WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Участие липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина а-i в механизмах внутриклеточной регуляции и направленном транспорте биологически активных веществ в клетки

На правах рукописи

СУМЕНКОВА ДИНА ВАЛЕРЬЕВНА

УЧАСТИЕ ЛИПОПРОТЕИНОВ ВЫСОКОЙ ПЛОТНОСТИ И АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I В МЕХАНИЗМАХ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ РЕГУЛЯЦИИ И НАПРАВЛЕННОМ ТРАНСПОРТЕ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ В КЛЕТКИ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Новосибирск – 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН, г. Новосибирск

Научные консультанты:

академик РАМН Панин Лев Евгеньевич

доктор медицинских наук,

профессор Поляков Лев Михайлович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Селятицкая Вера Георгиевна

доктор медицинских наук,

профессор Цырендоржиев Дондок Дамдинович

доктор медицинских наук,

профессор Кузьменко Дмитрий Иванович

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН

Защита состоится «___» ______ 20___ года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, г. Новосибирск, ул. Тимакова, 2

Тел.: (383) 333 54 81; факс: (383) 333 67 58

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН

Автореферат разослан «____» ______ 20___ г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Русских Г.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Липопротеины плазмы крови в функциональном отношении представляют собой, как известно, транспортную систему для биологически активных веществ различной химической природы. Кроме липидов липопротеины могут связывать и транспортировать, в том числе и через цитоплазматическую мембрану, ксенобиотики [Поляков Л.М. и др., 1992; Woofter R.T., Ramsdell J.S., 2007], жирорастворимые витамины [Glevidence B.A., Bieri J.G., 1993; Панин Л.Е. и др., 1997; Balazs Z. et al., 2004], стероидные соединения [Панин Л.Е. и др., 1988; Meng Q.H. et al., 1999; Khalil A. et al., 2000], тиреоидные гормоны [Поляков Л.М., 1998], лекарственные препараты [Rensen P.C. et al., 2001; Lou B. et al., 2005; Feng M. et al., 2008].

Главную роль при взаимодействии биологически активных веществ с липопротеинами играют белковые компоненты – аполипопротеины, а клеточный захват их осуществляется посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Многолетние научные исследования сотрудников НИИ биохимии СО РАМН и данные литературы позволяют сделать вывод о преимущественном участии липопротеинов высокой плотности (ЛПВП) и их основного белкового компонента – аполипопротеина А-I (апоА-I), – в связывании и транспорте биологически активных соединений. Так, именно ЛПВП с высоким сродством связывают стероидные гормоны и ксенобиотики, играя роль их активной транспортной формы в организме [Панин Л.Е. и др., 1992; Поляков Л.М. и др., 1992]. Показана способность липопротеинов высокой плотности осуществлять транспорт некоторых противоопухолевых лекарственных препаратов [Kader A., Pater A., 2002]. В серии работ изучена способность апоА-I транспортировать малые интерферирующие РНК против вируса гепатита С в гепатоциты посредством рецептора SR-B1 [Kim S.I. et al., 2009; Lee H. et al., 2009]. Отмечено участие апоА-I в переносе олигонуклеотидов через гемато-энцефалический барьер [Kratzer I. et al., 2007].

Следует отметить, что проблема направленного транспорта является одной из центральных в современной медицинской биотехнологии. Химическая природа липо(апо)протеинов, способность их проникать в клетки обусловливают преимущества данных соединений как высокоэффективных природных переносчиков. Использование липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов и генетического материала может повысить эффективность лечения ряда патологических состояний.

Роль липопротеинов плазмы крови не ограничивается выполнением транспортной функции. Известно, что липопротеины и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов. Так, ЛПВП и апоА-I осуществляют регуляцию обмена холестерина в клетках при участии мембранных белков ABCA1 и SR-BI [Zannis V.I. et al., 2006; Торховская Т.И. и др., 2006]. Липопротеины разных классов оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, принимают участие в регуляции стероидогенеза [Панин Л.Е., Поляков Л.М., 1979; Temel R.E. et al., 1997; Travert C. et al., 2000], синтеза тироксина [Бернштейн Л.М. и др., 1982] и инсулина [Панин Л.Е. и др., 1994]. Описано влияние липо(апо)протеинов на структурно-функциональные свойства митохондрий [Панин Л.Е. и др., 1991]. Показана роль липопротеинов и их белковых компонентов в регуляции углеводного обмена [Панин Л.Е. и др., 1990].

Обнаружен лизосомотропный эффект апоА-I [Панин Л.Е., 1987], отмечены его антимикробные [Agawa Y. et al., 1991; Tada N. et al., 1993] и противовирусные свойства [Srinivas R.V. et al., 1990; Owens B.J. et al., 1990; Панин Л.Е. и др., 2002]. Известно кардиопротекторное, антиоксидантное и противовоспалительное действие ЛПВП, апоА-I и их синтетических миметиков [Ma J. et al., 2004; Gupta H. et al., 2005; Navab M. et al., 2007; Gomaraschi M. et al., 2008]. В то же время ЛПВП в силу сложности своего строения и состава могут оказывать прооксидантный и провоспалительный эффекты [Van Lenten B.J. et al., 2001].

Имеются данные о способности ЛПВП усиливать пролиферацию опухолевых клеток [Favre G. et al., 1989, 1993; Rotheneder M. et al., 1989]. Напротив, липопротеины очень низкой плотности (ЛПОНП) и их основной белковый компонент аполипопротеин Е (апоЕ) ингибируют деление клеток, включая опухолевые [Vogel T. et al., 1994; Paka L. et al., 1999; Moore Z.W. et al., 2005].

Особый интерес для изучения механизмов регуляции внутриклеточного метаболизма представляет взаимодействие липопротеинов и гормонов. Отмечено, что стимулирующий эффект эстрадиола на клеточный рост карциномы грудной железы проявляется только в присутствии ЛПВП [Jozan S. et al., 1985]. Показан кооперативный эффект в действии гидрокортизона, адреналина и ЛПВП, в основе которого лежит лизосомозависимая активация хроматина, приводящая к индукции синтеза РНК и белка в переживающих срезах печени крыс [Панин Л.Е., 1987; 1990].

Исследования, проведенные сотрудниками НИИ биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е.Панина, позволяют утверждать, что липо(апо)протеины играют важную роль в структурно-функциональной организации хроматина эукариот, поддерживая его транскрипционную активность. В частности, в ядрах клеток различных тканей крыс была обнаружена апоА-I-иммунореактивность. Наиболее высокой она оказалась в транскрипционно активном хроматине и ядерном матриксе [Панин Л.Е.и др., 1992, 2000]. В серии работ института на различных моделях была показана способность ЛПВП и апоА-I усиливать процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в клетках различных тканей организма [Панин Л.Е. и др., 1987, 2001, 2002, 2003, 2007]. Механизм этого явления связан с образованием биологически активного комплекса апоА-I и восстановленных форм стероидных гормонов при участии макрофагов и его специфическим взаимодействием с ДНК с последующей инициацией транскрипции генов [Панин Л.Е., 1998; Гимаутдинова О.И. и др., 2002; Панин Л.Е. и др., 2002, 2006, 2008]. Предполагается, что данный механизм лежит в основе регуляции процессов пролиферации [Панин Л.Е., 2002].

Участие липо(апо)протеинов в регуляции генетического аппарата клетки подтверждают и данные других авторов. Так, ЛПВП ингибировали экспрессию фактора адгезии-1 в эндотелиальных клетках пупочной вены человека. При этом более выраженным эффектом обладала фракция ЛПВП3 [Ashby D.T. et al., 1998]. В опухолевых клетках ЛПВП повышали скорость образования мРНК апоА-I [Monge J.C. et al., 1989]. АпоА-I и его синтетический пептид стимулировали экспрессию плацентарного лактогена в культуре трофобластов человека [Handwerger S., et al., 1995].

Несмотря на представленные в литературе результаты исследований по изучению транспортной и регуляторной роли липо(апо)протеинов плазмы крови, многие вопросы в этой области остаются открытыми. В частности, окончательно невыяснены механизмы регуляции метаболических процессов с участием липо(апо)протеинов. Недостаточно работ по изучению возможности использования липо(апо)протеинов в качестве транспортной формы лекарственных препаратов для повышении эффективности лечения ряда заболеваний. Отсутствуют данные о способности липо(апо)протеинов осуществлять направленный транспорт генетического материала в ядра клеток для коррекции функции поврежденных генов.

Цель исследования: изучить роль липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I в механизмах регуляции внутриклеточного метаболизма и направленном транспорте биологически активных веществ в клетки.

Задачи исследования:

  1. Изучить процессы комплексообразования липопротеинов высокой плотности и аполипопротеина А-I с биологически активными веществами различной природы: стероидными гормонами, полисахаридами, лекарственными препаратами и исследовать способность аполипопротеина А-I осуществлять направленный транспорт биологически активных веществ в клетки.
  2. Выяснить роль липопротеинов высокой плотности в комплексе со стероидными гормонами в регуляции процессов биосинтеза белка в опухолевых клетках.
  3. Изучить роль аполипопротеина А-I в комплексе со стероидными гормонами и аполипопротеина Е в регуляции биосинтетических процессов в клетке.
  4. Выяснить влияние липопротеинов высокой плотности и их комплексов с полисахаридами на продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1.
  5. Оценить возможность использования аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы генетического материала в ядра эукариотических клеток.
  6. Исследовать эффективность использования липопротеинов высокой плотности в качестве транспортной формы противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина.
  7. Изучить возможность использования аполипопротеина А-I в качестве транспортной формы противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида.

Научная новизна работы.

На изолированных гепатоцитах крыс методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показан рецептор-опосредованный эндоцитоз апоА-I с последующей транслокацией белка в ядерный аппарат клетки. Показана способность апоА-I повышать эффективность внутриклеточного транспорта биологически активных веществ различной природы.

Впервые показано взаимодействие апоА-I с генетическим материалом с использованием в качестве модели эукариотического вектора с встроенным геном флуоресцирующего белка CFP. В опытах in vitro и in vivo методами флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показана способность апоА-I осуществлять транспорт генетического материала в ядра клеток (гепатоциты) с последующей экспрессией транспортируемого гена и синтезом флуоресцирующего белка в цитоплазме.

В работе обнаружена способность липопротеинов плазмы крови связывать и транспортировать свободные нуклеиновые кислоты. Показано относительное содержание внеклеточной ДНК в составе различных фракций липопротеинов. Наибольшее содержание внеклеточной ДНК отмечено в составе ЛПВП.

На модели асцитной карциномы Эрлиха показано участие ЛПВП и стероидных гормонов (кортизол, прогестерон) в механизме опухолевого роста, которое заключается в усилении скорости биосинтеза белка. В сокультуре опухолевых клеток подтвержден открытый ранее в НИИ биохимии СО РАМН механизм регуляции процессов пролиферации и клеточного роста, в котором важную роль играют макрофаги.

Показано участие перитонеальных макрофагов в метаболической деградации ЛПВП. Обнаружено, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Отмечено стимулирующее влияние стероидных гормонов на поглощение ЛПВП макрофагами, более выраженное для опухоль-ассоциированных клеток.

Впервые на культуре гепатоцитов крыс выявлена биологическая активность комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами. Показано повышение скорости синтеза белка под влиянием эстриола и эстрадиола, которое значительно усиливалось в присутствии апоА-I. Отмечено, что комплекс апоА-I с эстроном также усиливал синтез белка, в то время как свободный гормон не обладал индуцирующим влиянием. Впервые показана способность комплекса апоА-I с прегненолоном повышать скорость биосинтеза ДНК и белка в культуре гепатоцитов.

Обнаружена активация гликолитического звена углеводного обмена в изолированных гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I с тетрагидрокортизолом, биологическая активность которого в отношении процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот была показана ранее в работах НИИ биохимии СО РАМН.

На культуре гепатоцитов, клеток асцитной НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха впервые установлена разнонаправленность эффектов ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами и ЛПОНП/апоЕ в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Показана способность ЛПОНП и апоЕ снижать скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот и подавлять стимулирующий эффект биологически активных комплексов апоА-I со стероидными гормонами.

Обнаружение разнонаправленности эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП/апоА-I раскрывает механизм регуляции опухолевого роста с участием макрофагов, который обусловлен способностью макрофагов, с одной стороны, поглощать ЛПВП и стероидные гормоны с образованием биологически активного комплекса, усиливающего биосинтез белка и нуклеиновых кислот, а с другой стороны, синтезировать и секретировать апоЕ, обладающий антипролиферативной активностью. Показано, что опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженным содержанием апоЕ.

Впервые методом флуоресцентной микроскопии показана возможность транспорта ЛПС в гепатоциты с использованием в качестве переносчика апоА-I. Результаты свидетельствуют о способности гепатоцитов участвовать в метаболической деградации эндотоксина при поглощении его в комплексе с ЛПВП и апоА-I. Путь нейтрализации ЛПС без участия макрофагов можно рассматривать как альтернативный, позволяющий снизить интенсивность воспалительного ответа. Показана способность ЛПВП ингибировать продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1 перитонеальными макрофагами мышей.

На культуре клеток HA-1 гепатомы показана эффективность использования ЛПВП в качестве средства адресной доставки противоопухолевых лекарственных препаратов на примере рубомицина. На частицах ЛПВП обнаружены места связывания для препарата с различной степенью аффинитета. Показано повышение эффективности поглощения рубомицина опухолевыми клетками при использовании ЛПВП в качестве переносчика, обусловленное рецептор-опосредованным эндоцитозом. Отмечено увеличение цитотоксического эффекта препарата в комплексе с ЛПВП при снижении его терапевтических доз. Показана селективность воздействия препарата в комплексе с ЛПВП, более выраженная по отношению к опухолевым клеткам.

Впервые проведено исследование возможности использования апоА-I в качестве лизосомотропного агента и средства внутриклеточной доставки противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида. Обнаружен высокий аффинитет изониазида к апоА-I. Показана способность апоА-I повышать свободную активность ферментов лизосом на фоне антимикобактериальной терапии. Отмечен противовоспалительный эффект апоА-I.

Теоретическая и практическая значимость работы. Решение поставленных в диссертации задач является важным этапом в изучении транспортной и регуляторной роли липопротеинов плазмы крови и их белковых компонентов. Внесен вклад в понимание механизмов проникновения биологически активных веществ в клетку в составе липопротеиновых комплексов. Результаты исследования свидетельствуют о том, что транспортируемые липопротеинами соединения проникают в клетку посредством рецептор-опосредованного эндоцитоза. Изучение роли липопротеинов в регуляции пролиферации и клеточного роста имеет важное теоретическое значение для понимания молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий в норме и в условиях опухолевого роста и может служить основой для повышения эффективности лечения онкологических больных.

Совокупность полученных фактов свидетельствует о перспективности использования ЛПВП и апоА-I в качестве транспортных форм для биологически активных веществ и лекарственных препаратов как в эксперименте, так и в клинике. Результаты работы показывают перспективность дальнейшего изучения использования апоА-I в качестве транспортной формы генетического материала при решении проблем генотерапии и генокоррекции.

Положения, выносимые на защиту.

  1. ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами усиливают процессы биосинтеза белка в опухолевых клетках при участии макрофагов. Опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Стероидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на метаболическую деградацию ЛПВП.
  2. Комплексы апоА-I со стероидными гормонами обладают высокой биологической активностью: усиливают процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в изолированных гепатоцитах и повышают активность гликолитического звена углеводного обмена.
  3. ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами и ЛПОНП/апоЕ характеризуются разнонаправленностью эффектов в регуляции процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот.
  4. АпоА-I проникает в ядерный аппарат гепатоцитов и может использоваться в качестве средства адресной доставки генетического материала с последующей экспрессией транспортируемого гена.
  5. ЛПВП и апоА-I являются эффективной формой для направленного транспорта в клетки различных лекарственных средств: цитостатиков, противотуберкулезных и гормональных препаратов.

Апробация результатов исследования. Материалы диссертации докладывались на I Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (19-23 сентября 2005 г, Сочи), V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (19-22 мая 2008 г, Москва), Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология» (1-3 октября 2008 г, Новосибирск), Российской научно-практической конференции с международным участием «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г, Томск), EASL Special Conference on NAFLD/NASH and Related Metabolic Disease (24-26 сентября 2009 г, Болонья, Италия), IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (27-29 октября 2009 г, Новосибирск) и были представлены на III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов» (7-9 ноября 2007 г, Новосибирск), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (11-15 мая 2008 г, Новосибирск), II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (29-31 октября 2008 г, Кишинев, Молдова), 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell (2-4 декабря 2008 г, Гуанджой, Китай), Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (12-16 апреля 2010 г, Москва), II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов» (18-19 марта 2010 г, Новосибирск).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 27 научных работ, из них 12 статей в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.

Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ биохимии СО РАМН.

***

Автор выражает глубокую благодарность за консультативную помощь и поддержку на всех этапах выполнения работы академику РАМН Панину Льву Евгеньевичу, профессору Полякову Льву Михайловичу, а также всем коллегам, принимавшим участие в исследованиях.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В работе использовались здоровые лабораторные животные: половозрелые крысы-самцы Wistar массой 180-200 г и 3-х месячные мыши-самцы CBA массой 20-23 г (виварий СО РАМН, Новосибирск), а также животные с моделью опухолевого роста: мыши-самцы A/Sn с асцитной HA-1 гепатомой и мыши-самцы CBA с асцитной карциномой Эрлиха (Институт цитологии и генетики СО РАМН, Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями правил проведения работ с использованием экспериментальных животных (приложение к приказу Министерства высшего и среднего специального образования СССР № 742 от 13.11.1984).

Поставленные задачи исследования решались с использованием модельных систем in vitro (культура гепатоцитов и непаренхимных клеток печени крыс, асцитных опухолевых клеток, перитонеальных макрофагов здоровых мышей и опухоль-ассоциированных макрофагов мышей с моделью опухолевого роста) и in vivo (туберкулезное воспаление, трансфекция эукариотического вектора).

Выделение асцитных клеток проводили в лог-фазе опухолевого роста на 10 день после прививки опухоли. Монослойные культуры клеток выращивали по общепринятой технологии и в соответствии с рекомендациями, представленными в литературе [Уголев А.Т. и др., 1985; Фрешни Р., 1989; Маурер Г., 1989].

Модель туберкулезного воспаления воспроизводили на мышах линии СВА путем однократного интраперитонеального введения 0,5 мг вакцины БЦЖ в 1 мл физиологического раствора [Шкурупий В.А., 2007]. Адекватность модели тестировали через 14 дней по морфологической оценке патологических изменений в паренхиматозных органах, характерных для туберкулезного воспаления.

Для изучения способности апоА-I осуществлять внутриклеточный транспорт генетического материала в качестве экспериментальной модели использовали эукариотический вектор pE-GAG со встроенным геном флуоресцирующего белка CFP Aequoria Victoria, синтезированный в лаборатории генной инженерии НИИ биохимии СО РАМН под руководством профессора А.Б.Беклемишева.

Основные методы, используемые в работе

  1. Выделение липопротеинов плазмы крови методом изоплотностного ультрацентрифугирования [Hatch F.T., Lees R.S., 1968].
  2. Выделение аполипопротеинов методом гель-фильтрации [Herbert P.N, et al., 1973].
  3. Диск-электрофорез в полиакриламидном геле с додецил­сульфатом натрия [Laemmli U.K., 1970].
  4. Электрофорез в 1% геле агарозы [Остерман Л.А., 1981].
  5. Иммуноэлектроблоттинг [Тovey E., Baldo A., 1987; Lin R.C., 1986].
  6. Денситометрическая обработка электрофореграмм и иммуноблоттов с помощью компьютерной программы TotalLab.
  7. Выделение плазматических мембран [Невилл Д., 1979].
  8. Выделение и культивирование клеток животных: перитонеальных макрофагов, асцитных опухолевых клеток и опухоль-ассоциированных макрофагов мышей [Хант С., 1990], гепатоцитов и непаренхимных клеток печени крыс [Seglen P., 1976].
  9. Выделение фракции лизосом из гомогената печени [De Duve Ch., 1963].
  10. Определение содержания белка с использованием в качестве стандарта бычьего сывороточного альбумина [Lowry O.H. et al., 1951].
  11. Оценка скорости биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре клеток по включению радиоактивной метки [Шаткин А., 1972].
  12. Определение содержания лактата энзиматическим методом [Howell B.F., 1980].
  13. Определение содержания ИЛ-1 методом твердофазного иммуноферментного анализа с использованием коммерческой тест-системы.
  14. Определение активности ферментов лизосом: катепсина D с использованием в качестве субстрата азоказеина [Wiederanders B., Oelke B., 1984], кислой фосфатазы с использованием в качестве субстрата -глицерофосфата натрия [De Duve Ch. et al., 1955; Fiske C., Subbarow Y., 1925] и хитотриозидазы с использованием флуоресцентного субстрата 4-метилумбеллиферил-триацетилхитотриозида [Czartoryska B. et al., 1998].
  15. Определение внеклеточной ДНК методом спектрофлуориметрии с использованием флуоресцентного красителя Хёхст 33258 [Morozkin E.S. et al., 2003].
  16. Оценка апоптоза методом спектрофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии с использованием в качестве флуорофора Хёхст 33258 [Maciorowski Z. et al., 1998; Данченко Е.О., 2001].
  17. Изучение взаимодействия липо(апо)протеинов с биологически активными веществами различной природы методом гель-фильтрации и методом тушения триптофановой флуоресценции с расчетом константы ассоциации и количества мест связывания [Attalah N.A., Lata G.F., 1968].
  18. Флуорохромирование с использованием флуоресцеинизотиоцианата [Hidaka H. et al., 1999].
  19. Морфологические методы с использованием световой и электронной микроскопии.
  20. Статистическая обработка результатов исследований методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для доказательства возможности использования апоА-I в качестве транспортной формы биологически активных веществ в клетки эукариот нами был использован хроматографически очищенный белок (рис. 1), меченный флуоресцеинизотиоцианатом (ФИТЦ).

 Электрофореграмма хроматографической очистки апоА-I, выделенного из-0

Рис. 1. Электрофореграмма хроматографической очистки апоА-I, выделенного из суммарных белков ЛПВП. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с DS-Na.

1 – белки-стандарты; 2 – суммарные белки ЛПВП; 3-9 – стадии очистки апоА-I.

Методом флуоресцентной микроскопии и спектрофлуориметрии показано связывание меченого апоА-I с рецепторным аппаратом цитоплазматических мембран изолированных гепатоцитов, а также его интернализация в цитоплазму и ядро. Исследования проводили в режиме флуоресцентного анализа на микроскопе AxioImager Z1 «Zeiss» с использованием цифровой камеры AxioCam MRc и программного обеспечения AxioVision V. 4.5. Анализ спектров флуоресценции клеточных лизатов проводили на спектрофлуориметре RF-5301 PC «Shimadzu».

Поглощение белка клетками зависело от времени инкубации и температурных условий. Выраженное накопление апоА-I-ФИТЦ в ядрах гепатоцитов наблюдалось уже через 30 минут инкубации при 37°С (рис. 2А). Через 1 – 2 ч интенсивность флуоресценции ядер снижалась, а цитоплазмы увеличивалась. Эти данные хорошо согласуются с полученными ранее результатами иммуноферментного анализа, которые показали присутствие апоА-I в транскрипционно активном хроматине, ядерном матриксе и фракции кислых негистоновых белков [Панин Л.Е. и др., 1992, 2000].

А Б

Рис. 2. А. Накопление апоА-I-ФИТЦ в ядрах изолированных гепатоцитов крыс через 30 минут инкубации при 37°С (ув. х200 ). Б. Флуоресцентная микроскопия гепатоцитов крыс после инкубации с апоА-I-ФИТЦ при 4°С (ув. х200).

При 4°С взаимодействие рецептор-лиганд на поверхности клеточной мембраны ограничивается, как известно, связыванием без последующей интернализации. Инкубация гепатоцитов при 4°С в течение 30 мин показала связывание апоА-I-ФИТЦ с клеточной мембраной без интернализации, что выражалось в равномерном свечении меченого белка на поверхности мембраны (рис. 2Б). При этом спектрофлуориметрический анализ клеточных лизатов показал снижение общей интенсивности флуоресценции на 64% по сравнению с результатами, полученными при инкубации клеток в условиях 37С.

Обнаруженное нами связывание апоА-I с цитоплазматическими мембранами гепатоцитов носило специфический характер. Спектрофлуориметрическое исследование клеточных лизатов показало, что даже 10-кратный избыток немеченого апоА-I приводил к снижению интенсивности флуоресценции на 29% (рис. 3).

Рис. 3. Спектры флуоресценции лизатов гепатоцитов после инкубации с апоА-I-ФИТЦ: 1 – без избытка немеченого апоА-I; 2 – в присутствии 10-кратного избытка немеченого апоА-I.

Поглощение клетками апоА-I-ФИТЦ происходило путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Флуоресцентные методы анализа показали отсутствие свечения гепатоцитов после их предварительной обработки 0,25% раствором трипсина. Методом иммуноэлектроблоттинга нами был идентифицирован белок-рецептор, связывающий апоА-I в качестве лиганда, с молекулярной массой 100-120 кДа, что может соответствовать рецептору HB2 для ЛПВП и апоА-I на поверхности мембран гепатоцитов [Hidaka H., Fidge N., 1992; Matsumoto A. et al., 1997].

Изучение роли ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами в регуляции биосинтеза белка в опухолевых клетках

Ранее в НИИ биохимии СО РАМН на тканевых и клеточных культурах печени, а также клетках асцитной НА-1 гепатомы был описан кооперативный эффект ЛПВП и кортизола в регуляции процессов пролиферации и клеточного роста при участии макрофагов [Панин Л.Е., 1987; Усынин И.Ф. и др., 1995; Панин Л.Е., Хощенко О.М., 2003]. В наших экспериментах показана важная роль ЛПВП в комплексе с кортизолом и прогестероном в регуляции биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии макрофагов.

Образование комплекса ЛПВП-прогестерон мы показали методом тушения триптофановой флуоресценции с расчетом константы ассоциации, которая составила 4,47х106 М-1. Образование комплекса ЛПВП-кортизол было показано ранее [Панин Л.Е. и др., 1992].

ЛПВП добавляли в количестве 1 мг белка на 1 мл среды инкубации, стероидные гормоны – 410–6 М. Присутствие ЛПВП и кортизола в культуре клеток асцитной карциномы, 30-40% которых составляют макрофаги, приводило к увеличению скорости биосинтеза белка в опухолевых клетках по сравнению с контролем на 15%, а по сравнению с культурой клеток карциномы, свободной от макрофагов, на 29% (табл. 1).

Табл. 1. Скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии макрофагов и комплекса ЛПВП с кортизолом

Условия инкубации Имп/мин х 103/мг белка M ± m, n=6
1.Клетки карциномы 816,1 ± 14,3
2.Клетки карциномы + ЛПВП-кортизол 937,2 ± 35,4 *
3.Клетки карциномы + апоЕ + ЛПВП-кортизол 733,2 ± 28,3 * #
4.Клетки карциномы без макрофагов + ЛПВП-кортизол 728,1 ± 20,5 * #

* - р < 0,05 по сравнению с группой 1; # - р < 0,05 по сравнению с группой 2

Добавление ЛПВП и прогестерона приводило к повышению скорости биосинтеза белка в опухолевых клетках на 15% по сравнению с контролем и на 23% по сравнению с культурой клеток карциномы без макрофагов (табл.2).

Табл. 2. Скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии макрофагов и комплекса ЛПВП с прогестероном

Условия инкубации Имп/мин х 103/мг белка M ± m, n=6
1.Клетки карциномы 762,43 ± 34,23
2.Клетки карциномы + ЛПВП-прогестерон 876,77 ± 47,91 *
3.Клетки карциномы + апоЕ +ЛПВП-прогестерон 760,49 ± 64,1 #
4.Клетки карциномы без макрофагов + ЛПВП-прогестерон 712,4 ± 48,91 #

* - р < 0,05 по сравнению с группой 1; # - р < 0,05 по сравнению с группой 2

Полученные нами результаты свидетельствуют о важной роли макрофагов в усилении биосинтеза белка в опухолевых клетках и подтверждают открытый ранее механизм участия этих клеток в регуляции экспрессии генов. Ключевая роль макрофагов заключается в поглощении ЛПВП и стероидных гормонов с последующей дезинтеграцией липопротеиновых частиц, восстановлением 4–3-кетогруппа А кольца стероидных гормонов и формированием биологически активного комплекса апоА-I-стероидный гормон [Панин Л.Е., 1998, 2002].

На клетках асцитной НА-1 гепатомы мышей мы показали, что у опухоль-ассоциированных макрофагов способность поглощать ЛПВП и подвергать их метаболической деградации выражена в значительно меньшей степени. Изучение белкового спектра клеточных лизатов после инкубации макрофагов мышей с ЛПВП, выделенных из плазмы крови человека, выявило наличие банда, соответствующего по молекулярной массе и иммунохимическим характеристикам апоА-I человека (рис. 4).

Кроме основной формы апоА-I идентифицированы продукты его метаболической деградации с молекулярными массами от 26 до 6 кДа (рис. 4Б). Денситометрический анализ данных иммуноблотта показал, что способность опухоль-ассоциированных макрофагов поглощать ЛПВП снижена почти в 2 раза по сравнению с перитонеальными макрофагами здоровых животных. Но, как оказалось, присутствие стероидных гормонов в среде инкубации оказывает стимулирующее влияние на данный процесс и более выраженное в отношении опухолевых клеток. В частности, добавление кортизола увеличивало поглощение ЛПВП макрофагами здоровых мышей в 1,6 раза, а опухоль-ассоциированными макрофагами – в 2,2 раза.

 Оценка поглощения и метаболической деградации белкового компонента-4

Рис. 4. Оценка поглощения и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП перитонеальными макрофагами мышей.

А результаты диск-электрофореза в 12,5% ПААГ с DS-Na:

1 – опухоль-ассоциированные макрофаги

2 – опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП

3 – апоА-I (стандарт)

4 – макрофаги здоровых мышей + ЛПВП

5 – макрофаги здоровых мышей

Б данные иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических апоА-I-антител:

1 – апоА-I (стандарт)

2 – макрофаги здоровых мышей + ЛПВП

3 – макрофаги здоровых мышей + ЛПВП-кортизол

4 – опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП

5 – опухоль-ассоциированные макрофаги + ЛПВП-кортизол

Одним из факторов, участвующих в регуляции биосинтеза белка, в том числе в опухолевых клетках, может быть апоЕ, обладающий антипролиферативной активностью [Vogel T. et al., 1994; Paka L. et al., 1999; Ho Y.Y et al., 2001; Niemi M. et al., 2002]. Отмечено, что содержание апоЕ составляет 10-25% от общего секретируемого макрофагами белка [Werb Z. et al., 1986]. Однако, как показали наши исследования с использованием модели асцитной НА-1 гепатомы, в спектре внутриклеточных белков опухоль-ассоциированных макрофагов количество апоЕ снижено по сравнению с макрофагами здоровых мышей (рис. 5).

Рис. 5. Электрофореграмма внутриклеточных белков перитонеальных макрофагов мышей. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с DS-Na:

1 – опухоль-ассоциированные макрофаги

2 – макрофаги здоровых мышей

3 – белки ЛПОНП

Иммуноэлектроблоттинг и денситометрический анализ результатов показали снижение содержания апоЕ в дегликозилированной проформе (рис. 6), что может свидетельствовать о нарушении посттрансляционной модификации данного белка в опухоль-ассоциированных макрофагах.

 Анализ внутриклеточного содержания апоЕ в перитонеальных макрофагах-6

Рис. 6. Анализ внутриклеточного содержания апоЕ в перитонеальных макрофагах мышей.

А – данные иммуноэлектроблоттинга с использованием специфических апоЕ-антител: 1 – опухоль-ассоциированные макрофаги; 2 –макрофаги здоровых мышей;

банд 1 – гликозилированная форма; банд 2 – дегликозилированная проформа

Б – денситометрия бандов апоЕ-иммунореактивности: 1 – банд 1; 2 – банд 2

Учитывая данный факт, а также способность апоЕ оказывать антипролиферативный эффект, мы изучили влияние экзогенного апоЕ на скорость биосинтеза белка в опухолевых клетках при стимуляции процесса ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами. Добавление хроматографически очищенного апоЕ (рис. 7) в концентрации 10 мкг/мл среды к клеткам асцитной карциномы Эрлиха за 24 ч до стимулирующего воздействия комплекса ЛПВП-стероидный гормон приводило к снижению скорости биосинтеза белка (табл. 1, 2) и подавлению кооперативного эффекта ЛПВП и стероидных гормонов.

 Электрофореграмма хроматографической очистки апоЕ, выделенного из-7

Рис. 7. Электрофореграмма хроматографической очистки апоЕ, выделенного из суммарных белков ЛПОНП. Диск-электрофорез в 12,5% ПААГ с DS-Na.

1 – низкомолекулярные белки-стандарты; 2 – суммарные белки ЛПОНП

3-9 – стадии очистки апоЕ

Разнонаправленность эффектов апоЕ и ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами была подтверждена и на модели асцитной НА-1 гепатомы с использованием апоЕ-содержащих ЛПОНП.

Полученные результаты позволяют рассматривать роль макрофагов в регуляции опухолевого роста с позиции как ингибирующей, так и стимулирующей активности. На наш взгляд, это зависит от того, какая программа реализуется в большей степени: подавления белкового синтеза под влиянием апоЕ или поглощения ЛПВП и стероидных гормонов с образованием биологически активного комплекса апоA-I-стероидный гормон, усиливающего биосинтез белка в опухолевых клетках.

Изучение роли апоА-I в комплексе со стероидными гормонами в регуляции биосинтетических процессов в клетке

Как было показано ранее и подтверждено в наших последующих исследованиях, кооперативный эффект ЛПВП и стероидных гормонов в отношении процессов пролиферации и клеточного роста осуществляется при участии макрофагов и связан с образованием биологически активного комплекса апоA-I-стероидный гормон. Так, в ряде работ показана способность комплексов апоА-I с тетрагидрокортизолом (апоА-I-ТГК), андростероном, дегидроэпиандростероном усиливать процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в нормальных и опухолевых клетках [Панин Л.Е. и др., 2001, 2007].

Молекулярный механизм биологической активности комплексов связан с их взаимодействием с сайтами ДНК, имеющих структуру (GCC)n-повторов, и последующей инициацией транскрипции генов [Панин Л.Е. и др., 2002, 2006]. Показано, что в активации экспрессии генов принципиально важную роль играет восстановленная 4–3-кетогруппа кольца А стероидных гормонов, которая в макрофагах восстанавливается при участии - и -редуктаз. Появление OH-группы в положении 3 кольца А приводит к возможности взаимодействия гормона с азотистыми основаниями ДНК посредством образования водородных связей. Это обстоятельство определило выбор гормонов в данном исследовании.

На изолированных гепатоцитах крыс была обнаружена высокая биологическая активность комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами и прегненолоном. Образование комплексов подтверждено нами методами гель-фильтрации и тушения триптофановой флуоресценции с расчетом констант ассоциации. Так, для комплекса апоА-I-прегненолон константа связывания составила 0,45х106 М-1. Комплексы для оценки биологической активности готовили, руководствуясь результатами исследования их связывания с апоА-I и в соответствии с данными по изучению влияния комплекса апоА-I-ТГК на стуктуру ДНК [Гимаутдинова О.И., 2002]. Смесь белка и гормонов выдерживали в молярном соотношении 1:2 в фосфатном солевом буфере (рН 7,4) при комнатной температуре в течение 30 мин. Концентрация апоА-I в среде инкубации составляла 60 мкг/мл, гормонов – 4х10-6 М.

В присутствии апоА-I анаболический эффект эстрадиола и эстриола повышался на 40%. Комплекс апоА-I с эстроном увеличивал скорость биосинтеза белка в гепатоцитах на 33% при отсутствии стимулирующего влияния свободного гормона (табл. 3).

Табл. 3. Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс под влиянием комплексов апоА-I с женскими половыми гормонами

Условия инкубации Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
АпоА-I-эстрадиол 4972 ± 135 #
Эстрадиол 3525 ± 82 *
АпоА-I-эстриол 6532 ± 116 #
Эстриол 4637 ± 105 *
АпоА-I-эстрон 3966 ± 108 #
Эстрон 2988 ± 67
АпоА-I 2876 ± 121
Интактный контроль 2975 ± 144

*- р < 0,05 по сравнению с интактным контролем

# - р < 0,05 по сравнению со свободным гормоном

Важную роль OH-группы в положении 3 кольца А стероидных гормонов подтверждают результаты изучения биологической активности комплексов апоА-I с прегненолоном и прогестероном. Только комплекс апоА-I-прегненолон оказывал стимулирующее влияние на биосинтетические процессы в изолированных гепатоцитах крыс: в 2 раза усиливал скорость биосинтеза белка (табл. 4), в 1,6 раза – скорость синтеза ДНК (табл. 5). Комплекс апоА-I-прогестерон не вызывал достоверных изменений синтеза белка, также как прегненолон и прогестерон в отсутствии белка-переносчика. Следует отметить, что и апоА-I без участия гормонов также не проявлял стимулирующего эффекта.

Табл. 4. Скорость биосинтеза белка в гепатоцитах крыс под влиянием комплексов апоА-I с прогестероном и прегненолоном

Условия инкубации Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
Контроль 57606 ± 2762
АпоА-I 50405 ± 1446 #
Прогестерон 64815 ± 968 #
Прегненолон 57730 ± 1267 #
АпоА-I-прогестерон 64055 ± 1415 #
АпоА-I-прегненолон 112089 ± 1560 *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению с комплексом апоА-I-прегненолон

Табл. 5. Скорость биосинтеза ДНК в гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I с прегненолоном и апоЕ-содержащих ЛПОНП

Условия инкубации Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
Контроль 648 ± 46
АпоА-I-прегненолон 1046 ± 75 *
ЛПОНП + апоА-I-прегненолон 498 ± 59 #
ЛПОНП 343 ± 43 *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению с комплексом апоА-I-прегненолон

Как известно, анаболические процессы в клетке требуют энергетических затрат. Резонно было предположить, что повышение интенсивности процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот под влиянием комплексов апоА-I со стероидными гормонами будет сопряжено с активацией энергетического обмена. Действительно, присутствие комплекса апоА-I-ТГК в среде инкубации гепатоцитов повышало поглощение 14С-глюкозы на 52% по сравнению с контрольными клетками. Это сопровождалось значительным накоплением лактата в среде кондиционирования: 0,77±0,05 мг/дл против 0,18±0,02 мг/дл в контроле (p<0,001). Полученные результаты свидетельствуют об активации гликолитического звена энергетического обмена в изолированных гепатоцитах под влиянием комплекса апоА-I-ТГК.

Отмеченная нами выше разнонаправленность эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП в комплексе со стероидными гормонами в опухолевых клетках была показана и в культуре интактных клеток. Так, апоЕ, добавленный в среду инкубации нормальных гепатоцитов (10 мкг/мл) за 24 ч до стимулирующего воздействия комплекса апоА-I-ТГК, полностью снимал эффект последнего в отношении стимуляции процессов биосинтеза белка и РНК. А скорость синтеза ДНК была даже в 1,6 раза ниже, чем в контроле. Примечательно, что апоЕ-содержащие ЛПОНП проявляли более выраженный ингибирующий эффект и снижали данный показатель в 3 раза (табл. 6). При стимуляции процессов биосинтеза ДНК комплексом апоА-I-прегненолон ЛПОНП также оказывали ингибирующее действие и снижали скорость синтеза в 2 раза (табл. 5).

Табл. 6. Скорость биосинтеза ДНК в гепатоцитах крыс под влиянием комплекса апоА-I-ТГК и апоЕ-содержащих ЛПОНП

Условия инкубации Имп/мин /мг белка M ± m, n=6
Контроль 1343 ± 74
АпоА-I-ТГК 1985 ± 104 *
ЛПОНП + апоА-I-ТГК 420 ± 30 #
ЛПОНП 424 ± 28 *
АпоЕ + апоА-I-ТГК 803 ± 48 #
АпоЕ 862 ± 70 *

* - р < 0,05 по сравнению с контролем

# - р < 0,05 по сравнению с комплексом апоА-I-ТГК

Влияние ЛПВП и их комплексов с полисахаридами на продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1

Известно, что липопротеины наряду с липополисахаридсвязывающим белком могут являться переносчиками полисахаридов в плазме крови, играя при этом важную роль в механизме противовоспалительной защиты организма (van Lenten B.J. et al., 1986; Ma J. et al., 2004; Gupta H. et al., 2005; Викторов А.В., Юркив В.А., 2006). Показано преимущественное взаимодействие липополисахарида (ЛПС) с ЛПВП [Ulevitch R. J. et al., 1981]. В связывании эндотоксина принимают участие белковые компоненты липопротеинов, в частности, апоА-I [Massamiri T. et al., 1997].

В нашей работе методами тушения триптофановой флуоресценции и электрофореза в геле агарозы показано связывание ЛПВП и апоА-I с полисахаридами бактериального (ЛПС из Escherichia coli) и дрожжевого происхождения (карбоксиметилированный и сульфоэтилированный гликаны из клеточной стенки Basidiomycetes и Oomycetes).

Патологический эффект полисахаридов опосредуется, как известно, через секреторные продукты макрофагов – провоспалительные цитокины, одним из которых является ИЛ-1. Известно также, что воспаление может играть важную роль в развитии опухолевого процесса. Показана способность ИЛ-1 повышать метастатический потенциал опухоли [Elaraj D.M. et al., 2006]. На культуре опухоль-ассоциированных макрофагов мышей с асцитной НА-1 гепатомой нами показано, что липопротеины снижают продукцию ИЛ-1 макрофагами: ЛПНП – в 2 раза, ЛПВП – в 8 раз по сравнению с контролем. Сочетанное добавление липопротеинов с кортизолом усиливало противовоспалительное действие. Комплекс ЛПВП с кортизолом оказывал аддитивный эффект (рис. 8).

Считается, что связанный с липопротеинами ЛПС не способен вызвать полноценной активации макрофагов (Feingold K.R. et al., 1995). В наших экспериментах при добавлении полисахаридов в комплексе с липопротеинами содержание ИЛ-1 снижалось в 2 – 4 раза по сравнению с контролем. При этом более выраженный эффект отмечен для комплекса ЛПС с ЛПВП.

 Содержание ИЛ-1 (пг/мл) в опухоль-ассоциированных макрофагах мышей с-8

Рис. 8. Содержание ИЛ-1 (пг/мл) в опухоль-ассоциированных макрофагах мышей с асцитной НА-1 гепатомой под влиянием липопротеинов и полисахаридов:

1 – контроль; 2 – ЛПВП; 3–ЛПНП; 4 – кортизол;

5 – ЛПВП-кортизол; 6 – ЛПС; 7 – ЛПВП-ЛПС

На изолированных гепатоцитах крыс с использованием метода флуоресцентной микроскопии нами показана способность апоА-I транспортировать ЛПС в клетку (рис. 9).

А Б

Рис. 9. Флуоресцентная микроскопия гепатоцитов крыс после инкубации с ФИТЦ-меченным ЛПС из E.coli в присутствии апоА-I в качестве переносчика (А) и без него (Б).

Известно, что эндотоксин напрямую не взаимодействует с гепатоцитами в связи с отсутствием соответствующих рецепторов, в частности, CD14. В комплексе с апоА-I ЛПС способен проникать в гепатоциты путем рецептор-опосредованного эндоцитоза. Данный факт указывает на способность гепатоцитов участвовать в метаболической деградации ЛПС, минуя макрофаги. Такой путь нейтрализации эндотоксина можно рассматривать как альтернативный, позволяющий снизить интенсивность воспалительного ответа. Ключевую роль в реализации этого пути играют липопротеины и их белковые компоненты, участвующие в образовании комплексов с полисахаридами. Целесообразность образования комплексов состоит в создании дополнительных путей проникновения полисахаридов в клетку при участии специфических рецепторов для липопротеинов.

Использование апоА-I в качестве транспортной формы генетического материала в клетки эукариот

Обнаруженная способность апоА-I проникать в ядерный аппарат клетки позволила нам использовать данный белок в качестве транспортного средства для адресной доставки генетического материала непосредственно в ядра. С этой целью в качестве экспериментальной модели был выбран эукариотический вектор со встроенным геном флуоресцирующего белка CFP Aequoria Victoria, в промоторную часть которого были встроены цис-элементы типа CC(GCC)n для получения его транспортной формы с апоА-I (Панин Л.Е. и др., 2002, 2008).

Связывание апоА-I с вектором было показано нами методом тушения триптофановой флуоресценции. Добавление вектора к белку приводило к снижению интенсивности свечения и изменению характера спектра со сдвигом максимума флуоресценции, что свидетельствует об образовании комплекса.

Анализ экспрессии гена, трансфицированного в ядра гепатоцитов с помощью апоА-I, проводили методом флуоресцентной микроскопии. Через 3 ч инкубации гепатоцитов с комплексом апоА-I-вектор было показано накопление флуоресцирующего белка в цитоплазматическом компартменте (рис. 10А). Это говорит о доставке гена CFP с помощью апоА-I в ядро с последующей его экспрессией и синтезом на основе тРНК специфического белка в цитоплазме. Экспрессии вектора и накопления флуоресцирующего белка в отсутствии переносчика не наблюдалось.

А Б

Рис. 10. Накопление флуоресцирующего белка CFP в цитоплазме гепатоцитов крыс. Ген флуоресцирующего белка доставлен в ядерный аппарат клеток с использованием в качестве переносчика апоА-I. А. Модель in vitro (ув. х400). Б. Модель in vivo (ув. х200).

Данные результаты получили подтверждение и на модели in vivo. Через 3 ч после введение комплекса апоА-I с вектором в хвостовую вену крыс было отмечено накопление флуоресцирующего белка в цитоплазме гепатоцитов (рис. 10Б). Это говорит о том, что трансфекция гена в ядра клеток успешно завершается синтезом соответствующего белка.

Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о реальной возможности использования апоА-I в клинике в качестве средства адресной доставки целевых генов в клетки печени для генокоррекции и генотерапии, а также для решения различных биотехнологических задач в условиях эксперимента.

Возможность использования липо(апо)протеинов как переносчиков генетического материала подтверждают и полученные нами результаты по изучению способности липопротеинов связывать и транспортировать внеклеточную ДНК (вкДНК) в плазме крови человека и животных. С использованием специфического для ДНК флуоресцентного красителя Хёхст 33258 показано, что 11-13% внеклеточной ДНК в плазме крови циркулирует в составе липопротеиновых комплексов, из них 7-8% – в составе ЛПВП.

Исследование эффективности использования ЛПВП в качестве транспортной формы противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина

Отсутствие специфичности действия большинства противоопухолевых лекарственных препаратов в отношении опухолевых клеток является одной из проблем онкотерапии. Противоопухолевый препарат проникает в равной степени и в здоровые клетки, оказывая свое поражающее действие на организм в целом. Решение проблемы возможно путем использования адресных переносчиков лекарственных средств, среди которых могут быть липопротеины плазмы крови.

Связывание ЛПВП с рубомицином изучали методом тушения триптофановой флуоресценции и равновесного диализа с последующей спектрофлуориметрией по флуоресценции рубомицина. Тушение триптофановой флуоресценции составило 27-55%. Таким образом, на частицах ЛПВП обнаружено около 60 мест связывания, из них 20 – с более высоким аффинитетом. О связывании свидетельствует также увеличение электрофоретической подвижности комплекса ЛПВП с рубомицином в 1,5 раза по сравнению с контролем в 1% геле агарозы (рис. 11). Коэффициент подвижности комплекса составил 0,36 против 0,23 в контроле.

Рис. 11. Электрофоретическая подвижность комплекса ЛПВП-рубомицин в 1% геле агарозы. 1-я дорожка – ЛПВП; 2-я дорожка – ЛПВП-рубомицин.

На культуре клеток асцитной HA-1 гепатомы было показано, что поглощение комплекса ЛПВП-рубомицин происходит путем рецептор-опосредованного эндоцитоза и является специфическим. Спектрофлуориметрия клеточных лизатов показала, что уже 5-кратный избыток нативных ЛПВП приводит к снижению интенсивности флуоресценции на 20%, а 10-кратный – на 60%. Эффективность поглощения препарата опухолевыми клетками в составе комплекса была в 1,6 раза выше по сравнению с контролем.

Поглощение комплекса изучали и на культуре гепатоцитов здоровых крыс. Оказалось, что интенсивность флуоресценции рубомицина в клеточном лизате опухолевых клеток в 1,7 раза выше, чем в гепатоцитах. Обнаруженный факт позволяет сделать предположение об адресной доставке препарата в опухолевые клетки в составе комплекса с ЛПВП. Возможно, клетки гепатомы имеют большее количество рецепторов для ЛПВП, которые после «захвата» подвергаются деградации в лизосомах, или более высокую их аффинность.

Цитотоксический эффект комплекса оценивали методом спектрофлуориметрии и флуоресцентной микроскопии с использованием красителя Hoechst 33258. Используемый метод, согласно данным литературы, позволяет выявить начальные стадии апоптоза [Maciorowski Z. et al., 1998]. Клетки HA-1 гепатомы инкубировали в течение 24 ч в присутствии свободного препарата и в составе комплекса в концентрациях 1, 3 и 6 мкг/мл. Спектрофлуориметрический анализ показал, что цитотоксичность препарата имеет дозозависимый характер и наиболее выражена при использования его в составе комплекса с ЛПВП при концентрации рубомицина 1 и 3 мкг/мл. С увеличением дозы препарата различия в формах применения нивелировались. Результаты флуоресцентной микроскопии с расчетом количества апоптотических клеток представлены в табл. 7.

Табл. 7. Количество апоптотических клеток НА-1 гепатомы (% от общего числа) после влияния рубомицина и его комплекса с ЛПВП

Показатель Рубомицин, мкг/мл ЛПВП-рубомицин, мкг/мл
1 3 6 1 3 6
% клеток 4,7 14 44,2 16 36,7 63,2

Эффективность использования апоА-I в качестве транспортной формы противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида

Методом тушения триптофановой флуоресценции мы показали способность апоА-I связывать изониазид. Максимальное тушение при полном насыщении связывающих мест составило 77%. При этом форма спектров не изменялась, а максимальный сдвиг составил 1-3 нм, что можно объяснить конформационными перестройками белкового компонента после взаимодействия с лигандом. Количество мест связывания составило ~ 70.

Эффективность использования апоА-I на фоне антимикобактериальной терапии с использованием изониазида изучали на модели БЦЖ-индуцированного туберкулезного воспаления у мышей. Лечение животных начинали через 14 дней после инфицирования и проводили в течение 30 дней. АпоА-I (200 мкг) и изониазид (14 мг/кг) вводили интраперитонеально 2 раза в неделю в 1 мл физиологического раствора. Экспериментальные животные были разделены на 4 группы: 1) БЦЖ-инфицированные животные, нелеченые (контроль); 2) БЦЖ-инфицированные животные, леченые изониазидом; 3) БЦЖ-инфицированные животные, которым вводили комплекс изониазид-апоА-I; 4) здоровые животные, которым внутрибрюшинно вводили 1 мл физиологического раствора (интактный котроль).

Анализ активности лизосомальных ферментов (таблица 8) в печени БЦЖ-инфицированных мышей показал, что общая активность катепсина D в 3-й и 4-й экспериментальных группах снижена в 1,5 раза по сравнению с контрольными группами. Свободная активность фермента у животных леченых изониазидом была в 2 раза ниже относительно контрольных групп. Введение апоА-I в сочетании с изониазидом приводило к увеличению свободной активности катепсина D. Данный показатель превосходил таковой у контрольных животных 1,4 раза.

Общая активность кислой фосфатазы на фоне лечения не отличалась от контрольных группах. Свободная активность фермента в группах леченых животных была снижена по сравнению с интактным контролем, но существенно превосходила данный показатель у нелеченых животных. Следует отметить, что в группе с введением апоА-I свободная активность фермента была в 1,3 раза выше по сравнению с группой без апоА-I.

Активность хитотриозидазы в плазме крови БЦЖ-инфицированных мышей превосходила интактный контроль в 3,4 раза. На фоне лечения активность фермента снижалась и в большей степени при введении препарата с апоА-I. Считается, что источником поступления в кровь данного фермента могут являться активированные макрофаги, а уровень его активности отражает интенсивность воспалительного процесса [Короленко Т.А. и др., 2000].

Таким образом, результаты проведенных исследований свидетельствуют о способности апоА-I повышать свободную активность лизосомальных ферментов в печени мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением на фоне антимикобактериальной терапии. Лизосомотропный эффект апоА-I был отмечен ранее на переживающих срезах печени крыс [Панин Л.Е., 1987]. Учитывая способность микобактерии нарушать функции лизосомального аппарата [Vergne I. et al., 2005], повышение свободной активности гидролаз при экспериментальной модели туберкулезного воспаления является благоприятным фактором, направленным на уничтожение и элиминацию возбудителя. Кроме того, полученные данные демонстрируют способность апоА-I оказывать противовоспалительный эффект, по-видимому, снижая гиперактивность макрофагов.

Табл. 8. Активность ферментов лизосом у мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением на фоне антимикобактериальной терапии с введением апоА-I (M±m; n=6)

Группа Катепсин D, у.ед./ч на 1 мг белка Кислая фосфатаза, мкмоль Рi /мин на 1 г белка Хитотриозидаза, нмоль MUF/мл в час
свободная общая свободная общая
Контроль 0,143 ± 0,01 0,679 ± 0,042 1,628 ± 0,261* 10,385 ± 0,424 1035,1 ± 65,66 *
Изониазид 0,075 ± 0,002 * 0,374 ± 0,022 * 2,75 ± 0,07 * $ 10,68 ± 0,69 576,5 ± 24,65 * $
АпоА-I-изониазид 0,208 ± 0,016 * # 0,376 ± 0,05 * 3,515 ± 0,2 * # $ 11,53 ± 0,53 447,8 ± 46,14 $
Интактный контроль 0,147 ± 0,01 0,569 ± 0,026 4,65 ± 0,19 12,78 ± 0,78 306,4 ± 44,39

*- р<0,05 по сравнению с интактным контролем

# - р<0,05 по сравнению с группой 2 (изониазид)

$ - р<0,05по сравнению с контролем

ВЫВОДЫ

  1. ЛПВП в комплексе с кортизолом и прогестероном повышают скорость биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха при участии опухоль-ассоциированных макрофагов.
  2. Показано участие макрофагов в метаболической деградации ЛПВП. Опухоль-ассоциированные макрофаги отличаются сниженной способностью к поглощению и метаболической деградации белкового компонента ЛПВП. Стероидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на эти процессы, более выраженное для опухоль-ассоциированных клеток.
  3. АпоА-I в комплексе с женскими половыми гормонами стимулирует процессы биосинтеза белка и ДНК в изолированных гепатоцитах крыс.
  4. Комплекс апоА-I с тетрагидрокортизолом, усиливая процессы биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в изолированных гепатоцитах, повышает интенсивность поглощения глюкозы клетками и накопление лактата, что свидетельствует об активации гликолитического звена углеводного обмена.
  5. На культуре гепатоцитов, клеток асцитной НА-1 гепатомы и карциномы Эрлиха установлена разнонаправленность эффектов ЛПОНП/апоЕ и ЛПВП/апоА-I в комплексе со стероидными гормонами в регуляции процессов биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. ЛПОНП и апоЕ снижали скорость биосинтеза белка и нуклеиновых кислот и подавляли стимулирующий эффект биологически активных комплексов апоА-I со стероидными гормонами.
  6. Методами флуоресцентного анализа показан транспорт ЛПС в гепатоциты с использованием в качестве переносчика апоА-I.
  7. ЛПВП и ЛПНП ингибировали продукцию провоспалительного цитокина ИЛ-1 опухоль-ассоциированными макрофагами мышей с асцитной НА-1 гепатомой. Наиболее выраженный эффект отмечен для ЛПВП и их комплексов с кортизолом. Ингибирующий эффект проявлялся и при стимуляции макрофагов комплексами ЛПВП с полисахаридами бактериального и дрожжевого происхождения.
  8. На модели эукариотического вектора pE-GAG со встроенным геном флуоресцирующего белка CFP Aequoria Victoria в экспериментах in vitro и in vivo показана способность апоА-I выступать в качестве транспортной формы генетического материала в клетку с последующей экспрессией транспортируемого гена и накоплением флуоресцирующего белка в цитоплазме.
  9. Липопротеины способны выступать в качестве транспортной формы внеклеточной ДНК в плазме крови. Показано, что 11-13% внеклеточной ДНК в плазме крови циркулирует в составе липопротеиновых комплексов, из них 7-8% – в составе ЛПВП.
  10. ЛПВП являются эффективной транспортной формой противоопухолевого лекарственного препарата рубомицина. На частицах ЛПВП обнаружено ~ 60 мест связывания для препарата. Использование ЛПВП в качестве переносчика повышает эффективность транспорта рубомицина в клетки асцитной НА-1 гепатомы и его цитотоксичность при снижении дозировки преимущественно в отношении опухолевых клеток.
  11. АпоА-I может служить эффективной транспортной формой противотуберкулезного лекарственного препарата изониазида. На молекуле апоА-I обнаружено ~ 70 мест связывания для препарата. Использование апоА-I на фоне антимикобактериальной терапии повышает свободную активность ферментов лизосом в печени (катепсина D и кислой фосфатазы).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Поляков Л.М., Зуева Т.В., Суменкова Д.В., Русских Г.С., Панин Л.Е. Влияние тетрагидрокортизола на поглощение и метаболическую деградацию белкового компонента липопротеинов плазмы крови перитонеальными макрофагами мышей в норме и в условиях опухолевого роста // Научные труды I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Сочи, 2005. С. 112.
  2. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Гуща Р.С., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние комплекса тетрагидрокортизола с аполипопротеином А-I на метаболические характеристики изолированных гепатоцитов крыс // Научные труды I Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Сочи, 2005. С. 216.
  3. Панин Л.Е., Князев Р.А., Суменкова Д.В., Гуща Р.С., Поляков Л.М. Роль аполипопротеина Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень СО РАМН. – 2007. – № 1. – С. 63 – 66.
  4. Поляков Л.М., Зуева Т.В., Суменкова Д.В., Панин Л.Е. Роль липопротеинов плазмы крови в связывании полисахаридов бактериального и дрожжевого происхождения // Бюллетень СО РАМН. – 2007. – № 1. – С. 67 – 70.
  5. Русских Г.С., Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Зуева Т.В. Роль макрофагов в поглощении и метаболической деградации белкового компонента липопротеинов высокой плотности // Бюллетень СО РАМН. – 2007. – № 5. – С. 45 – 48.
  6. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Русских Г.С., Усынин И.Ф., Зуева Т.В. Метаболическая деградация белкового и липидного компонента липопротеинов низкой плотности резидентными макрофагами // Бюллетень СО РАМН. – 2007. – № 5. – С. 49 – 52.
  7. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние комплексов аполипопротеина А-I со стероидными гормонами на биосинтез белка в культуре гепатоцитов крыс // Сибирский консилиум. – 2007. – Т. 62, №7. – С. 78. Материалы III Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Новосибирск, 2007.
  8. Панин Л.Е., Князев Р.А., Суменкова Д.В., Поляков Л.М. Влияние комплексов аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и прегненолоном на биосинтез белка в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 9. – С. 264 – 266.
  9. Панин Л.Е., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Взаимодействие аполипопротеинов А-I и Е в регуляции биосинтеза ДНК, РНК и белка в культуре гепатоцитов крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2007. – Т. 144, № 12. – С. 629 – 631.
  10. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Князев Р.А., Панин Л.Е. Аполипопротеин А-I как средство направленного транспорта биологически активных веществ и генетического материала в клетки эукариот // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск, 2008. С. 348.
  11. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М. Роль макрофагов в регуляции биосинтеза белка в опухолевых клетках // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2008. – № 6 (Приложение). – С. 420. Материалы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2008.
  12. Князев Р.А., Суменкова Д.В., Поляков Л.М. Роль аполипопротеинов А-I и Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в гепатоцитах крыс // Вестник Российской академии медицинских наук. – 2008. – № 6 (Приложение). – С. 198 – 199. Материалы V конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины». Москва, 2008.
  13. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов плазмы крови на содержание ИЛ-1 в макрофагах мышей с асцитной НА-1 гепатомой // Материалы Всероссийской конференции с международным участием «Молекулярная онкология». Новосибирск, 2008. С. 150 – 151.
  14. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Князев Р.А., Панин Л.Е. Влияние комплексов липопротеинов плазмы крови с полисахаридами на содержание ИЛ-1 в макрофагах мышей с асцитной НА-1 гепатомой // Научные труды II Съезда физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека». Молдова, Кишинев, 2008. С. 157.
  15. Polyakov L., Panin L., Sumenkova D., Knyazev R., Usynin I. Effect of complexes corticosteroids with apolipoprotein A-I on protein synthesis in primary culture of hepatocytes // Proceedings of 1st Annual World Congress of Regenerative Medicine & Stem Cell. China, Guangzhou, 2008.
  16. Панин Л.Е., Поляков Л.М., Усынин И.Ф., Суменкова Д.В., Князев Р.А. Влияние кортикостероидов в комплексе с аполипопротеином А-I на биосинтез белка в культуре гепатоцитов // Проблемы эндокринологии. – 2009. – Т. 55, № 3. – С. 45 – 47.
  17. Поляков Л.М., Суменкова Д.В., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов плазмы крови и их комплексов с полисахаридами на содержание ИЛ-1 в макрофагах мышей с асцитной HA-1 гепатомой // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 2009. – Т. 147, № 4. – С. 499 – 451.
  18. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Гуща Р.С., Поляков Л.М. Панин Л.Е. Влияние комплекса аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом на биосинтез белка и поглощение глюкозы гепатоцитами крыс // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. –2009. – Т. 147, № 8. – С. 173 – 175.
  19. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Князев Р.А., Панин Л.Е. Метаболические характеристики опухоль-ассоциированных макрофагов и их роль в регуляции опухолевого роста // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием «Современная онкология: достижения и перспективы развития». Томск, 2009. С. 188 – 189.
  20. Sumenkova D.V., Polyakov L.M., Panin L.E. Defence properties of high-density lipoproteins of blood plasma: potential protective effect in the development of metabolic diseases // Proceedings of the EASL Special Conference on NAFLD/NASH and Related Metabolic Disease. Italy, Bologna, 2009. P. 209.
  21. Суменкова Д.В., Поляков Л.М. Связывание эндотоксина липопротеинами высокой плотности как защитно-приспособительная реакция организма // Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Фундаментальные аспекты компенсаторно-приспособительных процессов». Новосибирск, 2009. С. 248 – 249.
  22. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Роль макрофагов в регуляции биосинтеза белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // Сибирский онкологический журнал. – 2010. – Т. 38, № 2. – С. 30 – 34.
  23. Суменкова Д.В., Князев Р.А., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние липопротеинов и стероидных гормонов на биосинтез белка в клетках асцитной карциномы Эрлиха // Бюллетень СО РАМН. – 2010. – Т. 30, № 2. – С. 44 – 48.
  24. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Аполипопротеин А-I как транспортная форма противотуберкулезных лекарственных препаратов // Материалы Российского национального конгресса «Человек и лекарство». Москва, 2010.
  25. Суменкова Д.В., Поляков Л.М., Панин Л.Е. Влияние аполипопротеина А-I в комплексе с изониазидом на активность лизосомальных ферментов у мышей с БЦЖ-индуцированным туберкулезным воспалением // Труды II Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Вопросы патогенеза типовых патологических процессов». Новосибирск, 2010. С. 342 – 345.
  26. Суменкова Д.В. Липопротеины плазмы крови как транспортная форма внеклеточной ДНК // 11 Конгресс молодых ученых с международным участием «Науки о человеке». Томск, 2010.
  27. Polyakov L.M., Sumenkova D.V., Knyazev R.A., Panin L.E. The analysis of interaction lipoproteins and steroid hormones // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. – 2010. – № 4. – P. 350 – 353.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Апо – аполипопротеин

вкДНК – внеклеточная дезоксирибонуклеиновая кислота

ИЛ-1 – интерлейкин-1

ЛПВП – липопротеины высокой плотности

ЛПНП – липопротеины низкой плотности

ЛПОНП – липопротеины очень низкой плотности

ЛПС – липополисахарид

ПААГ – полиакриламидный гель

ТГК – тетрагидрокортизол

ФИТЦ – флуоресцеинизотиоцианат

Pi - неорганический фосфат

MUF – 4-метилумбеллиферон

Соискатель Суменкова Д.В.



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.