WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Моноцитарный хемотаксический белок-1 (мср-1) как фактор воспаления при атерогенезе. разработка пептидного ингибитора мср-1.

На правах рукописи

КУХТИНА НАДЕЖДА БОРИСОВНА

МОНОЦИТАРНЫЙ ХЕМОТАКСИЧЕСКИЙ БЕЛОК-1 (МСР-1) КАК ФАКТОР ВОСПАЛЕНИЯ ПРИ АТЕРОГЕНЕЗЕ.

РАЗРАБОТКА ПЕПТИДНОГО ИНГИБИТОРА МСР-1.

14.00.06 Кардиология

03.00.25 Гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунологии НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ.

Научные руководители:

Академик РАН, РАМН Чазов Евгений Иванович

Доктор биологических наук Красникова Татьяна Леонидовна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук,

профессор Аронов Давид Меерович

Доктор медицинских наук,

профессор Мазуров Алексей Владимирович

Ведущая организация: Государственное учебно-научное учреждение Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова

Защита состоится 30 сентября 2009 года в ч. на заседании диссертационного совета (Д 208.073.01) по присуждению ученой степени кандидата медицинских наук в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д.15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «РКНПК» МЗ и СР РФ.

Автореферат разослан 2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, д.м.н. В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Атеросклероз коронарных сосудов, проявляющийся клинически как ишемическая болезнь сердца (ИБС), представляет собой наиболее распространенную причину смерти у населения развитых стран. Атеросклероз - многофакторное заболевание, одним из патогенетических звеньев которого является воспаление. Накопление мононуклеарных лейкоцитов в стенке артерии приводит к локальной продукции цитокинов, активных форм кислорода, протеолитических ферментов и других факторов, которые могут вызвать размягчение атеросклеротической бляшки и возникновение острого коронарного синдрома. Для лечения больных ИБС с целью восстановления кровотока в стенозированных коронарных артериях широко применяют транслюминальную баллонную ангиопластику со стентированием. Воспалительная реакция, возникающая в ответ на повреждение сосуда при выполнении ангиопластики, способствует рестенозированию – повторному сужению просвета сосуда. Подавление миграции и пролиферативной активности клеток в области повреждения сосуда значительно повышает эффективность стентирования сосудов. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления осуществляется под действием хемотаксических цитокинов – хемокинов, представляющих собой семейство гликопротеиновых молекул небольшой массы (8-10 кДа), классифицируемых по расположению в структуре консервативных цистеиновых аминокислотных остатков. Одним из основных хемокинов для моноцитов/макрофагов и активированных Т-лимфоцитов является моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1). Результаты исследований свидетельствуют о том, что МСР-1 - один из ведущих хемокинов при атерогенезе, так как ингибирование МСР-1 или его рецептора у экспериментальных животных приводит к значительному подавлению развития атеросклеротических повреждений. МСР-1 вырабатывается моноцитами/макрофагами, эндотелиальными и гладкомышечными клетками. Он не обнаружен в нормальной сосудистой стенке, однако его экспрессия значительна в атеросклеротических бляшках в богатых макрофагами областях, прилегающих к липидному ядру, и в зонах инфаркта миокарда.

В настоящее время ведется активный поиск лекарственных средств, действие которых направлено на ограничение миграции лейкоцитов, в частности, антагонистов МСР-1. Исследуются противовоспалительные свойства ингибирующих МСР-1 моноклональных антител, мутантных рекомбинантных форм МСР-1, ингибиторов вирусной природы и коротких пептидов молекулярной структуры МСР-1. Пептиды представляют собой наиболее безопасные соединения, и разработка пептидных антагонистов МСР-1 является одним из наиболее перспективных направлений.

Цель исследования: изучение роли хемокина МСР-1 в атерогенезе и рестенозировании сосудов и разработка противовоспалительного пептидного препарата – фрагмента МСР-1, ингибирующего миграцию лейкоцитов.

Задачи исследования:

1. Проанализировать экспрессию хемокинов, цитокинов и факторов роста в атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС. Исследовать клеточный состав атеросклеротических бляшек, оценить экспрессию клетками хемокиновых рецепторов.

2. Определить концентрацию хемокина МСР-1 в плазме крови больных со стабильной и нестабильной стенокардией.

3. Получить короткие пептидные фрагменты последовательности МСР-1. Протестировать полученные пептиды в моделях миграции лейкоцитов in vitro и in vivo. Выбрать целевой пептид с наиболее выраженными ингибиторными свойствами.

4. Проанализировать противовоспалительные свойства целевого пептида в моделях подкожного воспаления у грызунов и приматов, а также при баллонной ангиопластике сонных артерий крыс.

Научная новизна. Проведен анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты больных ИБС, полученных в ходе операций эндартерэктомии коронарных артерий и аортокоронарного шунтирования. Получены оригинальные данные об экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов, в частности, хемокина МСР-1 и новые данные об экспрессии хемокиновых рецепторов клетками, выделенными из атеросклеротических бляшек коронарных артерий больных ИБС.

Выявлено достоверное повышение концентрации МСР-1 в плазме крови больных ИБС с нестабильной стенокардией по сравнению с больными со стабильной стенокардией.

Протестировано 15 пептидных фрагментов аминокислотной последовательности МСР-1 по влиянию на миграцию лейкоцитарных клеток в условиях in vitro. На основе анализа выбран целевой пептид – фрагмент С-концевого домена 65-76 МСР-1 (PX). Показано, что РХ препятствует накоплению лейкоцитов в области подкожного воспаления и подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках после проведения баллонной ангиопластики сонных артерий у экспериментальных животных.

Впервые показано участие С-концевого домена хемокина МСР-1 в миграции клеток.

Практическая значимость. Полученные в ходе выполнения работы данные, в частности, об экспрессии цитокинов/хемокинов и рецепторов хемокинов в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека, способствуют более глубокому пониманию молекулярных механизмов атерогенеза. Получен новый пептидный фрагмент 65-76 С-концевой последовательности МСР-1 (PX), подавляющий миграцию лейкоцитов in vitro и in vivo в очаг воспаления. Данный пептид может найти применение в терапии больных с хроническими воспалительными заболеваниями, а также в кардиологии у больных ИБС при возникновении острого коронарного синдрома (ОКС) и при стентировании коронарных артерий.

Внедрение результатов исследования в практику. Безопасность действия полученного пептида РХ (условное название «Инграмон») показана в исследованиях на добровольцах. В настоящее время в НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ проводится клиническое исследование II фазы по протоколам: 1) «Применение препарата «Инграмон» при проведении стентирования коронарных артерий у пациентов со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий», 2) «Применение препарата «Инграмон» у больных с ОКС без подъема сегмента ST на ЭКГ».

Апробация диссертационной работы состоялась 7 июля 2009 года на межинститутской конференции НИИ клинической кардиологии им. А.Л.Мясникова и НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК МЗ и СР РФ.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 13 статей, 5 тезисов, получено 2 патента на изобретение. Статьи и тезисы опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, 3 глав (обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение), заключения, выводов и списка литературы, включающего в себя источников. Диссертация изложена на страницах, содержит таблиц и рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В исследование были включены 23 пациента с ИБС (II-III ФК). Группу с нестабильной стенокардией (НС) составили 12 пациентов, у которых длительность обострения заболевания не превышала 20 суток. В группу со стабильной стенокардией напряжения (ССН) включено 11 пациентов, у которых толерантность к физическим нагрузкам не менялась на протяжении как минимум 3 месяцев. Каждому пациенту выполняли многопроекционную коронароангиографию. Наличие гемодинамически значимого стеноза (50% и более), по крайней мере, в одной из магистральных коронарных артерий подтверждали у каждого пациента. Все пациенты получали аспирин (100 мг/сут) и плавикс (75 мг/сут), -блокаторы, за исключением одного в группе с НС, ингибиторы АПФ принимали 6 пациентов в группе с НС и 7 пациентов в группе с ССН, статины – 10 пациентов с НС и 8 – с ССН, нитраты назначали по показаниям. Больные ИБС с ССН и НС были сопоставимы по основным клинико-ангиографическим показателям (Таб. 1 и 2).

Таблица 1. Характеристика пациентов, включенных в исследование.

Показатель Нестабильная стенокардия (n = 12) Стабильная стенокардия напряжения (n = 11)
Мужской пол 12 (100%) 8 (73%)
Возраст, годы 53,2 ± 6,9 51,7 ± 13,7
Курение 5 (42%) 6 (55%)
Артериальная гипертензия 6 (50%) 5 (45%)
Уровень глюкозы в крови, ммоль/л 5,49 ± 0,72 5,18 ± 0,95
Уровень холестерина в крови, ммоль/л 6,54 ± 0,79 5,64 ± 1,13

Таблица 2. Данные коронароангиографии.

Нестабильная стенокардия Стабильная стенокардия напряжения
Гемодинамически значимое поражение: одной коронарной артерии двух коронарных артерий трех коронарных артерий 6 (50%) 4 (33%) 2 (17%) 6 (55%) 2 (18%) 3 (27%)
Поражение ствола левой коронарной артерии 2 (17%) 2 (18%)
Среднее количество пораженных артерий 1,8 ± 0,9 2,0 ± 1,2

Образцы интимы коронарных сосудов и аорт человека. Образцы интимы коронарных артерий и аорт человека получали в ходе операций эндартерэктомии коронарных артерий и аортокоронарного шунтирования пациентов, страдающих ИБС, ССН (хирургическое отделение ИКК РКНПК). Сегменты артерий заключали в среду для замораживания O.C.T. Compound Tissue-Tek®, помещали в жидкий азот и хранили при температуре -70°C или отмывали в стерильном физиологическом растворе, погружали в раствор RNA-later® и хранили при 4°C.

Иммуногистохимический анализ. Готовили гистологические срезы толщиной 6 мкм. Окрашивание и визуализацию проводили по стандартной методике для замороженных образцов. Визуализацию антигенов проводили с применением специфических мышиных антител к антигенам человеческих лейкоцитов CD45, CD68, CD11c и CD4. Контрольные срезы инкубировали с 10% раствором сыворотки. В качестве субстрата для визуализации антигенов использовали ДАБ и Н2О2. Для типирования лейкоцитов у яванских макаков использовали мышиные МкАт к антигенам человека CD11c (маркер моноцитов/макрофагов) и CD45 (общий лейкоцитарный антиген); у крыс для визуализации поверхностных клеточных антигенов использовали мышиные МкАт к фактору фон-Виллебранда (vWF) и к моноцитам/макрофагам (ED1). Клеточные ядра окрашивали гематоксилином Майера.

Выделение РНК. Из образцов коронарных артерий и интимы аорт выделяли РНК с применением коммерческого набора для фенольной экстракции РНК «РИБО-золь-А» в соответствии с рекомендациями производителя. Концентрацию полученной РНК определяли спектрофотометрически.

Реакция обратной транскрипции. Для получения кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием коммерческого набора «РЕВЕРТА». В качестве затравок для инициации реакции использовали смесь случайных гексануклеотидов. Инкубацию проводили в течение 30 минут при 37°C. Полученную кДНК хранили при -70°C до проведения анализа.

Полуколичественная полимеразная цепная реакция в «реальном времени». При помощи ПЦР в «реальном времени» исследовали экспрессию мРНК генов MIP-1, MIP-1, I-309, ИЛ-4, 10, -13, IP-10, MCP-1, -2, -3, MIG, I-TAC, RANTES, ФНО-, SDF-1. Данные об экспрессии каждого гена цитокина/хемокина выражали по отношению к уровню экспрессии гена домашнего хозяйства 2-микроглобулина. ПЦР проводили с использованием коммерческого набора «АмплиСенс-200-1» и интеркалирующего красителя SybrGreen в термоциклере Rotor-Gene 3000 (Corbett Research, Австралия).

Выделение и иммунофенотипирование клеток из образцов интимы аорты. Образцы сосудов больных с ИБС обрабатывали коллагеназой I типа согласно описанному ранее методу (Bonanno E et al., 2000). Полученную клеточную суспензию окрашивали при помощи коктейля МкАт, специфичных к антигенам зрелых лейкоцитов (lin1), МкАт к CD4, CD8, CD11c, рецептору MCP-1 CCR2 и контрольными иммуноглобулинами. Связывание антител с клетками анализировали на поточном цитофлюориметре FACSCalibur (BD Immunocytometry Systems) с использованием программного обеспечения CellQuest.

Измерение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с НС и ССН. Концентрацию МСР-1 измеряли методом твердофазного иммуноферментного анализа с помощью коммерческого набора Biosource (США).

Выделение моноцитов/макрофагов из периферической крови. Мононуклеарные клетки выделяли из венозной крови здоровых доноров методом центрифугирования в градиенте плотности Histopaque (Boyum, 1968). Обогащенную моноцитами суспензию клеток получали с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте перколла по описанному ранее методу (Al-Sumidaie et al., 1984). Полученная суспензия клеток (4 млн/мл) содержала 74 ± 10% моноцитов. Жизнеспособность клеток составляла не менее 96%.

Оценка миграции клеток in vitro в модифицированной микрокамере Бойдена. Изучение миграции клеток проводили с использованием микрокамеры Бойдена (Falk W et al., 1980). В качестве хемокина использовали МСР-1 (50 нг/мл для моноцитов и 100 нг/мл для клеток ТНР-1) (R&D Systems, США). Клетки и раствор хемокина разделяли мембраной с размером пор 5 мкм для моноцитов и 8 мкм для клеток ТНР-1. Время миграции составляло 1 час для моноцитов и 3 часа для ТНР-1. Промигрировавшие клетки фиксировали и окрашивали красителем Гимза. Мембрану сканировали на сканере HP ScanJet 5300C и анализировали с использованием программного обеспечения SigmaGel. Данные выражали в относительных единицах, представляющих собой отношение клеточной миграции в опыте к контрольной величине, полученной при отсутствии хемоаттрактанта.

«Air pouch» (воздушный мешок) у мышей. В спинной области самцов гибридных мышей F1CBA/Lac C57B1/6 (25 г, 7-9 нед., питомник «Столбовая»), создавали полость при помощи 2-кратного подкожного введения стерильного воздуха. На 7 сутки мышам вводили в полость 1 мл рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE/CCL2) (100 нг/мл) или 1 мл раствора МСР-1(JE) + РХ, раствора ЛПС (1 мкг/мл) или ЛПС + РХ. Контрольным животным в полость вводили 1 мл стерильного физиологического раствора. Через 4 ч полости промывали раствором Версена, лаважную жидкость отбирали, подсчитывали количество клеток в камере Нойбауэра. Типирование моноцитов/макрофагов проводили при помощи МкАт (клон F4/80) и поточного цитофлюориметра. В экспериментах при подборе оптимальной ингибирующей дозы пептида в «воздушный мешок» инъецировали ЛПС в указанной выше концентрации. РХ вводили внутримышечно в диапазоне концентраций от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл.

Подкожное воспаление у крыс и приматов. В работе использовали самцов линейных крыс Wistar (масса 300-400 г, 2,5-3 мес., питомник «Столбовая») и самцов яванских макаков (Macacus fascicularis) (масса 2,5-3 кг, 2,5-3 года, ГУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН). В спинную область животных подкожно вводили ЛПС: 2 мкг/кг для крыс и 3,3 мкг/кг для обезьян. РХ вводили внутримышечно крысам в концентрации 40 мкг/кг или двукратно внутривенно обезьянам (сразу после введения ЛПС и через 4 ч) в концентрации 33 мкг/кг. Контрольным животным вводили РХ, стерильный физиологический раствор или смесь аминокислот, входящих в состав РХ (33 мкг/кг). Препараты готовили через 24 ч, фиксировали и окрашивали красителем Гимза или МкАт. Количество клеток считали не менее чем в 10 полях зрения.

Баллонная ангиопластика общих сонных артерий крыс. Левую общую сонную артерию крыс Wistar деэндотелизировали при помощи 3 пассажей эмболоэктомического баллонного катетера Фогарти-2F (Baxter, США). Опытным животным вводили 1 раз в сутки внутримышечно 10 мкг РХ в 100 мкл физиологического раствора, контрольным - 100 мкл физиологического раствора. Через 4, 7, 14 и 28 суток после операции левую общую сонную артерию и контралатеральный контрольный сосуд иссекали. Фрагменты сосудов погружали в среду для замораживания O.C.T. Compound Tissue Teck®, замораживали в жидком азоте и хранили при температуре -70C.

Морфометрический анализ. Морфометрический анализ гистологических срезов сонных артерий (измерение площади неоинтимы, медии и просвета сосуда) проводили с помощью программного обеспечения Optimas 6.1.

Анализ параметров клеточного иммунитета крыс. Общее количество лейкоцитов подсчитывали в камере Нойбауэра по стандартной методике после лизиса эритроцитов в 5% уксусной кислоте. Анализ субпопуляций лимфоцитов проводили при помощи цитофлюориметрии в потоке с использованием мышиных МкАт, специфичных к антигенам лимфоцитов крыс CD3, CD4, CD8, NKR-p1A, а также контрольных Ig мыши.

Статистический анализ. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. Для оценки достоверности различий использовали t-критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни с минимальным уровнем значимости р=0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ атеросклеротических бляшек коронарных артерий и аорт больных ИБС. Во всех проанализированных образцах бляшек обнаружены очаговые скопления мононуклеарных лейкоцитов. Для подтверждения результатов морфологического анализа образцы сосудов окрашивали МкАт к антигенам лейкоцитов. Иммуногистохимический анализ выявил участки скопления CD45+клеток (лейкоцитов), в том числе моноцитов/макрофагов (CD11c+) и CD4+ Т-клеток (Рис. 1).

а б в г

Рисунок 1. Иммуногистохимический анализ атеросклеротической бляшки коронарной артерии человека. Окрашивание срезов контрольными иммуноглобулинами (а), антителами (коричневый цвет) к CD11с (б), CD45 (в) и CD4 (г). Ядра окрашены гематоксилином Майера, 600.

При помощи ПЦР в реальном времени практически во всех исследованных образцах атеросклеротических бляшек коронарных артерий и интимы аорты без макроморфологических изменений выявили экспрессию мРНК индуцибельных (воспалительных) хемокинов MIG, I-309, MCP-3, а также ИЛ-13 и SDF-1 (Рис. 2). Экспрессия конститутивного хемокина SDF-1 в интиме аорты и бляшках может быть обусловлена его участием в репарации поврежденной артериальной стенки (Xiao Q et al., 2007). Ранее ИЛ-13 рассматривали как противовоспалительный цитокин (Minty A et al., 1993). В настоящее время считают, что длительное действие ИЛ-13 оказывает провоспалительное действие из-за активации неспецифических факторов транскрипции, приводящих в свою очередь к усилению секреции хемокинов МСР-1, -2, -3, -5, MIP-1, -1 и -2 (McCaffrey TA et al., 2000).

В проанализированных образцах атеросклеротических бляшек, помимо указанных выше хемокинов и цитокинов, была обнаружена экспрессия хемокина МСР-1, MIP-1, и провоспалительного цитокина ФНО-, которые не были обнаружены в образцах «неизмененной» интимы аорты. Полученные нами результаты показали, что: 1) более чем в половине атеросклеротических бляшек коронарных артерий обнаружена мРНК хемокина МСР-1, 2) у пациентов с ИБС интима артерий без макроморфологических изменений может являться участком развивающегося воспаления.

 Анализ экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов в интиме «неизмененных»-4

Рисунок 2. Анализ экспрессии мРНК цитокинов/хемокинов в интиме «неизмененных» артерий и артерий с атеросклеротическими бляшками (данные представлены как процент образцов с выявленной экспрессией цитокина по отношению ко всем образцам в группе).

Образцы атеросклеротических бляшек подвергались обработке коллагеназой с последующим иммунофенотипированием выделенных клеток (Рис. 3).

 Иммунофенотипирование клеток, выделенных из атеросклеротических-5

Рисунок 3. Иммунофенотипирование клеток, выделенных из атеросклеротических бляшек (показаны результаты одного из 4 независимых экспериментов).

Из образцов бляшек (n = 4) были выделены лейкоциты, в основном Т-клетки (CD3+), 48-50% из которых являлись Т-хелперными клетками (CD3+CD4+). Рецепторы хемокина МСР-1 CCR2 обнаружены на 12-40% Т-хелперов. Полученные данные могут свидетельствовать о хемотаксисе клеток в атеросклеротическую бляшку под действием МСР-1.

Для дополнительной оценки участия хемокина МСР-1 в патогенезе атеросклероза и ОКС мы определили концентрацию МСР-1 в крови больных ИБС с нестабильной стенокардией (НС) и у больных со стабильной стенокардией напряжения (ССН).

Измерение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС со стабильной и нестабильной стенокардией. По данным нашего исследования концентрация МСР-1 оказалась достоверно выше в плазме крови у пациентов с НС по сравнению с больными с ССН (Рис. 4).

 Концентрация МСР-1 в плазме у пациентов с ИБС. * - р < 0,0001. -6

Рисунок 4. Концентрация МСР-1 в плазме у пациентов с ИБС. * - р < 0,0001.

Выраженность межгрупповых различий позволяет предполагать, что определение концентрации МСР-1 в плазме крови пациентов с ИБС в комплексе с другими показателями может использоваться для дифференциальной диагностики НС и ССН. На основании данных об участии МСР-1 в атерогенезе этот хемокин рассматривается как мишень для терапевтического воздействия. С этой целью в нашей работе совместно с сотрудниками лаборатории синтеза пептидов НИИЭК РКНПК (под рук. к.х.н. Беспаловой Ж.Д.) был получен ряд коротких пептидов – фрагментов структуры МСР-1.

Разработка и получение новых противовоспалительных препаратов пептидной природы на основе структуры хемокина МСР-1. Структура МСР-1 была проанализирована с помощью компьютерных программ Peptide Companion, позволяющих предсказывать линейные эпитопы в белках, включая метод предсказания гидрофильных участков аминокислотной цепи, метод оценки поверхностной доступности и метод учета встречаемости различных сочетаний аминокислотных остатков в уже известных антигенных детерминантах. После проведенных расчетов было выбрано несколько потенциально «активных» фрагментов последовательности МСР-1 и осуществлён их синтез посредством автоматического твердофазного метода с использованием Fmoc-технологии.

Синтезированные пептиды тестировали in vitro по их влиянию на миграцию моноцитарных клеток в камере Бойдена. В результате был выбран пептидный фрагмент 65-76 C-концевой последовательности МСР-1 (РХ), обладавший максимальной ингибирующей активностью (РХ подавлял миграцию клеток ТНР-1 и моноцитов крови на 60% и 50% соответственно) (Рис. 5).

 Влияние пептида РХ на МСР-1-стимулированную миграцию-7

Рисунок 5. Влияние пептида РХ на МСР-1-стимулированную миграцию промоноцитарных клеток ТНР-1 и моноцитов крови. Данные представлены как среднее трех независимых экспериментов ± стандартное отклонение. За 100% принята миграция клеток в присутствии МСР-1.

В первичной структуре МСР-1 C-концевая последовательность 65-76, соответствующая РХ, выделена красным цветом: H-Ala-Gln-Pro-Asp-Ala-Ile-Asn-Ala-Pro-Val-Thr-Cys-Cys-Tyr-Asn-Phe-Thr-Asn-Arg-Lys-Ile-Ser-Val-Gln-Arg-Leu-Ala-Ser-Tyr-Arg- Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Arg-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-Val-Ile-Phe-Lys-Thr-Ile-Val-Ala-Lys-Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-Asp-Ser-Met-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH.

В предыдущих исследованиях утверждалось, что C-концевой домен хемокина МСР-1 не имеет функционального значения в стимуляции клеточной миграции (Han KH et al., 1999), и пептиды из этой области не конкурируют с МСР-1 при взаимодействии с рецепторами клеток ТНР-1 (Steitz SA et al., 1998). Полученный нами пептид РХ значительно подавлял МСР-1-опосредованную миграцию клеток ТНР-1 и моноцитов крови. Ингибирующая активность РХ оказалась сопоставима с активностью пептида последовательности 51-62 МСР-1, который описан в литературе как наиболее эффективный пептидный ингибитор миграции моноцитарных клеток in vitro (Reckless J et al., 2001). Таким образом, мы впервые получили данные о возможном участии C-концевой части молекулы МСР-1 в клеточной миграции.

Для выявления ингибирующей активности РХ in vivo мы провели серию экспериментов с использованием нескольких моделей воспаления у экспериментальных животных.

Действие РХ на миграцию лейкоцитов в модели «аir pouch» (воздушный мешок) у мышей. Введение рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE) в воздушный мешок у мышей сопровождалось усилением миграции моноцитов в полость мешка. Содержание клеток (тыс.) в лаваже в присутствии хемокина по сравнению с контролем составляло 210 ± 73 против 100 ± 56, соответственно. Одновременное введение МСР-1 и РХ приводило к снижению числа моноцитов в лаваже (96 ± 43 клеток) (Рис. 6а). Инъецирование в сформированный воздушный мешок ЛПС сопровождалось миграцией в полость мешка гранулоцитов, которые в контроле отсутствовали. Совместное введение ЛПС и РХ приводило к снижению количества гранулоцитов в лаважной жидкости (n = 7 для каждой группы) и составляло в контрольной группе – 83 ± 43, с ЛПС – 1778 ± 870, с ЛПС + РХ – 970 ± 446 (Рис. 6б).

 а. РХ ингибирует MCP-1(JE)–индуцированную миграцию моноцитов в-8  а. РХ ингибирует MCP-1(JE)–индуцированную миграцию моноцитов в-9

Рисунок 6. а. РХ ингибирует MCP-1(JE)–индуцированную миграцию моноцитов в «воздушный мешок» у мышей (n = 5 для каждой группы). б. РХ ингибирует ЛПС-индуцированную миграцию гранулоцитов в «воздушный мешок» у мышей (n = 7 для каждой группы). Концентрация рекомбинантного мышиного МСР-1 - 100 нг/мл, ЛПС - 1 мкг/мл, РХ - 1мкг/мл, * - р < 0,05. # - p = 0,056.

В следующей серии экспериментов подбирали минимальную ингибирующую дозу РХ. Для этого в «воздушный мешок» вводили ЛПС. РХ вводили внутримышечно в диапазоне доз от 0,1 мкг/мл до 1,0 мг/мл. Ингибирующий эффект РХ сохранялся в диапазоне концентраций: 0,001-0,01-0,1 мг/мл. Таким образом, минимальная ингибирующая концентрация РХ составила 1 мкг/мл (40 мкг/кг). При этом количество гранулоцитов в лаважной жидкости мешка снижалось практически одинаково ~ на 40-50% (Рис. 7).

 Внутримышечное введение РХ подавляет ЛПС-стимулированный-10

Рисунок 7. Внутримышечное введение РХ подавляет ЛПС-стимулированный хемотаксис гранулоцитов в «воздушный мешок» у мышей (n=5 в каждой группе). За 100% принято среднее количество клеток у животных, которым не вводили РХ.

Таким образом, РХ эффективно подавлял миграцию моноцитарных и гранулоцитарных лейкоцитов в «воздушный мешок» у мышей при одновременном введении хемоаттрактанта и РХ в полость «воздушного мешка» и при внутримышечном введении РХ.

Действие РХ на миграцию лейкоцитов в очаг подкожного воспаления у крыс. В зоне ЛПС-индуцированного воспаления присутствовали фибробласты, гранулоциты и моноциты (Рис. 8в). Лейкоцитарные клетки отсутствовали при введении физиологического раствора (Рис. 8а) или РХ (Рис. 8б). При введении ЛПС и РХ количество гранулоцитов и моноцитов снижалось приблизительно на 70 и 25%, соответственно (Рис. 8г). Количество фибробластов достоверно не отличалось ни в одной из групп.

а б в г

Рисунок 8. Внутримышечное введение РХ подавляет подкожное воспаление у крыс. Представлены характерные результаты одного из трех независимых экспериментов (n = 4 для каждой из групп). Окрашивание по Романовскому-Гимза. Увеличение 100.

Действие РХ на развитие подкожного воспаления у приматов. У яванских макаков через 24 часа после инъекции ЛПС в очаге воспаления накапливались главным образом гранулоциты и единичные моноциты. Количество лейкоцитов в поле зрения в группе с введением ЛПС (n = 6) составляло 90 ± 10 против 50 ± 24 в группе с введением РХ (n = 5), т.е. РХ подавлял миграцию лейкоцитов в зону воспаления (Рис. 9 и 10). Количество фибробластов в группах достоверно не отличалось. Контрольная смесь аминокислот, составляющих РХ, никак не влияла на миграцию клеток.

а б

в г д

Рисунок 9. Внутривенное введение РХ подавляет подкожное воспаление у приматов. Окрашивание препаратов красителем Гимза. Увеличение 100.

а.  б. контроль ЛПС ЛПС + РХ Внутривенное введение РХ подавляет-20

б.  контроль ЛПС ЛПС + РХ Внутривенное введение РХ подавляет-21

контроль ЛПС ЛПС + РХ

Рисунок 10. Внутривенное введение РХ подавляет подкожное воспаление у приматов. Иммуногистохимическое окрашивание МкАт (коричневый цвет) к антигенам лейкоцитов CD45 (а) и моноцитов CD11с (б). Увеличение 100.

Таким образом, РХ обладает противовоспалительными свойствами, так как подавляет хемотаксис клеток в ответ на МСР-1(JE) и ЛПС у экспериментальных животных.

Экспериментальная баллонная ангиопластика сонных артерий крыс. Баллонное повреждение левой общей сонной артерии выполняли доступом через наружную сонную артерию. Через 4 суток после баллонирования на месте поврежденного интимального слоя в сосудах крыс, получавших только физиологический раствор, наблюдали адгезировавшие клетки крови. В сосудах крыс, получавших РХ, на месте поврежденного интимального слоя первичные скопления клеток практически отсутствовали (Рис. 11).

а б

Рисунок 11. 4-е сутки после баллонного повреждения сонной артерии крыс. а. Контрольная группа. б. Группа с РХ. Иммуногистохимическое окрашивание МкАт к vWF. Клеточные ядра окрашены гематоксилином Майера. Увеличение 600.

Количество ядер клеток в неоинтиме, площадь неоинтимы и отношение площади неоинтимы к медии были достоверно ниже в группе с РХ по сравнению с контрольной группой. Площадь просвета сосуда и площадь медии не имели достоверных отличий (Рис. 12 и 13).

 Количество ядер клеток в неоинтиме и площадь неоинтимы после-24 Количество ядер клеток в неоинтиме и площадь неоинтимы после-25

Рисунок 12. Количество ядер клеток в неоинтиме и площадь неоинтимы после баллонного повреждения общих сонных артерий крыс. Белые столбцы – контрольная группа с получением физиологического раствора, серые – группа с получением РХ. * - р < 0,05.

Рисунок 13. Площадь просвета сосуда и отношение площади неоинтимы к площади медии после ангиопластики сонной артерии крыс. Белые столбцы – контрольная группа с получением физиологического раствора, серые – группа с получением РХ. * - р < 0,05.

Через 7 суток в обеих группах животных люминальную поверхность сосуда покрывали расположенные в несколько слоев клетки, образующие неоинтиму (Рис. 14). В группе с получением РХ площадь неоинтимы, количество ядер клеток в неоинтиме и отношение площади неоинтимы к площади медии были достоверно ниже, а площадь просвета сосуда достоверно больше по сравнению с контрольной группой (Рис. 12 и 13).

а б

Рис. 14. Формирование неоинтимы через 7 суток после баллонирования сонной артерии крыс. Окрашивание красителем Гимза. а. Контроль. б. Группа с РХ. Увеличение 400.

Через 14 и 28 суток после баллонного повреждения сонной артерии крыс в контрольной группе и группе с получением РХ наблюдали выраженную интимальную гиперплазию. Ни один из указанных выше показателей не имел достоверных отличий.

Общее количество лейкоцитов в периферической крови, а также относительное содержание популяций лимфоцитов: Т-клеток, в том числе Т-хелперов (CD3+/CD4+), цитотоксических лимфоцитов (CD3+/CD8+) и естественных киллеров (CD3-/NKR-p1A+) достоверных отличий не имели на всех сроках после повреждения сосудов. Полученные данные свидетельствуют о том, что синтетический пептидный C-концевой фрагмент 65-76 МСР-1 РХ не оказывает системного действия на параметры неспецифического и специфического иммунитета. По-видимому, он оказывает локальное действие, подавляя миграцию лейкоцитов в месте повреждения артерии. РХ достоверно подавляет формирование неоинтимы на ранних сроках, когда в данном процессе самыми активными участниками являются лейкоциты.

В целом, на основании экспериментов в моделях воспаления у экспериментальных животных нами было показано противовоспалительное действие разработанного пептида РХ.

ВЫВОДЫ:

1. В атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ИБС выявлена экспрессия хемокина MCP-1. Лейкоциты, выделенные из образцов атеросклеротических бляшек, экспрессируют рецептор МСР-1 CCR2.

2. Концентрация МСР-1 в плазме крови пациентов с нестабильной стенокардией достоверно повышена по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией.

3. Синтетический пептид С-концевой последовательности (65-76) МСР-1 (PX) ингибирует МСР-1-опосредованную миграцию моноцитов человека in vitro в камере Бойдена и в «воздушном мешке» у мышей.

4. PX подавляет подкожное ЛПС-индуцированное воспаление у крыс и приматов.

5. PX препятствует формированию неоинтимы после баллонного повреждения сонных артерий крыс на ранних сроках после вмешательства.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Н.Б. Глазкова, Т.И. Арефьева, О.А. Антонова, Т.Л. Красникова. Действие ингибиторов митоген-активируемых киназ на хемотаксис клеток, стимулированный моноцитарным хемотаксическим белком-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2003, 89(1): 43-51.

2. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, А.М. Арефьева, Т.Л. Красникова. Зависимость хемотаксического ответа моноцитарных клеток, стимулированных моноцитарным хемотаксическим белком-1, от состава подложки. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2003, 89(12): 1577-1581.

3. Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Бушуев В.Н. Пептидные фрагменты хемокина МСР-1, их структурные аналоги и их влияние на МСР-1-опосредованную миграцию моноцитарных клеток. Биоорганическая химия, 30(6): 582-93, 2004.

4. Т.Л. Красникова, Т.И. Арефьева, М. Г. Мелехов, Н. Б. Кухтина, М.В. Сидорова, А.С. Молокоедов, В.Н. Бушуев, Ж.Д. Беспалова, Е.И. Чазов. Пептид последовательности 66-77 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) - ингибитор воспаления у экспериментальных животных. Доклады Академии наук, 2005, 404, 4,551-554.

5. Arefieva T.I., Kukhtina N.B., Antonova O.A., Krasnikova T.L. MCP-1 - stimulated chemotaxis of monocytic and endothelial cells is dependent on activation of different signaling cascades. Cytokine 2005, 31(6): 439-446.

6. М.В. Сидорова, А.С. Молокоедов, А.А. Азьмуко, Т.И. Арефьева, М.Г.Мелехов, Н.Б.Кухтина, Т.Л.Красникова, Ж.Д. Беспалова, В.Н. Бушуев. Пептидный фрагмент (66-77) моноцитарного белка -1 и его ретро-энантио-аналог ингибируют миграцию клеток in vivo и in vitro. Биоорганическая химия, 2006, 32,2,161-168.

7. С.И. Проваторов, Т.И. Арефьева, Н.Б. Кухтина, Т.К. Люкова, А.М. Арефьева, Т.Л. Красникова. Маркеры воспаления - моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и С-реактивный белок - в крови пациентов с нестабильной стенокардией и стабильной стенокардией напряжения. Терапевтический Архив, 2006, 6, 66-69.

8. Чазов Е.И., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Кухтина Н.Б., Мелехов М.Г., Арефьева Т.И., Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Гвоздик Т.Е., Мартьянов Б.М., Поздеев В.В., Сергиенко В.Б., Бушуева Т.Л. Ингибирование миграции моноцитов и гранулоцитов in vivo пептидом последовательности 65-76 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1). Доклады Академии наук, 2006; 411: 270-272.

9. Chazov EI, Bespalova JD, Arefieva TI, Kukhtina NB, Sidorova MV, Provatorov SI, Krasnikova TL. The peptide analogue of MCP-1 65-76 sequence is an inhibitor of inflammation. Can J Physiol Pharmacol. 2007; 85(3-4): 332-40.

10. Н. Б. Кухтина, П. П. Баштрыков, Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Т. И. Арефьева, В.О.Соколов, Т. Л. Красникова. Влияние синтетического фрагмента 65-76 МСР-1 на формирование неоинтимы после баллонного повреждения у крыс. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2008, 94(1): 27-36.

11. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, А.М. Арефьева, Р.С. Акчурин, Т.Л. Красникова. Экспрессия хемокинов и цитокинов в атеросклеротических бляшках и интиме артерий у больных ИБС. Терапевтический архив, 2008, №4, с.63-69.

12. Kukhtina NB, Bashtrykov PP, Bespalova ZhD, Sidorova MV, Aref’eva TI, Sokolov VO, Krasnikova TL. Effects of synthetic monocyte chemotactic protein – 1 fragment 65-76 on neointima formation after carotid artery balloon injury in rats. Neurosci Behav Physiol. 2009, 39:153-159.

13. Т.Л.Красникова, М.В.Сидорова, Т.И.Арефьева, Н.Б.Кухтина, А.А.Азьмуко, Ж.Д.Беспалова. Разработка нового противовоспалительного пептидного препарата - ингибитора моноцитарного хемотаксического белка-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова, 2009, 95(5): 494-506.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АПФ – ангиотензинпревращающий фермент

ДАБ - диаминобензидина тетрахлорид

ИБС – ишемическая болезнь сердца

ИЛ – интерлейкин

КФК - креатинфосфокиназа

ЛПС – липополисахарид

МкАт – моноклональное антитело

НС – нестабильная стенокардия

ОКС - острый коронарный синдром

ПЦР – полимеразная цепная реакция

СРБ – C-реактивный белок

ССН - стабильная стенокардия напряжения

ФК – функциональный класс

ФНО - фактор некроза опухоли

IP-10 - индуцированный ИФН- белок-10

I-TAC - индуцированный ИФН- Т-клеточный -хемоаттрактант

MIG - индуцированный ИФН- монокин

MIP – макрофагальный воспалительный белок

MCP-1 – моноцитарный хемотаксический белок-1

РХ – пептид-10

RANTES – хемокин, регулируемый при активации, экспрессируемый и секретируемый нормальными Т-клетками

SDF – получаемый из стромальных клеток фактор

vWF – фактор фон-Виллебранда



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.