WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Взаимодействие комплемента с иммуноглобулинами g и конформационные изменения компонента с3 при неопластических процессах

На правах рукописи





КНЯЗЕВА ОЛЬГА АЛЕКСАНДРОВНА

ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ КОМПЛЕМЕНТА

С ИММУНОГЛОБУЛИНАМИ G

И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ

КОМПОНЕНТА С3 ПРИ

НЕОПЛАСТИЧЕСКИХ ПРОЦЕССАХ

03.00.04 – Биохимия

03.00.02 – Биофизика

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Пущино – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Башкирский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению

и социальному развитию» и в Институте биохимии и генетики

Уфимского научного центра РАН

Научные консультанты:

доктор медицинских наук, профессор

Камилов Феликс Хусаинович

доктор биологических наук, профессор

Вахитов Венер Абсатарович


Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Маевский Евгений Ильич

доктор биологических наук, профессор

Башкатов Сергей Александрович

доктор медицинских наук, профессор

Далин Михаил Викторович

Ведущая организация:

ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Москва




Защита состоится июня 2008 года в часов на

заседании Диссертационного Совета Д 002.038.01 при Институте

биофизики клетки РАН по адресу: 142290 г. Пущино Московской

области, ул. Институтская, д.3.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке

Института биофизики клетки РАН г. Пущино

Автореферат разослан « » 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

кандидат биологических наук Т.И. Смолихина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Неопластические процессы развиваются благодаря способности опухолевых клеток к «ускользанию» от иммунного надзора. Причины данного феномена пока до конца не понятны, хотя для его объяснения имеется множество концепций. В настоящее время считается, что существует большое разнообразие механизмов ухода неопластических клеток из-под иммунологического контроля. Выяснение этих механизмов является одним из наиболее актуальных направлений современной биологии и медицины.

При развитии злокачественных новообразований у больных обнаруживаются нарушения иммунитета, затрагивающие практически все его звенья. Существенную роль при этом играют опухолевые маркеры, сывороточные антитела, белки системы комплемента [Йегер Л. и др., 1990; Барышников А.Ю., 2003; Абелев Г.И., 2004; Никулин Б.А., 2007].

Антитела, большая часть которых приходится на класс IgG, являются ключевыми макромолекулами приобретенного иммунитета, так как они отвечают за распознавание чужеродных агентов и запускают иммунные реакции организма. Вместе с тем иммунный ответ инициируется и усиливается различными фрагментами компонентов системы комплемента, которая среди систем гуморального звена врожденного иммунитета обладает наиболее сложным и многогранным действием.

Начальным этапом классического пути активации комплемента является присоединение к комплексу антиген-антитело C1q - субкомпонента первого фактора комплемента. Компонент С3, участвующий во всех путях активации комплемента и являющийся одним из центральных белков защитной системы человека, выступает в качестве связующего звена между врожденным и приобретенным иммунитетом [Sahu A. et al., 2001; Xin-pei Yu et al., 2004].

В основе нарушения механизмов реализации противоопухолевой защиты организма может лежать изменение характера взаимоотношений между различными системами иммунитета и их составляющими, в том числе между антителами и комплементом. Выявление этих закономерностей позволяет по-новому подойти к оценке патогенеза болезни и приблизить к разгадке феномена иммунной резистентности новообразований.

В силу выше изложенного, именно эти три молекулы: IgG, C1q, C3 были выбраны нами для исследований взаимодействия комплемента с иммуноглобулинами (C1q с IgG) и конформационных изменений в процессе спонтанного гидролиза (С3) при неопластических процессах.

Цель исследования: выяснить биохимические механизмы взаимодействия врожденного и приобретенного иммунитета на примере ключевых белков: субкомпонента комплемента C1q и иммуноглобулина G, а также конформационных изменений компонента комплемента С3 в процессе спонтанного гидролиза при неопластических состояниях.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

  1. Сравнить константы взаимодействия между субкомпонентом комплемента C1q и IgG при неопластических состояниях (хроническом лимфолейкозе, ходжкинских и неходжкинских лимфомах, раке молочной железы) и в норме.
  2. Провести сравнительный анализ аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG больных хроническим лимфолейкозом и здоровых доноров.
  3. Сравнить количество C1q связывающихся с IgG больных хроническим лимфолейкозом и здоровых доноров.
  4. Оценить на модели IgG-фосфатидилхолин влияние лигандирования на комплементфиксирующую функцию IgG и аффинность моноклональных антител к его различным антигенным детерминантам.
  5. Оценить влияние IgG при изучаемых заболеваниях на альтернативный путь активации комплемента.
  6. Оценить закономерности конформационных изменений С3 компонента комплемента в процессе спонтанного гидролиза при инкубации сыворотки и плазмы крови больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы, а также «группы онкологического риска».
  7. Исследовать взаимосвязь между уровнем конформационной формы С3 компонента – С3(Н2О) и опухольассоциированного антигена СА-125 у больных раком яичников до и после проведения курса химиотерапии.
  8. Изучить конформационные изменения С3 компонента у больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы на фоне программы химиотерапии.
  9. Оценить влияние на конформационные изменения С3 компонента иммуномотропных средств: эфирных масел Lavandula vera, Salvia sclaria и глюконатов 3d-металлов.

Научная новизна работы.

Впервые проведен анализ аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG больных хроническим лимфолейкозом. Впервые проведен сравнительный анализ констант диссоциации комплекса C1q-IgG до и после взаимодействия его с фосфатидилхолином и аффинности моноклональных антител к различным антигенным детерминантам IgG после его лигандирования.

Впервые охарактеризованы конформационные изменения С3 компонента комплемента в процессе его спонтанного гидролиза в сыворотке и плазме крови больных хроническим лимфолейкозом, ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы, «группы онкологического риска» по раку молочной железы. Впервые выявлена зависимость между изменением уровня конформационной формы С3 компонента комплемента С3(Н2О) и содержанием опухолевого маркера СА-125 в плазме крови больных раком яичников до и после проведения курса химиотерапии. Впервые охарактеризованы конформационные изменения С3 компонента под действием химиотерапии и иммунотропных средств (эфирных масел Lavandula vera, Salvia sclaria и глюконатов 3d-металлов).

Получены новые штаммы гибридом, продуцирующие моноклональные антитела к различным антигенным детерминантам иммуноглобулинов человека, пептиду мелиттину и опухолеассоциированному антигену СА-125.

Впервые обосновываются биохимические причины изменений взаимодействия C1q с IgG и конформационных изменений компонента С3 в процессе его спонтанного гидролиза при неопластических состояниях.

Научно-практическая значимость

Данные о взаимодействии C1q субкомпонента комплемента с IgG и конформационных изменениях С3 компонента в сыворотке крови больных при неопластических процессах и состояниях онкологического риска имеют большое значение для понимания молекулярных механизмов патогенеза заболеваний, для улучшения диагностики, прогноза и эффективности лечения. Полученные в работе моноклональные антитела (Патенты РФ от 1993-1994, №№: 2002803, 2003679, 2003680, 2003681, 2003682, 2003683, 2003684, 2003685, 2003686, 2003687, 2008350, 2010856) могут быть применены для различных биохимических, иммунологических, клинических исследований, создания диагностических тест-систем и лечебных препаратов.

Полученные результаты исследования могут помочь дальнейшему развитию и использованию научно-обоснованных методов борьбы со злокачественными заболеваниями. Результаты работы могут быть использованы в учебном процессе курсов биологической химии, иммунологии, онкологии образовательных учреждений высшего медицинского образования и последипломной подготовки врачей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При неопластических процессах: хроническом лимфолейкозе, ходжкинских и неходжкинских лимфомах, раке молочной железы происходит ослабление силы связывания между субкомпонентом комплемента C1q и иммуноглобулином G (IgG), выражающееся в увеличении константы диссоциации комплекса C1q-IgG.

2. Причиной снижения комплементфиксирующей функции IgG при неопластических процессах является взаимодействие с Fc-фрагментами IgG метаболитов деструкции неопластических и других клеток – лигандов пептидной и липидной природы, проявляющих свойства катионов.

3. При неопластических процессах белок С3 претерпевает модификационные изменения, проявляющиеся в процессе его спонтанного гидролиза, обусловленные появлением в сыворотке крови большего (по сравнению со здоровыми донорами) количества нуклеофилов, способствующих его конформационному переходу в форму С3(Н2О).

4. Изменение уровня конформационной формы С3 компонента – С3(Н2О) в плазме крови больных раком яичников после курса химиотерапии коррелирует со снижением концентрации опухольассоциированного антигена СА-125.

5. Под действием химиотерапии в процессе инкубации плазмы крови больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы наблюдается снижение уровня С3(Н2О) в зависимости от распространенности процесса и числа курсов химиотерапии, которое отражает положительную динамику лечения.

6. Иммунотропные средства (эфирные масла Lavandula vera, Salvia sclaria и глюконаты 3d-металлов) оказывает корригирующее и стабилизирующее влияние на изменение уровня С3(Н2О).

Личное участие автора в получении научных результатов заключается в разработке идеи работы, в постановке и проведении экспериментов, в статистической обработке и интерпретации полученных результатов.

Внедрение результатов работы. Полученные в диссертационной работе моноклональные антитела внедрены в научно-исследовательской работе кафедры биохимии и лаборатории биотехнологии Крымского государственного медицинского университета им. С.И. Георгиевского, Института биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН, кафедры биологической и биоорганической химии ГОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет Росздрава», Башкирского Республиканского онкологического диспансера и отдела биофизики Института биохимии им. А.В. Палладина НАН Украины (имеются акты внедрения).

Апробация работы: Материалы диссертации были доложены на республиканской конференции «Современные проблемы естествознания на стыке наук» (Уфа, 1998), 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 1999), XIX Всероссийском Чугуевском совещании по химии комплексных соединений (Иваново, 1999), Международном экологическом конгрессе «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2000), Международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности" (Томск, 2000), Международной научно-практической школе-конференции "Цитокины. Воспаление. Иммунитет" (Санкт-Петербург, 2002), III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002), научно-практической конференции «Перспективные разработки науки и техники» (Белгород, 2004), IV Международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований – 2005» (Днепропетровск, 2005), Межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук» (Уфа, 2006), Международной научно-практической конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований» (Одесса, 2006), Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы современной биохимии» (Киров, 2007), VIII Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007), VI Всероссийском научном семинаре «Химия и медицина» (Уфа, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 43 научные работы, из них 10 – в рекомендуемых ВАК РФ журналах, 4 – в центральной печати, 12 патентов РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 288 страницах компьютерного текста, включает 24 таблицы и 57 рисунков. Состоит из следующих разделов: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты собственных исследований и их обсуждение» (6 глав), «Заключение», «Выводы», «Список литературы», включающий 183 отечественных и 278 иностранных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В исследованиях были использованы сыворотки крови сходных по возрасту и полу больных при неопластических состояниях: хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) – 20 человек (с более 3 лет протекающей опухолевой формой ХЛЛ, при которой происходит диффузный рост опухоли в костном мозге); ходжкинские лимфомы (ХЛ) во II-IV стадии – 76; неходжкинские лимфомы (НХЛ) во II-IV стадии – 85; рак молочной железы (РМЖ) в I-IV стадии – 103; рак яичников (РЯ) в III стадии – 28; «группы онкологического риска» по раку молочной железы с диагнозом: фиброаденома (ФА) – 9 человек, диффузная мастопатия (ДМП) – 27, узловая мастопатия (УМП) – 10 и клинически здоровых доноров (контроль) – 37, а также смеси сывороток от разных доноров с пулом 50. Больные ХЛЛ находились на лечении в отделении гематологии городской клинической больницы №13 г. Уфы. Все другие – в Башкирском Республиканском онкологическом диспансере г. Уфы. Кровь здоровых людей получали на станциях переливания крови при этих больницах. У больных с новообразованиями диагноз был подтвержден при гистологическом исследовании опухолевой ткани, изучении анализов крови, стерильного пунктата и иммунологической маркерной характеристики лимфоцитов периферической крови (ХЛЛ).

Использовались чистые препараты IgG человека, выделенные методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-Трисакриле М ("LKB", Швеция) в 0,025М трис-HCl буфере, содержащим 1 М NaCl, рН 8,8, из сыворотки крови больных: ХЛЛ, ХЛ, НХЛ, РМЖ, здоровых доноров и смеси сывороток от 50 доноров (в каждой группе n=10). Чистоту полученных IgG определяли с помощью диск-электрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле по стандартной методике в системе буферных растворов рН 8,3-8,8.

Для решения поставленных в нашей работе задач необходимо было создать моноклональные антитела (МКАТ) к иммуноглобулинам человека, пептиду из яда пчелы – мелиттину и опухольассоциированному антигену СА-125, которые были получены с помощью гибридомной технологии. Гибридизацию проводили путем слияния 108 клеток селезенки мыши линии BALB/c, иммунизированной соответствующим антигеном, с 4107 клеток миеломы Sp 2/0 Ag14 в присутствии 50%-ного раствора полиэтиленгликоля с молекулярной массой 4000 ("Mеrck", Германия). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10-20% фетальной бычьей сыворотки и раствора ГАТ (гипоксантин, аминоптерин, тимидин) в первые 3 недели. Через 7-10 суток после гибридизации проводили анализ культуральной жидкости на наличие МКАТ методом непрямого ИФА. Позитивные клоны клонировали методом лимитирующего разведения. Наиболее продуктивный клон вводили в массовую культуру путем культивирования in vitro и in vivo. На всех стадиях получения гибридом клетки в фетальной бычьей сыворотке с добавлением 10%-ного диметилсульфоксида замораживали в жидким азоте. МКАТ выделяли из асцитической жидкости мышей путем осаждения в 17,5% растворе сернокислого аммония с последующей ионообменной хроматографией на ДЭАЭ-трисакриле М.

Таким образом, были получены МКАТ к IgG человека: A5B8; 2G11; Л2Н2; H11G5; 2F11; 2H11; к IgA - 3E11G8; -легким цепям иммуноглобулинов - Е5; -тяжелым цепям иммуноглобулинов - 3Н2; к (Fc)5: В3; к IgM( + Fc5): 1А4; В2; В5; мелиттину (пептиду из яда пчелы): M2F9; опухольассоциированному антигену рака яичников СА-125: C2, D5, E7, F4, G5.

Кроме того, в экспериментах были использованы МКАТ, полученные в Центральном научно-исследовательском рентгенорадиологическом институте МЗ РФ (С. Петербург): 5E3, 5F2, 3D3, 4D6 и МКАТ, полученные в НИИ особо чистых препаратов (С. Петербург): H11C3 и G10.

В работе использовались различные виды иммуноферментного анализа (ИФА): непрямой, конкурентный, «сэндвич», перйодатный метод конъюгации МКАТ, методы реакции связывания комплемента (РСК), двойной радиальной иммунодиффузии, определения общей (СН50) и по альтернативному пути (АРН50) гемолитической активности комплемента.

Статистическую обработку результатов проводили на ПЭВМ (AMD 486) в программе Microsoft Office Exeel 2003. Достоверность различий между группами оценивали в соответствии с критерием Стьюдента. Построение графиков и расчет констант производили, используя программу MATLAB 6.5.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие комплемента с IgG при неопластических состояниях.

Исследование взаимодействия комплемента с IgG по классическому пути проводили путем определения констант диссоциации (Kd) комплекса C1q-IgG больных ХЛЛ, ХЛ, НХЛ и РМЖ по разработанной нами методике (Ефетов К.А. и др., 1994), являющейся модификацией метода [Козлов Л.В. и др., 1983; Тэтин С.Ю. и др., 1985], предназначенной для сравнительной оценки величин Kd между собой. Изменение активности C1q прослеживалось в ИФА по конкуренции за связывание с ним двух IgG: исследуемых IgG человека и моноклональных IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой. Необходимым условием данного метода являлось взаимодействие обоих IgG с C1q и отсутствие взаимодействия между собой, поэтому были использованы полученные нами МКАТ М2F9 против пептида мелиттина.

Долю молекул C1q (Z), связавшихся с МКАТ, определяли по формуле: Z = ln (E1 – E2)/(E1 – E0), где E1 – экстинкция в контроле с PBS; E2 – экстинкция в контроле с BSA; E0 – экстинкция, регистрируемая в опыте.

Величина Z зависела от концентрации исследуемого IgG согласно уравнению: 1/Zi = С/Z0 1/Kd + 1/Z0, где Zi – доля молекул C1q, связавшихся с МКАТ в присутствии IgG; Z0 – доля молекул C1q, связавшихся с МКАТ в отсутствие IgG, Кd – константа диссоциации комплекса IgG-C1q, С – концентрация исследуемого IgG в моль/л. Построив график зависимости 1/Zi от [С] IgG, получали в точке пересечения прямой с осью абсцисс значение, равное Kd, но с противоположным знаком.

 Определение Kd комплекса C1q-IgG больных: ХЛЛ (1), ХЛ (2), НХЛ (3),-0

Рис.1. Определение Kd комплекса C1q-IgG больных:

ХЛЛ (1), ХЛ (2), НХЛ (3), РМЖ (4) и здорового донора (5).

На рисунке 1 в качестве примера продемонстрировано графическое определение Kd [C1q-IgG] больных: ХЛЛ – 1, ХЛ – 2, НХЛ – 3, РМЖ – 4, а также здорового донора принятого за контроль – 5. Значения Kd с противоположными знаками находятся в точках пересечения прямых с осью абсцисс. Для IgG ХЛЛ (1) величина Kd составила 15,5·10-7 М, для IgG ХЛ (2) – 7,2·10-7 М, для IgG НХЛ (3) – 6,9·10-7 М, для IgG РМЖ (4) – 3,5·10-7 М, для IgG донора (5) – 1,5·10-7 М.

Таким образом, для каждой исследуемой группы были получены следующие значения Кd: доноры – (1,91±0,42)·10-7; ХЛЛ – (13,16 ± 3,29)·10-7 (p < 0,01); ХЛ – (6,68±1,22)·10-7 (p < 0,01); НХЛ – (5,76±1,25)·10-7 (p < 0,02); РМЖ – (3,88±0,7)·10-7 (p < 0,05). И на основании этого сделан вывод, что при данных неопластических состояниях происходит ослабление силы связывания между C1q и IgG, выражающееся в увеличении Kd.

Следующим этапом работы было выяснение причины снижения комплементфиксирующей функции IgG при неопластических процессах. С этой целью было проведено исследование аффинности полученных нами МКАТ к различным антигенным детерминантам IgG доноров и больных ХЛЛ, т.к. при этом заболевании взаимодействие C1q с IgG оказалось наиболее слабым, путем определения Kd комплекса IgG-МКАТ в конкурентном ИФА, являющимся модификацией метода Friguet [Friguet B. et al., 1985].

Расчет Кd проводили, исходя из уравнения: Ао/(Ао – А) = 1 + Кd/а, где а – концентрация вносимого вместе с антителом антигена в моль/л, Ао – экстинкция при а = 0, А – экстинкция, регистрируемая в опыте. Строя зависимость Ао/(Ао – А) от 1/а, получали прямую, тангенс угла наклона которой был равен Кd.

В таблице 1 представлены величины Kd комплекса МКАТ-IgG, характеризующие аффинность МКАТ. Их специфичность такова: А5В8 специфичны к антигенной детерминанте всех подклассов кроме IgG2, 2G11 – к антигенной детерминанте всех подклассов кроме IgG2, 2G11 – к антигенной детерминанте хинджа всех подклассов кроме IgG3, Л2Н2 – к антигенной детерминанте хинджа всех подклассов кроме IgG4, H11G5 и 2H11 – к антигенной детерминанте хинджа всех подклассов, а 2F11 – к антигенной детерминанте, повторяющейся на Fab и Fc фрагментах IgG, Е5 – к антигенной детер-


Таблица 1. Константы диссоциации (Kd) специфических моноклональных антител (МКАТ) к различным антигенным

детерминантам IgG больных хроническим лимфолейкозом (IgGхлл) и здоровых доноров (IgGдон)

Вид IgG Штамм МКАТ
A5B8 2G11 Л2Н2 H11G5 2H11 2F11 Е5 3Н2 5E3 5F2
3D3

4D6
IgGдон (n=10)
3,21± 0,35
3,68± 0,41 4,71± 0,53 3,61± 0,38 2,82± 0,27
3,24± 0,39
3,57± 0,48 2,39± 0,27 3,62± 0,39 3,81± 0,43
3,56± 0,37

3,47± 0,31
IgGхлл (n=10)
4,74± 0,39 **
3,37± 0,34 4,58± 0,46 3,41± 0,35 2,96± 0,37
4,85± 0,42 **
3,49± 0,51 2,55± 0,31 3,59± 0,35 3,73± 0,44
4,99± 0,46 *

4,82± 0,36 **

Примечание. В сравнении с IgG доноров: * – p < 0,05, ** – p < 0,02.

Все приведенные значения Kd следует умножать на 10-8.

минанте, расположенной на -легких цепях, а 3Н2 – на -легких цепях. МКАТ 5E3 и 5F2 взаимодействовали с антигенными детерминантами IgG, расположенными в области хинджа, а 3D3 и 4D6 – с антигенными детерминантами IgG, расположенными в области Fc-фрагмента.

Таким образом, было показано, что при ХЛЛ происходит увеличение Kd (т.е. снижение аффинности) МКАТ к антигенным детерминтам, расположенным лишь в области Fc фрагмента IgG (примерно на 30%). И на основании полученных результатов предложена гипотеза о стерическом «экранировании» центра связывания C1q с IgG образующимися вследствие повышенной деструкции опухолевых и окружающих опухоль клеток метаболитами – лигандами.

Известно, что при взаимодействии белка с лигандом возможно два типа связывания: 1 – когда конформация белка не меняется и константа связывания остается постоянной, 2 – когда первая связывающая молекула лиганда увеличивает сродство белка к следующему лиганду, открывая новые центры связывания. В таком случае, метаболит – лиганд (L), соединяясь с IgG, открывает на нем дополнительные центры связывания другому лиганду – C1q. Так как IgG-мономер больше двух центров связывания с C1q иметь не может, то для более наглядного сравнивания количества C1q, присоединяющегося к IgG, нужно, чтобы молекулы IgG находились в ассоциированном состоянии, при котором количество центров связывания резко возрастает. При взаимодействии таких IgG с C1q могут образовываться различные комплексы: IgG-L-C1qn, IgG-L-C1qn+1, IgG-L-C1qn+2 и т.д. При отсутствии связывания IgG с лигандом количество C1q в комплексе с IgG будет меньше, и такой комплекс будет выглядеть, например, как IgG-C1qn-1. Kd подобных комплексов будут изменяться под влиянием стохастических факторов, то есть, чем больше лигандов связывается с IgG, тем больше диссоциация образовавшегося комплекса. Если процесс диссоциации образующихся комплексов выразить в форме следующих реакций:

IgG-C1qn-1 IgG-C1qn-2 + C1q (Kd1)

IgG-L-C1qn IgG-C1qn-1 + C1q (Kd2)

IgG-L-C1qn+1 IgG-L-C1qn + C1q (Kd3)

IgG-L-C1qn+2 IgG-L-C1qn+1 + C1q (Kd4),

то значения констант расположатся в следующем порядке: Kd4 > Kd3 > Kd2 > Kd1. Соответственно, количество C1q в этих комплексах будет уменьшаться таким образом: IgG-L-C1qn+2 > IgG-L-C1qn+1 > IgG-L-C1qn > IgG-C1qn-1.

Следовательно, если наше предположение о том, что IgG при неопластических процессах подвергается лигандированию продуктами деструкции опухолевых клеток, верно, то наряду с ослаблением взаимодействия между C1q и IgG больных должно возрастать количество C1q, связывающегося с ассоциированными IgG. Поэтому была проведена количественная оценка доли C1q, связанных с IgG больных ХЛЛ и здоровых лиц, находящихся в ассоциированном состоянии, с помощью методов реакции связывания комплемента (РСК) и ИФА.

По РСК с сенсибилизированными рецепторами эритроцитов барана (ЕА) в присутствии IgG можно косвенно судить о количестве C1q, связавшихся с исследуемыми IgG. Например, если наблюдается полный гемолиз ЕА, значит, взаимодействия с IgG не произошло, отсутствие гемолиза, наоборот, означает полное взаимодействие C1q с IgG. Разная степень задержки гемолиза свидетельствует о различном количестве C1q, связанных с IgG. Определение РСК в присутствии IgG больных ХЛЛ и здоровых доноров показало, что фиксация комплемента молекулами IgG больных ХЛЛ в 0,6 М растворе сахарозы, способствующей их ассоциации, происходит на 20-40% сильнее, чем IgG здоровых лиц (р < 0,05 – р < 0,001). При этом Kd образующихся комплексов C1q-IgG больных ХЛЛ, были значительно ниже, чем здоровых доноров, что свидетельствовало о большем взаимодействии IgG при патологии и с другими лигандами.

Кроме того, с помощью МКАТ методом ИФА было показано, что ассоциированные на полистироловом планшете IgG при ХЛЛ связывают C1q в 4,8-6,7 раз больше чем в контроле.

Таким образом, полученные результаты указывают на то, что при неопластических процессах происходит большее, чем в норме связывание IgG с лигандами.

Возможность взаимодействия IgG с различными низкомолекулярными факторами показана многими авторами [Завьялов В.П., 1984; Троицкий Г.В. и др., 1991]. Продемонстрирована способность IgG присоединять липидные и пептидные компоненты (фосфатидилхолин, мелиттин), что приводило к ослаблению антигенсвязывающей функции антител [Ефетов К.А. и др., 1993; Ефетов К.А. и др., 2001]. Однако не было выяснено, вызывает ли подобное взаимодействие изменения комплементфиксирующей функции IgG.

Следует отметить, что обе молекулы (фосфатидилхолин и мелиттин) имеют сходную структуру: гидрофобный «хвост», который у мелиттина сформирован преимущественно двадцатью гидрофобными аминокислотными остатками, и гидрофильную «головку», состоящую из шести положительно заряженных аминокислот у мелиттина, а также обладают свойствами поликатиона. При злокачественном росте клеток, сопровождающемся усиленной деградацией неопластических и других окружающих опухоль клеток, в кровяном русле циркулируют различные метаболиты – лиганды, имеющие в своем составе катионные компоненты, которые, подобно мелиттину и фосфатидилхолину, способны к взаимодействию с Fc-фрагментами IgG. Поэтому для подтверждения заключения о том, что при неопластических процессах происходит большее, чем в норме связывание IgG с лигандами, мы включили изучение влияния взаимодействия фосфатидилхолина, как модельного лиганда (одного из основных компонентов клеточных мембран), с IgG здоровых доноров на константу диссоциации комплекса C1q-IgG.

В результате было обнаружено, что лигандирование IgG фосфатидилхолином вызывает увеличение Kd [C1q-IgG] примерно в 10 раз: с 1,6·10-7 М до 16,8·10-7 М. Наряду с этим было также показано, что происходит снижение аффинности МКАТ к антигенным детерминтам в области Fc-фрагмента IgG, связанного с фосфатидилхолином (примерно на 30%).

На основании полученных результатов был сделан вывод, что снижение комплементфиксирующей функции IgG при неопластических процессах может происходить за счет взаимодействия с лигандами, количество которых при неопластических состояниях увеличивается вследствие повышенной деструкции опухолевых и окружающих опухоль клеток.

Локализация центра связывания для C1q в области CH2 домена молекулы IgG была показана достаточно давно [Emanuel E. J. et al., 1982], но при этом имеются и другие точки зрения. Так, существует мнение о наличии связывания C1q с IgG в области CH3 домена IgG [Painter R.H. et al., 1981]. Хотя и показано [Duncan A.R. et al., 1988], что для связывания C1q обязательным условием является последовательность: …-Glu318-X-Lys320-Y-Lys322-… H-цепи IgG и разработан синтетический пептид, моделирующий участок связывания IgG на C1q [Baumann M.A. et al., 1990], есть информация о локализции C1q-связывающего центра в другой области H-цепи IgG: 231-238 [Morgan A. et al., 1995], а также о том, что в иммуноглобулине, связывающем комплемент, указанный сайт является нефункционирующим [Idusogie E.E. et al., 2000].

Исходя из выше перечисленного, мы посчитали целесообразным уточнить локализацию центра связывания молекул C1q и IgG, исходя из взаимодействия IgG с фосфатидилхолином.

Так как для эффективного взаимодействия с положительно заряженной гидрофильной «головкой» фосфатидилхолина этот сайт должен обладать отрицательным зарядом и гидрофобным карманом для гидрофобного «хвоста» молекулы, и известно, что этим условиям хорошо удовлетворяет полость в молекуле IgG между двумя СH2-доменами, представленная преимущественно радикалами гидрофобных аминокислот и содержащая два углеводных компонента, на концах которых находятся отрицательно заряженные остатки нейраминовой кислоты, то было сделано предположение о локализации сайта взаимодействия C1q с IgG между двумя СH2-доменами IgG.

На следующем этапе работы была проведена оценка гемолитической активности комплемента по альтернативному пути (АРН50) в сыворотках больных ХЛЛ, ХЛ, НХЛ, РМЖ и здоровых доноров и исследование влияния на уровень АРН50 в донорской сыворотке IgG больных данных нозологий и здоровых лиц. А также были определены концентрации некоторых компонентов комплемента и их производных: C1q, С3, C3(H2O), С3а и С4 в плазме крови перечисленных групп больных и доноров.

 Определение функциональной активности альтернативного пути (АРН50) в-1

Рис. 2. Определение функциональной активности альтернативного

пути (АРН50) в сыворотке крови здоровых людей в присутствии IgG больных ХЛЛ (1), ХЛ (2), НХЛ (3), РМЖ (4) и донора (5).

В результате было показано, что отличия по величине АРН50 в исследуемых группах отсутствуют, а концентрации показателей при всех нозологических формах заболеваний находятся в пределах нормы. Лишь при РМЖ наблюдалось снижение количества С3 и его конформационной формы С3(Н2О) (примерно в 2,6 раза), а также подобное увеличение уровня фрагмента С3а.

Изменения уровня АРН50 в донорской сыворотке в присутствии IgG больных ХЛЛ, ХЛ, НХЛ, РМЖ и здоровых доноров, оказались статистически не различимыми (рис. 2), что свидетельствовало о сохранности данного пути активации и требовало более углубленного изучения отдельных компонентов.

Конформационные изменения С3 компонента комплемента в процессе его спонтанного гидролиза при неопластических процессах

и состояниях «онкологического риска»

При развитии заболевания белки претерпевают постсинтетическую модификацию, начальной стадией которой обычно является их конформационный переход (локальное или общее изменение конформации белка, в результате чего он переходит в другое – стабильное или метастабильное состояние). Для выявления самого факта модификации белка существуют различные методы, в числе которых может быть использован также их гидролиз [Троицкий Г.В., 1991]. В этом плане спонтанный гидролиз С3 представляет особый интерес, т.к. позволяет выявить самые начальные, скрытые изменения в его конформации в максимально приближенном к естественному состоянии. Поскольку С3 занимает центральное положение в системе комплемента и является связующим звеном между врожденным и приобретенным иммунитетом, изучение его конформационных изменений при неопластических процессах может приблизить к пониманию причин «ускользания» опухолевых клеток из-под иммунного надзора.

Структурной особенностью С3 компонента является наличие необычной тиоэфирной связи в -цепи, формирующейся в течение посттрансляционной модификации между тиольной группой цистеина и аминогруппой глутамина в пределах последовательности: Gly-Cys988-Gly-Glu-Gln991-Asn. Эта последовательность обычно скрыта в гидрофобном окружении нативной молекулы и недоступна действию воды. Однако благодаря конформационной подвижности глобулярный белок С3 находится в динамическом равновесии нативной и обратимо «развернутой» формы, в которой обнаженная тиоэфирная связь может быть подвергнута нуклеофильной атаке водой и любым растворенным в воде нуклеофилом и гидролизоваться. В результате образуется конформационная форма С3(Н2О), инициирующая активацию комплемента по альтернативному пути.

Определение уровня С3 компонента системы комплемента и его конформационной формы С3(Н2О) мы проводили в процессе инкубации сыворотки и плазмы венозной крови больных: ХЛ, НХЛ и РМЖ в сравнении с контрольной группой клинически здоровых доноров. Каждую пробу крови разделяли на две части: без ЭДТА и с добавлением 0,1 М раствора ЭДТА (рН 7,4) в соотношении 4:1 (добавление ЭДТА, хелатирующего Ca2+, Mg2+ и другие катионы, блокирует переход фибриногена в нерастворимый фибрин, а также переводит ферменты в формы, не способные проявлять свою активность, что приводит к инактивации и системы комплемента). Затем сыворотку и плазму отделяли центрифугированием при 1700 g, инкубировали при 37оС в течение 1,5; 3; 5; 7; 9; 11; 24 часов, замораживали и хранили при -70оС. Размораживание проб проводили одновременно, непосредственно перед постановкой эксперимента. Уровень С3 и С3(Н2О) определяли методом иммуноферментного анализа (ИФА) с помощью специфических МКАТ [Тяготин Ю.В. и др., 2002]. В качестве нижних антител использовали мышиные анти С3 МКАТ – H11C3. Для определения С3 сверху наносили кроличьи анти С3 поликлональные антител, а для С3(Н2О) – мышиные МКАТ G10, взаимодействующие с антигенной детерминантой, экспонированной лишь на С3(Н2О).

В результате было показано, что в процессе спонтанного гидролиза С3 при инкубации сыворотки и плазмы крови больных ХЛ, НХЛ, РМЖ происходит изменение уровня С3(Н2О), отличающееся от такового у здоровых лиц и характеризующееся для каждой нозологии своей индивидуальностью. Общим для всех групп больных было то, что через определенный промежуток времени происходило возрастание уровня С3(Н2О) в норме отсутствующее (рис. 3-4).

 Уровень С3(Н2О) в процессе инкубации сыворотки крови больных ХЛ, НХЛ-2

Рис. 3. Уровень С3(Н2О) в процессе инкубации сыворотки крови

больных ХЛ, НХЛ и РМЖ в сравнении с контролем.

 Уровень С3(Н2О) в процессе инкубации плазмы крови больных ХЛ, НХЛ и-3

Рис. 4. Уровень С3(Н2О) в процессе инкубации плазмы крови

больных ХЛ, НХЛ и РМЖ в сравнении с контролем.

Таблица 2. Уровень С3 и С3(Н2О) при инкубации сыворотки крови больных ходжкинскими (ХЛ), неходжкинскими лимфомами (НХЛ) и раком молочной железы (РМЖ) в сравнении со здоровыми донорами (контроль).

Группа обследо- ванных С3, мкг/мл С3(Н2О), мкг/мл
Время инкубации плазмы, ч
1,5 3 5 7 9 11 24 1,5 3 5 7 9 11 24
Конт- роль (n=12) 1303 ±44,2 1052 ±40,3 725 ±42 1297 ±62 998 ±41,8 1148 ±72,3 748 ±43 10,09±0,68 6,02 ±0,25 4,31 ±0,32 5,92 ±0,34 6,32 ±0,31 5,48 ±0,3 1,3 ±0,07
ХЛ (n=12) 1448 ±77,5 1640 ±85 *** 1225 ±74,2 *** 1746 ±107 ** 1450 ±103 ** 2020 ±118 *** 1198 ±64,5 *** 9,92 ±0,66 9,95 ±0,67 *** 9,98 ±0,56 *** 9,93 ±0,47 *** 5,94 ±0,43 6,05 ±0,34 0,62 ±0,03 ***
НХЛ (n=16) 1447 ±95,8 2080 ±139 *** 1225 ±71,6 *** 1150 ±41,7 1280 ±66,7 ** 2175 ±126 *** 1410 ±64 *** 10,07±0,65 10,05±0,57 *** 9,92 ±0,57 *** 9,95 ±0,43 *** 5,88 ±0,37 9,93 ±0,5 *** 1,03 ±0,11
РМЖ (n=15) 2450± 107,2 *** 495± 32,1 *** 950± 54,9 ** 1150± 71,1 1080± 65,6 1525± 106,5* 470± 23,3 *** 3,8± 0,27 *** 5,5± 0,29 5,0± 0,25 6,0± 0,34 6,3± 0,34 10,0± 0,63 *** 0,87± 0,03 ***

Примечание. В сравнении с контролем: * – p < 0,02; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001.

Таблица 3. Уровень С3 и С3(Н2О) при инкубации плазмы крови больных ходжкинскими (ХЛ), неходжкинскими

лимфомами (НХЛ) и раком молочной железы (РМЖ) в сравнении со здоровыми донорами (контроль).

Группа обследо- ванных С3, мкг/мл С3(Н2О), мкг/мл
Время инкубации плазмы, ч
1,5 3 5 7 9 11 24 1,5 3 5 7 9 11 24
Конт- роль (n=12) 1024 ±49 625 ±42,2 524 ±28,3 648 ±31,8 676 ±43,2 897 ±52,8 518 ±24 10,06±0,4 4,43 ±0,27 4,05 ±0,25 4,3 ±0,21 3,96 ±0,28 4,12 ±0,29 3,23 ±0,16
ХЛ (n=12) 874 ±62,5 1049 ±68,5 *** 1342 ±65,5 *** 1343 ±64,5 *** 1075 ±70,8 *** 1345 ±72,3 *** 963 ±67,7 *** 9,97 ±0,55 9,89 ±0,52 *** 7,48 ±0,27 *** 7,52 ±0,51 *** 9,86 ±0,91 *** 5,92 ±0,45 ** 5,11 ±0,3 ***
НХЛ (n=16) 952 ±46,5 1396 ±81,7 *** 1050 ±60,5 *** 1250 ±97,1 *** 475 ±25,5 ** 1197 ±57,7 ** 800 ±50,3 *** 10,04±0,59 3,9 ±0,21 9,96 ±0,52 *** 5,89 ±0,45 ** 9,92 ±0,75 *** 5,5 ±0,34 ** 4,9 ±0,32 ***
РМЖ (n=15) 675± 42,4 *** 365± 20,8 *** 375± 13,5 *** 495± 28,8 ** 570± 33,5 620± 38,3 ** 470± 18,3 3,9± 0,28 *** 4,1± 0,22 4,3± 0,28 4,1± 0,24 3,9± 0,18 4,3± 0,24 5,0± 0,17 **

Примечание. В сравнении с контролем: * – p < 0,02; ** – p < 0,01; *** – p < 0,001.

Из данных таблиц 2-3 видно, что уровень С3, как и С3(Н2О), при ХЛ и НХЛ через 1,5 часа инкубации сыворотки/плазмы не отличался от контроля. На протяжении всех последующих замеров его концентрация в сыворотке крови больных ХЛ была выше, чем в контроле: через 3, 5, 11, 24 часа (p < 0,001), через 7 и 9 часов (p < 0,01). В плазме, как и в сыворотке, у больных ХЛ уровень С3 постоянно превышал контроль. У больных НХЛ картина была сходной, за исключением 7 часов в сыворотке (без изменений) и 9 часов в плазме (снижение – p < 0,01).

Концентрация С3(Н2О) в сыворотке крови больных ХЛ через 3, 5 и 7 часов превышала контроль (p < 0,001), а через 24 часа становилась ниже (p < 0,001). У больных НХЛ уровень С3(Н2О) в сыворотке крови также в течение первых 7 часов инкубации почти не менялся, оставаясь в пределах от 10,07±0,65 мкг/л до 9,92±0,57 мкг/л. При этом его содержание в сыворотке здоровых лиц существенно снижалось уже к 3 часу наблюдений (p < 0,001). Через 24 часа уровень С3(Н2О) в сыворотке резко снижался, как в норме, так и при патологии. В плазме результаты были более стабильными: при ХЛ уровень С3(Н2О) на протяжении всего времени наблюдений оставался выше контрольного. При НХЛ через 1,5 и 3 часа инкубации концентрация С3(Н2О) практически не отличалась от контроля, но уже к 5 часу становилась выше, чем в контроле, примерно в 2,5 раза (p < 0,001), затем к 7 снижалась (p < 0,01) и вновь поднималась к 9 часу, превышая контроль более чем в 2,5 раза (p < 0,001). С 11 часов уровень С3(Н2О) падал, оставаясь выше, чем в контроле (p < 0,01), и еще более снижаясь к 24 часам (p < 0,001).

При РМЖ через 1,5 часа инкубации сыворотки/плазмы наблюдалось существенное снижение по сравнению с контролем содержания, как С3(Н2О), так и С3 (p < 0,01). При дальнейшей инкубации плазмы, уровень С3 оставался ниже, чем в контроле, а в сыворотке его уровень постоянно колебался, принимая значения то выше: через 1,5 (p < 0,001), 5 (p < 0,01) и 11 часов (p < 0,02), то ниже: через 3 и 24 часа (p < 0,001), то приближалась к контролю: через 7 и 9 часов. Снижение уровня С3(Н2О) в плазме относительно контроля (почти в 2,6 раза, p < 0,001) наблюдалось лишь через 1,5 часа. В дальнейшем (через 3, 5, 7, 9, 11 часов) его уровень практически не отличался от контрольного и только к 24 часам становился выше примерно в 1,5 раза (p < 0,01). В сыворотке уровень С3(Н2О) менялся более существенно: его снижение по сравнению с контролем наблюдалось через 1,5 и 24 часа инкубации (p < 0,001), значительное повышение – через 11 часов (p < 0,001). Через 3, 5, 7 и 9 часов различия отсутствовали.

На основании полученных результатов было сделано предположение, что наблюдаемый в сыворотке эффект связан с повышенной активностью протеолитических ферментов при неопластических процессах [Тяготин Ю.В. и др., 2002], под действием которых может происходить и гидролиз С3 [Бельтюков П.П., 2000]. Однако, при инкубации плазмы, полученной с помощью ЭДТА – классического ингибитора протеаз, уровень С3(Н2О) также возрастал. Следует заметить, что в отличие от ХЛ и НХЛ, при РМЖ повышение уровня С3(Н2О) наблюдалось лишь к 24 часам, что, видимо, связано со значительной ролью в образовании конформационной формы С3(Н2О) при данном заболевании протеолитических ферментов.

Спонтанный гидролиз тиоэфирной связи нативного С3 происходит постоянно, по литературным данным в нормальной сыворотке крови количество С3(Н2О) составляет 0,06-2,5% от общего уровня С3 [Andreev S. et al., 1990; Рыбакова Л.П. и др., 1996; Тяготин Ю.В. и др., 2002]. Нами было показано, что [С3(Н2О)/С3]100% находится в пределах нормы во всех группах, независимо от заболевания. Отличия по этому показателю относительно друг друга и контроля выявлялись также лишь в характере этих изменений при инкубации сыворотки и плазмы (рис. 5-6), что с одной стороны указывало на влияние опухолевых клеток на конформацию С3, своеобразие которого определялось спецификой патологического процесса. С другой стороны, значительное повышение данного показателя при патологии относительно контроля через

 Изменение С3(Н2О)/С3 (%) в процессе инкубации сыворотки крови больных-4

Рис. 5. Изменение С3(Н2О)/С3 (%) в процессе инкубации сыворотки крови больных ХЛ, НХЛ и РМЖ в сравнении с контролем.

 Изменение С3(Н2О)/С3 (%) в процессе инкубации плазмы крови больных-5

Рис. 6. Изменение С3(Н2О)/С3 (%) в процессе инкубации плазмы крови больных ХЛ, НХЛ и РМЖ в сравнении с контролем.

определенный промежуток времени в плазме с ЭДТА, явно свидетельствовало об изменениях конформации белка.

Как всякая белковая молекула, С3 в сыворотке крови под влиянием движения других молекул находится в форме шарообразного клубка, т.к. при этом поверхностная энергия будет минимальной: Gp = nGm (где Gm – изменение свободной энергии Гиббса мономера – одного аминокислотного

остатка, Gp – всей молекулы – полимера). При образовании глобулы ее устойчивость определяется формулой: Gm = Hm – TSm (где H – энтальпийный, S – энтропийный факторы). Значение энтропийного члена S рассчитывается исходя из свободы вращения внутри молекулы полипептида: Sm = Rln(mi) (где mi – число возможных конформеров). Т.е. число конформеров здесь может быть самым разнообразным. Группы, образующие антигенную детерминанту на С3(Н2О), могут принадлежать разным участкам полипептидной цепи и возникать в результате свертывания белка в уникальную структуру, удерживаемую сравнительно слабыми связями, которые легко могут быть разорваны. В таких условиях доступность антигенной детерминанты для МКАТ будет зависеть от конформационных переходов белка, происходящих под влиянием различных факторов, в данном случае, нуклеофилов, что, видимо, и является причиной резких колебаний уровня С3(Н2О).

Как уже отмечалось, злокачественный рост клеток сопровождается появлением в крови дополнительного количества различных метаболитов, в том числе и нуклеофилов, атакующих тиоэфирную связь, тем самым, способствуя конформационному переходу С3 в С3(Н2О), который, можно рассматривать, как первый этап постсинтетической модификации белка. Поэтому было выдвинуто предположение, что белок С3 при неопластических процессах претерпевает модификационные изменения, вызванные появлением в крови большего (по сравнению со здоровыми донорами) количества нуклеофилов, которые, открывают тиоэфирную связь для специфических МКАТ, взаимодействующих с антигенной детерминантой, экспонированной лишь на С3(Н2О).

 зменение уровня С3(Н2О) в процессе инкубации сыворотки крови больных-6

Рис.7 Изменение уровня С3(Н2О) в процессе инкубации сыворотки крови больных «группы онкологического риска»: диффузной (ДМП), узловой мастопатией (УМП) и фиброаденомой (ФА) и раком молочной железы (РМЖ) в сравнении с контролем.

Исследование конформационных изменений С3 у больных «группы онкологического риска» по молочной железе с диагнозом: диффузная мастопатия (ДМП), узловая мастопатия (УМП) и фиброаденома (ФА) показало, что уровень С3(Н2О) в процессе инкубации сыворотки и плазмы крови имеет статистически значимые отличия от такового у больных РМЖ и здоровых лиц. Наиболее выраженными эти отличия были в сыворотке крови (рис.7), но в отличие от РМЖ и других неопластических состояний, у больных ДМП, УМП и ФА резкого повышения уровня С3(Н2О) не наблюдалось. И данный факт является также дополнительным свидетельством в пользу нашего предположения.

Возникновение неопластических клеток и их пролиферация вызывает активацию системы иммунного надзора, проявляющуюся в многочисленных реакциях организма, в том числе, появлении в крови опухолевых маркеров, концентрация которых коррелирует с прогрессированием опухолевого процесса. В связи с этим возникает вопрос, существует ли взаимосвязь между прогрессированием опухоли и ответом неспецифического звена иммунной системы, проявляющаяся через изменение содержания в плазме крови опухолевых маркеров и С3(Н2О)?

Для ответа на поставленный вопрос в качестве такого маркера нами был избран опухольассоциированный антиген рака яичников СА-125. Этот антиген является гликопротеином с молекулярной массой 200 кДа, экспрессируется на поверхности опухолевых клеток и может быть определен методом ИФА с помощью МКАТ. Чувствительность диагностики рака яичников (РЯ) с использованием опухолевого маркера СА-125 составляет 86,2% - 95,5% [Чиссов В.И. и др., 2000].

В результате (таблица 4) было обнаружено, что после проведения полного курса химиотерапии пациенткам с РЯ в III стадии содержание маркера в плазме у них снижалось на 30–70% от исходного уровня и определялось в интервале от 313 до 440 МЕ/мл (p < 0,05; r = 0,942). При этом концентрация C3(H2O) до химиотерапии измерялась в пределах от 2,49 до 4,33 мкг/мл, после – от 0,97 до 1,51 мкг/мл (p < 0,01; r = 0,963).

Таблица 2. Концентрация СА-125 и C3(H2O) в плазме крови больных раком яичников (РЯ) до и после полного курса химиотерапии (ХТ)

Группа обследо- ванных Число наблю- дений СА-125, МЕ/мл С3(Н2О), мкг/мл ч/з 9 ч
РЯ до ХТ 28 750±105 3,41±0,92
РЯ после ХТ 28 375±62 p< 0,05; r=0,942 1,24±0,27 p< 0,01; r=0,963

Т.е. после курса химиотерапии происходит существенное снижение концентрации в плазме крови больных РЯ как СА-125 (примерно в 2 раза), так и C3(H2O) (примерно в 2,7 раза).

На основании полученных результатов было сделано заключение, что изменение уровня конформационной формы C3(H2O) в процессе инкубации плазмы больных РЯ находится в прямой зависимости от содержания опухолевого маркера СА-125, вследствие чего может служить оценочным критерием эффективности лечения.

Конформационные изменения С3 под влиянием химиотерапии и иммунотропных средств: эфирных масел Lavandula vera,

Salvia sclaria и глюконатов 3d-металлов.

Важным компонентом лечения больных ХЛ, НХЛ, РМЖ является адъювантная полихимиотерапия (ПХТ), направленная на подавление скрытых субклинических проявлений ракового заболевания. Поэтому следующим этапом нашей работы было исследование влияния программы полихимиотерапии (ПХТ) на конформационные изменения С3 компонента, что необходимо для дальнейших поисков вариантов адекватной иммунокоррекции.

В результате было показано, что изменения уровня С3 и С3(Н2О) в плазме крови больных ХЛ, НХЛ и РМЖ под влиянием ПХТ определяются числом курсов и временем инкубации плазмы. Увеличение числа курсов ПХТ вызывало дальнейшее снижение концентрации С3(Н2О), что отражало положительную динамику лечения.

Для больных ХЛ снижение уровня С3(Н2О) через 7 и 9 часов инкубации относительно нелеченного контроля, коррелирующее с положительной динамикой лечения, наблюдалось после пяти и шести курсов ПХТ, у больных НХЛ – через 7 часов после шести курсов.

У больных РМЖ проведение цикловой ПХТ приводило к значительному снижению уровня С3(Н2О) в процессе инкубации плазмы крови, которое зависело от числа курсов ПХТ (рис. 8), что также коррелировало с положительной динамикой лечения.

 Изменение уровня С3(Н2О) в плазме больных раком молочной железы после-7

Рис. 8. Изменение уровня С3(Н2О) в плазме больных раком молочной железы после курсов полихимиотерапии (ПХТ)

Таким образом, полученные результаты, дают основание рассматривать конформационный переход С3, как одну из защитных реакций иммунного надзора, характеризующую направленность изменений резистентности организма на интенсивность опухолевого роста.

Большое значение для лечения неопластических процессов представляют вещества, которые наряду с иммунотропными свойствами обладают противоопухолевой активностью. К таким веществам относятся эфирные масла Lavandula vera, Salvia sclaria (лаванды, шалфея) [Леонова, Н.С., 2001; Сюрин С.А., 2006] и соединения 3d-металлов (двухвалентных металлов Mn, Fe, Co, Cu и Zn) с глюконовой кислотой [Конкина И.Г. и др., 2002; 2006; 2007]. Результаты исследований конформационных изменений С3 дают основание для использования данного показателя в качестве оценочного критерия эффективности воздействия лекарственных средств. Кроме того, в литературе отмечено, что снижение содержания С3 компонента коррелирует с другими иммунными нарушениями, которые сопровождают онкологические и другие заболевания [Борисова А.М. и др., 1999]. Поэтому была проведена серия экспериментов, включавших исследования противоопухолевой активности эфирных масел лаванды – шалфея в режиме ароматерапии (АРТ) и композиции глюконатов 3d-металлов (МЭЛ) in vivo – на линейных мышах BALB/c с привитой миеломой Sp 2/0 Ag14 и влияния их на изменение уровня С3(Н2О) в процессе инкубации сыворотки крови больных РМЖ (I-IIа), ДМП и практически здоровых женщин.

Для проведения АРТ эфирные масла распылялись с парами воды при температуре 75-85о С, создавая концентрацию в воздухе помещения 3-6 мг/м3. Экспозиция одного сеанса составляла 40 минут, весь курс представлял собой 10-12 процедур в течение 2 недель ежедневно с перерывом на выходные дни.

В результате было показано ингибирующее влияние АРТ и МЭЛ на рост опухолевых клеток Sp 2/0 Ag14, выражающееся в торможении развития асцита у мышей BALB/c на 54,5 % и 65,5% относительно контрольной группы (p < 0,05) и увеличении продолжительности жизни животных на 26,5 % и 21,2% (p < 0,05) соответственно. Кроме того, было установлено цитотоксическое действие глюконатов данных 3d-металлов на клетки мышиной миеломы Sp2/0 Ag14 и эритролейкемические клетки К562 человека.

Определение уровня С3 компонента и его конформационной формы С3(Н2О) проводили путем ИФА в одновременно размороженной сыворотке крови, которую предварительно инкубировали при +37o C в течение 1,5; 3; 5; 7; 9; 11 и 24 часов, с помощью специфических МКАТ H11C3 и G10.

Обнаружено, что после курса АРТ во всех наблюдаемых группах в процессе инкубации сыворотки крови, происходило выравнивание уровня С3(Н2О). Особенно интересным на наш взгляд явилось то, что наблюдаемое ранее у больных РМЖ резкое возрастание уровня С3(Н2О) через 11 часов, после курса АРТ исчезало, а при ДМП отличия с контролем полностью нивелировались (рис. 9). Подобные конформационные изменения С3 происходили также после действия композиции глюконатов 3d-металлов.

 Изменение уровня С3(Н2О) в плазме больных РМЖ, ДМП и здоровых лиц-8

Рис. 9. Изменение уровня С3(Н2О) в плазме больных РМЖ, ДМП

и здоровых лиц (контроль) до и после проведения курса АРТ

После курса АРТ в сыворотке крови лиц длительно работающих в химической лаборатории с вредными условиями труда и имеющих патологические отклонения различного характера наблюдалось сглаживание изменений уровня С3(Н2О), который практически не снижался через 29 часов инкубации, а в некоторых случаях даже имел тенденцию к повышению. При этом уровень С3 также оставался выше на протяжении всего периода наблюдений.

Учитывая то, что снижение содержания С3 коррелирует с другими иммунными нарушениями, приводящими к онкологическим заболеваниям, повышение уровня С3 С3(Н2О) может свидетельствовать о благоприятном и корригирующем влиянии эфирных масел Lavandula vera – Salvia sclaria в режиме АРТ и композиции глюконатов биометаллов на иммунную систему в целом.

Заключение

Таким образом, наши исследования по изучению взаимоотношений между ключевыми представителями систем врожденного и приобретенного иммунитета указывают на то, что при неопластических процессах происходит ослабление силы взаимодействия между субкомпонентом C1q и IgG; снижение аффинности специфических моноклональных антител (примерно на 30%) к антигенным детерминантам, расположенным лишь в области Fc фрагмента IgG. Увеличивается количество C1q, связанных с IgG в ассоциированном состоянии. После взаимодействия IgG с фосфатидилхолином происходит ослабление силы связывания C1q c IgG (примерно в 10 раз) и снижение аффинности МКАТ к антигенным детерминтам в области Fc-фрагмента IgG (примерно на 30%). На основании всего перечисленного делается заключение, что ослабление комплементфиксирующей функции IgG происходит благодаря взаимодействию c Fc-фрагментами IgG лигандов с катионными компонентами – метаболитами деструкции опухолевых клеток и тканей. При этом сайт взаимодействия C1q с IgG локализован, вероятно, между двумя СH2-доменами IgG.

Изменения уровня гемолитической активности комплемента по альтернативному пути (АРН50) в донорской сыворотке в присутствии IgG больных ХЛЛ, ХЛ, НХЛ, РМЖ и здоровых доноров, статистически не различимы, что свидетельствует о сохранности данного пути.

В процессе спонтанного гидролиза С3 компонента при неопластических состояниях (ХЛ, НХЛ и РМЖ) происходят его конформационные изменения, отличающиеся от таковых у здоровых людей, характеризующиеся для каждой нозологии своей индивидуальностью и значительным повышением уровня С3(Н2О) через определенный промежуток времени. Одной из причин этих изменений является постсинтетическая модификация С3 вследствие появления в крови большего (по сравнению со здоровыми донорами) количества нуклеофилов, способствующих конформационному переходу С3 и образованию его производной формы – С3(Н2О), доступной специфическим моноклональным антителам, взаимодействующим с антигенной детерминантой, экспонированной лишь на С3(Н2О).

У больных, составляющих группу «онкологического риска» по РМЖ (ДМП, УМП и ФА) резкого возрастания уровня С3(Н2О) не происходит, что подтверждает выдвинутое нами предположение.

Изменение уровня конформационной формы С3(Н2О) в процессе инкубации плазмы при неопластических процессах (рак яичников) находится в прямой зависимости от содержания опухолевого маркера (СА-125), что может служить дополнительным оценочным критерием эффективности лечения злокачественных заболеваний.

Под действием химиотерапии в процессе инкубации плазмы крови больных ХЛ, НХЛ и РМЖ наблюдается снижение уровня С3(Н2О), которое зависит от числа курсов ПХТ и коррелирует с положительной динамикой лечения.

Воздействие иммуномодулирующих средств (эфирных масел Lavandula vera, Salvia sclaria и глюконатов 3d-металлов) наряду с противоопухолевой активностью оказывает корригирующее влияние на конформационные изменения компонента С3 и иммунную систему в целом.


ВЫВОДЫ

1. При неопластических состояниях (хронический лимфолейкоз, ходжкинские и неходжкинские лимфомы, рак молочной железы) происходит статистически значимое снижение константы взаимодействия между ведущими звеньями врожденного и приобретенного иммунитета: субкомпонента комплемента C1q и иммуноглобулина G (IgG).

2. Аффинность специфических моноклональных антител снижена (примерно на 30%) к антигенным детерминантам, расположенным в области Fc-фрагмента IgG больных хроническим лимфолейкозом по сравнению с IgG здоровых доноров.

3. После лигандирования IgG фосфатидилхолином константа взаимодействия его с C1q становится на порядок ниже, и одновременно снижается аффинность моноклональных антител к антигенным детерминантам Fc-фрагмента модифицированного таким образом IgG.

4. Ослабление силы взаимодействия между C1q и IgG при неопластических процессах является следствием посттрансляционной модификации IgG лигандами-катионами пептидной и липидной природы – продуктами деструкции неопластических клеток и окружающих их тканей.

5. Воздействие IgG при неопластических состояниях (хронический лимфолейкоз, ходжкинские, неходжкинские лимфомы, рак молочной железы) и здоровых доноров на альтернативный путь активации комплемента является статистически неразличимым.

6. В процессе спонтанного гидролиза С3 компонента при инкубации сыворотки/плазмы крови больных при неопластических состояниях (ходжкинские и неходжкинские лимфомы, рак молочной железы) происходит изменение уровня С3(Н2О), характеризующееся для каждой нозологии своей индивидуальностью и превышением контрольного уровня через определенный промежуток времени вследствие модификационных изменений конформации белка, под действием увеличенного количества нуклеофилов.

7. Снижение уровня конформационной формы С3(Н2О) в плазме крови больных раком яичников после курса химиотерапии коррелирует с содержанием опухольассоциированного маркера СА-125, что может служить дополнительным оценочным критерием эффективности лечения злокачественных новообразований и дает основание рассматривать конформационный переход С3, как одну из защитных реакций иммунного надзора, характеризующую направленность изменений резистентности организма на интенсивность опухолевого роста.

8. Под действием химиотерапии в процессе инкубации плазмы крови больных с ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами, раком молочной железы наблюдаются изменения концентрации С3 и С3(Н2О) в зависимости от распространенности процесса и курсов химиотерапии, увеличение числа которых вызывает дальнейшее снижение уровня С3(Н2О), коррелирующее с положительной динамикой лечения.

9. Под действием иммунотропных средств (эфирных масел Lavandula vera, Salvia sclaria и глюконатов 3d-металлов) происходит коррекция профиля спонтанного гидролиза компонента С3, что может свидетельствовать о благоприятном влиянии данных средств на иммунную систему в целом.


Список основных публикаций по теме диссертации

Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации основных научных результатов докторских диссертаций

  1. Ефетов К.А., Князева О.А. Использование моноклональных антител к иммуноглобулинам человека в реакциях иммунопреципитации // Иммунология. – 1994. – № 2. – С.57-58.
  2. Князева О.А., Сакаева Д.Д., Тяготин Ю.В. Конформационные изменения С3 компонента комплемента при хранении крови больных лимфогранулематозом и здоровых людей // Вопросы онкологии. – 2000. – Т. 46, № 1. – С. 58-60.
  3. Сакаева Д.Д., Князева О.А. Конформационные изменения С3 компонента комплемента у больных ходжкинскими и неходжкинскими лимфомами под влиянием цикловой полихимиотерапии // Иммунология. – 2002. – № 5. – С. 296-298.
  4. Князева О.А., Сакаева Д.Д. С3-компонент комплемента в процессе хранения сыворотки крови больных неходжкинскими лимфомами // Цитокины и воспаление. – 2002. – Т. 1, № 2. – С. 10.
  5. Сакаева Д.Д., Князева О.А. Влияние полихимиотерапии на конформационные изменения С3 компонента комплемента при лимфогранулематозе // Гематология и трансфузиология. – 2002. – Т. 47, № 4. – С. 28-30.
  6. Сакаева Д.Д., Князева О.А. Изменения С3 компонента комплемента под влиянием полихимиотерапии у больных раком молочной железы // Иммунология. – 2002. – № 3. – С. 172-174.
  7. Конкина И.Г., Иванов С.П., Князева О.А., Давыдова В.А., Васильева Е.В., Карачурина Л.М., Зарудий Ф.А., Ионова И.А., Гайфутдинова Р.К., Муринов Ю.И. Физико-химические свойства и фармакологическая активность глюконатов Mn (II), Fe (II), Co (II), Cu (II) и Zn (II) // Химико-фармацевтический журнал – 2002. – Т. 36, № 1. – С. 18-21.
  8. Князева О.А., Камилов Ф.Х. Особенности взаимодействия субкомпонента комплемента C1q с IgG при неопластических процессах // Иммунология. – 2007. – № 4. – С. 231-233.
  9. Князева О.А., Сакаева Д.Д., Камилов Ф.Х. Особенности конформационных изменений С3 компонента комплемента в процессе его спонтанного гидролиза при неопластических процессах // Иммунология. – 2007. – № 5. – С. 268-272.
  10. Князева О.А., Сакаева Д.Д., Камилов Ф.Х., Вахитов В.А. Взаимосвязь между изменением под действием химиотерапии уровня С3(Н2О) комплемента и опухолеассоциированного антигена СА-125 в плазме крови больных раком яичников // Вопросы онкологии. – 2007. – Т. 46, № 6. – С. 696-698.

Статьи в прочих изданиях

  1. Ефетов К.А., Князева О.А. Использование моноклональных антител для определения комплементфиксирующей активности иммуноглобулинов G человека в норме и при хроническом лимфолейкозе // Украинский биохимический журнал. – 1994. – Т. 66, № 6. – С. 106-111.
  2. Князева О.А., Вахитов В.А. Исследование молекулярных механизмов снижения комплементфиксирующей фиксации IgG при хроническом лимфолейкозе с помощью моноклональных антител. Современные проблемы естествознания на стыке наук: Сб. статей. – Уфа, 1998. – Т. 2. – С. 120-122.
  3. Князева О.А., Сакаева Д.Д. Влияние аэрофитотерапии на альтернативный путь комплемента. Труды Четвертой Всероссийской научно-практической конференции с междунанародным участием «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». В 3-х томах. С.Петербург, 1999, Т.3. – С. 411.
  4. Конкина И.Г., Князева О.А. Физико-химические характеристики и иммуномодулирующие свойства соединений 3d – элементов с глюконовой кислотой. XIX Всероссийское Чугуевское совещание по химии комплексных соединений: Тезисы докладов. Иваново, 1999. – С. 302.
  5. Конкина И.Г., Князева О.А., Иванов С.П., Гайфутдинова Р.К., Муринов Ю.И. Биологическая активность комплексного препарата глюконатов 3d-металлов. Материалы международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности", – Томск, 2000. – С.166-167.
  6. Князева О.А., Конкина И.Г., Халфин Р.М. Иммуномодулирующее действие эфирных масел лекарственных растений. Материалы международного экологического конгресса «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». С.Петербург, 2000. – С. 357.
  7. Конкина И.Г., Князева О.А. Комплексная методика психологической разгрузки. Материалы международного экологического конгресса «Новое в экологии и безопасности жизнедеятельности». С.Петербург, 2000. – С.329.
  8. Князева О.А., Конкина И.Г., Хакимова Р.Х. К вопросу о механизмах иммуностимулирующего действия эфирных масел Lavandula vera и Salvia sclaria. Материалы международной научной конференции "Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности", – Томск, 2000. – С.163-164.
  9. Сакаева Д.Д., Князева О.А. Изменение С3 компонента комплемента под влиянием полихимиотерапии у больных с неходжкинскими лимфомами / ГЦМБ. – М., 2000. – Деп. в ГЦМБ 01.11.00; Д 26613.
  10. Князева О.А., Сакаева Д.Д., Хакимова Р.Х. Катаболизм С3 компонента комплемента при хранении сыворотки крови больных предопухолевыми заболеваниями и раком молочной железы. Материалы III съезда биохимического общества. Санкт-Петербург, 2002. – С.175.
  11. Sakajeva, D.D., Knyazeva O.A., igajev N.I. Influo de kombinita kemioterapio al komplemento //Medicina internacia revuo. – Universala Medicina Esperanto – Asocio. – Krakov, 2002. – Vol. 20a, 1(78). – P. 29-37.
  12. Князева О.А., Сакаева Д.Д. Исследование катабализма С3 компонента комплемента в процессе искусственного старения сыворотки крови больных неходжкинскими лимфомами. Материалы научно-практической конференции «Перспективные разработки науки и техники». Т.6. Медицина. – Белгород: Руснаучкнига; Днепропетровск: Наука и образование, 2004. – С. 25-28.
  13. Князева О.А. Конформационные изменения С3 компонента комплемента при хранении сыворотки крови больных раком молочной железы. Материалы IV международной научно-практической конференции «Динамика научных исследований - 2005». Т.29. Медицина. – Днепропетровск: Наука и образование, 2005. – С. 16-18.
  14. Конкина И.Г., Князева О.А., Ищенко А.М., Муринов Ю.И. Влияние биометаллов и их лигандного окружения на ингибирование роста онко-клеток “in vitro”. Материалы Межвузовской научно-технической конференции «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук». Уфа, 2006. – С. 203-205.
  15. Конкина И.Г., Князева О.А., Ищенко А.М., Муринов Ю.И. Исследование цитотоксического действия координационных соединений биометаллов “in vitro”. Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции «Современные направления теоретических и прикладных исследований». Одесса, 2006. – С. 41-43.
  16. Князева О.А. Конформационные изменения С3 компонента комплемента при инкубации плазмы крови больных раком молочной железы и «группы онкологического риска» // Вятский медицинский вестник. – 2007. – № 4. – С. 54-56.
  17. Князева О.А. Оценка комплементфиксирующей функции IgG при неопластических процессах. Научные труды VIII международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке; концепции болезней цивилизации». Москва, 2007. – С. 307.
  18. Конкина И.Г., Князева О.А., Ищенко А.М., Попова И.Ю., Муринов Ю.И. Физиологическая активность координационных соединений 3d-элементов. Сборник научных трудов по материалам VI Всероссийского научного семинара «Химия и медицина». Уфа, 2007. – С. 61-62.

Патенты

  1. Патент РФ № 2002803, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG1,3,4 человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. – Опубл. 15.11.93. Бюл. 1993, № 41-42.
  2. Патент РФ № 2003679, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG1,2,3 человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  3. Патент РФ № 2003680, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к IgM человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  4. Патент РФ № 2003681, МКИ5 С 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к -цепям IgG человека / О.А. Князева, К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  5. Патент РФ № 2003682, МКИ5 С 12 N 5/00. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител к -легким цепям иммуноглобулинов человека / К.А. Ефетов, О.А. Князева, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  6. Патент РФ № 2003683, МКИ5 C 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител к мелиттину из яда пчелы (Apis mellifera L.) / О.А. Князева, К. А. Ефетов, С. Ю. Тэтин. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  7. Патент РФ № 2003684, МКИ5 С 12 N 5/00. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител к (Fc)5-фрагменту IgM человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  8. Патент РФ № 2003685, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител к IgM человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  9. Патент РФ N 2003686, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 N 5/16. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. – продуцент моноклональных антител к IgG человека / О.А. Князева, К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  10. Патент РФ № 2003687, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 P 21/00. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgM человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. – Опубл. 30.11.93. Бюл. 1993, № 43-44.
  11. Патент РФ № 2008350, МКИ5 С 12 N 5/00, С 12 Р 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L., используемый для получения моноклональных антител к IgG человека / К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, О.А. Князева. – Опубл. 28.02.94. Бюл. 1994, № 4.
  12. Патент РФ № 2010856, МКИ5 С 12 N 5/00, C 12 P 21/08. Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus L., используемый для получения преципитирующих моноклональных антител к IgG человека / О.А. Князева, К.А. Ефетов, С.Ю. Тэтин, Г.В. Троицкий. – Опубл. 15.04.94. Бюл. 1994, № 7.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.