR, был специфичным к 3’ концевому участку LTR, а второй – к уникальному геномному локусу, лежащему ниже 3’-конца LTR. Уровень транскрипции измеряли относительно гена бета-актина. Для выборки из 20 протестированных HS LTR, частоты встречаемости ELT в библиотеках линейно коррелировали с уровнем соответствующих им транскриптов, измеренным при помощи ОТ-ПЦР для обеих тканей, со значениями коэффициента корреляции 0.91 и 0.89 для паренхимы яичка и семиномы, соответственно. Это свидетельствует об адекватности метода GREM задаче одновременного качественного и количественного анализа промоторной активности исследуемой группы повторов.

5.2. Приложение GREM для поиска промоторно-активных эндогенных ретровирусов, специфичных для ДНК человека

Метод GREM использовали для создания библиотек ELT нормальной паренхимы яичка и соответствующей опухоли, семиномы. Биологические образцы брались от одного и того же пациента, так что распределение ELT между библиотеками отражает ткане- и опухоль-специфичность экспрессии чсЭРВ. Для каждой ткани было отсеквенировано 500 клонов ELT. За вычетом плазмидных перестроек и плохо отсеквенированных последовательностей, осталось 395 и 419 ELT для паренхимы и семиномы, соответственно. Анализ ELT позволил нам однозначно картировать промоторно активные одиночные и 3’-провирусные LTR.

Впервые было проведено полногеномное сравнение in vivo-промоторной активности специфичных для генома человека эндогенных ретровирусов в нормальной и опухолевой тканях. Оказалось, что по крайней мере 50% HS элементов обладают промоторной активностью. Индивидуальные LTR экспрессировались на уровне от ~0.001 до ~3% относительно транскрипции гена бета-актина (Рис. 7). Не наблюдалось связи между особенностями первичной структуры HS элементов и их транскрипционной активностью. И наоборот, функциональный статус LTR (одиночный, 5’ или 3’ провирусный) был одним из важнейших факторов: промоторные силы одиночных и 3’ провирусных LTR были почти идентичны в обеих тканях, тогда как 5’ провирусные LTR показали более сильную промоторную активность (вдвое и впятеро для паренхимы и семиномы, соответственно; Рис.8). Это свидетельствует о наличии в провирусной последовательности некоторых пока не известных регуляторных элементов.

Рисунок 7. Сравнение относительных уровней транскрипции некоторых генов человека и LTR. Относительные уровни транскрипции определяли при помощи ОТ-ПЦР, относительно уровня гена бета-актина (обозначен как 100%). A, паренхима яичка; Б, семинома.

Кроме того, важнейший фактор, влияющий на промоторную активность LTR - это расстояние от генов. Относительное содержание промоторно активных LTR в ген-богатых локусах значительно выше, чем в локусах, обеднённых генами.

Данные также свидетельствуют в пользу селективного подавления транскрипции 3’ провирусных LTR, расположенных в интронах генов. Такая транскрипционная супрессия может быть нацелена на подавление активности провирусных генов, расположенных вблизи генов хозяина. Также в паренхиме яичка наблюдалось существенное понижение промоторной силы одиночных LTR в интронах генов. Это может свидетельствовать о существовании пока неустановленных механизмов подавления активности “лишних” промоторов, созданных мутациями или вирусными вставками, и расположенными вблизи генов или в интронах. Такой механизм может минимизировать деструктивный эффект «незапланированных» транскриптов – например, образование антисмысловых РНК. Многие транскрипционно компетентные LTR были картированы вблизи известных генов, и 86-90% этих генов транскрибируются в яичках. При этом не было выявлено никакой корреляции между уровнем транскрипции генов и соответствующих им LTR.

 Сравнение относительной промоторной силы одиночных, 5’ провирусных-7

Рисунок 8. Сравнение относительной промоторной силы одиночных, 5’ провирусных и 3’ провирусных LTR (на один LTR). Серые и чёрные столбцы представляют относительные промоторные силы LTR указанных типов в паренхиме яичка и в семиноме, соответственно.

Таким образом, было проведено первое исчерпывающее качественное и количественное исследование промоторов человека, предоставленных небольшой группой эндогенных ретровирусов. Конечно, подавляющее большинство ретровирусных последовательностей, занимающих около 8% генома человека, ещё только предстоит исследовать. Но оптимизм внушает то, что разработанная методология вполне позволяет это сделать при наличии необходимых (достаточно скромных) временных и материальных ресурсов.

Детальные результаты картирования и анализа ELT, а также вся имеющаяся на сегодняшний день (31.12.2007) информация по структуре и функциональному статусу соответствующих HS LTR, содержатся в сводной таблице, доступной в Интернет по адресу:

http://www.thescientificworld.com/supplements/2007.270/Buzdin_031307_SuppTable1.xls

5.3. Антисмысловая регуляция экспрессии генов молекулами РНК, транскрибируемыми с промоторов чс эндогенных ретровирусов

Работа проводилась Е.В.Гогвадзе, Е.А.Стукачёвой, Е.Д.Свердловым и А.Буздиным.

На первом этапе работы были проанализированы все человек-специфические ретроэлементы HERV-K (HML-2) и для дальнейшего анализа были отобраны все LTR (13 индивидуальных ретроэлементов), расположенные в интронах известных генов человека в противоположной направлению транскрипции данного гена ориентации и удаленные от ближайшего экзона не более, чем на 5 т.п.н. (рис. 9)

Для каждого из исследуемых локусов были дизайнированы праймеры на экзоны, фланкирующие LTR (Gfor и Grev, рис. 9), а также праймер на 3’- и 5’ - концевую часть LTR. Праймеры Gfor+Grev применяли для определения уровня транскрипции гена, а Gfor+LTRfor и Gfor+LTRfor2 - для определения уровня транскрипции LTR, расположенного в интроне анализируемого гена. В качестве матрицы для ПЦР использовали первые цепи кДНК, синтезированные с помощью олиго(dT)-праймера на суммарной РНК нормальной паренхимы яичка человека и герминогенной опухоли – семиномы. Методом ОТ-ПЦР с праймерами Gfor+Grev и Gfor+LTRfor был определен уровень транскрипции исследуемых генов, а также уровень транскрипции LTR, находящегося в интроне. В результате было отобрано 9 LTR, для которых было показано, что они транскрибируются в исследуемых тканях.

Однако для того, чтобы понять, действительно ли транскрипция начинается внутри LTR, необходимо было найти 5’-конец образующейся РНК. Для этого был применен метод 5’- RACE (Rapid Amplification of cDNA ends). Схема метода и полученные результаты представлены на рисунке 10.

Для всех LTR, транскрибирующихся в нормальной паренхиме и семиноме, было проведено два раунда ПЦР с праймерами на 5’- адапторную последовательность кДНК и на ближайший к LTR экзон. В результате продукт был получен только в случае LTR, расположенного между 23 и 24 экзонами гена SLB (selective LIM binding factor, rat homolog; AC074117) и между 5 и 6 экзонами гена SLC (solute carrier family 4; AC027750). Эти продукты были отсеквенированы и оказалось, что точка начала транскрипции находится внутри LTR на границе R и U5 областей (826 нуклеотид консенсусной последовательности человек-специфического LTR), что совпадает с полученными нами ранее данными о точке начала транскрипции LTR семейства HERV-K. Таким образом, было показано, что из 13 человек-специфических LTR, расположенных в интронах известных генов в противоположной направлению транскрипции гена ориентации и удаленных от ближайшего экзона не более чем на 5 т.п.н., только 2 служат промоторами для транскриптов, перекрывающихся с экзонами клеточного гена. В дальнейшем проводился анализ только двух данных локусов.

Для более полной характеристики этих двух случаев был определен уровень транскрипции генов SLB и SLC, а также находящихся в них LTR для еще десяти тканей человека: скелетной мышцы, печени, сердца, легкого (нормы и опухоли), гиппокампа и эмбриональных тканей мозга (лобной доли, затылочной коры, базальных ядер и гипоталамуса). Транскрипционная активность LTR, находящегося в интроне гена SLC, была показана только для нормальной паренхимы яичка, семиномы и эмбриональных затылочной коры, гипоталамуса и лобной доли. Причем во всех случаях уровень транскрипции LTR был ниже уровня транскрипции гена.

Транскрипт LTR, находящегося между 23 и 24 экзонами гена SLB, был найден во всех проанализированных тканях кроме нормальной ткани легкого. В большинстве случаев, как и для LTR в гене SLC, уровень транскрипции LTR оказался в 4-8 раз ниже уровня транскрипции гена (эмбриональные лобная доля и гипоталамус, печень, лёгкое (опухоль) и гиппокамп). В случае эмбриональных базальных ядер и затылочной коры LTR и ген транскрибируются на одном уровне. Для скелетной мышцы, сердца, паренхимы яичка и семиномы был показан более высокий уровень транскрипции LTR по сравнению с геном. Особого интереса заслуживает нормальная паренхима яичка, в которой LTR транскрибируется в 16 раз интенсивнее гена.

Для доказательства того, что во всех случаях мы имеем дело именно с транскриптами, комплементарными РНК гена, был проведен синтез первых цепей кДНК с праймером, избирательно связывающимся с антисмысловыми к гену РНК. После этого была поставлена ОТ-ПЦР с праймерами LTRfor и Gfor. Во всех случаях ПЦР-продукт получался на тех же циклах, как и при амплификации кДНК, синтезированной с oligo(dT)-праймером. Следовательно, найденные нами ранее транскрипты LTR действительно являются антисмысловыми к гену. А для доказательства того, что транскрипция антисмысловых РНК начинается внутри LTR, были поставлены ОТ-ПЦР с праймерами на 5’- конец LTR (LTRfor2) и на экзон анализируемого гена (Gfor). В большинстве случаев продукт не детектировался или же появлялся на значительно более поздних циклах, из чего следует, что промотором для антисмысловых транскриптов в этих случаях действительно служит 3’-конец LTR.

После этого была предпринята попытка определить 3’-конец транскриптов, начинающихся в LTR, расположенных в интронах генов SLB и SLC. Нам не удалось получить необходимые результаты с помощью метода 3’-RACE, поэтому мы решили провести ОТ-ПЦР с праймером на 3’-конец LTR и серией праймеров, постепенно удаляющихся от LTR.

В результате серии ОТ-ПЦР было показано, что в случае гена SLB существует, по крайней мере, 2 типа транскриптов: один включает в себя только экзон 23 (транскрипт 1), а второй – экзоны 23 и 22 (транскрипт 2) (рис. 11). Интересно отметить, что «длинный» транскрипт был найден только в нормальной паренхиме яичка, для которой была показана значительно большая активность LTR по сравнению с геном. В случае гена SLC 3’-конец транскрипта найден не был, но было определено, что весь экзон 5 входит в его состав (транскрипт 3).

На следующем этапе работы необходимо было определить, могут ли найденные транскрипты оказывать влияние на экспрессию соответствующих клеточных генов. Для этого предполагалось получить клеточные линии, стабильно экспрессирующие изучаемые транскрипты, и посмотреть, изменяется ли в этих клетках уровень транскрипции генов SLB и SLC.

Нами был проведен скрининг 8 клеточных линий человека и для дальнейшего анализа были отобраны линии Tera-1 и NGP127, для которых был показан наиболее высокий уровень транскрипции генов SLB и SLC.

На основе плазмиды pcDNA3.1 Hygro- были созданы три конструкции, каждая из которых содержала под контролем конститутивного цитомегаловирусного промотора (Pcmv) участок ДНК, соответствующий найденным в работе LTR-транскриптам (рис 12). Этими конструкциями были трансфицированы клетки Tera-1 и NGP127 и в результате получены клеточные линии, стабильно экспрессирующие интересующие нас транскрипты. Для каждой клеточной линии было проведено четыре трансфекции: 3 опытные (плазмидами, содержащими вставку соответствующего транскрипта) и 1 контрольная (плазмидой без вставки).

В результате опытов по трансфекции, мы получили 4 линии клеток NGP127 (NGP127-1 – клетки, стабильно экспрессирующие транскрипт 1, NGP127-2 – стабильно экспрессирующие транскрипт 2, NGP127-3 – стабильно экспрессирющие транскрипт 3 и NGP127-К – контрольные клетки, транфицированные плазмидой без вставки) и 4 линии клеток Tera-1 (Tera1-1-3 – стабильно экспрессирующие транскрипты 1-3, соответственно) и Tera1-K (контрольные клетки). Из всех клеточных линий была выделена РНК, методом ОТ-ПЦР показана эксперессия изучаемых LTR-транскриптов в полученных линиях клеток и определён её уровень, после чего проводили ОТ-ПЦР в реальном времени для определения уровня экспрессии генов SLB и SLC. Результаты ПЦР представлены в таблице 1.

Таблица 1. Уровень транскрипции генов SLB и SLC в клеточных линиях NGP127 и Tera1, стабильно экспрессирующих антисмысловые к гену транскрипты.

Клеточная линия Уровень транскрипции генов SLB и SLC относительно -актина, % х10-4
Tera1 (SLB РНК)
Tera1-3 1,31±0.37
Tera1-К 3,74±0.56
Tera1 (SLB РНК)
Tera1-1 2.21±0.24
Tera1-2 1,50±0.48
Tera1-К 5.75±1.39

В случае клеточной линии NGP не было выявлено статистически достоверного изменения уровня транскрипции генов SLB и SLC в опытных клетках по сравнению с контрольными. В данных клетках антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR не регулируют транскрипцию соответствующих клеточных генов. Возможно, это связано с нарушением процессов РНК-интерференции в данной клеточной линии. В случае же линии Tera1 было показано уменьшение количества РНК SLB в клетках, экспрессирующих транскрипт 1 (транскрипт, включающий только экзон 23 гена SLB) в 2,6 раза по сравнению с контрольными клетками (Pvalue<0,01), а также снижение уровня мРНК гена SLC в клетках, экспрессирующих транскрипты 2 и 3, в 2,5 и в 2,9 раз, соответственно.

Таким образом, можно сделать вывод, что антисмысловые РНК, образованные с промотора LTR, могут уменьшать уровень транскрипции соответствующего клеточного гена (как было показано для клеток Tera-1).

6. Новое семейство химерных ретроэлементов эукариот

Неожиданным результатом анализа библиотеки чс внедрений L1 стало открытие нового семейства ретроэлементов, образованных при происходящей in vivo РНК-рекомбинации в ходе обратной транскрипции. Упомянутый механизм образования ретроэлементов впервые предложен в ходе данной работы.

В ходе анализа полученной с помощью TGDA библиотеки чс L1-фланкирующих последовательностей, был найден клон, соответствовавший внедрению ретроэлемента необычной структуры. Последовательность вставки была гомологична геномной ДНК человека хромосомного локуса 10p13 (код доступа в GenBank AL138764). Ретроэлемент представлял собой химеру полной копии U6 малой ядерной (мя) РНК с 3’-концевой частью L1. Её 5'-часть является полноразмерной последовательностью U6 мяРНК длиной 107 пн, 100% идентичная консенсусной последовательности человеческой U6 (взята из базы данных RepBase Update, http://www.girinst.org/server/RepBase/). Сразу за U6 следует 3'- концевая последовательность элемента L1 семейства L1Hs в прямой ориентации длиной 1324 пн. На своём 3'- конце эта последовательность несёт поли-А “хвост” длиной 40 пн. Химерный ретротранскрипт фланкирован прямыми повторами длиной 20 пн. Гексануклеотид TTAAAA, расположенный на 22 пн выше сайта интеграции U6-L1, идентичен последовательности T2A4, которую предпочтительно узнаёт эндонуклеаза L1 (L1-EN), инициирующая интеграцию L1 копий в соответствующие сайты генома.

Предпринятый поиск в геномных базах данных человека выявил 56 химерных ретротранскрипта, сходных с вышеупомянутым. Все химеры U6-3’-L1 фланкированы прямыми повторами длиной 11–21 пн, что свидетельствует об интеграции химеры как единой последовательности. Все они имели рядом со своими 5’- концами либо гексануклеотид TTAAAA, либо его производные с однонуклеотидными заменами A/G либо T/C. Перечисленные выше особенности сайтов интеграции химер свидетельствуют о том, что их внедрения в геном были произведены интеграционным аппаратом ретротранспозонов L1.

Образование химер происходило вплоть до самого недавнего времени в эволюционной истории человека, поскольку некоторые интеграции U6-L1 уникальны для генома человека. Кроме того, по крайней мере одна интеграция химеры U6-L1 является полиморфной в человеческой популяции.

Другие химерные ретроэлементы. Для того, чтобы понять, является ли случай U6-L1 уникальным примером, мы провели анализ геномных баз данных с целью поиска новых химер, образованных фрагментами других псевдогенов. Для этого в геноме человека были идентифицированы 735 псевдогенов наиболее часто встречающихся типов, дивергировавшие от своих консенсусных последовательностей от 0 до 10%, и для них был проведён детальный структурный анализ.

Было установлено, что химерные ретротранскрипты, напоминающие U6-L1, могут образовываться и из других транскрибируемых компонентов генома. Затем поиск химерных ретроэлементов провели для всех опубликованных геномных последовательностей. При этом двухчастные структуры, аналогичные вышеописанным (Рис. 13), обнаружили во всех геномах млекопитающих, а также в геноме одного паразитического нитчатого гриба: в сумме в ДНК человека, мыши, крысы и гриба Magnaporthe grisea нашли 82, 116, 66 и 31 химеру, соответственно (Табл. 2). Химеры состоят из ДНК копий клеточных транскриптов, либо непосредственно объединённых друг с другом, либо, чаще, объединённых с 3’-концевой частью ретроэлементов, относящихся к LINE (например, L1). Клеточные транскрипты, соответствующие химерам, относятся к мРНК белок-кодирующих генов, рибосомным РНК, малым ядерным РНК, а также 7SL RNA (Табл. 2).

 Схема двухчастных химерных ретроэлементов, найденных в геномах-12

Рисунок 13. Схема двухчастных химерных ретроэлементов, найденных в геномах эукариот. Вставки в геномах млекопитающих расположены ниже мотива TTAAAA. Вставки в геномах млекопитающих и гриба содержат поли (А) последовательность или А-богатый микросателлит и фланкированы прямыми повторами геномной ДНК длиной 10-25 пар нуклеотидов.

Таблица 2. Сопоставление 5'- и 3'-концевых частей химерных ретроэлементов млекопитающих с известными последовательностями РНК.

Типa Количество и доляb Функцияc Локализация РНКd
Человек Мышь Крыса
5’ –концевые части
U6 66 (82%) 111 (95%) 61 (93%) мяРНК, сплайсинг Ядрышко, ядро
U5 1 (1%) 0 0 мяРНК, сплайсинг Ядрышко, ядро
U3 8 (10%) 2 (2%) 1 (1%) мяРНК, процессинг рРНК Ядрышко
5S рРНК 3 (4%) 3 (3%) 4 (6%) Рибосомная РНК Ядрышко, цитоплазма
7 SL 1 (1%) 0 0 SRP, сортинг белков Ядрышко, цитоплазма
Alu 2 (2%) 0 0 Эгоистичная РНК Ядрышко, ядро, цитоплазма
3’ –концевые части
L1 65 (80%) 103 (88%) 54 (82%) Эгоистичная мРНК Цитоплазма, ядро
мРНК 9 (11%) 9 (8%) 5 (8%) мРНК генов Цитоплазма
Alu 7 (9%) 0 0 Эгоистичная РНК Цитоплазма, ядро, ядрышко
B1_Mm 0 2 (2%) 0 Эгоистичная РНК Цитоплазма, ядро
B2_Mm1 0 1 (1%) 0 Эгоистичная РНК Цитоплазма, ядро
B2_Mm2 0 1 (1%) 1 (1%) Эгоистичная РНК Цитоплазма, ядро
ID_Rn 0 0 5 (8%) Эгоистичная РНК Цитоплазма, ядро
4,5S РНК 0 0 1 (1%) Рибосомная РНК Цитоплазма, ядро

aНазвания клеточных транскриптов, соответствующих данной части химеры. Компоненты химер из генома гриба M. grisea не указаны, поскольку функция и локализация РНК WEIRD остаются неизвестными.

bКоличество и доля последовательностей данного типа среди химер.

cФункция соответствующих РНК в клетке.

Для химер характерны следующие общие свойства: (1) их 5’-концевые части являются полноразмерными копиями клеточных РНК; (2) 3’-части химер – это 5’-укороченные копии соответствующих РНК (в основном LINE); (3) обе части объединены в одной и той же ориентации относительно направления транскрипции; (4) химеры несут поли (A) хвост или А-богатый микросателлит на 3’ конце, (5) химеры фланкированы короткими прямыми повторами геномной ДНК пре-интеграционного сайта.

Последняя особенность подчёркивает, что эти элементы внедрялись в геном уже в виде двухчастных ДНК-копий. Все химеры млекопитающих несли выше 5' конца гексануклеотид T2A4 или его варианты, что соответствует последовательности T2A4. Одновременность интеграций обеих частей химер была затем подтверждена в ходе экспериментов, основанных на исследовании эволюционного инсерционного полиморфизма.

Важно отметить, что создающий химеры механизм часто объединяет функциональные копии клеточных транскриптов, часто не имеющих ничего общего с мобильными элементами. Многие химеры можно рассматривать как новые гены, поскольку они транскрибируются, причём некоторые из них – тканеспецифически.

По-видимому, все химерные ретроэлементы были созданы по механизму, включающему смену матрицы при обратной транскрипции. Хотя основной энзиматической активностью обратной транскриптазы (ОТ) является синтез кДНК на неизменной матрице РНК, ОТ также способна к смене матриц в ходе обратной транскрипции. Например, известно, что «прыжки» ОТ ретровирусов с одного сайта матричной РНК на другой необходимы для образования LTR.

Вцелом, данные анализа геномов, эволюционных исследований, а также экспериментальные доказательства, убедительно свидетельствуют, что смена РНК-матриц может проходить в ходе обратной транскрипции LINE. Нам удалось найти соответствующие химеры во всех геномах млекопитающих, но не в ДНК амфибий, рыб и беспозвоночных. Однако же, химерные элементы были найдены в геноме гриба-паразита риса Magnaporthe grisea, что говорит о консервативности этого механизма среди представителей царств животных и грибов.

Некоторые особенности химерных ретроэлементов грибов

Семейство химерных ретроэлементов MINE было найдено в геноме гриба Magnaporthe grisea. 5’-концевые части MINE соответствуют полноразмерной копии некодирующего транскрипта неизвестной функции длиной 1.1 тпн, называемого WEIRD. 3’ –концевая часть MINE соответствует 5’-укороченым копиям MGL LINE грибов. Инсерция одной копии MINE произошла буквально на глазах у исследователей, так что механизм образования химер у грибов активен и в настоящее время. Систематический анализ геномных баз данных выявил для M. grisea 31 такой химерный ретроэлемент.

Функция РНК WEIRD пока остаётся неизвестной. В серии экспериментов по гибридизации in situ с зондами, специфичными для WEIRD, внутриклеточную локализацию WEIRD установить нам не удалось из-за чрезвычайно низкой проницаемости клеточной стенки M. grisea. При этом при помощи количественной ОТ-ПЦР был показан высокий уровень экспрессии WEIRD относительно двух генов домашнего хозяйства на всех стадиях жизненного цикла гриба. Содержание WEIRD в клетках сравнимо с РНК гена домашнего хозяйства Ilv5 (35, 20 и 61% от уровня транскрипции Ilv5 на различных стадиях). WEIRD экспрессируется дифференциально, причём повышенный уровень её содержания показан при инфекции гриба в растение (2-кратное превышение относительно содержания WEIRD в мицелии). В то же время, ретротранспозон MGL транскрипционно более активен в спорах гриба.

Биоинформатический анализ показал, что WEIRD не является мобильным элементом, поскольку все геномные копии этой РНК были объединены с MGL LINE в составе химерных ретроэлементов. Одиночных копий WEIRD найдено не было. Отсутствие исходного гена WEIRD в базах данных, по-видимому, связано с незавершённостью проекта по секвенированию генома M. grisea. В других геномах также не было найдено последовательностей, гомологичных WEIRD.

Таким образом, WEIRD (1) не является мобильным элементом, (2) экспрессируется на всех стадиях жизненного цикла и (3) не кодирует белок. Это позволяет предположить, что WEIRD может являться функциональной конститутивной некодирующей РНК.

Помимо 31 MINE, в геноме M. grisea был найден также новый двухчастный химерный элемент, состоящий из копии WEIRD, объединённой с 5’-укороченным ретротранспозоном Mg-SINE. Химера WEIRD-MgSINE фланкирована прямыми повторами длиной 12 пар нуклеотидов. Mg-SINE – это неавтономный ретроэлемент, относящийся к группе SINE. Для размножения в геноме он использует стратегию “молекулярной мимикрии” относительно последовательности MGL. 3’ конец Mg-SINE гомологичен 3’ концевому фрагменту MGL, который используется для праймирования обратной транскрипции. По-видимому, это свойство Mg-SINE обуславливает его узнавание ретропозиционным аппаратом MGL.

Кроме того, нам удалось обнаружить химерный элемент, состоящий из трёх частей (Рис. 14). На 5’ конце располагалась полноразмерная копия WEIRD, объединённая с 5’-укороченным Mg-SINE, который, в свою очередь, был объединён с 5’-укороченным MGL. Химера фланкирована прямыми повторами длиной 14 пар нуклеотидов, что доказывает одновременную интеграцию в геном всех её компонентов.

В серии ОТ-ПЦР экспериментов мы показали, что многие химерные элементы грибов транскрибируются, причём некоторые - тканеспецифично. Дифференциальная транскрипционная активность химер может отражать выполнение ими какой-либо функциональной нагрузки в клетках гриба.

Пожалуй, наиболее интересным результатом анализа химер грибов оказалось то, что смена матрицы проходит только по специфическим нуклеотидным позициям в составе исходной РНК. 3’ концевые части химер, как правило, сформированы фрагментами MGL LINE. Длина этих фрагментов варьирует от 230 до 5461 3’-концевых нуклеотидов MGL. Анализ последовательностей 33 химер позволил картировать 28 различных точек химеризации в составе последовательности MGL. В шести случаях, одна и та же точка использовалась при образовании двух различных элементов. То есть, смена матриц осуществлялась по одной и той же нуклеотидной позиции РНК-матрицы в ходе формирования шести пар химер. Анализ 28 точек химеризации показал, что они расположены не случайным образом в составе РНК MGL (таблица 3).

Точки смены матрицы соответствовали особому мотиву нуклеотидной последовательности, который присутствовал также и в точках химеризации в составе Mg-SINE. Всем им соответствовала консенсусная последовательность GCC*A/U, где * обозначает участок возможной смены матрицы. Обратная транскриптаза MGL копирует матрицу до нуклеотида A/U в составе мотива, где она может «перепрыгнуть» на другую РНК перед триплетом GCC.

РНК полноразмерного MGL имеет 87 мотивов GCC(A/U) и гораздо больше – участков с однонуклеотидными заменами, тогда как только лишь небольшая их часть используется при химеризации in vivo. Учитывая, что шесть таких сайтов являются “горячими точками” РНК рекомбинации, очевидно, что наличие мотива необходимо, но не достаточно для смены матрицы. Мы постулировали, что точки химеризации расположены в структурированных участках РНК-матрицы. Такие участки могут быть труднопроходимы для ОТ. Похожая ситуация наблюдается для химер млекопитающих, где многие точки химеризации примерно соответствуют наблюдаемым участкам паузы ОТ. В согласии с выдвинутой гипотезой, In silico вокруг точек химеризации в геноме гриба были предсказаны участки выраженной вторичной структуры РНК (Предсказанные структуры размещены в Интернет по адресу:

http://www.biomedcentral.com/content/supplementary/1471-2164-8-360-s2.doc.

Таблица 3. Репрезентативные точки химеризации, найденные в геноме M. grisea

№ химерыa РНК-матрицаb Вышележащая посл-тьc Нижележащая посл-тьd
34 MGL CGCAGC ATTCG
24 MGL TATGCT ATATT
23 MGL AGCGCC TCCGG
4 MGL GGGGTC TTAGA
15 MGL GGGGTC TTAGA
14 MGL TGGGCC TTTCT
13 MGL GGAGCC CGAGG
12 MGL GGAGCC CGAGG
9 MGL TTGGCC ATGAG
8 MGL TTGGCC ATGAG
6 MGL ATAGCC ACCAA
5 MGL ATAGCC ACCAA
2 MGL ACTGCC TTTTC
1 MGL GCCGTC AGACG
7 MGL CAAGCT TCGGG
16 MGL TGGGCC GCTTT
32 MgSINE GCCGTC AGACG
33 MgSINE CCCGCC TGTGC
Консенсус. посл-ть Все типы ---GCC A/T----

aДетальное описание химер дано в тексте диссертации.

bТип РНК-матрицы.

cВышележащая нуклеотидная последовательность относительно участка смены матрицы.

dНижележащая нуклеотидная последовательность относительно участка смены матрицы.

Остаётся неясным, почему ОТ диссоциирует непосредственно перед триплетом GCC. Для многих ОТ известно, что их процессивность зависит от нуклеотидного состава РНК-матрицы. Можно предположить, что мотив GCC, в особенности находящийся в составе шпильки, является труднопроходимым местом для ОТ MGL, что может приводить к временной остановке фермента в этом месте или же к диссоциации и смене матрицы.

В заключение следует упомянуть, что вышеуказанный механизм химеризации не включает какого-либо специфического спаривания нуклеотидов между новосинтезированной кДНК и второй РНК-матрицей, поскольку никаких участков микро- или протяжённых гомологий между ними обнаружено не было.

Тройные химеры и уточнение схемы образования химерных элементов

Обнаруженный в нашей работе тройной элемент грибов (Рис. 14) доказывает, что в ходе LINE-опосредованной РНК рекомбинации in vivo может происходить более чем один акт смены матрицы. Наиболее вероятным механизмом образования тройных химер является двойная смена матрицы при ретротранспозиции LINE (Рис. 15). Скопировав 3’-концевые 4369 нуклеотидов MGL LINE (полная длина MGL составляет ~6 т.п.н.), ретропозиционный комплекс переключается на другую РНК и добавляет к кДНК ~350-нуклеотидный 3’-концевой фрагмент элемента Mg-SINE. Затем, не закончив синтез комплементарной цепи Mg-SINE, ОТ меняет матрицу во второй раз и прибавляет к двухчастной кДНК ещё и полноразмерную копию WEIRD (1113 нуклеотидов). После лигирования химеры и репарации геномной ДНК, элемент оказывается фланкирован 14-нуклеотидными прямыми повторами – дупликациями преинтеграционного сайта (Рис. 14).

Ранее в геноме человека были найдены два тройных элемента (Рис. 14). Один из них интегрирован в протяжённый микросателлитный локус, другой – в АТ-богатую последовательность. Поэтому идентифицировать прямые повторы для них не удалось.

Однако же, в геноме мыши были обнаружены два новых тройных химерных ретроэлемента, фланкированных 15- и 16-нуклеотидными прямыми повторами (Рис. 14). Химеры состояли из блоков B2 SINE, U6 мяРНК и L1 LINE. Тройные химеры в геномах таких эволюционно отдалённых организмов, как млекопитающие и нитчатые грибы свидетельствуют, что двойные акты смены матрицы в ходе обратной транскрипции LINE, возможно, являются не исключением, а консервативным механизмом перестройки эукариотической ДНК.

Рисунок 14. Схема обнаруженных тройных элементов из геномов M.grisea (A), человека (Б) и мыши (В). Только элементы гриба и мыши фланкированы прямыми повторами и, соответственно, могут, рассматриваться как тройные химеры.

Многие химеры экспрессируются у млекопитающих и у гриба M.grisea, некоторые из них – тканеспецифично. Возможно, некоторые химерные ретротранскрипты, являющиеся продуктами «перетасовки» последовательностей функциональных генов, могут быть каким-то образом вовлечены в функционирование клетки. Некоторые химеры, по-видимому, дали начало новым группам ретроэлементов. Вместе с тем, подавляющее большинство таких элементов являются нефункциональными побочным продуктами ретротранспозиции представителей семейства LINE.

Рисунок 15. Механизм образования химер при помощи энзиматического аппарата LINE. (1) преинтеграционный комплекс LINE связывает РНК LINE, SINE или другую РНК в цитоплазме. (2) Рибонуклеопротеид транспортируется в ядро. (3) Обратная транскрипция связанной РНК, праймированная одноцепочечным разрывом в геномной ДНК (target site primed reverse transcription). (4A) Успешная интеграция кДНК в геномную ДНК. (4B) Смена матрицы на другую РНК в ходе обратной транскрипции. (5A) Интеграция двойной химеры в геномную ДНК. (5B) Вторая смена матрицы на другую РНК с последующей репарацией ДНК приводит к образованию интеграции тройного химерного ретроэлемента, фланкированной прямыми повторами. Нормальная последовательность событий при ретротранспозиции LINE: (1)- (2)- (3)- (4A).

Выводы

  1. Разработан метод, названный MDR (англ. Мispaired DNA Rejection), позволяющий значительно повышать специфичность отбора совершенных дуплексов при гибридизации. Метод также применим для поиска эволюционно консервативных последовательностей.
  2. Разработаны новые экспериментальные методы поиска дифференциальных геномных повторов. Первый метод, TGDA (англ. Targeted Genomic Differences Analysis), основан на вычитающей гибридизации геномных последовательностей, а второй, Diffir (англ. Differences in the integration sites of low and medium copy number interspersed repeats technique) – на дифференциальной гибридиазации участков генома на фильтре.
  3. Разработанные подходы были успешно применены для полногеномной идентификации специфичных для генома человека представителей ретроэлементов семейств HERV-K (HML-2) u L1. На основании полученных данных, проведён детальный структурный анализ человек-специфичных ретроэлементов HERV-K (HML-2) u L1. Для человек-специфичных представителей группы HERV-K (HML-2), обладающих общностью гомологии нуклеотидной последовательности, была создана консенсусная последовательность.
  4. Разработан новый экспериментальный методический подход, впервые позволяющий проводить полногеномные исследования промоторной активности геномных повторов как на качественном, так и на количественном уровне. Этот подход, названный GREM (англ. Genomic Repeat Expression Monitor), основан на гибридизации геномных последовательностей, фланкирующих повторы, с 5’-концевыми фрагментами кДНК. Подход был применён для полногеномного исследования промоторной активности человек-специфичных эндогенных ретровирусов HERV-K (HML-2) в нормальной и раковой тканях.
  5. В составе последовательности длинных концевых повторов представителей семейства HERV-K (HML-2) найдена точка начала транскрипции, отличающаяся от канонической для экзогенных ретровирусов. Появление новой точки начала транскрипции может быть связано с адаптивной эволюцией геномов эндогенных ретровирусов.
  6. В интронах двух генов человека – SLC u SLB – выявлены человек-специфичные эндогенные ретровирусы HERV-K (HML-2), инициирующие транскрипцию антисмысловых РНК, перекрывающихся с последовательностями экзонов этих генов. В системе in vitro показано, что экспрессия этих антисмысловых транскриптов на физиологическом уровне, наблюдаемом для эмбриональных и герминогенных тканей, приводит к 2-3 –кратному снижению концентрации мРНК соответствующих генов. Обнаружены первые два случая человек-специфичной регуляции экспрессии генов.
  7. Было обнаружено новое семейство ретроэлементов, состоящее из химерных последовательностей, образованных при однократной или двукратной смене матрицы в ходе обратной транскрипции. Представители семейства были найдены в геномах млекопитающих и у нитчатого гриба Magnaporthe grisea.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ В СЛЕДУЮЩИХ РАБОТАХ:

Исследовательские статьи:

1) E. Gogvadze, C. Barbisan, M.-H. Lebrun and A. Buzdin (2007) Tripartite chimeric pseudogene from the genome of rice blast fungus Magnaporthe grisea suggests double template jumps during long interspersed nuclear element (LINE) reverse transcription. BMC Genomics, 8(1):360

2) I. Kholodenko, R. Kholodenko, V. Sorokin, A. Tolmazova, O. Sazonova, A. Buzdin (2007) Anti-apoptotic effect of retinoic acid on retinal progenitor cells mediated by a protein kinase A-dependent mechanism. Cell Research, 17(2):151-62.

3) Buzdin A., Kovalskaya-Alexandrova E., Gogvadze E., Sverdlov E. (2006) At Least 50% of Human-Specific HERV-K (HML-2) Long Terminal Repeats Serve In Vivo as Active Promoters for Host nonrepetitive DNA Transcription. J Virol., 80(21):10752-62.

4) A. Buzdin, E. Kovalskaya-Alexandrova, E. Gogvadze, E. Sverdlov (2006) GREM, a technique for genome-wide isolation and quantitative analysis of promoter active repeats. Nucleic Acids Res., 34(9): e67.

5) И.В.Холоденко, A. A. Буздин, Р.В.Холоденко, Ю.А.Байбикова, В.Ф.Сорокин, В.Н.Ярыгин, Е.Д.Свердлов (2006) Сокультивирование клеток-предшественников сетчатки (КПС) мыши с культурой клеток пигментного эпителия влияет на особенности дифференцировки КПС. Биохимия 71(7):767-74.

6) Kovalskaya, E., Buzdin, A., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Sverdlov, E.D. (2006) Functional human endogenous retroviral LTR transcription start sites are located between the R and U5 regions. Virology, Mar 15; 346(2):373-378.

7) Гогвадзе, E., Буздин, A., Свердлов, E. (2005) Множественные акты смены матрицы в ходе LINE-опосредованной обратной транскрипции являются общим механизмом образования химерных ретроэлементов у млекопитающих. Биоорганическая химия, 31(1):82-89

8) Chalaya T., Gogvadze E., Buzdin A., Kovalskaya E., Sverdlov E.D. (2004). Improving specificity of DNA hybridization-based methods. Nucleic Acids Res., 32(16):e130.

9) Buzdin, A., Gogvadze, E., Kovalskaya, E., Volchkov, P., Ustyugova, S., Illarionova, A., Fushan, A., Vinogradova, T., Sverdlov, E. (2003) The human genome contains many types of chimeric retrogenes generated through in vivo RNA recombination. Nucleic Acids Res., 31(15):4385-4390.

10) Буздин, A., Лебедев, Ю., Свердлов, E. (2003) Человек-специфичные вставки LTR HERV-K в интронах генов имеют неслучайную ориентацию и, возможно, участвуют в антисмысловой регуляции экспрессии генов. Биоорганическая химия, 29(1):103-106.

11) Buzdin, A., Ustyugova, S., Khodosevich, K., Mamedov, I., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2003) Human-specific subfamilies of HERV-K (HML-2) long terminal repeats: three master genes were active simultaneously during branching of hominoid lineages. Genomics, 81(2):149-156.

12) Buzdin, A., Ustyugova, S., Gogvadze, E., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2003) Genome-wide targeted search for human specific and polymorphic L1 integrations. Human Genetics, 112(5-6):527-533.

13) Buzdin, A., Ustyugova, S., Gogvadze, E., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) A new family of chimeric retrotranscripts formed by a full copy of U6 small nuclear RNA fused to the 3' terminus of L1. Genomics, 80(4):402-406.

14) Mamedov, I., Batrak, A., Buzdin, A., Arzumanyan, E., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2002) Genome-wide comparison of differences in the integration sites of interspersed repeats between closely related genomes. Nucleic Acids Res., 30(14):e71.

15) Буздин, A., Ревина, Л., Костина, Л., Залунин, И., Честухина, Г. (2002) Взаимодействие белков молекулярной массы 65- и 62-кДа из апикальных мембран эпителия кишечника личинок Aedes aegypti с эндотоксинами Bacillus thuringiensis Cry4B и Cry11A. Биохимия, 67(5):540-546.

16) Buzdin, A., Khodosevich, K., Mamedov, I., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Hunsmann, G., Sverdlov, E. (2002) A technique for genome-wide identification of differences in the interspersed repeats integrations between closely related genomes and its application to detection of human-specific integrations of HERV-K LTRs. Genomics, 79(3):413-422.

обзорные статьи:

17) A. Buzdin (2007) Human specific endogenous retroviruses. TheScientificWorldJournal, 7: 1848-1868.

18) Buzdin A, Gogvadze E, Lebrun MH. (2007) Chimeric retrogenes suggest a role for the nucleolus in LINE amplification. FEBS Lett., 581(16):2877-82. Epub 2007 May 25.

19) Buzdin, A. (2006) Transposable elements and their use for target site specific gene delivery. Current Pharmacogenomics, March; 4(1): 1-8.

20) Гогвадзе, E., Буздин, A. (2005) Новый механизм образования ретрогенов в геномах млекопитающих: рекомбинация in vivo в ходе обратной транскрипции РНК. Молекулярная биология, 39(3):364-373.

21) Buzdin, A., Vinogradova, T., Lebedev, Y., Sverdlov, E. (2005) Genome-wide experimental identification and functional analysis of human specific retroelements. Cytogenet. Genome Res.;110(1-4):468-474., in the special issue: "Retrotransposable elements and genome evolution"

22) Buzdin, A. (2004) Retroelements and formation of chimeric retrogenes. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61(16):2046-2059

монографии, главы в книгах:

23) Книга “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov; Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

24) Nucleic acids hybridization: potentials and limitations (Anton Buzdin)

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

25) Selective suppression of polymerase chain reaction and its most popular applications (Sergey Lukyanov, Konstantin Lukyanov, Nadezhda Gurskaya, Ekaterina Bogdanova, Anton Buzdin).

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

26) Suppression subtractive hybridization (Sergey Lukyanov, Denis Rebrikov, Anton Buzdin).

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

27) Stem-loop oligonucleotides as hybridization probes and their practical use in molecular biology and biomedicine (Anton Buzdin, Sergey Lukyanov).

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

28) Coincidence cloning: robust technique for isolation of common sequences (Anton Buzdin).

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

29) DNA hybridization in solution for mutation detection (Anton Buzdin)

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

30) Current attempts to improve the specificity of nucleic acids hybridization (Anton Buzdin).

глава в книге “Nucleic acids hybridization: modern applications”. Редакторы: Anton Buzdin, Sergey Lukyanov, Springer (2007) ISBN 978-1-4020-6039-7.

Результаты работы докладывались на Российских и международных конференциях, симпозиумах и конгрессах: на Конгрессе по молекулярной эволюции в Сорренто (Италия) в 2002 г.; на Конгрессах ФЕБО (FEBS) в Стамбуле (Турция) в 2003г, в Варшаве (Польша) в 2004г., в Будапеште (Венгрия) в 2005 г.; на 7й и 8й Международных Энгельгардтовских конференциях в Суздале (2005г.) и в Сергиевом Посаде (2006г.); на 1-м Европейском симпозиуме «Мобильные элементы ДНК и транспозиция” в Виттенберге (Германия) в 2005 г., на Летних исследовательских конференциях FASEB в 2005 и 2007 гг. (Тусон, США); на Международном съезде IUBMB (Киото, Япония, 2006 г.); на 9-м международном Конгрессе по вариабильности генома человека (Ситжес, Испания, 2007г.), а также на других конференциях и научных школах. Отдельные этапы работы были удостоены Медали Президиума РАН в 2003 году, а также медали Европейской Академии (Academia Europaea) в 2006 году.

Использованные сокращения:

КИРИЛЛИЦА

ВГ, вычитающая гибридизация

кДНК, комплементарная ДНК

мРНК, матричная РНК

ОТ, обратная транскрипция

ПЦР, полимеразная цепная реакция

ЛАТИНСКИЙ РЕГИСТР

GREM, англ. метод genomic repeat expression monitor

LTR, англ. long концевой repeat, длинный концевой повтор

MDR, метод mispaired DNA rejection

RACE, англ. rapid amplification of cDNA ends, быстрая амплификация концов кДНК

TGDA, метод targeted геномный difference analysis



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.