WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Генетико-физиологические аспекты социального поведения ассоциативных бактерий azospirillum brasilense

На правах рукописи

Шелудько Андрей Вячеславович

ГЕНЕТИКО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЦИАЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ АССОЦИАТИВНЫХ БАКТЕРИЙ AZOSPIRILLUM BRASILENSE

03.02.03 – микробиология

А В Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Саратов – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН)

Научный консультант доктор биологических наук Елена Ильинична Кацы
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Лидия Владимировна Карпунина
доктор биологических наук, доцент Маргарита Юрьевна Грабович
доктор биологических наук, старший научный сотрудник Галина Александровна Ерошенко
Ведущая организация: Всероссийский институт сельскохозяйственной микробиологии РАСХН

Защита диссертации состоится « 8 » декабря 2010 г. в 1300 ч на заседании диссертационного совета Д 002.146.01 при Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (410049, г. Саратов, просп. Энтузиастов, 13).

Тел. / факс (8452) 97 03 83.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ИБФРМ РАН.

Автореферат диссертации размещен на сайте ВАК.

Автореферат разослан « __ » октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор В.Е. Никитина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бактерии рода Azospirillum являются модельным объектом в исследованиях молекулярных механизмов ассоциативного взаимодействия растений и микроорганизмов. Азоспириллы – ризобактерии, стимулирующие рост и развитие растений (PGPR – Plant Growth-Promoting Rhizobacteria), благодаря своей способности к фиксации атмосферного азота, продукции фитогормонов, контролю фитопатогенов и др. (Berg, 2009; Lugtenberg, Kamilova, 2009). Существование в гетерогенных условиях почвы, смена экологических ниш (почва – ризосфера – растение) требуют от бактерий богатого набора адаптивных способностей.

Наличие специализированных двигательных органелл, наряду со способностью реагировать на постоянно изменяющиеся условия окружающей среды посредством тактических реакций, существенно расширяет адаптационные возможности бактерий, живущих в разнообразных местах обитания (Armitage 1992; Кацы, 1996; Дебабов, 1999; Vladimirov, Sourjik, 2009). Эффективность экспансии микроорганизмов повышается в результате перехода индивидуально движущихся клеток к коллективной миграции (Henrichsen, 1972; Дебабов, 1999; Олескин с соавт., 2000; Verstraeten et al., 2008). В настоящее время описано значительное количество типов индивидуальной и коллективной подвижности микроорганизмов (плавание, роение, скольжение, тянущая подвижность и др.). Особенности совместного перемещения микроорганизмов определяются механизмами, обеспечивающими движение; межклеточными контактами, обусловленными мажорными компонентами клеточной поверхности; а в некоторых случаях зависят от продукции сурфактантов и ряда других факторов (Harshey, 2003). Генетико-физиологический анализ изменений в подвижности бактерий и архитектуре их клеточной поверхности необходим для выяснения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Исследование подвижности и хемотаксиса бактерий является одной из динамично развивающихся областей современной микробиологии. Столь пристальное внимание к проблеме во многом вызвано тем обстоятельством, что на сравнительно простой биологической системе, каковой является бактериальная клетка, можно установить закономерности, лежащие в основе поведенческих реакций, которые можно экстраполировать на более сложные системы (Adler, 1987; Иваницкий, 1999; Олескин, 2009). Наряду с классическими объектами Escherichia coli и Salmonella typhimurium внимание исследователей привлекают и почвенные бактерии. Именно у них обнаружены более сложные, чем у Enterobacteriaceae, хемосенсорные системы, большее разнообразие двигательных органелл и механизмов, приводящих клетки в движение. Усложнение организации систем подвижности и хемотаксиса у почвенных бактерий считают отражением высокой пластичности их метаболизма (Manson et al., 1998; Кацы, 2003).

В природных экосистемах большинство бактерий существуют в виде прикрепленных к субстратам биопленок, образование которых представляет собой сложный строго регулируемый биологический процесс. Формирование микроорганизмами биопленочных сообществ является одной из стратегий выживания бактерий не только в окружающей среде, но и в инфицируемых макроорганизмах. В составе биопленок бактерии объединены сложными межклеточными связями и во многом функционально сходны с многоклеточными организмами (Shapiro, 1998; Ильина с соавт., 2004; Dobretsov et al., 2009). Учитывая то обстоятельство, что в случае ассоциативного взаимодействия не происходит образования каких-либо специфических структур, наподобие клубеньков, характерных для бобово–ризобиального симбиоза (Pedrosa, 1988), формирование азоспириллами биопленок может играть существенную роль в успешном функционировании ассоциации.

В последнее десятилетие интенсивное изучение разнообразных процессов, реализуемых при наличии достаточной плотности популяции микроорганизмов (“ощущение кворума”, формирование биопленок или плодовых тел, различные способы коллективной подвижности, синтез экзоферментов, конъюгативный перенос плазмид и пр.), вышло на качественно новый теоретический и методический уровень. В 2005 г. для данной области исследований предложено название “социомикробиология” (Parsek, Greenberg, 2005). В обзоре А.В. Олескина (2009) отмечено, что бактерии проявляют различные формы коллективного поведения (кооперацию, координированную агрессию и избегание); бактериальные системы характеризуются контактной и дистантной коммуникацией; микроорганизмы формируют надклеточные системы, которые можно рассматривать как бактериальные биосоциальные системы, по аналогии с сообществами животных. Бактериальные биосоциальные системы характеризуются целостностью, единым жизненным циклом и иерархической или сетевой организацией (Олескин, 2009). Таким образом, выбор популяцией микроорганизмов оптимального варианта взаимодействия с внешней средой и клетками высших организмов, осуществляемый в результате обмена информацией между отдельными особями, можно считать социальным поведением.

Новые знания о генетических и внешних факторах, влияющих на социальное поведение ассоциативных бактерий, стимулирующих рост и развитие растений, будут полезны при разработке аграрных биотехнологий, методов мониторинга состояния окружающей среды (создание биосенсоров) и фиторемедиации загрязненных почв.

В качестве основного объекта данного исследования выбраны бактерии штамма Azospirillum brasilense Sp245, обладающие всеми характеристиками, которые могут влиять на их ассоциативное взаимодействие с растениями (диазотрофность, хемотаксис, подвижность, образование фитогормонов, полисахаридов клеточной поверхности и др.). Кроме того, бактерии данного штамма, наряду с бактериями штаммов A. brasilense Sp242, Sp107 и Sp108 (Baldani et al., 1983) и A. irakense KBC1 (Faure et al., 1999), способны не только колонизировать ризосферу, но и проникать внутрь корней и существовать в них в метаболически активном состоянии (Dbereiner, De-Polli, 1981; Jain, Patriquin, 1984). Все перечисленное выше делает бактерии A. brasilense Sp245 крайне интересным объектом для изучения молекулярных основ адаптационного потенциала почвенных микроорганизмов. В работе были использованы и другие штаммы азоспирилл – представители видов A. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum.

Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений, распространены практически во всех климатических зонах и экологических нишах (в почве, в корнях растений, на поверхности подземной и надземной частей растений, в воде и др.) (Umali–Garcia et al., 1980; Басилашвили, Нуцубидзе, 1984; Федорова с соавт., 1985; Assmus et al., 1995; Bashan, Holguin, 1997). В данном контексте интересно сравнение поведения A. brasilense Sp245 и других штаммов для выявления универсальных механизмов, обеспечивающих разнообразные проявления социальной активности азоспирилл.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в комплексном генетико-физиологическом анализе социального поведения ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense.

В связи с поставленной целью в наши задачи входило следующее:

1. Охарактеризовать социальную подвижность штаммов A. brasilense дикого типа и мутантов штамма A. brasilense Sp245 c изменениями в жгутиковании и составе углеводсодержащих полимеров клеточной поверхности.

2. Оценить роль полисахаридов и белка-гемагглютинина, локализованных на клеточной поверхности, в реализации социальной подвижности бактерий штамма A. brasilense Sp245.

3. Изучить возможное влияние на подвижность азоспирилл ряда внешних факторов (состав среды культивирования; присутствие прижизненного красителя конго красного, корневых экссудатов проростков пшеницы, растительных и грибного лектинов, поликлональных антител на поверхностные полимеры бактериальных клеток).

4. Охарактеризовать нуклеотидную последовательность сегмента резидентной 85-МДа плазмиды штамма A. brasilense Sp245, мутагенез которого приводит к дефектам в жгутиковании и/или подвижности азоспирилл.

5. Провести анализ изменений в структуре генома A. brasilense Sp245, сопровождающихся вариациями в социальной подвижности этих бактерий.

6. Исследовать процесс формирования биопленок культурами штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов с изменениями в структуре клеточной поверхности и подвижности на абиотических плотных средах и на корнях проростков пшеницы.

Научная новизна работы. Дана характеристика новых проявлений социальной подвижности азоспирилл: ускоренное роение, зависящее от работы жгутиков, и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний, реализуемое и в отсутствие жгутиков. Описаны новые экстраклеточные органеллы бактерий штамма A. brasilense Sp245 – полярный пучок пилей, продукция которых, возможно, альтернативна сборке полярного жгутика.

Установлено, что социальная подвижность азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбировать прижизненный краситель конго красный.

Показано, что межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, двигающихся в полужидких средах, опосредуются взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида этих бактерий.

Определены некоторые факторы (сниженная концентрация кислорода, аминокислоты аспарагиновая кислота, серин и треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил--D-глюкозамина, соли аммония, нитраты и нитриты), способствующие переходу части популяции клеток A. brasilense от плавания и роения к распространению с образованием микроколоний или оказывающие модулирующее действие на скорость движения клеток.

Обнаружено, что спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальное поведение бактерий. В ДНК 85-МДа плазмиды A. brasilense Sp245 идентифицированы гены hdfR и ccoN, предсказанные белковые продукты которых могут влиять на поведенческие реакции бактерий.

Выявлены поверхностные структуры бактерий и типы подвижности, участвующие в процессе формирования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность” или на корнях проростков пшеницы.

Научно-практическая значимость работы. В данной работе представлены оригинальные мутанты штамма A. brasilense Sp245 с изменениями в индивидуальной и социальной подвижности, продукции жгутиков и поверхностных полисахаридов, которые могут быть полезны при изучении механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Разработанные методические приемы и теоретические положения нашли применение в исследованиях, выполняемых в пяти лабораториях ИБФРМ РАН (генетики микроорганизмов, биохимии, микробиологии, иммунохимии и экологической биотехнологии), объектами которых были не только бактерии рода Azospirillum, но и бактерии других родов (что частично отражено в публикациях, представленных в списке основных публикаций по теме диссертации).

Предложенная биотест-система, основанная на ингибировании подвижности разных штаммов азоспирилл поликлональными антителами на поверхностные бактериальные структуры, может быть использована для первичной оценки серологического родства этих бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности интактных клеток.

Результаты работы использованы при подготовке учебно-методического пособия “Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам” / Составители: Шелудько А.В., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Щеголев С.Ю. / Под ред. Игнатова В.В. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с. Данное пособие, рекомендованное к печати кафедрой органической и биоорганической химии и кафедрой биохимии и биофизики Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского (СГУ), предназначено для студентов и аспирантов химического и биологического факультетов СГУ.

Положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Ускоренное роение и распространение в полужидких средах с образованием микроколоний представляют собой новые проявления социальной подвижности азоспирилл. Коллективное движение азоспирилл определяется не только аппаратом подвижности, но и межклеточными взаимодействиями, обусловленными поверхностными структурами, способными адсорбирировать прижизненный краситель конго красный.

2. Распространение бактерий A. brasilense Sp245 по полужидким средам опосредуется взаимодействием белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Источники азота в окружающей среде и кислород модулируют гемагглютинирующие свойства бактериальных клеток и, как следствие, подобные взаимодействия.

3. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил--D-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense от плавания или роения к распространению с образованием микроколоний. На эффективность роения азоспирилл влияют природа источника азота в среде, концентрация кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы.

4. Генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма A. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и подвижности азоспирилл. На социальное поведение азоспирилл могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в p85 генов hdfR и ccoN – негативный регулятор транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и каталитическая субъединица I цитохромоксидазы, соответственно.

5. Изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Липополисахариды, полисахариды, связывающие калькофлуор, и полярный жгутик участвуют в организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность”.

6. После “заякоривания” на корнях пшеницы формирование биопленки клетками штамма A. brasilense Sp245 и его нероящихся мутантов опосредовано распространением с образованием микроколоний. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

7. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии чужеродного лектина, “распознаются” организмом, продуцирующим лектин, с наименьшим проявлением антагонизма.

8. Эффект ингибирования подвижности азоспирилл антителами на поверхностные структуры или лектинами различного происхождения может быть использован для оценки серологического родства бактерий и степени экспонированности углеводных и белковых компонентов на поверхности клеток.

Диссертационная работа выполнена в лаборатории генетики микроорганизмов (ЛГМ) ИБФРМ РАН в рамках трех плановых тем НИР: “Изучение генов почвенных азотфиксирующих бактерий, определяющих их взаимодействие со злаками” (№ госрегистрации 01960001676); “Изучение вклада плазмид в определение подвижности и образование мажорных компонентов клеточной поверхности у почвенных ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense” (№ госрегистрации 01200606181); “Изучение генетической регуляции социальной подвижности и образования мажорных компонентов клеточной поверхности у бактерий, ассоциированных с растениями” (№ госрегистрации 01200904390). Работа частично поддержана грантом Президента РФ МК-235.2003.04 для молодых кандидатов наук (канд. биол. наук А.В. Шелудько) и их научных руководителей (д-р биол. наук Е.И. Кацы); грантами Президента РФ НШ-1529.2003.4, НШ-6177.2006.4 и НШ-3171.2008.4 для ведущей научной школы засл. деятеля науки РФ, д-ра биол. наук, проф. В.В. Игнатова; грантом Роснауки № 2005-РИ-112/001 (рук. – д-р биол. наук, проф. В.В. Игнатов); грантом Фонда содействия отечественной науке для канд. биол. наук А.В. Шелудько и грантом Российского фонда фундаментальных исследований № 06-04-48204-а (рук. – д-р биол. наук Е.И. Кацы).

Личный вклад автора. Автору принадлежит решающая роль в планировании и осуществлении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. Автор выражает искреннюю признательность своему научному консультанту – заведующей ЛГМ ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Е.И. Кацы за многолетнюю помощь и всестороннюю поддержку работы. Автор признателен участвовавшим в проведении исследований сотрудникам ЛГМ ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.П. Петровой, канд. биол. наук И.В. Борисову, канд. биол. наук О.В. Кулибякиной и О.Э. Варшаломидзе; сотрудникам лаборатории иммунохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.Ю. Матора, канд. биол. наук Г.Л. Бурыгину и канд. биол. наук А.А. Широкову; сотрудникам лаборатории биохимии ИБФРМ РАН д-ру биол. наук Л.П. Антонюк, канд. биол. наук А.В. Тугаровой и В.А. Крестиненко; сотрудникам лаборатории микробиологии ИБФРМ РАН канд. биол. наук Л.В. Степановой, канд. биол. наук Е.Г. Пономаревой и канд. биол. наук Е.П. Ветчинкиной; сотруднику лаборатории физиологии растительной клетки ИБФРМ РАН канд. биол. наук М.К. Соколовой; чей вклад отражен в совместных публикациях; а также другим сотрудникам ИБФРМ РАН, способствовавшим успешному выполнению работы.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на 5-й Школе-конференции молодых ученых “Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000), 10-м Международном конгрессе IUMS The “World of Microbes” (Париж, 2002), 1-й и 2-й Региональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, 2002, 2004), 6-й, 9-й и 10-й Школах-конференциях молодых ученых “Биология – наука XXI века” (Пущино, 2000, 2005, 2006), международной конференции “Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants” (Саратов, 2003), 3-й Всероссийской школе-конференции “Химия и биохимия углеводов” (Саратов, 2004), 30-м конгрессе FEBS (Будапешт, 2005), Всероссийской конференции “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Саратов, 2005), Международной научной конференции “Мiкробнi бiотехнологi” (Одесса, 2006), Международной школе-конференции “Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва–Пущино, 2006), 3-й и 4-й Межрегиональных конференциях молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой” (Саратов, 2006, 2008), Всероссийской конференции с международным участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, 2007), Международной научной конференции “Микроорганизмы и биосфера” (Москва, 2007), 5-м Всероссийском Конгрессе по медицинской микологии “Успехи медицинской микологии” (Москва, 2007), Международном рабочем совещании “Azospirillum VII and related PGPR: Genomics, molecular ecology, plant responses and agronomic significance” (Монпелье, 2007), Международной конференции “Вавиловские чтения–2007”, посвященной 120-летию со дня рождения Н.И. Вавилова (Саратов, 2007), Международной научно-практической конференции “Вавиловские чтения–2008”, посвященной 95-летию Саратовского госагроуниверситета (Саратов, 2008), 5-м Московском междунар. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития” (Москва, 2009), отчетных научных конференциях ИБФРМ РАН (Саратов, 2003, 2004, 2008).

Диссертационная работа обсуждена и одобрена на расширенном заседании лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН 09.06.2010, протокол № 175.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 работ, в том числе, 18 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных научных результатов диссертаций на соискание ученых степеней доктора и кандидата наук.

Структура и объем диссертации. Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 24 таблицы и 54 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения и обсуждения результатов собственных исследований (из 14 подразделов), а также заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 510 литературных источников, из них 80 на русском и 430 на английском языках. В приложении приведены аннотированные нуклеотидные последовательности обсуждаемых в работе генов 85-МДа плазмиды бактерий штамма A. brasilense Sp245, депонированные в международную базу данных GenBank (NCBI, США) (GenBank accession no. EU194339, EU784144, EU595702, EU595701 и EU595706).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает подразделы: 1.1 Общая характеристика ассоциативных бактерий рода Azospirillum; 1.2 Мажорные углеводсодержащие полимеры бактериальной поверхности; 1.3 Межклеточная коммуникация бактерий; 1.4 Двигательные органеллы бактерий; 1.5 Поведение бактерий, обусловленное подвижностью; 1.6 Формирование бактериями биопленок.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использованы бактерии штаммов дикого типа A. brasilense Cd, KR77, S17, S27, Sp7, Sp107, Sp245, SpBr14, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794 и UQ1796, A. halopraeferans AU4, A. irakense KA3 и KBC1, A. lipoferum Sp59b, SpRG20a и SpRG6xx; 36 мутантов (табл. 1) и спонтанных производных A. brasilense Sp245; три мутанта A. brasilense S27 (KS107, KS109 и KS122); три штамма Escherichia coli; 11 рекомбинантных плазмид; а также растительный и грибной объекты – мягкая яровая пшеница Triticum aestivum cv. Саратовская 29 и базидиальный ксилотроф Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917.

Таблица 1. Характеристика мутантов A. brasilense Sp245

Штамм Фенотип Характеристика плазмид
Sp245 Дикий тип p85, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
Sp245.5 Cal LpsI LpsII Swa+ * четыре плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
KM018 Cal LpsII Mot Swa Gri+ p85, p120::Omegon–Km и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
KM127 LpsI Swa++
KM134 LpsI Swa++
KM139 LpsII Swa++
KM252 Cal LpsI Swa+
KM348 LpsI Swa++
SK048 Fla Mot Swa Gri+
SK051 Leaky Fla Laf Mot Swa Gri+ p85::pJFF350, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
SK248 Mot Swa Gri+
BK570 Swa++
BK571 Swa++
BK759G Fla Swa Gri+
BK759P Fla+ Swa++ 36-МДа плазмида, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
BK468 Swa++ p85, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
SK005 Fla Laf Mot Swa Gri+
SK039 Leaky Fla Mot Swa Gri+
SK237 Fla Swa Gri+
SK454 Fla leaky Laf Swa Gri+
SK531 Fla Laf Mot Swa
SK586 Fla Laf Swa
KZ019 Fla Swa p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
KZ020 Leaky Fla Mot Swa
KZ044 Fla Swa
KZ042 Swa++ p85::pSUP5011, p120 и три плазмиды с молекулярной массой более 300 МДа
KZ050 Swa++

Примечание: * – диффузная колония.

В главе 2 описаны: питательные среды и условия выращивания бактерий, гриба и проростков пшеницы; методы изучения ряда биохимических, физиологических и морфологических характеристик бактериальных культур; иммунохимические методы анализа различий в продукции бактериями полисахаридов и белков; методы анализа ДНК и свойств предсказанных белковых продуктов кодирующих последовательностей. Все количественные результаты подвергали статистической обработке с использованием пакета Microsoft Office Excel 2003 (11.6355.6360) SP1. Доверительные интервалы определяли для 95% уровня значимости.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Индивидуальная и социальная подвижность азоспирилл, зависящая от работы жгутиков. Выросшие в жидкой среде азоспириллы синтезируют длинный жгутик (Fla), располагающийся на одном из полюсов клетки. Активность Fla обеспечивает возможность клеткам штамма Sp245 плавать прямолинейно вдоль их длинной оси со средней скоростью 29.0±1.1 мкм/с. После точечного посева в агаризованную питательную среду клетки Sp245 переходят к роению при помощи жгутиков и формируют макроколонию, имеющую вид концентрической структуры (Swa+–фенотип, от англ. swarming) (рис. 1). Внимание к поведению азоспирилл на полужидких агаризованных средах обусловлено возможностью в данных условиях смоделировать физико-химические свойства муцигеля (Скворцов, 1994), окружающего бактерии на корнях растения. Стоит отметить, что использование агаризованных сред позволяет выявить у бактерий способность к различным типам коллективной подвижности, опосредуемым не только жгутиками, но и обусловленными другими механизмами (Henrichsen, 1972). Формирование роящимися клетками на средах, содержащих от 0.4–0.6% агара, концентрических макроколоний у штамма Sp245 происходит после 2.5–5-часового латентного периода и сопровождается увеличением на 15–20% продольного размера клеток и, как и у других штаммов A. brasilense (Moens et al., 1995), синтезом дополнительных латеральных жгутиков (Laf). Концентрические макроколонии образуют роящиеся бактерии всех штаммов, исследованных нами, – представителей A. brasilense, A. halopraeferans, A. irakense и A. lipoferum, что позволяет определить описанную морфологию колоний как характерную для рода Azospirillum. Отчасти это может быть обусловлено формой клеток азоспирилл и характером расположения на них жгутиков.

Получены производные штамма A. brasilense Sp245, распространяющиеся по полужидким средам со скоростью коллективной миграции клеток, превышающей подвижность родительского штамма (Swa++–фенотип), а также мутанты, утратившие способность к жгутиковой подвижности (Swa–фенотип) (табл. 1, рис. 1). Например, штамм BK570, клетки которого распространяются в малатно-солевой среде (MSM) с 0.3 или 0.4% агара примерно в 2 раза быстрее, чем у штамма Sp245 (рис. 1). Клетки BK570 движутся активнее Sp245 также и в жидкой среде (34.8±1.0 и 29.0±1.1 мкм/с, соответственно). Различия в поведении Swa++–, Swa–мутантов не зависели от использованного источника углерода или азота в среде.

Считается, что именно активность Laf обеспечивает роение азоспирилл на агаризованных средах. Однако в отличие от сохраняющего подвижность на полужидких средах Fla Laf+–мутанта A.brasilense Sp7 (Hall, Krieg, 1983), полученные нами Fla Laf+, Fla/Mot Laf+ и Mot Laf+ Omegon–Km–мутанты (SK039, SK048 и SK248) штамма Sp245, а также Fla leaky Laf мутант SK454, синтезирующий Laf в меньшем количестве, не способны к роению с образованием концентрических макроколоний. Fla leaky Laf (KZ019 и KZ044) и Mot leaky Fla Laf+ (KZ020) Tn5–Mob –мутанты мутанты Sp245, а также TnphoA Fla Laf+ (KS107 и KS122) и Fla leaky Laf (KS109) мутанты A. brasilense S27 тоже не способны к роению. Результаты изучения поведения в полужидких средах Fla Laf+/Fla leaky Laf производных A. brasilense Sp245 и S27 и данные по подвижности аналогичных мутантов штамма Sp7 (Hall, Krieg, 1983) свидетельствуют о том, что мы наблюдаем некоторые внутривидовые различия, характеризующие роль Laf в обеспечении подвижности азоспирилл на агаризованных средах. По крайней мере, у двух штаммов, A. brasilense Sp245 и S27, и Fla обеспечивает распространение бактерий по полужидким средам.

3.2 Миграция A. brasilense с образованием микроколоний, не зависящая от жгутиков. Наблюдения за поведением одного из Swa–мутантов штамма Sp245, SK048 (Fla Mot) позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Бактерии дикого типа за 18 ч инкубации образуют концентрические колонии. Клетки мутанта более 18 ч остаются в точке инокуляции (Swa–фенотип), а затем начинают перемещаться, формируя небольшие диски, состоящие из клеточных агрегатов – Gri–распространение (от англ. granular inclusions) (рис. 2). Как правило, морфология макроколоний соответствует определенному способу социальной подвижности микроорганизмов (Henrichsen, 1972). Возможно, изменение морфологии макроколоний у SK048 обусловлено использованием клетками способа коллективной миграции, скрытытого у дикого типа в лабораторных условиях, но ставшего единственным способом распространения мутанта.

Способность к Gri–распространению удалось обнаружить не только у мутанта SK048, но и у ряда других Swa–производных штамма Sp245. Инокулированные с плотной MSM в среды, содержащие от 0.2 до 0.9% агара, клетки омегоновых Swa–мутантов (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, SK531, SK586, KM018, BK759G), в отличие от роящихся штаммов Sp245 и BK570, либо остаются в месте укола, либо образуют зернистые зоны распространения. В случае SK248 бактерии остаются в точке инокуляции в полужидкий агар, но иногда образуют зернистые или смешанные мутно-зернистые колонии. В полужидкой MSM мутанты SK005 (Fla Laf Mot), SK039 (leaky Fla Mot), SK048 (Fla Mot), SK051 (leaky Fla Laf Mot), SK237 (Fla), SK248 (Mot), SK454 (Fla leaky Laf) и KM018 (Cal LpsII Mot) демонстрировали фенотипическую вариацию (либо Swa Gri, либо Swa Gri+–фенотип) при одной и той же температуре независимо от концентрации (от 0.2 до 0.6%) агара и используемого источника углерода. В случае SK531 (Fla Laf Mot) и SK586 (Fla Laf) клетки преимущественно оставались в точке инокуляции – Swa Gri–фенотип колоний. При концентрации агара в среде выше 0.6% все использованные в эксперименте штаммы к 48 ч инкубации либо остаются в месте инокуляции, либо начинают распространяться, но не в толще и не по поверхности агара, а по дну чашки Петри, если там имеется немного влаги. Стоит отметить, что клетки штамма дикого типа, мигрирующие по дну чашки Петри, также иногда распространяются с образованием микроколоний. Не исключено, что дефицит кислорода, который будет возникать под толщей агара, может способствовать переходу клеток Sp245 к Gri–подвижности. Причина такого перехода может быть обусловлена подавлением подвижности при помощи жгутиков в условиях недостатка кислорода. Так, у A. brasilense вращение полярного жгутика обеспечивается трансмембранной разностью потенциалов Na+ (µNa+), в создании которой существенную роль играет активируемая дыханием натриевая помпа (Wood et al., 1998).

Период, предшествующий Gri–распространению, например, у штаммов A. brasilense SK048, SK039, SK051, SK248 и SK454 длится около 24–42 ч. Мутанты не отличаются от дикого типа в скорости роста. По-видимому, у Gri+–мутантов, активация генов, обеспечивающих Gri–распространение, происходит при достижении определенной плотности популяции бактерий через стадию неподвижных особей. На средах с концентрацией агара от 0.4% и выше на клетках штаммов Sp245, SK039, SK048 и SK248 синтезируются многочисленные Laf. У SK454 Laf образуются в меньшем количестве, а у SK051 Laf отсутствуют. Однако диаметр Gri+–колоний, образуемых мутантами, не зависел от присутствия Laf или от их количества. Так, у SK039, SK048, SK248, SK454 и SK051 через 48 ч инкубации на полужидкой MSM с 0.4% агара размер колоний составлял 7.1±0.8, 10.7±1.3, 7.3±0.9, 10.4±1.0 и 8.0±0.7 мм, соответственно. Таким образом, на способность к Gri+–распространению и эффективность такого способа миграции бактерий не влияет присутствие на клетках Laf. В пользу данного предположения свидетельствует поведение в полужидких средах клеток KZ019, KZ020 и KZ044 – Tn5–Mob–мутантов A. brasilense Sp245. Сохраняя способность к синтезу Laf, клетки мутантов KZ019, KZ044 (Fla leaky Laf) и KZ020 (Mot leaky Fla) на полужидких средах неподвижны (Swa Gri–фенотип), как и омегоновые мутанты SK531 (Fla Laf Mot) и SK586 (Fla Laf), лишенные Laf.

Мы не наблюдали заметных различий в морфологии колоний у Sp245 и его Gri+–мутантов, выращенных на плотных средах MSM или LB. Большинство мутантов не отличались от штамма Sp245 дикого типа по продукции О–специфических полисахаридов (ОПС) и полисахаридов, связывающих калькофлюор (ПССК) (Cal+–фенотип). Исключением являлись SK051 имеющий Cal–фенотип, а также Cal–штамм KM018, утративший один из липополисахаридов (ЛПСII). Однако ряд других мутантов (KM127, KM139, KM252 и KM139) с изменениями в продукции ОПС и ПССК сохраняли способность к плаванию и роению. Таким образом, у Gri+–мутантов способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности.

Анализ поведения A. brasilense Sp245 и его Swa–мутантов на полужидких средах свидетельствует, что утрата способности к роению мутантами Sp245 с нарушениями продукции и функционирования жгутиков позволила обнаружить у A. brasilense способ распространения с образованием микроколоний, который скрыт у штамма дикого типа. Вероятно, для реализации механизма Gri–распространения бактерии не используют жгутики. Интересно, какие же клеточные структуры могут способствовать миграции бактерий и формированию агрегатов. Просвечивающая электронная микроскопия клеток SK048, выращенных на плотной среде, показала наличие пучка пилей на одном из полюсов клетки. Необходимо отметить, что хотя в жидких аэрируемых культурах около 10% клеток SK048 все еще продуцировали длинный или укороченный Fla (Шелудько, 2000), мы никогда не наблюдали Fla у бактерий SK048, выросших на плотной среде. Пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток других омегоновых мутантов и самого штамма Sp245, выращенных в жидкой или на плотной среде. Необходимо отметить, что визуализировать пили было довольно сложно, возможно, из-за их хрупкости. Расположение обнаруженных на клетках азоспирилл пилей соответствует локализации образующих полярный пучок пилей Bfp (от англ. bundle–forming pilus). Bfp обеспечивают тянущую подвижность Pseudomonas aeruginosa и ряда других грам–отрицательных бактерий, скольжение почвенных бактерий Myxococcus xantus и требуются для агрегации клеток (Henrichsen et al., 1972; Harshey, 2003). При световой микроскопии мы наблюдали характерные для тянущей подвижности подергивания клеток у SK048 в капельке жидкости, выдавленной из плотной среды, на которой рос мутант, после наложения на колонии покровного стекла. Подергивания клеток, сопровождающиеся изменением их положения в пространстве, отмечены нами и при микроскопии Gri–колоний, например, SK048, SK051, SK248 или SK454, сформированных бактериями в полужидкой среде.

Мы ни разу не наблюдали Fla и полярные пили на одной и той же клетке при просмотре препаратов для просвечивающей электронной микроскопии клеток, выращенных на плотной среде или в жидкой культуре. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл. Необходимо отметить, что распространение с образованием микроколоний наблюдалось в случае мутантов A. brasilense Sp245 (SK005, SK039, SK048, SK051, SK237, SK248, SK454, KM018, BK759G), у которых Fla либо не продуцировался, либо был парализован. Кроме того, при предварительном культивировании родительского штамма в статичных условиях, неблагоприятных для работы Fla, наблюдается пусть незначительное, но увеличение частоты перехода азоспирилл к Gri+–распространению (см. ниже). Возможно, собственно вращающийся Fla или иные компоненты функционирующей Fla–системы каким-то образом вовлечены в регуляцию частоты фенотипической вариации у A. brasilense. Также не исключено, что у систем, обеспечивающих Swa– или Gri–подвижность, существуют общие контролирующие элементы, поскольку среди мутантов A. brasilense Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков встречаются Swa Gri–штаммы (SK531, SK586, KZ019, KZ020 и KZ044). К настоящему времени в литературе появились сообщения, свидетельствующие о том, что у азоспирилл в геноме присутствуют локусы, обуславливающие синтез пилей (Кацы, 2002а; Valverde et al., 2006).

Наблюдения за поведением Sp245 и его Swa–мутантов на полужидких средах позволили обнаружить у азоспирилл способ распространения с образованием микроколоний, скрытый у штамма дикого типа, что может быть обусловлено как большей скоростью миграции Swa+–клеток (рис. 2), так и доминированием в популяции Sp245 роящихся особей. Возможно, тестирование подвижности в полужидких средах отдельных бактериальных клонов позволит охарактеризовать фенотипические вариации в способах распространения Sp245. Оказалось, что после инокуляции в полужидкую MSM (0.4% агара) отдельных колоний Sp245 с плотной MSM через 48 ч шесть (3103) из 1814 клонов демонстрируют Gri+–фенотип. Необходимо отметить, что мы наблюдали синтез Bfp не только у Swa–мутантов, но и у клеток дикого типа. Восемьдесят одна колония (5102) вообще не распространилась в агаре (Swa Gri), а другие клоны образовали кольца роения. Проверка стабильности выявленных производных Sp245 показала, что в использованных нами лабораторных условиях клоны этого штамма со спонтанным Gri+ или Swa–фенотипом оказались нестабильными (бактерии восстанавливали способность к роению). По описанной выше экспериментальной схеме было изучено поведение мутанта SK048 и отмечено появление Swa колоний с частотой 1101. Эти Swa–колонии впоследствии дали начало Gri+ и Swa–потомкам. Остальные колонии, образованные отдельными клонами SK048, были Gri+.

Образование клеточных агрегатов на корнях растений характерно для азоспирилл (Murthy, Ladha, 1987), но природа клеточных структур и механизмов, определяющих агрегацию бактерий, остается не выясненной. Не исключено, что в случае клонов, выделенных после колонизации штаммом Sp245 корней пшеницы (бактерии находились 7 суток или 21 день на растениях, росших в жидкой среде), Gri+–распространение станет преобладать. Однако анализ подвижности на полужидкой MSM клонов Sp245, выделенных после колонизации этим штаммом корней пшеницы, не подтвердил данное предположение – увеличивалось лишь число Swa Gri–колоний, высеянных с корней 24–дневных растений (101 клонов). Не исключено, что способ распространения A. brasilense в форме микроколоний, или клеточных агрегатов, является предпочтительным лишь при определенных условиях окружающей среды, например, в слизи, выделяемой корнями растений.

Для A. brasilense было показано (Wood et al., 1998), что связанная с дыханием активность Na+–помпы, по-видимому, служит движущей силой для вращения Fla. Интересно было определить, стимулируют ли условия недостатка кислорода появление Gri+ или Swa–колоний. Серийные разведения 24–ч статичных культур Sp245 смешивали с расплавленной MSM, содержащей 0.4% агара и выливали смесь на чашки Петри. После застывания агара инкубировали при 32C. Через 48 ч колонии формировали нераспространяющиеся Swa–клоны (259 клонов) (размер колоний не изменялся через 72 или 144 ч), колонии с мутноватым Gri+–фенотипом (34 клона) или колонии с Swa+–фенотипом (остальные из 3235 клонов). Таким образом, частота появления Swa (8102) или Gri+ (1102)–фенотипа слегка возрастала в результате преинкубации Sp245 без аэрации с последующей инокуляцией бактерий непосредственно в полужидкую среду, в которой возможно формирование области с пониженным содержанием кислорода, неблагоприятно влияющей на работу Fla. Стоит отметить, что Swa или Gri+–фенотип оказался нестабильным и в этой серии экспериментов. Клетки SK048, выращенные в жидкой среде в условиях недостатка кислорода, протестировали так же, как и Sp245. Четыре из 680 колоний (6103), появившихся через 72 ч, показали смешанный фенотип. У двух колоний наблюдались небольшие кольца роения, а в случае двух других клонов Swa–сектора распространялись из Gri+–зон. После одного пассажа этих 4-х колоний на плотной MSM и последующей инокуляции уколом в полужидкую среду все клеточные линии демонстрировали Swa–фенотип в течение 48 ч и стали зернистыми через 72 ч. Тридцать пять (~5102) из 680 колоний, появившихся в полужидкой среде через 72 ч, были Swa, а оставшаяся 641 колония – Gri+.

3.3 Особенности продукции и работы флагелл у роящихся дериватов Gri+штаммов A. brasilense и у производных A. brasilense с ускоренным роением. Интересен BK759.G – Fla Gri+–мутант Sp245, клетки которого из сектора зоны роения, выходящей из Gri+–колонии, сохраняют способность к роению, в отличие от особей с подобным поведением у SK048. Так, часто на полужидкой среде у BK759.G из произвольной точки зоны распространения микроколониями возникает фронт роения (рис. 3). Клоны, отсеянные из образовавшихся фронтов роения (ВК759.Р), приобретали устойчивый фенотип Swa++. Способность к Swa++–распространению сохранялась у них после многократных пассажей на плотной среде. Важно отметить, что переходы ВК759.G к роению происходили только в полужидкой среде. Инокулированные в такую среду бактерии, выращенные в бульонной культуре, или отдельные колонии с плотной среды, всегда давали Gri+–фенотип. Электронная микроскопия ВК759.Р показала, что клетки восстанавливали способность к синтезу Fla, отсутствующего у ВК759.G, как в жидких, так и на агаризованных средах. Количество Laf у ВК759.Р сохранялось на уровне штаммов Sp245, ВК759.G и BK571 (Swa++). Таким образом, результаты изучения морфологии клеток Gri+–мутанта ВК759.G и его Swa++–производного ВК759.Р показывают, что переход от Gri–распространения к роению сопровождается восстановлением Fla.

Довольно часто на 3–4-е сутки после посева культуры клеток штамма A. brasilense Sp245 уколом в полужидкую MSM от внешней границы колец роения начинают отходить так называемые “протуберанцы” (или выпячивания), имеющие бльшую скорость роения (рис. 3в). В результате рассева бактерий из протуберанцев до отдельных колоний и перепроверки скорости их роения были отобраны пять спонтанных производных Sp245 со стабильным фенотипом Swa++ (Sp245.P1–Sp245.P5). На полужидкой среде диаметр колец роения, формируемых штаммами Sp245.P1–Sp245.P5, превышал таковой у Sp245 примерно в 1.8–2.5 раза. При этом еще более быстро роящиеся клоны в популяции Swa++–производных Sp245 не появлялись. Скорость роста в жидкой и на плотной MSM у Sp245 и Sp245.P1–Sp245.P5 была практически одинаковой. На плотной MSM морфология колоний Swa++–вариантов была такой же, как у родительского штамма. В жидких культурах характер движения клеток Swa++–производных Sp245 не отличался от такового у штамма дикого типа, а в средах, содержащих 0.3–0.4% агара, они перемещались, как и у BK570, на более протяженные отрезки, чем клетки дикого типа. В жидкой или содержащей 0.3% агара MSM (на клетках есть только Fla) скорость движения отдельных клеток Swa++–производных Sp245 (Sp245.P1–Sp245.P5), как и у BK570, была выше, чем у Sp245, а при большей концентрации агара (на клетках есть Fla и Laf) эти различия исчезали. По-видимому, удлинение траектории прямолинейного движения и увеличение скорости движения клеток Swa++–штаммов зависели от активности именно Fla.

Можно сделать несколько предположений о причине Swa++–фенотипа азоспирилл. Например, ускоренная миграция в полужидких средах может быть следствием каких-то изменений в клеточной энергетике, обеспечивающей вращение Fla (Wood et al., 1998). Взаимосвязь между высокими скоростями миграции в полужидких средах и подвижностью при помощи Fla прослеживается в случае омегонового Swa++–мутанта BK570 и спонтанных Swa++ –производных Sp245.P1–Sp245.P5.

Появление среди клеток BK759.G, формирующих агрегаты при колонизации полужидких сред, субпопуляции бактерий c восстановленной способностью не просто к роению, а к роению, эффективность которого гораздо выше, чем у родительского штамма, наводит на мысль, что Swa++–фенотип BK759.P связан с активностью Fla. Однако у Swa++–мутантов BK759.P, BK468 и BK571 клетки движутся при помощи Fla в жидких средах с той же скоростью, что и бактерии родительского штамма (у BK759.P, BK468 и BK571 скорость составляла 29.2 ± 2.5, 33.2 ± 1.5 и 31.9 ± 2.0 мкм/с, соответственно, а у Sp245 – 30.3 ± 1.5 мкм/с). Таким образом, ускоренная миграция в полужидких средах может быть не только следствием каких-то изменений в клеточной энергетике, обеспечивающей вращение Fla (Wood et al., 1998), но и обусловлена другими причинами. Возможно, у каких-то Swa++–производных структура полярного жгутика, обеспечивающего активность роящихся клеток, модифицирована таким образом, что Fla способен эффективнее вращаться в полужидком агаре. Например, показано, что флагеллин Fla у A. brasilense Sp7 гликозилирован (Moens et al., 1995). Также показано, что филамент Fla у A. brasilense покрыт полисахаридным чехлом (Бурыгин, 2003). Можно предположить, что модификация в гликозильной части флагеллина или в его полисахаридном чехлике приводит к облегчению вращения Fla в полужидких средах. Нельзя исключать, что Swa++–производные сверхпродуцируют позитивный гипотетический регулятор коллективного распространения бактерий в полужидких средах (или у них снижен уровень синтеза негативного регулятора). Причина быстрого распространения также может быть приписана более интенсивному потреблению питательных соединений и, в результате, ускоренному образованию градиентов последних, по которым двигались бактерии. Однако стоит отметить, что скорость роста в жидкой и на плотной MSM у всех омегоновых мутантов не отличается от таковой у штамма Sp245.

3.4 Влияние продуктов бактериального метаболизма на социальную подвижность азоспирилл. Получены косвенные данные, что характер и эффективность распространения азоспирилл в полужидких средах обусловлены продуцируемыми бактериями метаболитами. Так между макроколониями азоспирилл остаются незарастающие зоны (демаркационные зоны) (например, рис. 3). В местах сближения границ фронтов движущихся бактерий форма колонии искажается. Образование незарастающих зон происходит независимо от состава среды. Столкновение фронтов движущихся бактерий может быть обусловлено ингибирующим действием метаболитов, выделяемых микроорганизмами, концентрация которых удваивается в зоне сближения колоний (Иваницкий, 1999). Выделяемые азоспириллами какие-либо ингибиторы могут способствовать перемещению клеток из точки инокуляции (как при Swa–, так и при Gri–подвижности), а также препятствовать сближению микроколоний при Gri–распространении. Их действие на медленно движущиеся клетки Gri+–мутантов будет мешать сближению бактерий, что может способствовать образованию клеточных агрегатов, состоящих из сохраняющих межклеточные связи потомков изолированных друг от друга особей.

3.5 Влияние модификаций клеточной поверхности, вызванных адсорбцией прижизненного красителя конго красного, на подвижность азоспирилл. Механизмы, обусловливающие вариации в коллективной подвижности бактерий, зависят не только от работы двигательных органелл, но и от межклеточных взаимодействий (Harshey, 2003), которые определяются структурой бактериальной поверхности. По-видимому, изменения в структуре бактериальной поверхности могут быть индуцированы адсорбцией на клетках прижизненных красителей. Так, углеводсодержащие полимеры A. brasilense способны к образованию комплексов с конго красным (Skvortsov, Ignatov, 1998). В результате на плотной среде с красителем колонии азоспирилл приобретают красную окраску (Bastarrachea et al., 1988). Следует отметить, что конго красный может взаимодействовать и с белковыми компонентами поверхности бактерий (Hammar et al., 1995).

При определении способности к адсорбции конго красного штаммом Sp245, его Swa++–производными и неспособными к роению мутантами строгой корреляции между интенсивностью адсорбции красителя бактериями, инкубируемыми на плотной среде с красителем, и размером и морфологией колоний, образующихся в полужидкой MSM, нами не выявлено. Количество колониеобразующих единиц (КОЕ) в жидких 24-часовых культурах A. brasilense Sp245 в MSM без красителя или с конго красным (37.5 мкг/мл), было практически одинаковым. Выращенные в жидкой MSM, содержащей 37.5 мкг/мл красителя, клетки обладали внешне нормальным Fla. При культивировании в жидкой MSM, содержащей конго красный (но не при добавлении красителя к выросшей культуре), скорость движения клеток, за исключением клонов CRP (см. ниже), снижалась (табл. 2).

Таблица 2. Средняя скорость движения клеток штамма A. brasilense Sp245 и его производных, выращенных в жидкой или полужидкой среде

Штамм A.brasilense Средняя скорость движения клеток, мкм/с
в жидкой среде в полужидкой MSM с концентрацией агара, %
MSM MSM + конго красный* 0.3 0.4 0.6
Sp245 29.0±1.1 14.9± 0.7 14.4±1.8 12.4±1.1 8.7±1.3
BK570 34.8±1.0 21.4±2.7 19.9±1.8 14.0±1.9 8.8±1.2
Sp245.P1 36.8±2.1 17.7±1.0 17.7±1.4 13.3±0.6 8.2±0.9
Sp245.P2 34.3±1.9 18.9±1.6 18.2±1.2 14.3±1.8 8.3±1.3
Sp245.P3 36.0±2.2 22.4±2.3 18.1±1.3 14.1±1.2 8.7±1.4
Sp245.P4 36.7±3.4 19.8±2.0 17.3±1.2 14.0±1.3 8.4±1.2
Sp245.P5 35.3±2.5 19.2±2.2 18.2±1.8 14.2±1.6 8.6±1.3
Sp245.CRP 28.5±2.0 26.0±1.8 13.6±1.3 12.8±1.1 8.2±1.1
Sp245.P1.CRP1 30.5±2.9 26.7±1.9 13.6±1.5 11.8±1.8 7.8±1.0
Sp245.P1.CRP2 29.3±2.3 24.5±1.9 13.7±1.2 12.6±1.0 8.7±1.0

Примечание: *Концентрация конго красного составляла 37.5 мкг/мл.

На полужидкой MSM, содержащей конго красный, штаммы Sp245, Sp245.Р1–Sp245.P5 и BK570 радикально меняли свое поведение и начинали мигрировать с образованием микроколоний (рис. 4б) через 24 ч после инокуляции (без красителя движение начиналось через 2.5–5 ч). Макроколонии названных штаммов имели светло-красную окраску. В случае мутантов SK048, SK051, SK248 и SK454 конго красный не влиял на продолжительность фазы (~24–42 ч), предшествующей началу Gri–распространения.

Выделены производные Sp245 (Sp245.CRP) и Sp245.Р1 (Sp245.Р1.CRP1–Sp245.Р1.CRP4), способные к роению и в присутствии красителя. При этом зоны роения, в отличие от светло-красных Gri+ –макроколоний, приобретали в полужидкой среде оранжевую окраску.

На плотной MSM CRP–варианты адсорбировали конго красный по–разному: колонии Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP1 были светло–розовыми, а Sp245.P1.CRP2 – ярко-красными. Иными словами, изменение плотности среды и/или концентрации кислорода и/или локальной концентрации бактерий влияло на структуру клеточной поверхности азоспирилл, взаимодействующей с красителем. Диаметр колец роения, образуемых штаммами Sp245.P1.CRP(1–4) и Sp245.CRP в полужидкой MSM, был примерно на 32% меньше, чем таковой у Sp245. В присутствии 37.5 мкг/мл конго красного диаметр колец роения Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP(1–4) уменьшался. Скорость движения клеток Sp245, Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP в жидкой MSM без красителя была практически одинаковой (табл. 2). При выращивании бактерий в жидкой среде с конго красным скорость перемещения клеток Sp245.CRP и Sp245.P1.CRP, в отличие от таковой у штамма дикого типа и его суперроящихся производных, почти не снижалась (табл. 2). По-видимому, варианты Sp245.CRP и Sp245.Р1.CRP способны преодолевать ингибирующее действие конго красного за счет модификации экстраклеточных соединений, образующих комплексы с красителем. Стоит отметить, что модификации экстраклеточных соединений в случае роящихся в присутствии конго красного производных Sp245.P1, возможно, затрагивают структуры, связанные с Fla, поскольку скорость движения клеток Sp245.P1.CRP1 и Sp245.P1.CRP2 ниже, чем у родительского варианта. Это могут быть изменения в гликозильной части флагеллина или в его полисахаридном чехлике.

Было изучено влияние разных концентраций конго красного на коллективную подвижность в полужидкой MSM штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов. Обнаружен переход Sp245 и BK570 от образования концентрических колец роения (при концентрации конго красного, не превышающей 2.3 мкг/мл) через макроколонии смешанного мутно–зернистого фенотипа (в присутствии 2.3–9.3 мкг/мл конго красного) к распространению с образованием микроколоний (при концентрации красителя выше 9.3 мкг/мл). У SK051, SK248 и SK454 на средах с конго красным отмечено замедление коллективной подвижности и сохранение зернистой морфологии макроколоний.

Скорости движения одиночных клеток штамма Sp245, выращенных в жидкой MSM с конго красным или в полужидкой MSM с 0.3–0.4% агара, различались мало (табл. 2). На полужидких средах без конго красного, независимо от содержания агара и степени торможения клеток, культуры Sp245 формировали концентрические кольца роения. Зернистые макроколонии Sp245 образовывались только в присутствии красителя. Вероятно, Sp245 продуцирует, по меньшей мере, два соединения, взаимодействующие с конго красным и способствующие коллективной миграции бактерий. Если конго красный блокирует соединение, необходимое для роения клеток, у бактерий снижается подвижность, обеспечиваемая жгутиками, и индуцируется Gri+–фенотип. Второе из соединений, возможно образующее менее прочный или менее специфичный комплекс с красителем, может быть необходимым как для роения, так и для распространения азоспирилл с образованием микроколоний. Слабое взаимодействие конго красного со вторым соединением приводит к небольшому снижению скорости Gri+–распространения бактерий. Когда первое соединение заблокировано, другие компоненты клеточной поверхности могут восполнить недостающие функции (например, в результате повышения уровня продукции), помочь клеткам преодолеть ингибирующее действие конго красного и возобновить роение (если жгутиковый аппарат клеток не поврежден в результате мутации).

Описана способность поверхностных полимеров поверхности клеток A. brasilense Sp245 адсорбировать конго красный. Так, смещение длинноволнового максимума поглощения конго красного, свидетельствующее о формировании комплекса (Wood, 1980), в случае добавления к раствору красителя липополисахарид-белкового комплекса (ЛПБК) штамма Sp245 составляло 19 нм, а в случае добавления кислых полисахаридов (ПС), выделенных из полисахарид-липидного комплекса (ПСЛК) этого штамма, – 5 нм (Коннова, 2002). Смещение максимума поглощения можно наблюдать не только при добавлении к раствору красителя препаратов бактериальных полимеров, но и в том случае, если конго красный адсорбирован на поверхности интактных клеток (Weimer et al., 1998). По нашим наблюдениям смещение максимума поглощения конго, накопленного клетками штамма Sp245, составляет 19.4±1.8 нм, что сопоставимо с показателем, свидетельствующим о формировании комплекса красителя с ЛПБК штамма Sp245.

Бактерии рода Azospirillum способны к ассоциативному взаимодействию с чрезвычайно широким кругом растений. При колонизации корней растений часто происходит образование микроколоний азоспирилл посредством неизученных механизмов (Burdman et al., 2000). Формирование зернистых дисков на средах с конго красным наблюдалось у 15 исследованных штаммов A. brasilense (Cd, KR77, S17, S27, Sp7, Sp107, Sp245, SpBr14, SR8, SR15, SR55, SR75, SR80, UQ1794, UQ1796) дикого типа, у 2-х штаммов A. irakense (KA3, KBC1) и 2-х штаммов A. lipoferum (Sp59b, SpRG20a), независимо от их происхождения или различий в скорости роения на среде без красителя. Отсутствие перехода к Gri–распространению отмечалось у штаммов A. halopraeferans AU4 и A. lipoferum SpRG6xx.

3.6 Роль полисахаридов клеточной поверхности в реализации социальной подвижности A. brasilense. Выше показано, что азокраситель конго красный осуществляет роль модулирующего фактора, нарушающего контакты между бактериями. Вероятно, природа взаимодействий, определяющих такие контакты азоспирилл, может определяться поверхностными полисахаридами.

3.6.1 Изменения в подвижности у cal и lps мутантов A. brasilense Sp245. Анализ поведения на полужидких средах нескольких классов cal и lps мутантов Sp245 показал, что наиболее существенно изменилось поведение на агаризованных средах спонтанного мутанта Cal LpsI LpsII Sp245.5. В полужидкой среде клетки Sp245.5 формируют “диффузную” колонию, тогда как бактерии дикого типа образуют четко очерченный диск. В случае мутанта фронт движущихся бактерий в отличие от дикого типа характеризуется несколько меньшей плотностью клеток. Размер колоний, сформированных за 36 ч подвижными клетками Sp245.5 на MSM (0.4% агара), превышает таковой у Sp245 и составляет соответственно штамму 26.1±0.8 и 21.8±0.8 мм. Интересно, что у мутанта скорость движения клеток в жидких средах (обеспечиваемая активностью Fla) ниже, чем у дикого типа (17.1±0.8 и 29.0±1.1 мкм/с, соответственно). В присутствии конго красного распространяющиеся клетки Sp245.5, в отличие от Sp245, сохраняют морфологию колоний, наблюдаемую на среде без красителя. Таким образом, последствиями существенных изменений в свойствах поверхностных полисахаридов могут быть изменения межклеточных контактов, опосредуемых либо полисахарид–полисахаридными взаимодействиями, либо связями полисахаридов с белковыми или липидными компонентами бактериальной поверхности.

Если мутация приводит к изменениям, затрагивающим свойства одного или двух полисахаридов, столь радикальных изменений в поведении клеток, как у Sp245.5, не наблюдается. Клетки омегоновых мутантов штамма Sp245, относящихся к классам Cal LpsI (КМ252), LpsI (КМ127, КМ134, КМ348) и LpsII (КМ139), распространяются по полужидким средам, формируя колонии, морфология которых характерна для родительского штамма. Однако у КМ127, КМ134, КМ348 и КМ139 диаметры колоний превышают размер колоний Sp245. Скорость плавания клеток у КМ127, КМ134, КМ348 и КМ139 не отличается от скорости движения Sp245. В случае КМ252 отличия в скорости распространения по полужидким средам незначительны. Стоит отметить, что у клеток КМ252 наряду с утратой LpsI произошли изменения в синтезе ПССК.

3.6.2 Подвижность A. brasilense в присутствии поликлональных антител на полисахариды и флагеллин. Антитела можно рассматривать как модулирующий фактор, усиливающий или ингибирующий межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактерий. Проведено исследование подвижности различных штаммов в присутствии штаммоспецифичных антител (Ат) на ЛПС штаммов A. brasilense Sp245 и Sp7, а также Ат на флагеллин типового штамма Sp7. Диаграмма зависимости процента подвижных клеток и средней скорости подвижных клеток Sp245 от концентрации штаммоспецифичных Ат на ЛПС (рис. 5) показала, что увеличение концентрации Ат приводило к полному прекращению движения бактерий. Снижение скорости движения подвижных клеток в присутствии Ат, а также визуально наблюдаемые при этом резкие остановки свободно плавающих клеток A. brasilense или переход от поступательного движения клеток к кувырканию позволили заключить, что подавление движения вызвано взаимодействием антител с полярным жгутиком бактерий, покрытым чехлом, в состав которого входят ЛПС. Добавление как Ат на флагеллин, так и Ат на ЛПС другого штамма, не приводило к такому эффекту (табл. 3).

Таблица 3. Влияние антител различной специфичности на процентное содержание подвижных клеток A. brasilense и их скорость движения

Подвижные клетки A. brasilense, %
Штамм без антител Ат/ЛПСSp7 Ат/ЛПСSp245 Ат/флагеллинSp7
Sp7 85.5±2.2 0 84.0±3.3 62.7±2.7
Sp245 85.8±3.8 84.0±3.3 0 82.8±2.7
Sp107 84.0±2.8 81.2±2.9 63.8±4.0 77.8±2.6
Средняя скорость подвижных клеток A. brasilense, мкм/с
Sp7 36.7±2.8 0 36.0±3.7 28.5±1.0
Sp245 29.9±3.5 32.7±1.8 0 32.3±2.9
Sp107 31.3±5.2 31.9±3.2 26.3±1.5 31.6±2.3

Примечание: Концентрация всех использованных в экспериментах антител составляла 1 мг/мл.

Последнее послужило отправной точкой для разработки серологического теста, заключающегося в ингибировании подвижности бактерий вида A. brasilense при добавлении к клеточной суспензии штаммоспецифичных антител на ЛПС. О специфичности взаимодействия антител с бактерями в данном тесте судили, оценивая подвижность всех клеток в поле зрения микроскопа и определяя скорость движения у случайно выбранных подвижных клеток. В серии экспериментов по исследованию подвижности клеток 11 штаммов А. brasilense (Sp7, Cd, SR55, SR80, Sp245, S17, S27, SR15, SR75, Sp107 и SR8) в присутствии Ат на ЛПС определены штаммы, показывающие антигенные перекресты с Sp7 или Sp245. Выявлена корреляция между наличием антигенных перекрестов в реакции иммунодиффузии и снижением процента подвижных клеток и их скорости в присутствии Ат на ЛПС Sp7 или Sp245 у штаммов Sp7, Cd, SR55, SR80 или Sp245, S17, S27, SR15, SR75. ЛПС штаммов Sp245 и Sp107 в тесте иммунодиффузии демонстририровали лишь минорные антигенные различия, свидетельствующие о том, что в составе ОПСI штамма Sp107 отсутствуют некие антигенные детерминанты, присутствующие в составе ОПСI штамма Sp245. Вследствие этого Ат на ЛПС Sp245 (в концентрации, ингибирующей подвижность клеток данного штамма) лишь незначительно изменяли подвижность клеток Sp107 в жидкой и полужидкой средах. Ингибирующий эффект достигался увеличением концентрации Ат на ЛПС Sp245, поскольку это приводило к увеличению количества Ат на общие для Sp245 и Sp107 детерминанты. Таким образом, тест на ингибирование подвижности бактериальных клеток в присутствии Ат может быть информативным при исследовании углеводных антигенных детерминант, представленных в составе клеточной поверхности.

Штаммоспецифические Ат на ЛПС (в отличие от Ат на флагеллин) также снижали скорость распространения Sp245 или Sp7 в полужидких средах. Размер бактериальных колоний в присутствии штаммоспецифических Ат на ЛПС значительно уступал их диаметру в контрольных экспериментах. Мутант Sp245.5 с полностью измененным ЛПС сохранял диаметр колец роения в присутствии Ат на ЛПС Sp245. Таким образом, снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием Ат на ЛПС с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих распространение азоспирилл в полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов. Говоря о межклеточных контактах, обусловленных взаимодействиями с участием полисахаридов, необходимо отметить, что агрегацию клеток азоспирилл в жидкой культуре опосредуют взаимодействия полисахаридов и белков–гемагглютининов (Никитина с соавт. 1994, 2001). Возможно, при колонизации полужидких сред аналогичные лектин–углеводные взаимодействия обеспечивают контакты между движущимися клетками.

3.7 Влияние поверхностного гемагглютинина A. brasilense Sp245 на социальную подвижность этих бактерий. Уровень продукции полисахаридов и активность гемагглютининов азоспирилл изменяются в зависимости от наличия в среде связанного азота и его химической природы (Yagoda–Shagam et al., 1988; Никитина с соавт., 2005), что в свою очередь может влиять на формирование межклеточных контактов. Изучение подвижности A. brasilense показало, что в аэробных условиях на полужидких средах без источника связанного азота клетки штамма Sp245 формируют макроколонии, превышающие диаметр колоний, образованных в присутствии аммония, нитрата или нитрита (рис. 6). На среде без азота через 36 ч после инокуляции бактерии распространяются в 3.7 раза быстрее в толще среды, чем по ее поверхности, а в присутствии аммония, нитрата или нитрита эти различия составляют только 1.4–1.6 раза (рис. 6б). Вероятно, азоспириллы, будучи микроаэрофилами (Tarrand et al., 1978), в отсутствие азота преимущественно формируют колонию в микронише, благоприятной для работы нитрогеназы. Присутствие связанного азота, в том числе, и его накопление при азотфиксации (например, к 72 ч инкубации) способствует развитию колонии на поверхности среды. На средах с 0.2–0.4% агара в ряду “аммоний–нитрат–нитрит” наблюдается уменьшение размера колоний (рис. 6а, б). Максимальный диаметр колоний на полужидкой MSM (0.4% агара), содержащей хлорид аммония или нитрат калия, не зависит от концентрации соли в диапазоне 1–3 г/л. Изменение концентрации аммония или нитрата в среде выращивания не влияет на скорость индивидуального движения клеток штамма Sp245 в жидкой среде. Так, при концентрации солей 1 или 3 г/л скорость индивидуального движения клеток, соответственно, составляет 28.6±1.5 и 28.6±1.4 мкм/с в присутствии аммония и 29.9±1.5 и 29.8±1.4 мкм/с в присутствии нитрата. Скорость движения клеток, выросших на среде с нитритом, несколько уменьшается с увеличением его концентрации. Клетки, выросшие в присутствии 1 г/л или 3 г/л нитрита, двигаются, соответственно, со скоростью 24.4±1.2 или 22.4±1.4 мкм/с. Однако диаметр колоний в сходных условиях не изменяется.

Таким образом, на MSM, содержащей 0.2–0.4 % агара и аммоний, нитрат или нитрит, скорость движения отдельных клеток – не единственный показатель, определяющий размер колоний. Возможно, присутствующий в среде источник азота влияет на взаимодействия, определяющие контакты между перемещающимися бактериями, что сказывается на диаметре колоний. На средах с 0.6% агара роль взаимодействий, модулируемых источником азота, становится не столь существенной, очевидно, в результате того, что клетки на более плотных средах между собой находятся в более тесном контакте.

Агглютинацию трипсинизированных эритроцитов вызывают жидкие бактериальные культуры Sp245, выросшие в стационарных условиях на среде с 1 г/л хлорида аммония, суспензии клеток этих культур в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и культуральная жидкость, освобожденная от бактерий. Во всех случаях титр реакции агглютинации составил 1:4. Обработанные в течение 8 ч трипсином клетки штамма Sp245 утрачивали способность агглютинировать трипсинизированные эритроциты. На проявление агглютинирующей активности бактерий в отношении нативных эритроцитов, несущих белковые рецепторы, чувствительные к трипсину, влияют мутации в синтезе полисахаридов. В суспензиях клеток в ФСБ, выросших в жидкой MSM с аммонием, у мутантов КМ252 (LpsI Cal) и КМ348 (LpsI) титр реакции агглютинации составил, как и у Sp245, 1:16. У мутантов КМ139 (LpsII) и Sp245.5 (LpsI LpsII Cal) титр реакции гемагглютинации, соответственно, составил 1:4 и 1:32. Не исключено, что у мутантов различия в гемагглютинирующей активности обусловлены не только разной структурой полисахаридов, но и разным влиянием последних на активность гемагглютининов.

Способность культур штамма Sp245 вызывать агглютинацию эритроцитов изменяется в зависимости от источника связанного азота в среде выращивания бактерий. Титр агглютинации трипсинизированных эритроцитов жидкими культурами Sp245, выросшими в стационарных условиях на среде с 1 г/л нитрита или нитрата калия, составил 1:16, а в случае 1 г/л хлорида аммония – 1:4. Изменение содержания хлорида аммония в среде выращивания (1, 3 или 0.05 г/л) не влияло на агглютинирующие свойства культур Sp245.

В случае Sp245 повышение гемагглютинирующей активности бактерий и уменьшение диаметра “колец роения” в средах с нитратом или нитритом позволяют полагать, что размер сформированных подвижными клетками колоний может зависеть от поверхностных структур, опосредующих гемагглютинацию. Не исключено, что существует связь между способностью поверхностных полимеров, участвующих в формировании межклеточных взаимодействий, вызывать агглютинацию эритроцитов и влиять на подвижность бактерий.

Добавление к суспензии клеток Sp245 гемагглютинина (ГА), выделенного с поверхности клеток этого штамма, приводит к заметному снижению скорости движения бактерий в жидких средах (рис. 7). Эффект сохраняется более 30 мин инкубации. Присутствие ЛПС, ЛПБК или ПСЛК не сказывается на подвижности бактерий. Исследование подвижности мутантов Sp245 с нарушениями в продукции полисахаридов в присутствии ГА показало, что он не влияет на подвижность клеток мутанта Sp245.5 с кардинальной перестройкой в структуре полисахаридов. ГА вызывает незначительное снижение скорости движения мутантов КМ252 и КМ348, (ОПСI), и замедляет движение клеток мутанта КМ139 (ОПСII) (рис. 7).

Предварительная инкубация ГА с ЛПС, ЛПБК и ОПСI приводит к ингибированию его воздействия на скорость движения клеток. В присутствии ПСЛК или ОПСII действие ГА на скорость движения бактерий на 9.3 или 12.6% менее эффективно в сравнении с незаблокированным белком (рис. 7). У штамма Sp245 в состав ЛПС, ЛПБК и ПСЛК входят сходные моносахариды и антигены, идентичные таковым у ОПСI (Коннова с соавт., 2005). Результаты измерения скорости движения мутантов и данные ингибиторного анализа позволяют говорить о значительном сродстве ГА к ЛПС Sp245. Моносахариды рамноза, глюкоза, галактоза и глюкозамин, входящие в состав ЛПС, ЛПБК или ПСЛК, не блокируют действие ГА на подвижность. Следует отметить, что рамноза находилась в L–форме. В тоже время ОПСI и ОПСII, представляющие собой линейные D–рамнаны (Федоненко с соавт., 2004), подавляют (в разной степени) влияние ГА на скорость движения бактерий Sp245. Степень сродства ГА к ОПС, скорее всего, обусловлена конформацией и зарядом последнего. Так, кислый ОПСI полностью снимает эффект воздействия ГА на подвижность клеток Sp245, а нейтральный ОПСII ингибирует данную активность ГА только на 12.6%. При этом отсутствие ОПСII у мутанта КМ139 не позволяет ГА вызвать снижение скорости движения клеток мутанта с той же эффективностью, что и у штамма дикого типа (рис. 7). Только в случае мутанта Sp245.5, утратившего ОПС, содержащий D–рамнан, подвижность клеток не изменялась в присутствии ГА. В полужидких средах Sp245.5 формирует “диффузные” колонии, тогда как бактерии дикого типа образуют четко очерченные кольца. Образование “диффузных” колоний происходит, несмотря на то, что в ФСБ гемагглютинирующая активность суспензии клеток Sp245.5 вдвое превышает таковую у Sp245 (1:32 у мутанта и 1:16 у родительского штамма). Необходимо отметить, что результаты определениия специфичности ГА Sp245 (лаборатория микробиологии ИБФРМ РАН) ингибированием углеводами реакции гемагглютинации согласуются с данными влияния ГА на подвижность бактерий.

Из литературных данных известно, что контакты бактерий, распространяющихся по агаризованной среде, опосредованы белковыми структурами и ЛПС. Так, у бактерий M. xanthus углевод–белковые взаимодействия необходимы для коллективного, скоординированного скольжения клеток и формирования структур надклеточного уровня (при агрегации и споруляции) (Bowden et al., 1998; Will et al., 1998). Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями ГА и ОПС в распространении азоспирилл – бактерий, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода, что, в свою очередь, может иметь значение при бактериальной колонизации корневой системы растения.

3.8 Молекулярногенетическая характеристика мутантов A. brasilense Sp245 по социальной подвижности. В таблице 1 представлена молекулярно–генетическая характеристика Fla, Laf, Mot, Swa и Gri –мутантов A. brasilense Sp245, полученных с помощью Omegon–Km и Tn5–Mob–мутагенеза. Характеристика основана на результатах ECL-гибридизации ДНК мутантов с меченными пероксидазой зондами, содержащими ДНК транспозонов или векторов для мутагенеза и анализа плазмидного состава по методу Eckhardt (1978). Штамм A. brasilense Sp245 содержит плазмиды р85 (с молекулярной массой 85-МДа), р120 (120-МДа) и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома A. brasilense, закономерен интерес к роли этих внехромосомных элементов в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а).

Образование коинтегратов векторов для мутагенеза с р85 приводит как к утрате способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы, так и к появлению бактерий с ускоренным роением. В случае инсерций омегона в р120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков, но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов. Среди этих мутантов с нарушениями синтеза ЛПС ряд клонов демонстрируют Swa++–фенотип.

Анализ плазмидного состава штаммов A. brasilense ВК759G (Gri+–фенотип) и ВК759Р (Swa++–фенотип) показал, что различия в подвижности Gri+–мутанта и его Swa++–производного согласуются с плазмидной перестройкой. Из плазмидного профиля ВК759Р исчезает р85 и появляется новая плазмида с молекулярной массой 36 МДа. Можно предположить, что новый 36–МДа репликон, обнаруженный в геноме ВК759Р, сохраняет локусы, необходимые для ускоренного роения, а генетические элементы, необходимые для Gri–распространения либо элиминированы, либо их интеграция в другие репликоны клетки затрудняет/блокирует их экспрессию.

Гибридизация ВаmНI– и XhoI–переваров тотальной ДНК Sp245 и его мутантов ВК468, ВК571, ВК759Р и ВК759G с ДНК вектора pJFF350 и различными зондами (табл. 4) позволила более подробно исследовать вышеуказанную перестройку. Результаты гибридизации показали, что переход ВК759G от распространения с образованием микроколоний к ускоренному роению (ВК759Р) сопровождается изменениями длин фрагментов рестрикции тотальной ДНК, гибридизующихся с фрагментами р85 и р120. Эффективность распространения в полужидких средах клеток BK759Р сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571 (Swa++–фенотип). Однако картина гибридизации pJFF350, фрагментов р85 и р120 с ДНК этих трех Swa++–штаммов различается (табл. 4). Таким образом, переход от Gri+–распространения клеток мутанта BK759G к Swa++–подвижности (BK759P) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерий, по-видимому, обуславливают несколько генетических локусов A. brasilense Sp245.

Таблица 4. Полиморфизм длин фрагментов рестрикции тотальной ДНК A. brasilense Sp245 и его мутантов, гибридизующихся с фрагментами р85 и р120

Штамм A.brasilense Рестриктазы, использованные для гидролиза ДНК Размер фрагментов рестрикции ДНК (т.п.н.), прогибридизовавшихся с зондами
1 (р85–1) 2 (р85–2) 3 (р120–1) 4 (р120–2)
Sр245 (Swa+) XhoI 16.6; 11.1 12.8 13.6 7.8
BamHI 15 4 14.5 ~21
ВК468 (переход от Swa+ к Swa++) XhoI 16.6; 11.1 12.8 13.6 7.8
BamHI 15 4. 14.5 ~21
ВК571 (переход от Swa+ к Swa++) XhoI 16.6; 11.1 13.6 7.8
BamHI 15 14.5 ~21
ВК759G (переход от Swa+ к Gri+) XhoI ~23; 11.1 12.8 13.6 7.8
BamHI ~21; 15 4 15 ~21
ВК759Р (переход от Gri+ к Swa++) XhoI 11.7 15 15 8.1
BamHI ~21; 15.9 н.о. 19.1; 15.9 ~26

Примечание: Зонды: 1 – 2.4–т.п.н. EcoRI–фрагмент р85, несущий локусы fla, laf, mot; 2 – 1.1–т.п.н. EcoRI–фрагмент р85, несущий локус swa++; 3 – 14–т.п.н. BamHI–фрагмент, несущий локусы p120 lpsI, lpsII и cal; 4 – 8.3–т.п.н. BamHI–фрагмент, несущий локусы p120 fla, swa. Н.о. – не определяли.

Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих подвижность бактерий с образованием микроколоний, присутствие в геноме репликона р85 является существенным. Например, у трех Swa Gri–мутантов штамма Sp245 с различными нарушениями в продукции и функционировании жгутиков, KZ019, KZ044 и KZ020, исследование плазмидного профиля показало утрату р85 (табл. 1).

В случае сохранивших р85 мутантов штамма Sp245 с похожими дефектами в продукции и функционировании флагелл (BK759G, SK039, SK237 или SK454) утрата способности к роению компенсируется Gri+–распространением. У мутанта Sp245.5 (утрачены р85 и р120) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в присутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Gri–подвижности. В настоящей работе представлены два мутанта Sp245, содержащие коинтеграт p85::pJFF350, дефектные по жгутикованию или подвижности: SK051 и SK248. Несмотря на интеграцию pJFF350 в плазмиду с молекулярной массой 85 МДа, SK051 и SK248 сохраняют способность к Gri+–распространению. Таким образом, прослеживается некоторая зависимость между отсутствием в экстрахромосомном состоянии р85 у клеток мутантов с измененными Fla и/или Laf системами и потерей ими способности к распространению с образованием микроколоний. Стоит отметить, что утрата подвижности наблюдается и в тех случаях, когда транспозон встраивается в хромосомную ДНК (мутанты SK531 (Fla Laf Mot) и SK586 (Fla leaky Laf)).

Данные о роли генетических локусов p85 в обеспечении подвижности неоднозначны. Так, подвижность в жидких и полужидких средах у ряда исследованных ранее производных Sp245, утративших р85, не отличаются от таковых у родительского штамма (Кацы с соавт., 1994). Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли p85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов fla/laf/swa/gri в другие репликоны. Не исключено, что интеграцию обуславливают мобильные элекменты, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). Так, в случае мутанта SK248 слияние pJFF350 и p85, опосредованное ISAzba1 и ISAzba2 (Katsy, Prilipov, 2009), приводит к утрате способности клеток двигаться при помощи жгутиков (Mot Swa–фенотип). Следует отметить, что динамическая организация района р85, примыкающего к ISAzba1 и ISAzba2, может сказываться на экспрессии генов расположенных вблизи от IS–элементов. Далее мы охарактеризовали ряд обнаруженных в ДНК р85 A. brasilense генов, продукты экспрессии некоторых из которых, по-видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий.

Физико–генетическая карта секвенированного сегмента р85 A. brasilense Sp245 из рекомбинантной плазмиды pEK248X приведена на рис. 8. В результате анализа нуклеотидной последовательности XhoI–фрагмента p85, клонированного в составе плазмиды pEK248X, были идентифицированы гены norCBQD и nirK, важные для осуществления денитрификации.

Рядом с nirK локализованы orf208 и orf181. В ORF181 обнаружены два гемэритриновых домена. Полагают, что бактериальный гемэритрин является регулятором ответа на NO (Strube et al., 2007), играет значимую роль при попадании организмов в условия лимитации по кислороду, будучи его накопителем (Strube et al., 2007), и опосредует анаэротактис бактерий в качестве кислородного сенсора (Isaza et al., 2006).

В секвенированном фрагменте p85 обнаружена также orf293, кодирующая регулятор транскрипции семейства LysR из 293 аминокислотных звеньев. Регуляторы LysR участвуют в контроле транскрипции разнообразных генов, в том числе, в условиях кислородного стресса. ORF293 обладает значимым сходством с HdfR из Paracoccus denitrificans, Erwinia carotovora, E. coli, Shigella flexneri и других бактерий. HdfR известен как репрессор транскрипции мастер–оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у E. coli и других бактерий (Ko, Park, 2000).

Многие бактерии адаптируются к микроаэрофильным условиям, благодаря образованию цитохром c оксидазы cbb3–типа, кодируемой опероном ccoNOQP. Ген ccoN впервые выявлен нами в плазмидной ДНК азоспирилл. Кодируемая p85 каталитическая субъединица I (CcoN) цитохром c оксидазы обладает свойствами, достаточными для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных жгутиков (Скулачев, 1989).

В секвенированном сегменте p85 обнаружен ген metC. В случае E. coli metC–мутанты, дефектные по синтезу гомоцистеина, имели более высокий уровень экспрессии гена флавогемоглобина (hmp), индуцируемого NO (Membrillo-Hernndez et al., 1998). Продукт orf164, по–видимому, не связан с процессами денитрификации или регуляции метаболизма в ответ на оксиды азота и редокс–статус клетки.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 Sp245 недалеко от IS–элементов ISAzba1 и ISAzba2 (рис. 8) свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Так у спонтанного мутанта Sp245.5 с крупной плазмидной перестройкой исчезновение p85 и одного из двух фрагментов тотальной ДНК, гомологичных 2.4–т.п.н. EcoRI–фрагменту p85, содержащему, как выяснилось, часть гена nirK, а также orf208 и orf181, сопровождалось утратой способности бактерий к нитритредукции (Кацы, 2002б). Скорость движения клеток Sp245.5 в жидкой среде сильно редуцирована.

Не исключено, что появление спонтанных Swa++–производных (Sp245.P1–Sp245.P5) обусловлено изменениями в структуре ДНК р85, затрагивающими комплекс генов, расположенный недалеко от IS элементов ISAzba1 и ISAzba2. Использован метод ПЦР–амплификации на ДНК названных штаммов целевых районов р85 с парами специфических прямых и обратных праймеров к генам nirK–orf208, hdfR, hdfR–ccoN, ccoN–metC и orf414 (рис. 8). ПЦР с парой праймеров, специфичных к 3'–концу гена hdfR (у Sp245 продукт амплификации имеет длину 411 п.н.), давали негативные результаты на ДНК из суперроящихся штаммов Sp245.P1 и Sp245.P5. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa++–вариантов, в ряде случаев сопровождаются утратой или существенной модификацией гена hdfR, локализованного в p85.

Известно, что на активность транскрипции генов может влиять общая структура окружающей ДНК, особенно степень ее суперспирализации. Эта структура модулирует, а иногда и определяет силу промоторов (Perez-Martin et al., 1994). Возможно, мы имеем дело именно с таким случаем, а интеграция в p85 вектора pJFF350 является препятствием для осуществления на должном уровне подобной регуляции экспрессии ряда генов p85. В пользу данного предположения говорит тот факт, что у мутанта SK051 вектор pJFF350 интегрировал в тот же сайт p85, что и у мутанта SK248. Различия между двумя коинтегратами p85::pJFF350 заключаются лишь в утрате примерно 1.5 т.п.н. ДНК вектора из коинтеграта, образовавшегося в клетках штамма SK051. Фенотип у мутантов A. brasilense SK051 и SK248 разный.

3.9 Подвижность A. brasilense Sp245 в лабораторных средах разного состава. Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности. Выявление факторов внешней среды, способствующих доминированию одного из способов распространения, интересно с точки зрения изучения механизмов адаптации азоспирилл к обитанию в разнообразных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями.

Проведено сравнение скорости плавания и особенностей социальной подвижности в присутствии солей аммония, нитратов или нитритов у A. brasilense Sp245 и его спонтанных Swa++–вариантов Sp245.P, у двух из которых утрачен ген hdfR. В жидкой среде для нитратредукции (MPSS) с нитратом калия клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5, выросшие в условиях интенсивной аэрации, как и в случае MSM с аммонием (см. табл. 2), плавали значительно быстрее, чем особи Sp245. При замене нитрата на нитрит у Sp245 и Sp245.P3 подвижность подавлялась, а у Sp245.P1 и Sp245.P5 скорость движения практически не снижалась. У бактерий, выращенных в условиях недостатка кислорода в жидкой MPSS, скорость движения клеток Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 снижается, не зависит от источника азота и близка к показателю, характерному для Sp245 в сходных условиях в присутствии нитрата. Однако у Sp245 при замене нитрата на нитрит при недостатке кислорода клетки плавают медленнее.

Диаметр колоний, формируемых в полужидкой MSM всеми исследованными штаммами, максимален в отсутствие солей азота в среде и снижается при добавлении солей азота (1 г/л) в ряду “NH4Cl > KNO3 > KNO2”. При этом на среде MSM с KNO2 все исследованные варианты Sp245.P утрачивают способность к Swa++–распространению. Однако на полужидкой среде MPSS, отличающейся от MSM более богатым составом (добавлен пептон, 5 г/л) и содержащей сукцинат вместо малата, штамм Sp245.P5 оказывается менее чувствительным к токсическому действию нитрита и сохраняет Swa++–фенотип. Измерение скорости движения клеток на полужидкой MPSS показало, что на среде с нитратом клетки Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245.P5 двигаются быстрее родительского штамма. На среде с нитритом скорость движения клеток падает у Sp245.P1, Sp245.P3 и Sp245, а межштаммовые различия нивелируются. В случае штамма Sp245.P5 замена нитрата на нитрит не влияет на подвижность клеток.

Таким образом, выявлены различия в поведении спонтанных вариантов Sp245.P с изменениями в структуре p85, имеющих одинаковый Swa++–фенотип в присутствии молекулярного азота или хлорида аммония, при замене источников азота в среде на нитрат или нитрит.

Переходы в способах распространения у Sp245 при использовании богатых полужидких сред MPSS или LB выявить не удалось. Возможно, в случае использования среды, насыщенной ростовыми факторами, доля клеток с Gri–распространением мала, поскольку в среде могут находиться факторы, значительно увеличивающие число роящихся бактерий. В результате поток роящихся азоспирилл не позволяет наблюдать особи, формирующие агрегаты. В связи с этим предположением интересны наблюдения за поведением Sp245 на средах, в которых один и тот же субстрат может быть источником углерода и азота, например, аминокислот. В присутствии малата и аммония, или без них диаметры макроколоний не различаются как в случае Sp245, так и BK570, SK048 или SK454. Самые крупные макроколонии выявляются у Sp245, но не у BK570 и SK048, при добавлении в среду аланина или триптофана. Пролин стимулирует роение BK570. В случае SK048 и SK454 ни одна из 18 исследованных аминокислот не способствовала увеличению скорости Gri–подвижности. Снижение скорости распространения происходит в присутствии аспарагина, аспарагиновой кислоты или треонина как в случае Swa–, так и Gri–подвижности (у Sp245, BK570, SK048 и SK454). Гистидин, глутамин, валин, метионин или пролин блокировали подвижность SK048 и SK454. Таким образом, в случае Swa, Swa++ или Gri+–подвижности набор аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в составе той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности.

В случае Sp245 аспарагиновая кислота, серин или треонин способствовали индукции Gri+–подвижности. Интересен тот факт, что аминокислоты, которые влияют на проявление Gri+ фенотипа у Sp245, не стимулируют скорость движения Gri+–мутантов SK048 или SK454. Более того, на среде с аспарагиновой кислотой и треонином колонии SK048 и SK454 мельче. Вероятно, факторы, способствующие переходу клеток к Gri–подвижности, и факторы, активизирующие скорость мигрирующих подобным образом бактерий, различаются.

3.10 Социальная подвижность A. brasilense в присутствии корневых экссудатов пшеницы. Исследовано влияние корневых экссудатов пшеницы (к/э) на характер/эффективность подвижности азоспирилл. Установлено, что диаметр колоний, сформированных Sp245 на полужидкой MSM (0.4% агара) с добавлением к/э 10–дневных проростков пшеницы, значительно превышает контрольный. У роящегося мутанта KM252 с изменениями в синтезе полисахаридов размер колоний в присутствии к/э возрастает, но различия не столь существенны, как у родительского штамма. В то же время, у Swa++–мутантов ВК468, ВК571 и ВК759Р увеличения размера колоний в присутствии к/э не происходит. При этом к/э не оказывают существенного влияния на скорость роста бактериальных культур. Различий в скоростях движения клеток, выросших в жидких средах с к/э, и без них также не наблюдается. Анализ гетерогенности популяции азоспирилл в способах распространения в полужидких средах показал, что присутствие к/э способствует доминированию в популяции Sp245 роящихся клонов. Так, после 48 ч инкубации (MSM + среда для растений) 81% колоний Sp245 имели Swa+–фенотип, 18.3% Swa– и 0.7% Gri+–фенотип. На MSM + к/э 100% колоний Sp245 были Swa+. В случае мутантов КМ018 и ВК759G добавление к/э способствовало возрастанию частоты перехода к роящимся вариантам.

Вероятно, на полужидких средах в присутствии к/э повышается эффективность коллективного распространения клеток Sp245. При этом к/э не влияют на скорость индивидуального движения клеток за счет активности полярного жгутика, как в случае Sp245, так и в случае Swa++–мутантов ВК468, ВК571, BK759P, роение которых не зависит от присутствия к/э. Интересно, что экссудаты способствуют доминированию Swa+–клонов или уменьшению числа Swa и Gri+–клонов, встречающихся в популяции Sp245, КМ018 и ВК759G. Вероятно, к/э проростков пшеницы способны оказывать модулирующее действие на механизмы/системы, обеспечивающие скоординированную подвижность A. brasilense Sp245 в полужидких средах. При этом поведение Swa++–производных Sp245, клетки которых двигаются со скоростью, близкой к скорости, наблюдаемой у родительского штамма, не зависит от присутствия корневых экссудатов. Возможно, эффект обусловлен тем, что у мутантов системы, обеспечивающие скоординированную подвижность, максимально антивны и дополнительный сигнал, индуцируемый наличием в среде к/э, в этом случае не является столь значимым.

Можно предположить, что в составе к/э присутствуют компоненты, “имитирующие” действие внутрипопуляционных бактериальных факторов (Teplitski et al., 2000), регулирующих социальное поведение азаспирилл. При этом клетки Swa++–мутантов не воспринимают сигнал либо из-за высокого уровня продукции собственного регулятора или в результате изменения системы “рецепции”. Добавление к/э пшеницы в среду для роста бактерий приводит к изменению соотношения моносахаридов в составе экзополисахаридов и электрофоретического профиля ЛПС A. brasilense Cd (Fischer et al., 2003). Не исключено, что к/э модифицируют какие-либо поверхностные полимеры Sp245, участвующие в формировании контактов между бактериями, перемещающимися в полужидкой среде, а в случае Swa++–мутантов эти изменения не являются существенными. Так, в случае LpsI Cal–мутанта KM252 корневые выделения, присутствующие в среде, лишь незначительно стимулируют роение, тогда как клетки родительского штамма перемещаются в два раза быстрее. Таким образом, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Gri+–клонов к роению.

3.11 Подвижность A. brasilense в присутствии растительных лектинов, обладающих разной специфичностью. Известно, что взаимодействие компонентов поверхности азоспирилл, содержащих остатки N–ацетил––D–глюкозамина, с агглютинином зародышей пшеницы (WGA) может опосредовать ранние этапы формирования растительно–бактериальных ассоциаций и индуцировать соответствующие изменения в метаболизме бактерий (Антонюк, 2005). Так как двигательная активность бактерий важна для формирования их симбиозов с растениями (Кацы, 2003), интересно выяснить, оказывают ли фитолектины влияние на этот аспект поведения азоспирилл.

3.11.1 Скорость плавания A. brasilense в присутствии лектинов растений. В присутствии WGA, агглютинина клубней картофеля (STA) или лектина из утесника обыкновенного (UEAII), обладающих сродством к N–ацетил––D–глюкозамину или его олигомерам, скорость плавания клеток штамма Sp245 снижалась (рис. 9). Конканавалин А (ConA) или фитогемагглютинин–P (PHA–P), обладающие иной углеводной специфичностью, на подвижность Sp245 не влияли.

Более подробно изучение специфичности ингибирования движения бактерий осуществляли на примере WGA. В результате блокировки активных центров WGA глюкозамином или его олигомером, N,N’,N’’–триацетилхитотриозой (хитотриозой), ингибирующая активность WGA элиминировалась. Рамноза или глюкоза, входящие в состав полисахаридов клеточной поверхности штамма Sp245, но не являющиеся гаптенами для данного лектина (Коннова с соавт., 1992), не влияли на способность WGA снижать подвижность азоспирилл. Напротив, добавление препарата ЛПБК, содержащего остатки глюкозамина, приводило к практически полному восстановлению скорости плавания бактерий, характерной для клеток в отсутствие WGA. Контрольные эксперименты показали, что ни одно из используемых для блокирования веществ само по себе не вызывало снижения скорости плавания бактерий. По-видимому, снижение скорости плавания азоспирилл в присутствии WGA происходило в основном вследствие специфического связывания этого лектина с полимерами поверхности бактерий, содержащими глюкозамин. Скорость плавания клеток штамма A. brasilense Sp107 в присутствии WGA уменьшалась в меньшей степени, чем у Sp245. При этом для обоих штаммов характерен близкий моносахаридный состав полисахаридной части экзополимеров, но у Sp107 выявлен более низкий процент содержания глюкозамина в составе полимеров клеточной поверхности по сравнению с Sp245 (Коннова с соавт., 1992).

3.11.2 Влияние фитолектинов на поведение A. brasilense в полужидких средах. В полужидкой MSM с WGA или STA образовывались колонии Sp245 смешанного мутно–зернистого фенотипа (рис. 10), что может свидетельствовать о переходе части популяции от роения к распространению с образованием микроколоний. BSA или ConA такого эффекта не вызывали (рис. 10). При блокировке активных центров WGA хитотриозой не удалось полностью ингибировать влияние фитолектина на поведение Sp245. В пределах колонии, сформированной бактериями в присутствии WGA и хитотриозы, встречаются агрегаты, хотя и не в таком количестве, как в случае среды, содержащей только лектин (рис. 10). WGA обладает способностью связываться с нейраминовой кислотой. Это может частично объяснить образование клеточных агрегатов в присутствии WGA с заблокированными центрами связывания хитотриозой. Только хитотриоза не способствует распространению клеток Sp245 с образованием агрегатов, но влияет на форму формируемых колоний (рис. 10). Возможно, на полужидкой MSM с малатом хитотриоза является дополнительным источником углерода, и, как следствие этого, бактерии, скорее всего, перемещаются как по градиенту малата, так и хитотриозы.

Замена малата в полужидкой MSM, содержащей WGA или STA, на такие источники углерода, как сукцинат, арабиноза или фруктоза, не влияла на морфологию макроколоний, формируемых штаммом Sp245.

Вероятно, переход азоспирилл от Swa–подвижности к Gri–распространению, в присутствии лектинов со сродством к остаткам N–ацетил––D–глюкозамина является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков (см. пункт 3.11.1) и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

3.12 Формирование биопленок A. brasilense на абиотических поверхностях. Методом солевой агрегации проведена оценка суммарной относительной гидрофобности планктонных клеток A. brasilense Sp245 и его мутантов по синтезу полисахаридов и подвижности: KM018, KM127, KM134, KM139, KM252, KM348, SK048, SK051, SK248 и SK454, инкубированных ~20 ч в жидкой LB. Гидрофобность выращенных клеток всех исследованных штаммов существенно не различается. У мутанта A. brasilense Sp245.5 радикальное изменение структуры ЛПС и утрата ПССК (Кацы с соавт., 2002; Федоненко с соавт., 2010) сопровождается небольшим, но статистически достоверным, увеличением гидрофобности клеточной поверхности. Не исключено, что в случае Sp245.5 начальный этап взаимодействия с гидрофобной средой протекает быстрее, чем у других штаммов. У остальных штаммов, по-видимому, гидрофобные силы вносят примерно одинаковый вклад в прикрепление клеток к твердой поверхности.

В первые 24–48 ч инкубации бактерий в жидкой среде LB на поверхности пробирок или лунок планшетов формировались тонкие пленки, при микроскопии которых просматривались разрозненные клеточные агрегаты (микроколонии), легко смываемые при аспирации суспензий и промывании планшета или пробирки водой. Через 72–96 ч инкубации микроколонии сливались в достаточно прочную и плотную пленку с более ровной поверхностью.

С использованием окрашивания бактерий кристаллическим фиолетовым осуществлено сравнение биомассы в пленках (рис. 11), формируемых Sp245 и его мутантами за 96 ч на границе раздела фаз “жидкость (LB) – твердая гидрофильная поверхность (стекло)” и “жидкость (LB) – твердая гидрофобная поверхность (полистирол)”. На гидрофильной поверхности примерно равноценные биопленки КМ127, КМ134 и КМ348 (LpsI) и КМ252 (Cal LpsI) лучше выражены, чем у штамма дикого типа. Возможно, это объясняется изменением заряда клеток названных мутантов вследствие утраты кислого ЛПСI. Толщина пленок, формируемых Sp245, KM124, KM134, KM139 и KM348 на гидрофобной среде, не имеет существенных различий, что согласуется с примерно одинаковой гидрофобностью их клеток. На поверхности полистирола Cal LpsII Mot Swa–мутант КМ018 и Cal LpsI–мутант КМ252 образуют более тонкие пленки. Общей характеристикой КМ018 и КМ252 является утрата ПССК. Биопленки, образуемые на гидрофобной и гидрофильной среде Cal LpsI LpsII–мутантом Sp245.5, обладающим радикально измененной структурой клеточной поверхности, толще, чем у штамма Sp245 и его омегоновых мутантов (рис. 11). У SK051 (leaky Fla Laf Mot Gri+ Cal) толщина пленок, формируемых как на стекле, так и на полистироле, была менее выраженной. Пример мутантов KM018 и SK051 показывает, что одновременное нарушение в продукции и функционировании жгутиков и синтезе полисахаридов приводит к тому, что клетки значительно хуже формируют биопленки как на гидрофильной, так и на гидрофобной поверхности. У Mot Gri+-мутанта SK248 биопленки окрашиваются на уровне Sp245 как на стекле, так и на полистироле. Вероятно, в стационарной культуре полярный жгутик в большей степени определяет прикрепление бактерий к поверхности, а не подвижность клеток в составе пленки. У мутантов SK048 (Fla Mot Gri+) и SK454 (Fla leaky Laf Gri+) на стекле биопленки образуются хуже, чем у дикого типа. Однако на полистироле они, как и SK248, формируют биопленку на уровне Sp245.

Общий уровень выявления полисахаридных антигенных детерминант в биопленках (для сравнения количества антигенов использовали иммуноферментный анализ (ИФА), используя Ат на ЛПС Sp245), образуемых на гидрофобной поверхности Sp245 и мутантов KM127, KM134 и KM348, и KM252, различается несущественно. В то же время планктонные клетки этих LpsI–мутантов взаимодействуют с антителами менее эффективно, чем Sp245. С учетом примерно равного количества биомассы (см. рис. 11) в биопленках Sp245 и KM127, KM134, KM348 можно предположить, что при взаимодействии с твердой поверхностью в клетках перечисленных мутантов активируется синтез полисахаридов. В случае штамма KM252 уровень продукции полисахаридов, очевидно, повышается в еще большей степени. Общее количество полисахаридных антигенов, продуцируемых LpsII–мутантом KM139 в бульонной культуре и биопленках, значительно выше, чем у других штаммов. Различия в уровне продукции белковых антигенов, выявляемых в биопленках Sp245, KM127, KM139, KM252, KM348 и Sp245.5, не существенны. У мутантов KM018 и KM134 количество экспонированных белковых антигенов снижено по сравнению с другими штаммами; однако в случае KM018 это снижение коррелирует с меньшей толщиной биопленки.

В результате проделанной работы установлено, что сохраняющие жгутиковую подвижность LpsI–штаммы образуют более толстые биопленки на гидрофильной поверхности. Мутанты с нарушениями в продукции ПССК формируют менее выраженные биопленки на твердой гидрофобной поверхности. Дефекты в продукции ПССК в совокупности с утратой жгутиковой подвижности негативно сказываются на способности азоспирилл к закреплению на гидрофобной и гидрофильной поверхности. Утрата LpsII при сохранении ПССК не приводит к изменениям в поведении мутантов на гидрофобной поверхности – по-видимому, за счет повышения уровня продукции других полисахаридов. Радикальная перестройка в структуре полисахаридных антигенов коррелирует с активизацией процесса формирования биопленок соответствующего мутанта (Sp245.5) на разнообразных поверхностях. Таким образом, липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор, участвуют в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность”. Для формирования азоспириллами устойчивой биопленки продукция латеральных жгутиков, скорее всего, не является существенной. Мутанты Sp245, образующие биопленку со сходной биомассой, различаются по продукции Laf, например, KM018 (Cal LpsII Mot) и SK051 (leaky Fla Laf Mot) или SK048 (Fla Mot) и SK454 (Fla leaky Laf). В тоже время отсутствие полноценного полярного жгутика может существенно влиять на образование биопленок.

Как оказалось, спонтанные (как у мутанта Sp245.5) или индуцированные (как у штаммов KM018, KM127, KM134, KM139, KM252, KM348, SK048, SK248 и SK051) изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок.

3.13 Изменения в подвижности бактериальных клеток при их первичном контакте с потенциальным партнером на примере взаимодействия A. brasilense и базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray. При изучении свойств лектина, выделенного с поверхности мицелия базидиального ксилотрофа G. frondosa (Fr.) S.F. Gray 0917, авторами была установлена его необычная углеводная специфичность к ОПС ЛПС A. brasilense Sp245 (Степанова с соавт., 2007), представляющему собой линейный D–рамнан (Fedonenko et al., 2002). Совместное культивирование G. frondosa 0917 с бактериями штамма A. brasilense Sp245 дикого типа или его мутантами по синтезу полисахаридов показало, что присутствие азоспирилл в кокультуре сказывалось на росте мицелия в целом положительно. Однако в случае совместной культуры со штаммами КМ018 и КМ139 зона первичного контакта по периметру подсева представлена характерным кольцом воздушного редкого мицелия. В случае штаммов КМ252 и КМ348 во всех опытах такая зона была более выраженной, что можно трактовать как более резкое проявление антагонизма. Это еще очевиднее, если сравнить указанные смешанные культуры с чистой (контрольной), морфологически однородной культурой гриба, а также с совместной культурой гриба с диким штаммом Sp245, которая по морфологии практически ничем не отличается от контрольной. Заметные различия в морфологии кокультур наблюдали в опытах с предобработкой растущих гиф препаратом ОПСI перед подсевом бактериальных культур, по сравнению с опытами по их совмещению без предобработки. Возможным объяснением наблюдаемых эффектов является блокировка лектина ОПСI, что в конечном итоге привело к временному затруднению в контакте гиф с бактериями. Но в процессе дальнейшего роста выработка лектина растущими гифами привела к распознаванию и более скорой “идентификации” штаммов Sp245, КМ018 и КМ139 по сравнению со штаммом КМ252 и КМ348, у которых зона противостояния гораздо ярче выражена, чем в остальных случаях.

Мицелиальный лектин G. frondosa 0917 замедляет индивидуальную подвижность клеток A. brasilense Sp245 (рис. 12). Исследование подвижности бактерий мутантов КМ139, КМ252 и КМ348 до и после их инкубации с лектином в концентрации 10 мкг/мл показало, что под влиянием лектина подвижность КМ139 замедляется. В случае КМ252 и КМ348 этого не происходит. Вероятно, лектин G. frondosa 0917 вызывает замедление индивидуальной подвижности азоспирилл только у тех штаммов, в ЛПС которых экспонирован ОПСI, являющийся гаптеном лектину.

Таким образом, штаммы A. brasilense Sp245, КМ018 и КМ139, в клеточной стенке которых экспонирован ОПСI, являющийся гаптеном грибного лектина, распознаются грибом с наименьшим проявлением антагонизма. При этом лектин влияет на подвижность бактерий, что свидетельствует об участии специфических лектин–углеводных взаимодействий в первичном контакте мицелия G. frondosa и A. brasilense в процессе совместного культивирования. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa, “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

3.14 Колонизация корней пшеницы A. brasilense с различиями в социальной подвижности. Исследована динамика колонизации корней пшеницы штаммом A. brasilense Sp245 и его Swa Gri+–мутантами. Начальные этапы колонизации азоспириллами корневой системы растений зависят от способности бактерий перемещаться по направлению к корням растения (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Данное обстоятельство обусловило наш выбор условий инокуляции (с покачиванием инкубационных сосудов), обеспечивающих штамму дикого типа и его мутантам по жгутикованию и подвижности равные шансы на контакт с поверхностью корня. Через сутки после инокуляции определяли количество бактерий, “заякоривающихся” на корнях проростков. На седьмые сутки после инокуляции в корневой системе пшеницы увеличивается количество разветвленных корней, по сравнению с контрольными образцами, что служит индикатором позитивного влияния бактерий.

В выбранных условиях после 3 ч инкубации суспензии бактерий с трехсуточными проростками количество бактерий, прикрепившихся к корням, стабилизировалось. Мутанты SK048, SK051 и SK454 имели сниженную по сравнению с Sp245 способность к адсорбции на корнях (рис. 13). Мы не обнаружили у штамма Sp245 и использованных мутантов различия в продукции или антигенной структуре поверхностных углеводных полимеров. Исключение представляет SK051, в отличие от других штаммов имеющий Cal фенотип. Гидрофобность клеток дикого и мутантных штаммов существенно не различается. Таким образом, на этапе прикрепления к корням пшеницы клеток всех исследованных штаммов гидрофобные силы и полисахаридные компоненты клеточной поверхности, по–видимому, вносят примерно одинаковый вклад. Сниженная по сравнению со штаммом Sp245 способность клеток мутантов к адсорбции на корнях может быть обусловлена отсутствием у них Fla.

Через сутки на корнях “заякоривалось” ~30% адсорбировавшихся клеток Sp245. В случае мутантов SK048, SK051 и SK454 на корнях остается, соответственно, ~59, 44 и 21% клеток (рис. 13). Высевы с 10–дневных проростков показали, что после “заякоривания” бактерий на растении численность популяций штамма Sp245 и его мутантов возрастает примерно в одинаковой степени (рис. 13). Наблюдаемое снижение численности азоспирилл на корнях растущих проростков можно объяснить миграцией в среду для выращивания растений части адсорбировавшихся клеток. Это предположение было подтверждено результатами высевов бактерий из сред после извлечения растений.

Таким образом, динамика колонизации проростков пшеницы мутантами и родительским штаммом свидетельствует о том, что после “заякоривания” клеток механизм распространения с образованием микроколоний (Gri+-фенотип) может достаточно эффективно обеспечить заселение бактериями растущих корней. Стоит отметить, что увеличение количества разветвленных корней у 10–дневных проростков, инокулированных клетками Sp245 или его мутантов, не зависит от количества бактерий, изначально адсорбировавшихся на растении.

Предположение о реализации у азоспирилл, заселяющих корни проростков пшеницы, механизма распространения с образованием микроколоний подтверждают микроскопические наблюдения. На этапе инокуляции в случае штамма Sp245 адсорбировавшиеся на корневых волосках бактерии располагались равномерно, без предпочтительного группирования в какой-либо зоне. В случае инокуляции штаммами SK048, SK051 и SK454 встречались корневые волоски, заселенные бактериями, располагающимися вдоль волоска в виде агрегатов. Уже через 24–48 ч после инокуляции растений клетки штамма Sp245 обнаруживались на корнях в виде агрегатов наряду с равномерно распределенными особями. На седьмые сутки агрегаты клеток, оставшихся на поверхности корня, образовывали скопления в случае проростков, заселенных как штаммом Sp245, так и мутантами SK048, SK051 и SK454.

Формирование азоспириллами агрегатов в процессе их распространения по корневой системе растения, вероятно, является следствием воздействия на бактериальную популяцию определенных внешних факторов. Например, в полужидких средах с агглютинином зародышей пшеницы часть популяции Sp245 переходит от роения к распространению с образованием микроколоний. Дополнительным стимулом, обеспечивающим переход бактерий к Gri-распространению in planta, может стать недостаток кислорода, поскольку в опытах in vitro предварительное культивирование в условиях дефицита кислорода приводило к увеличению количества Swa Gri+–клонов в популяции клеток штамма Sp245.

Через неделю после инокуляции проростков пшеницы скопления клеток штамма Sp245 или его мутантов выявляли на поверхности корня и корневых волосков и при иммунофлуоресцентной микроскопии (рис. 14). Флуоресценция комплекса ФИТЦ–меченных Ат (ослиные антикроличьи Ат, конъюгированные с флуоресцеинизотиоцианатом) с антителами к полисахаридам штамма Sp245 (Ат 1) или антителами, выявляющими белковые структуры (Ат 2), наблюдалась на корнях отдельными светящимися участками. Комплекс Ат 1 или Ат 2 с ФИТЦ–меченными антителами позволил выявить бактерии, находящиеся в корневых волосках 10–дневных проростков, инокулированных как клетками штамма Sp245, так и SK048, SK051 или SK454 (рис. 14). На трехдневных проростках с только что адсорбированными клетками значительные скопления бактерий удалось визуализировать лишь при использовании антител к полисахаридам. При применении антител на бактериальные белковые антигены сигнал флуоресценции наблюдали только у редких групп бактерий среди большого количества клеток, адсорбировавшихся на поверхности корней трехдневных проростков. Таким образом, в случае прикрепившихся азоспирилл белковые структуры выявляются Ат 2 в меньшей степени, чем у бактерий, адаптировавшихся к существованию на растении. Необходимо отметить, что сигнала в контролях не наблюдали.

Таким образом, результаты иммунофлуоресцентной микроскопии свидетельствуют, что полисахаридные и белковые детерминанты могут участвовать в организации биопленок на корнях пшеницы, как и в случае образования азоспириллами биопленок на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная или гидрофобная поверхности”. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня (Rodriguez–Navarro et al., 2007), но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения, в том числе, и способствующие переходу азоспирилл к микроколониальному распространению. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле также является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после “заякоривания” бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает.

Иммунофлуоресцентная микроскопия с антителами на антигены клеточной поверхности бактерий позволила выявить экспонированные полисахаридные или белковые детерминанты у азоспирилл, находящихся непосредственно на корне проростков пшеницы. Иммуноферментный анализ и параллельный подсчет КОЕ использовались для обнаружения возможных изменений в содержании полисахаридных и белковых антигенов при адаптации азоспирилл к существованию на корнях растений.

В ИФА с Ат 1 на клетках штаммов A. brasilense Sp245, SK048, SK051 и SK454 из культур, использованных для инокуляции растений, выявляется сходное количество полисахаридных детерминант. Какие-либо различия в иммунохимических характеристиках ЛПС исследованных штаммов азоспирилл также не были обнаружены. Результаты иммунофлуоресцентной микроскопии инокулированных корней проростков пшеницы, подсчета КОЕ в гомогенатах инокулированных корней (рис. 13а) и ИФА этих же гомогенатов (рис. 13б) свидетельствуют о том, что в течение недели вариации в содержании полисахаридов, узнаваемых Ат 1, соответствуют изменениям в количестве заселивших корни клеток дикого и мутантных штаммов

Иммунохимический анализ белков, выделенных с поверхности клеток штамма Sp245 и его Fla Swa Gri+–мутанта SK048, распространяющихся в полужидком агаре, выявил один и тот же мажорный антиген в составе данных препаратов. При этом, в отличие от препарата Sp245, на иммуноэлектрофореграмме препарата SK048 наблюдается двойной пик, сформированный линиями преципитации, что может быть следствием существования двух изоформ соответствующего антигена. В ИФА с Ат 2 ночных культур бактерий, использованных для инокуляции растений, у штаммов Sp245 и SK051 выявляется примерно одинаковое, а у SK048 и SK454 незначимо меньшее количество экспонированных белковых детерминант. Незначительное увеличение количества белковых детерминант, экспонированных на клетках штаммов Sp245, SK048, SK051 и SK454 через 7 суток после инокуляции проростков пшеницы, статистически недостоверно (рис. 13б). Численность клеток штамма Sp245 на корнях за это же время снижается практически на порядок, а в случае мутантов SK048, SK051 и SK454 данный показатель сохраняется примерно на исходном уровне. Эти результаты являются косвенным свидетельством того, что при адаптации к корням растений в клетках штамма A. brasilense Sp245 заметно активизируется синтез белковых детерминант, узнаваемых Ат 2.

Таким образом, в настоящей работе нами подтверждены данные других авторов (Croes et al., 1993) о том, что у Fla–мутантов A. brasilense, утративших филамент полярного жгутика, снижается способность к адсорбции на корнях пшеницы. Впервые показано, что после “заякоривания” на корнях клетки штамма A. brasilense Sp245 дикого типа и его Fla Swa Gri+–мутантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. При этом образование микроколоний (клеточных агрегатов) на поверхности корней характерно как для штамма дикого типа, так и для его Fla Swa Gri+–мутантов. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Азоспириллы привлекают внимание исследователей коллективного поведения микроорганизмов в основном в качестве модели для изучения механизмов изменения характера жгутикования при переходе бактерий от свободного плавания к роению (Merino et al., 2006). Однако разнообразные проявления коллективного поведения микроорганизмов зависят не только от бактериальных систем, функционирование которых напрямую связано с поведенческим процессом (“ощущение кворума”, формирование биопленок, плодовых тел, роение, скольжение, тянущая подвижность и пр.), но и от факторов, способствующих наиболее успешной адаптации микроорганизмов к условиям их обитания (Олескин, 2000). Так, способность азоспирилл перемещаться в почве по направлению к корням растения и наличие у них чувствительной системы хемотаксиса обусловливают заселение бактериями растений (Steenhoudt, Vanderleyden, 2000). Первые этапы взаимодействия бактерий с поверхностью корня опосредуют полисахариды, белки и полярный жгутик. Однако механизмы подвижности, позволяющие клеткам A. brasilense после закрепления на поверхности корня сформировать биопленку, и относительный вклад в этот процесс разнообразных полимеров клеточной поверхности у A. brasilense не известны.

Анализ генетических причин и физиологических последствий изменений в способах коллективного подвижности бактерий, архитектуре их клеточной поверхности оказался весьма интересной задачей и позволил расширить существующие представления о поведении азоспирилл. В своих исследованиях мы использовали созданную в лаборатории генетики микроорганизмов ИБФРМ РАН уникальную коллекцию мутантов и спонтанных производных A. brasilense по признакам, связанным с продукцией поверхностных структур и функционированием систем, обеспечивающих бактериальную подвижность. Мы исследовали роль тех структур, которые первыми вступают во взаимодействие с окружающей средой и во многом определяют поведение микроорганизма: аппарат подвижности, полисахаридсодержащие полимеры и белки бактериальной поверхности.

Результаты настоящей работы позволили нам расширить существующие представления о роении азоспирилл. Так, нами показано, что, по крайней мере, у двух штаммов A. brasilense, Sp245 и S27, роение бактерий по полужидким средам, помимо латеральных флагелл, обеспечивает полярный жгутик. Получены новые экспериментальные подтверждения существенной роли межклеточных контактов в реализации роения азоспирилл. В случае роения 15 исследованных штаммов A. brasilense, двух штаммов A. irakense и двух штаммов A. lipoferum формирование межклеточных контактов обусловлено поверхностными структурами, взаимодействующими с конго красным.

Азоспириллы обладают потенциалом, повышающим скорость роения бактерий по агаризованным средам (Swa++–фенотип). Ускоренное роение азоспирилл на полужидких средах может быть следствием изменений, затрагивающих механизмы, обеспечивающие вращение флагелл (получены мутанты и спонтанные производные A. brasilense Sp245, клетки которых двигаются быстрее особей родительского штамма) или изменений в продукции поверхностных полисахаридов (ряд мутантов A. brasilense Sp245 с изменениями в продукции полисахаридов имеет Swa++–фенотип). Также возможно, что Swa++–фенотип обусловлен снижением или возрастанием уровня продукции бактериальных факторов, регулирующих социальное поведение азоспирилл или изменением систем “рецепции”, воспринимающих эти факторы.

Наблюдения за поведением ряда Swa–мутантов штамма A. brasilense Sp245 позволили нам выявить скрытый потенциал, обеспечивающий распространение азоспирилл по полужидким средам. Клетки мутантов длительное время остаются в точке инокуляции (Swa–фенотип), а затем начинают перемещаться, формируя диски, состоящие из клеточных агрегатов – Gri+–распространение. Способ распространения с образованием микроколоний не связан с какими-либо общими дефектами в продукции полисахаридов, локализованных на клеточной поверхности. Более того, межклеточные взаимодействия, обусловленные поверхностными структурами бактериальной клетки, важны для реализации Gri+–распространения.

Изучение морфологии клеток Gri+–мутантов и их подвижности в полужидком агаре позволяет полагать, что, реализуя механизм распространения с образованием микроколоний, бактерии не используют жгутики. При этом на одном из полюсов клеток Gri+–мутантов обнаружен пучок пилей. Необходимо отметить, что пучок пилей был также обнаружен на полюсе клеток и у штамма Sp245. Вероятно, продукция на полюсе клетки либо вращающегося Fla, либо пилей являются альтернативными состояниями вегетативных клеток азоспирилл.

В популяции клеток A. brasilense Sp245 с низкой частотой появляются клоны, распространяющиеся с образованием Gri+–колоний (3103), и неподвижные клоны (5102). Частота появления Gri+–клонов слегка возрастает (до 1102) в результате преинкубации Sp245 без аэрации. Клоны Sp245 со спонтанным Gri+– или Swa Gri–фенотипом оказались нестабильными, а Swa+–фенотип доминировал в популяции. Охарактеризованная нами впервые фенотипическая диссоциация азоспирилл по признаку подвижности клеток в гелеобразных средах подтверждена результатами анализа диссоциативного спектра популяций, вырастающих после рассева цистоподобных покоящихся клеток на плотных средах (работы сотрудников Института микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, г. Москва). Авторами (Погорелова с соавт., 2009) показано, что диссоцианты A. brasilense Sp7 или Sp245 помимо колониально–морфологических признаков различались в способах распространения в полужидких средах (отмечены Swa+–, SwaGri– и Swa+ Gri+–фенотипы).

Подавление роения бактерий рода Azospirillum (показано для 15 исследованных штаммов A. brasilense дикого типа, 2-х штаммов A. irakense и 2-х штаммов A. lipoferum) и стабильное проявление у них способности к распространению с образованием микроколоний может быть индуцировано адсорбцией на клетках “прижизненного” красителя конго красного. Модификации экстраклеточных соединений, которые бактерии используют для реализации социальной подвижности, могут способствовать переходу от Gri–распространения к роению в присутствии конго красного.

Появление среди клеток Gri+–мутанта, формирующих агрегаты на полужидком агаре, субпопуляции бактерий с восстановленной способностью к роению сопровождается возобновлением продукции полярного жгутика. Такие производные приобретают устойчивый фенотип Swa++. Субпопуляция особей, обладающих повышенной скоростью миграции, возникает и в популяции роящихся клеток. Вероятно, у A. brasilense существует либо механизм запуска экспрессии систем, необходимых для ускоренного движения бактерий, либо быстро двигающиеся особи, изначально присутствующие в популяции, формируют Swa++–субпопуляцию в ответ на внешние или внутрипопуляционные стимулы.

Нами показано, что скорость перемещения азоспирилл снижается в присутствии специфических антител на липополисахариды. Снижение скорости движения клеток, обусловленное взаимодействием антител на ЛПС с полярным жгутиком (чехлом) и возникновением на линии фронта движущихся бактерий иммунных агрегатов, тормозящих распространение азоспирилл в полужидком агаре, позволяет рассматривать антитела как модулирующий фактор, усиливающий межклеточные контакты, обусловленные взаимодействиями с участием полисахаридов.

Результаты настоящей работы позволили впервые описать роль межклеточных контактов, обусловленных взаимодействиями гемагглютинина и О-специфического полисахарида в распространении азоспирилл, использующих для движения жгутики. Подобные взаимодействия бактерий модулируются, в частности, в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

Штамм A. brasilense Sp245, являющийся модельным объектом наших исследований, содержит плазмиды р85, р120 и три плазмиды с молекулярной массой >300 МДа (Кацы, 1992). Поскольку плазмиды составляют весомую долю генома A. brasilense, закономерен интерес к выяснению роли этих ДНК в обеспечении поведения бактерий (Кацы, 2002а). Ранее нами было продемонстрировано, что в плазмидах р85 и р120 находятся локусы, инсерционный мутагенез которых приводит к Fla, Mot и Laf–фенотипу мутантов (Shelud’ko et al., 1998; Шелудько, 2000; Кацы, 2002б). Результаты, представленные в настоящей работе, свидетельствуют, что интеграция вектора pJFF350 в плазмиду р85 приводит к разным фенотипическим проявлениям: к утрате способности клеток синтезировать функционирующие флагеллы и, как следствие, к Swa–фенотипу или к появлению бактерий с ускоренным роением. Стоит отметить, что при включении pJFF350 в ДНК p85 отсутствует строгая сайт–специфичность. В случае вставки Omegon–Km в плазмиду р120 нарушается не только продукция и функционирование жгутиков (Swa–фенотип), но и изменяются свойства поверхностных полисахаридов. При этом у ряда мутантов изменения в синтезе полисахаридов сопровождаются повышением скорости роения. Необходимо отметить, что, утратив способность к роению, мутанты с инсерциями, локализованными в р85 или р120, сохраняют способность к распространению с образованием микроколоний.

Переход от Gri+–распространения (BK759G) к Swa++–подвижности (BK759P) сопровождается исчезновением р85 и появлением новой плазмиды с молекулярной массой 36 МДа. Вероятно, для функционирования генов, обеспечивающих Gri–распространение, присутствие в геноме репликона р85 является существенным. Так, ряд Swa Gri–мутантов штамма Sp245 утратили р85, а у мутанта Sp245.5 (утрачены 85– и 120–МДа репликоны) поведение клеток в полужидких средах не изменяется в присутствии конго красного, способствующего переходу азоспирилл к Gri+–подвижности. Swa Gri–фенотип наблюдается и в тех случаях, когда транспозон встраивается в хромосомную ДНК.

Интересным оказалось то, что эффективность распространения в полужидких средах клеток A. brasilense BK759Р (Swa++–производного мутанта BK759G) сопоставима со скоростью роения ВК468 и ВК571. Однако молекулярно–генетический анализ показал, что за проявление Swa++–фенотипа у мутантов, по-видимому, отвечают множество локусов, гомологичные фрагментам ДНК р85 или р120, несущим информацию о продукции флагелл или полисахаридов Sp245. Таким образом, переход от Gri+–распространения клеток мутанта BK759G к Swa++–подвижности (BK759P) сопровождается перестройкой генома, затрагивающей плазмиды, а возрастание скорости коллективного роения бактерий, по–видимому, обуславливают несколько генетических локусов A. brasilense Sp245.

Одним из возможных объяснений неоднозначности данных о роли p85 в обеспечении подвижности может быть не истинная элиминация плазмиды из клетки, а интеграция этой плазмиды или локусов fla/laf/swa/gri в другие репликоны. Не исключено, что интеграцию обуславливают мобильные элементы, обнаруженные в составе р85 (Katsy, Prilipov, 2009). В секвенированном фрагменте ДНК p85 A. brasilense нами обнаружены гены, продукты экспрессии некоторых из которых, по–видимому, могут опосредовать поведенческие реакции бактерий. Так, продукт orf293 обладает значимым сходством с HdfR. HdfR известен как репрессор транскрипции мастер–оперона flhDC, продукты которого необходимы для экспрессии остальных флагеллярных генов у E. coli и других бактерий (Ko, Park, 2000). Рядом с hdfR в р85 выявлен ccoN – ген каталитической субъединицы I цитохромоксидазы, являющейся интегральным белком цитоплазматической мембраны. Эта кодируемая p85 56–кДа субъединица содержит участки и каталитические центры, достаточные для работы фермента в качестве протонной помпы. Трансмембранный протонный потенциал, в частности, используется как источник энергии для вращения бактериальных флагелл.

Локализация охарактеризованного комплекса генов в р85 A. brasilense Sp245 недалеко от IS–элементов ISAzba1 и ISAzba2 свидетельствует о потенциальной мобильности этих генов, что может сказываться на поведении бактерий. Оказалось, что у двух спонтанных Swa++–производных (Sp245.P1 и Sp245.P5) ПЦР с парой праймеров, специфичных к 3'–концу гена hdfR, давали негативные результаты. Таким образом, спонтанные перестройки, приводящие к появлению Swa++–вариантов, в ряде случаев сопровождаются утратой или модификацией гена hdfR, локализованного в p85. Стоит еще раз отметить, что рядом с hdfR в р85 локализован ccoN. Таким образом, выявленное нами спонтанное изменение первичной структуры исследуемого района 85–МДа плазмиды A. brasilense Sp245 может влиять на экспрессию генов hdfR и ccoN и, как следствие, на появление субпопуляций азоспирилл с ускоренным роением.

Результаты проделанной работы свидетельствуют, что на полужидких средах подвижные клетки бактерий рода Azospirillum способны переходить от плавания или роения к неподвижному состоянию, распространению с образованием микроколоний или ускоренному роению. Подобное многообразие способов коллективной подвижности бактерий описано только у P. aeruginosa (Kohler et al., 2000). Возникает вопрос, в каких условиях азоспириллы используют потенциал, предоставляемый тем или иным типом подвижности.

Такие аминокислоты, как аспарагиновая кислота, серин или треонин, способствовали индукции Gri+–подвижности у A. brasilense Sp245. В случае роения, Swa+–, Swa++– или Gri+–подвижности спектр аминокислот, влияющих на эффективность распространения бактерий, различен. Вероятно, это имеет определенное значение в процессе адаптации азоспирилл к существованию в симбиозе с растениями, поскольку состав корневых экссудатов (преимущественное содержание в экссудатах той или иной аминокислоты) может определять преобладание того или иного фенотипа подвижности. По нашим наблюдениям, корневые экссудаты проростков пшеницы стимулируют роение клеток A. brasilense Sp245 по пока непонятному механизму и способствуют переходу неподвижных или Gri+–клонов к роению.

В настоящей работе нами впервые показано, что лектины со сродством к остаткам N–ацетил––D–глюкозамина (WGA или STA) наиболее заметно влияют и на коллективную подвижность Sp245, стимулируя переход части популяции к распространению в полужидких средах с образованием микроколоний. Мы предполагаем, что в присутствии лектинов со сродством к остаткам N–ацетил––D–глюкозамина переход азоспирилл от Swa+–подвижности к Gri+–распространению является следствием снижения подвижности бактерий при помощи жгутиков и возможных изменений межклеточных взаимодействий, необходимых для роения.

Интересными оказались результаты, свидетельствующие, что специфические взаимодействия лектинов различного происхождения с клетками A. brasilense влияют на скорость движения бактерий. В конечном итоге это сказывается на контакте бактерий с целостным организмом, продуцирующим лектин. В настоящей работе с использованием мутантов Sp245 по образованию ЛПС установлено, что лектин G. frondosa, как и фитолектины, оказывает тормозящее влияние на движение A. brasilense, но при условии сохранения на поверхности азоспирилл специфического гаптена – ОПСI. Бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина G. frondosa (в природе A. brasilense и G. frondosa занимают разные экологические ниши), “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма. Данная находка, на наш взгляд, позволяет использовать результаты влияния лектинов на скорость движения бактерий для прогнозирования развития взаимодействий между организмами.

Изучение такого проявления социального поведения микробов как формирование биопленок позволило нам впервые охарактеризовать некоторые структуры, участвующие в данном процессе у азоспирилл. Показано, что в структурной организации биопленок азоспирилл на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность” участвуют липополисахариды и полисахариды, связывающие калькофлуор. Как оказалось, спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245 оказывают заметное влияние на социальную активность этих бактерий, проявляющуюся, в частности, в формировании биопленок. Организация биопленок на корнях пшеницы происходит при участии полисахаридных и белковых детерминант бактериальной поверхности. По-видимому, бактериальные гликополимеры и белки обеспечивают не только прикрепление бактериальной биопленки к поверхности корня, но и участвуют в организации ее строения, вовлекая в этот процесс факторы растительного происхождения. Одной из стадий формирования биопленки и на стекле или полистироле является образование клеточных агрегатов, но в дальнейшем микроколонии сливаются в единый слой клеток. Напротив, на поверхности корня после “заякоривания” бактерий их расположение в составе микроколоний преобладает. В настоящей работе нами впервые показано, что после “заякоривания” на корнях клетки штамма A. brasilense Sp245 дикого типа и его Fla Swa Gri+–мутантов заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью. Установлено, что в процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

Разработанные в рамках настоящего исследования методические приемы позволили предложить тест, основанный на ингибировании подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения. Тест может быть использован для определения серологического родства бактерий и исследования экспонированных углеводных и белковых детерминант в составе поверхности интактных клеток.

В ходе выполнения работы открылись новые перспективы для дальнейших исследований. Так, обнаружение таких фактов, как модулирующее действие корневых экссудатов и фитолектинов на социальную подвижность азоспирилл, активация синтеза белковых детерминант у бактерий, формирующих биопленку на корнях пшеницы, дает возможность для развития исследований, направленных на выяснение механизмов обмена сигналами между партнерами ассоциативного симбиоза.

Автор надеется, что выполненная работа послужит основой для продолжения изучения механизмов адаптации микроорганизмов к обитанию в различных экологических нишах, в том числе, в ассоциациях с растениями. Данное исследование может найти дальнейшее практическое применение при конструировании бактерий, перспективных для использования в биотехнологии.

ВЫВОДЫ

1. В полужидких средах микроколониальное распространение A. brasilense Sp245 не зависит от работы жгутиков и происходит при участии поверхностных структур бактериальной клетки, способных адсорбирировать “прижизненный” краситель конго красный. Адсорбция на клетках конго красного приводит к подавлению роения азоспирилл и стабильному проявлению у них способности к распространению с образованием микроколоний.

2. Эффективность зависящего от работы жгутиков роения A. brasilense Sp245 определяется не только скоростью движения клеток, но и свойствами и составом поверхностных полисахаридов этих бактерий.

3. Межклеточные контакты бактерий A. brasilense Sp245, распространяющихся по полужидким средам, опосредованы взаимодействиями белка-гемагглютинина и О-специфического полисахарида. Подобные взаимодействия бактерий модулируются в зависимости от природы источника азота в окружающей среде и доступности кислорода.

4. Сниженная концентрация кислорода, аспарагиновая кислота, серин, треонин и растительные лектины, специфичные к остаткам N-ацетил--D-глюкозамина, стимулируют переход части популяции клеток A. brasilense к распространению с образованием микроколоний. Источники азота, недостаток кислорода и корневые экссудаты проростков пшеницы оказывают модулирующее действие на зависящие от работы жгутиков скорость движения клеток и роение бактерий.

5. Определенные генетические перестройки в 85-МДа плазмиде штамма A. brasilense Sp245 сопровождаются изменениями в жгутиковании и социальной подвижности азоспирилл. На подвижность клеток могут, в частности, влиять предсказанные белковые продукты выявленных в р85 генов hdfR – негативного регулятора транскрипции жгутикового мастер-оперона flhDC и ccoN – каталитической субъединицы I цитохромоксидазы.

6. Спонтанные или индуцированные изменения состава и (или) структуры плазмид A. brasilense Sp245, приводящие к дефектам в образовании липополисахаридов, полисахаридов, связывающих калькофлуор, и полярного жгутика, оказывают заметное влияние на эффективность формирования биопленок азоспирилл на абиотических поверхностях. Перечисленные компоненты клеток азоспирилл участвуют в организации биопленок A. brasilense на границе раздела фаз “водная среда – твердая гидрофильная поверхность” и “водная среда – твердая гидрофобная поверхность”.

7. После “заякоривания” на корнях пшеницы клетки штамма A. brasilense Sp245 и его мутантов, распространяющихся с образованием микроколоний, заселяют растущие корни с примерно одинаковой эффективностью, формируя клеточные агрегаты. В процессе адаптации к существованию на корнях у штамма A. brasilense Sp245 повышается количество экспонированных на клеточной поверхности родоспецифических белковых антигенов.

8. Специфические взаимодействия чужеродных лектинов с клетками A. brasilense влияют на скорость движения бактерий, что сказывается на контакте с организмом, продуцирующим лектин. Так, бактериальные штаммы, клетки которых снижают скорость движения в жидких средах в присутствии лектина базидиомицета Grifola frondosa, “распознаются” грибом с наименьшим проявлением антагонизма.

9. Ингибирование подвижности азоспирилл антителами на поверхностные бактериальные структуры или лектинами различного происхождения может быть использовано в качестве теста, позволяющего оценивать серологическое родство бактерий и исследовать степень экспонированности углеводных и белковых компонентов в составе поверхности интактных клеток.

Условные обозначения и сокращения: orf – открытая рамка считывания; ORF – белковый продукт orf; p85 – 85-МДа плазмида штамма A. brasilense Sp245; p120 – 120-МДа плазмида штамма A. brasilense Sp245; ЛПС, LPS – липополисахарид; ОПС – О-специфический полисахарид; ПССК – полисахариды, связывающие калькофлуор; ЛПБК – липополисахарид–белковый комплекс; ПСЛК – полисахарид–липидный комплекс; Cal+/Cal – адсорбция/отсутствие адсорбции калькофлуора; Fla – полярный жгутик; Fla+/Fla – наличие/отсутствие полярного жгутика; Mot+/Mot – подвижность/отсутствие подвижности в жидких средах; Laf – латеральные жгутики; Laf+/Laf – наличие/отсутствие латеральных жгутиков; Bfp – пучок пилей; Swa+/Swa – наличие/отсутствие роения бактерий; Swa++ – ускоренное роение; Gri+ – распространение бактерий в полужидкой среде с образованием микроколоний; LB – среда Luria-Bertani; MSM – малатно-солевая среда; MPSS – среда для нитратредукции; ФСБ – фосфатно-солевой буфер; ИФА – твердофазный непрямой иммуноферментный анализ; КОЕ – колониеобразующие еденицы; BSA – бычий сывороточный альбумин; ConA – конканавалин А (Canavalia ensiformis); PHA–P – фитогемагглютинин–P (Phaseolus vulgaris); STA – агглютинин клубней картофеля (Solanum tuberosum); UEAII – лектин из утесника обыкновенного (Ulex europaeus); WGA – агглютинин зародышей пшеницы (Triticum vulgaris).

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Cтатьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ

  1. Scheludko A.V., Katsy E.I., Ostudin N.A., Gringaus O.K., Panasenko V.I. Novel>
  2. Katzy E.I., Matora L.Yu., Serebrennikova O.B., Scheludko A.V. Involvement of a 120-MDa plasmid of Azospirillum brasilense Sp245 in production of lipopolysaccharides // Plasmid. 1998. V. 40, № 1. P. 73-83.
  3. Кацы Е.И., Шелудько А.В. Картирование локуса fla в плазмиде с молекулярной массой 120 МДа у бактерий Azospirillum brasilense Sp245 // Генетика. 1999. Т. 35, № 10. С. 1367-1372.
  4. Кацы Е.И., Шелудько А.В. Использование транспозонового TnphoA мутагенеза для получения мутантов Azospirillum brasilense по подвижности и жгутикованию // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2000. № 4. С. 17-20.
  5. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В. Влияние интеграции вектора pJFF350 в 85-МДа плазмиду Azospirillum brasilense Sp245 на жгутикование и подвижность бактерий // Генетика. 2001. Т. 37, № 2. С. 183-189.
  6. Камнева А.Б., Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В., Панасенко В.И. Комплементационный анализ мутантов ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense Sp245 и S27, дефектных по подвижности и жгутикованию // Генетика. 2001. Т. 37, № 2. С. 190-196.
  7. Шелудько А.В., Кацы Е.И. Образование на клетке Azospirillum brasilense полярного пучка пилей и поведение бактерий в полужидком агаре // Микробиология. 2001. Т. 70, № 5. C. 662-667.
  8. Шелудько А.В., Борисов И.В., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Влияние конго красного на подвижность бактерий Azospirillum brasilense // Микробиология. 2006. Т. 75, №1. C. 62-69.
  9. Лощинина Е.А., Никитина В.Е., Цивилева О.М., Степанова Л.В., Пономарева Е.Г., Шелудько А.В. Морфолого-культуральные характеристики базидиомицета Lentinus edodes при совместном культивировании с бактериями рода Azospirillum // Вестн. Сарат. гос. аграрн. ун-та. 2006. № 6. С. 13–14.
  10. Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Шелудько А.В., Кацы Е.И., Щеголев С.Ю., Матора Л.Ю. Выявление чехла на поверхности полярного жгутика Azospirillum brasilense // Микробиология. 2007. Т. 76, № 6. С. 822-829.
  11. Stepanova L.V., Schelud'ko A.V., Katsy E.I., Ponomareva E.G., Nikitina V.E. The role of lectin-carbohydrate biospecific interactions between medicinal basidiomycetes mushroom Grifola frondosa (Dicks.: Fr.) S. F. Gray and Azospirillum brasilense during their co-cultivation // Int. J. Med. Mushrooms. 2008. V. 10, № 1. P. 65-72.
  12. Шелудько А.В., Кулибякина О.В., Широков А.А., Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Влияние мутаций в синтезе липополисахаридов и полисахаридов, связывающих калькофлуор, на формирование биопленок Azospirillum brasilense // Микробиология. 2008. Т. 77, № 3. С. 358-363.
  13. Golubev S.N., Scheludko A.V., Muratova A.Yu., Makarov O.E., Turkovskaya O.V. Assessing the potential of rhizobacteria to survive under phenanthrene pollution // Water Air Soil Pollut. 2009. V. 198, № 1-4. P. 5-16.
  14. Scheludko A.V., Makrushin K.V., Tugarova A.V., Krestinenko V.A., Panasenko V.I., Antonyuk L.P., Katsy E.I. Changes in motility of the rhizobacterium Azospirillum brasilense in the presence of plant lectins // Microbiol. Res. 2009. V. 164, № 2. P. 149-156.
  15. Borisov I.V., Scheludko A.V., Petrova L.P., Katsy E.I. Changes in Azospirillum brasilense motility and the effect of wheat seedling exudates // Microbiol. Res. 2009. V. 164, № 5. P. 578-587.
  16. Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Варшаломидзе О.Э., Ветчинкина Е.П., Кацы Е.И., Никитина В.Е. Гемагглютинирующая активность и подвижность бактерий Azospirillum brasilense в присутствии разных источников азота // Микробиология. 2009. Т. 78, № 6. С. 749-756.
  17. Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Локализация генов денитрификации в плазмидной ДНК Azospirillum brasilense // Генетика. 2010. Т. 46, № 7. С. 904-910.
  18. Шелудько А.В., Широков А.А., Соколова М. К., Соколов О. И., Петрова Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Колонизация корней пшеницы бактериями Azospirillum brasilense с различной подвижностью // Микробиология. 2010. Т. 79, № 5 С. 696-704.

Статьи в сборниках

  1. Шелудько А.В., Крестиненко В.А., Бурыгин Г.Л., Богомолова И.С. Изучение факторов, влияющих на тип пространственных структур, формируемых подвижными бактериями Azospirillum brasilense Sp245 // Сб. “Нелинейные дни для молодых в Саратове–2003”. Саратов: ГосУНЦ “Колледж”, 2003. С. 237-241.
  2. Шелудько А.В., Тугарова А.В., Бурыгин Г.Л., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Кацы Е.И. Моделирование условий, влияющих на способы распространения Azospirillum brasilense по агаризованным средам // Сб. ст. 2-й регион. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой”. Саратов: Научная книга, 2005. С. 82-89.
  3. Степанова Л.В., Никитина В.Е., Шелудько А.В. Совместное культивирование базидиомицета Grifola frondosa (Fr.) S.F. Gray и ризобактерии Azospirillum brasilense: значение специфических взаимодействий при первичном контактировании // Сб. матер. 5-го Всеросс. конгресса по медицинской микологии “Успехи медицинской микологии” / Ред. Ю.В. Сергеев. М.: Национальная академия микологии, 2007. Т. IX. С. 261–265.
  4. Варшаломидзе О.Э., Шелудько А.В., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Кацы Е.И. Влияние источников азота на подвижность и свойства клеточной поверхности Azospirillum brasilense // Сб. “Биология: традиции и инновации в XXI веке” / Ред. Т.В. Балтина. Казань: Изд-во КГУ, 2008. С. 29–31.
  5. Кацы Е.И., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Шульгин С.В. Спонтанные и индуцированные изменения в социальной подвижности ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense // Бюлл. МОИП. Отдел биол. 2009. Т. 114, № 2, прил. 1. С. 132-133.

Учебно-методическое пособие

  1. Методы изучения бактериальной подвижности в приложении к биохимическим, генетическим и иммунохимическим задачам / Составители: Шелудько А.В., Кацы Е.И., Матора Л.Ю., Бурыгин Г.Л., Широков А.А., Щеголев С.Ю. / Ред. В.В. Игнатов. Саратов: Научная книга, 2007. 56 с.

Тезисы докладов

  1. Шелудько А.В., Кацы Е.И., Борисов И.В. Поведение ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense Sp245, характеризующейся смешанным жгутикованием, в полужидких средах // Сб. тез. шк.-конф. “Горизонты физико-химической биологии” (Пущино, 2000 г.). Пущино, 2000. Т. 1. С. 214.
  2. Borisov I.V., Petrova L.P., Sheludko A.V., Katzy E.I. Genetic analysis of flagellar production and spreading in semiliquid media in the plant-associated bacterium Azospirillum brasilense // The World of Microbes. Abstr. Xth IUMS Intern. Congr. Bacteriol. Appl. Microbiol. (Paris, France, 2002). Paris, 2002. P. 79.
  3. Шелудько А., Кацы Е., Борисов И., Абрамов А., Скрипаль А. Энергообеспечение вращения полярной флагеллы ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense // Биология – наука XXI века: 6-я Пущинская шк.-конф. молодых ученых (Пущино, 2002 г.): Сб. тез. Тула: Изд-во Тул. гос. пед. ун-та им. Л. Толстого, 2002. Т. 1. С. 75-76.
  4. Katsy E.I., Borisov I.V., Petrova L.P., Sheludko A.V. Genetic and phenotypic variability in the populations of Azospirillum brasilense // Molecular Plant-Microbe Interactions: New Bridges between Past and Future. Abstr. XIth Intern. Congr. Molecular Plant-Microbe Interactions (St.-Petersburg, Russia, 2003). St.-Petersburg, 2003. P. 311.
  5. Katsy E.I., Petrova L.P., Sheludko A.V., Borisov I.V., Kamneva A.B., Matveeva E.V., Matora L.Yu., Burygin G.L. Properties of the plant-growth promoting rhizobacterium Azospirillum brasilense relevant to colonization of artificial media and wheat roots and to bioremediation // Abstr. Intern. Symp. “Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants” (Saratov, Russia, 2003). Saratov, 2003. P. 15-16.
  6. Макрушин К.В., Шелудько А.В., Бурыгин Г.Л., Крестиненко В.А., Панасенко В.И., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Быстрая идентификация штаммов Azospirillum brasilense с использованием видеоанализа подвижности микроорганизмов в присутствии антител на поверхностные антигены // Матер. 2-й регион. конф. молодых ученых “Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой” (Саратов, 2004 г.). Саратов: Научная книга, 2004. С. 21-22.
  7. Шелудько А.В., Тугарова А.В., Кацы Е.И., Панасенко В.И., Крестиненко В.А., Антонюк Л.П. Участие фитолектинов в регуляции подвижности ризобактерии Azospirillum brasilense // Биология – наука XXI века: 9-я Междунар. Пущинская шк.-конф. молодых ученых (Пущино, 2005 г.). Пущино, 2005. C. 219.
  8. Кацы Е.И., Борисов И.В., Шелудько А.В., Петрова Л.П., Панасенко В.И. Генетический анализ подвижности и образования компонентов клеточной поверхности у ассоциативных альфа-протеобактерий Azospirillum brasilense // Матер. Всеросс. конф. “Молекулярные механизмы взаимодействия микроорганизмов и растений: фундаментальные и прикладные аспекты” (Саратов, 2005 г.). Саратов: Научная книга, 2005. С. 10-12.
  9. Tugarova A.V., Sheludko A.V., Katzy E.I., Panasenko V.I., Antonyuk L.P. Phytolectins as biologically active substances for rhizobacteria of the genus Azospirillum // FEBS J. 2005. V. 272, Suppl. 1 (Abstr. 30th FEBS Congr., Budapest, Hungary, 2005). P. 77.
  10. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Кулибякина О.В., Борисов И.В., Макрушин К.В., Широков А.А., Матора Л.Ю., Соколова М.К., Соколов О.И., Хлебцов Б.Н. Изменения в структуре клеточной поверхности, социальная активность и взаимодействие Azospirillum brasilense с пшеницей // Мiжнар. наук. конф. “Мiкробнi бiотехнологi” (Одесса, Украина, 2006 г.): Тез. допов. Одесса: Астропринт, 2006. С. 65.
  11. Борисов И.В., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Кацы Е.И. Фазовые вариации в подвижности ассоциативных бактерий Azospirillum brasilense сопровождаются изменениями в архитектуре генома // Междунар. шк.–конф. “Генетика микроорганизмов и биотехнология” (Москва–Пущино, 2006 г.): Сб. тез. Москва-Пущино, 2006. С. 34.
  12. Шелудько А.В., Широков А.А., Кулибякина О.В., Петрова Л.П., Хлебцов Б.Н., Соколова М.К., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Изменения в социальной активности и взаимодействие Azospirillum brasilense с проростками Triticum aestivum // Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой / III Межрегион. конф. мол. уч.: Сб. матер. Саратов: Научная книга, 2006. С. 18.
  13. Katsy E.I., Prilipov A.G., Petrova L.P., Borisov I.V., Scheludko A.V., Kulibyakina O.V. Properties and functions of the Azospirillum brasilense Sp245 and Sp7 plasmids relevant to associative interactions of these bacteria with plants // Abstr. Intern. Sci. Conf. “S.P. Kostychev and Contemporary Agricultural Microbiology” (Yalta, Ukraine, 2007). Chernihiv: CSTEI, 2007. P. 14.
  14. Шелудько А.В., Широков А.А., Кулибякина О.В., Пономарева Е.Г., Тугарова А.В., Никитина В.Е., Антонюк Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Внутрипопуляционные и внешние факторы, определяющие изменения в социальной активности Azospirillum brasilense // Сб. матер. Всеросс. конф. с междунар. участием “Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем” (Саратов, 2007 г.). Саратов: Научная книга, 2007. С. 42.
  15. Шелудько А.В., Тугарова А.В., Широков А.А., Пономарева Е.Г., Никитина В.Е., Антонюк Л.П., Матора Л.Ю., Кацы Е.И. Внешние факторы, влияющие на социальную активность стимулирующих рост растений бактерий рода Azospirillum // Матер. междунар. науч. конф. “Микроорганизмы и биосфера” (Москва, 2007 г.). М.: Макс Пресс, 2007. С. 149–150.
  16. Кацы Е.И., Петрова Л.П., Шелудько А.В., Варшаломидзе О.Э., Кулибякина О.В., Прилипов А.Г. Изменения в структуре плазмид и вариации в проявлении признаков, значимых для взаимодействия ассоциативной бактерии Azospirillum brasilense с растениями// Матер. 5-го Московского междунар. конгр. “Биотехнология: состояние и перспективы развития”. Ч. 1. (Москва, 2009). М.: ЗАО “Экспо-биохим-технологии”, РХТУ им. Д.И. Менделеева, 2009. С. 283.

Подписано в печать XX.XX.XXXX. Формат 6084 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times. Печать RISO. Усл.п.л. 2. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в ООО “Ракурс”

410012, г. Саратов, ул. Б. Казачья, 79/85



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.