WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Метаболизм меди в мозг у крыс при различных состояниях организма


На правах рукописи



БАБИЧ

Полина Сергеевна


МЕТАБОЛИЗМ МЕДИ В МОЗГУ КРЫС ПРИ РАЗЛИЧНЫХ СОСТОЯНИЯХ ОРГАНИЗМА


03.00.04 — биохимия


Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук


САНКТ-ПЕТЕРБУРГ

2008

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики НИИ экспериментальной медицины (НИИЭМ РАМН), на кафедре биофизики физико-механического факультета Санкт-Петербургского Государственного политехнического университета (СПбГПУ) и на кафедре прикладной химии и микробиологии факультета Сельского и лесного хозяйства Хельсинского Университета (Хельсинки, Финляндия)

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор

Людмила Валентиновна Пучкова

Научный консультант:

профессор Marja Mutanen

(Helsinki University, Helsinki,

Finland)

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор

Елена Ефимовна Дубинина

доктор медицинских наук, профессор

Александр Дорофеевич Денисенко

Ведущее научное учреждение: Санкт-Петербургская Государственная

химико-фармацевтическая академия

Защита состоится «30» октября 2008 г. в 15.00 часов на заседании совета Д001.022.03 по защите докторских диссертаций при ГУ Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН по адресу: 197376 Санкт-Петербург, Каменноостровский пр., д. 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИЭМ РАМН (197376 Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12).

Автореферат разослан «____» сентября 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, проф. Пучкова Л.В.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Медь необходима для жизни всех организмов, так как участвует в осуществлении широкого круга клеточных процессов от образования трансмиттеров до синтеза гема. Она входит в состав простетических групп ключевых ферментов, участвующих в окислительном фосфорилировании, формировании соединительной ткани, антиоксидантной защите, двунаправленном транспорте железа (Karlin, 1993). С другой стороны, ионы меди могут индуцировать образование активных форм кислорода, которые, действуя по механизму, сходному с ионизирующей радиацией, разрушают биополимеры (Linder, 2001). Поэтому в клетках всех типов существуют эволюционно консервативные системы для безопасного импорта, распределения и экскреции меди (Puig, Thiele, 2002). Любые, даже незначительные, сдвиги в их работе, вызванные генетическими или экологическими факторами, становятся причиной отдаленного развития тяжелых нейродегенеративных заболеваний (Gaggelli et al., 2006). Системы носят органоспецифический характер и изменяются в течение онтогенеза (Пучкова, Платонова, 2004), они особенно уязвимы у новорожденных (Madsen, Gitlin, 2007; Penland, Prohaska, 2004; Prohaska et al, 2005).

В Отделе молекулярной генетики ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН было показано, что церулоплазмин (ЦП, мультимедная голубая оксидаза, выполняющая также роль донора меди для клеток негепатоцитарных рядов (Bielli, Calabrese, 2002)), входящий в состав молока является регулируемым пищевым источником меди (Платонова и др., 1999; Платонова и др., 2004). Новорожденные, вскармливаемые молочными смесями, которые, как правило, обогащены солями меди, получают избыток свободных ионов меди (Пучкова и др., 1997; Lonnerdal, 2005). У новорожденных крыс, вскармливаемых молочными смесями, в печени происходит преждевременная смена эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый тип (Платонова и др., 2005; Platonova et al., 2007). Одновременно в СМЖ этих животных 7-кратно повышается концентрация меди и ЦП. Показано, что in vitro ЦП в концентрации выше, чем она поддерживается в СМЖ, вызывает гибель нейронов. В то же время для дифференцировки молодых нейронов требуется ЦП (Maltais et al., 2003). Вместе эти данные указывают на важность поддержания гомеостаза меди в мозгу в период новорожденности. Однако механизмы, контролирующие баланс меди в мозгу новорожденных, не изучены. К тому же плохо понято воздействие сдвигов метаболизма меди в целом организме на сбалансированную функцию генов, обеспечивающих гомеостаз меди в мозгу. Поэтому исследование связи между обменом меди в организме и экспрессией генов белков, обеспечивающих гомеостаз этого микроэлемента в мозгу, является актуальным.

Цель работы заключалась в изучении in vivo обмена меди в отделах мозга крыс при различных состояниях метаболизма меди.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Осуществить мониторинг распределения меди в отделах мозга крыс в течение онтогенеза. Сравнить уровень активности генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в отделах мозга новорожденных и взрослых крыс.

2. Изучить влияние искусственного дефицита связанной с церулоплазмином меди в крови взрослых крыс, индуцированного кормлением солями серебра, на метаболизм меди в мозгу.

3. Исследовать влияние серебра, получаемого с кормом крысой-самкой с первого дня лактации, на метаболизм меди в печени и мозгу вскармливаемого ею потомства в течение первых десяти дней жизни.

4. Определить основные параметры обмена меди в отделах мозга крыс с экспериментально индуцированным фибриллогенезом (модель болезни Альцгеймера, БА).

5. Сопоставить уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в культивируемых клетках линии НС11 до и после их малигнизации, провести аналогичные исследования на ApcMin мышах (Min мыши).

В работе исследовали кору, мозжечок, гиппокамп, миндалевидное тело, гипофиз, гипоталамус и сосудистое сплетение. Эти структуры мозга отличаются друг от друга по удельному содержанию меди, уровню и профилю экспрессии генов медьтранспортных белков (Платонова и др., 2005). В качестве маркеров состояния метаболизма меди в работе использованы концентрация меди, относительная активность генов медьтранспортных белков, а также секреторных и внутриклеточных купроэнзимов.

Научная новизна полученных результатов. Все полученные данные – новые. Показано, что особенностью метаболизма меди в мозгу крыс в период дифференцировки нейронов является высокий уровень мРНК, кодирующей секреторный ЦП. Напротив, у взрослых животных преимущественной молекулярной формой является мРНК, кодирующая церулоплазмин, связанный с клеточной мембраной через гликозилфосфатидилинозитоловый якорь (ГФИ-ЦП). Так как обе мРНК образуются из общего транскрипта в ходе альтернативного сплайсинга, очевидно, что этот процесс строго регулируется в течение развития мозга. Также показано, что в различные периоды онтогенеза, при широких колебаниях концентрации меди и ЦП в крови, в СМЖ она поддерживается на постоянно низком уровне. У крыс в течение развития в мозгу повышается концентрация меди. В работе показано, что это повышение связано с увеличением содержания в них купроэнзимов.

Продемонстрировано, что дефицит церулоплазминовой меди, искусственно вызванный добавлением в пищу AgCl, подавляет в мозгу экспрессию генов медьтранспортных белков, но мало влияет на формирование холо-купроэнзимов и концентрацию меди в клетках. Впервые продемонстрировано, что ионы серебра, поступающие в организм новорожденных с молоком, всасываются из ЖКТ, поступают в кровь и накапливаются в печени. Показано, что на всех этапах переноса, распределения и выведения атомы серебра остаются в обмениваемой форме. Высказано предположение, что ион серебра(I), изоэлектронный меди(I), использует внеклеточные и внутриклеточные транспортеры последней. Поэтому модель Ag-крыс может оказаться удобной для изучения транспорта ионов меди и механизмов включения их в активные центры купроэнзимов, за которыми можно следить по серебру. Именно этот раздел биологии меди плохо изучен, так как медь не имеет долгоживущих радиоактивных изотопов.

Важные результаты получены на модели крыс с индуцированным фибриллогенезом (модель БА). Показано, что у опытных крыс в отделах мозга снижается концентрация меди и нарушается гомеостаз цинка. При этом падает активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов. Таким образом, нарушение метаболизма меди, наблюдаемое при нейродегенеративных заболеваниях, может быть следствием фибриллогенеза. До сих пор нарушения обмена меди рассматриваются как причина фибриллогенеза. Возможно, что оба процесса имеют место при различных формах этих заболеваний. В работе впервые продемонстрировано, что развивающиеся опухоли, нуждающиеся в меди de novo, как для клеточного роста, так и для ее васкуляризации, возможно, транс-активируют метаболическую систему меди в печени.

Научно-практическое значение полученных результатов. Данные, полученные в разделе, посвященном исследованию онтогенетических особенностей метаболизма меди в мозгу новорожденных, дополнительно указывают на возможное негативное влияние избытка меди, получаемого новорожденными при вскармливании их молочными смесями. Данные о влиянии пищевого серебра на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных млекопитающих могут учитываться при разработке применения серебра в качестве агента, препятствующего метаболизму меди, при лечении нейродегенеративных и раковых заболеваний. К тому же, данные о локальной аккумуляции серебра в гипоталамо-гипофизарной системе и изменении в ней статуса железа и меди однозначно указывают на необходимость дополнительных исследований для получения научно-обоснованных рекомендаций по употреблению воды, обеззараженной обработкой серебром, особенно во время беременности и кормления.

Положения, выносимые на защиту:

1. В течение первого месяца жизни в клетках нервной ткани головного мозга крыс происходит увеличение активности генов, кодирующих купроэнзимы. В результате концентрация меди в мозгу повышается. В клетках сосудистого сплетения в этот период жизни происходят изменения статуса меди, сходные с таковыми в печени.

2. В мозгу в течение онтогенеза изменяется соотношение изоформ ЦП-мРНК, формирующихся путем альтернативного сплайсинга. У новорожденных образуется преимущественно мРНК секреторного ЦП, у взрослых – мРНК ГФИ-ЦП.

3. Отсутствие церулоплазминовой меди в крови взрослых крыс, вызванное потреблением с кормом ионов серебра, индуцирует в мозгу подавление экспрессии генов медьтранспортных белков и гена ЦП. Относительный уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов не меняется, но доля митохондриальной СОД1 увеличивается. Через гематоэнцефалический барьер ионы серебра переносятся в незначительном количестве, однако, они избирательно аккумулируются в гипофизе и вызывают изменения в обмене меди, железа и цинка в гипоталамо-гипофизарной системе.

4. Серебро, добавляемое в корм лактирующей самки, поступает в организм новорожденных, накапливается в печени в тех же компартментах, в которых аккумулируется медь и вызывает снижение оксидазной активности ЦП. В мозгу этих животных интенсивность образования секреторного ЦП снижена.

5. Фибриллогенез, вызванный прямым введением нейротоксического пептида в желудочки мозга крыс, провоцирует снижение концентрации меди и подавление активности генов медьтранспортных белков во всех рассмотренных отделах мозга, кроме сосудистого сплетения.

6. Развитие опухолей в кишечнике у Min мышей активирует в печени экспрессию генов медьтранспортных белков, участвующих в изменении уровня ЦП в крови. В опухолях повышается уровень активности только гена CTR1, белковый продукт которого участвует в импорте меди.

Апробация результатов работы. Результаты работы доложены на Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века» (2005, 2006 и 2007 гг.), на 17-ой Европейской конференции студентов и молодых ученых (Берлин, Германия, 2006), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, май, 2008), на международной конференции Европейской программы «Геном человека» (Барселона, Испания, 2008), на 38-ой международной конференции по координационной химии (Иерусалим, Израиль, 2008), а также на ежегодных собраниях «Неделя науки» в СПбГПУ. Устное сообщение 2006 г. в Пущино отмечено жюри как лучшее.

Личный вклад соискателя. Соискатель участвовала в получении экспериментальных данных, их обработке, обсуждении и описании всех разделов работы. Антитела к CTR1 получены аспирантами Клотченко С.А. и Затуловским Е.А., измерение концентрации металлов произведено на Физико-механическом факультете ГОУ СПбГПУ. Крысы с экспериментальным фибриллогенезом в мозгу получены в Отделе нейрофармакологии ГУ НИИЭМ РАМН. Данные о связи между неопластической трансформацией и метаболизмом меди получены соискателем в группе Dr. Giorgio Merlo, ассистента Dulbecco Telethon Institute C.N.R. ITB, Милан, Италия, и в группе проф. М. Мутанен на кафедре биохимии питания, факультета сельского и лесного хозяйства, Университет Хельсинки, Финляндия.

Структура диссертации. Диссертация содержит введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы, включающий 260 иностранных и 13 отечественных источников. Она изложена на 142 страницах. Результаты представлены в 7 таблицах и иллюстрированы 34 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Лабораторные животные и клеточные линии.

В работе использованы крысы линии Вистар и белые беспородные крысы, полученные из питомника «Рапполово».

1. Онтогенетическая модель. В качестве модели эмбрионального типа метаболизма меди были использованы новорожденные крысы.

2. Крысы с дефицитом оксидазного ЦП в крови. Самцы линии Вистар с массой тела около 250 г получали в течение 4-х недель корм, содержащий 50 мг AgCl на1 кг массы тела крыс в сутки. Корм и воду животные получали без ограничения. О развитии дефицита меди судили по исчезновению оксидазной активности в сыворотке крови.

3. Крысы с индуцированным фибриллогенезом (модель деменции альцгеймеровского типа, МДАТ). Самкам крыс линии Вистар массой 180 – 200 г в латеральный мозговой желудочек вводили 5 мкл водной взвеси, содержащей 15 мкг агрегированного пептида, который соответствует по последовательности нейротоксическому пептиду -амилоида (10YEVHHQKLVFFAEDV25, “Sigma”, США), на глубину 3,8 мм через операционное отверстие, сделанное над правым боковым желудочком в координатах А = 0,8, L = – 1,5 по атласу мозга крысы (Fifkova and Marsala, 1967). Крыс контрольной группы подвергали такой же операции, но в полость желудочка вводили по 5 мкл стерильной бидистиллированной воды. В опытах использовали животных через 21 день после операции. О развитии у них МДАТ судили по появлению на гистологических препаратах выраженных нейрональных повреждений и замедлению скорости выработки условного пищевого рефлекса (Stepanov and Sapronov, 2005).

4. Мыши линии ApcMin были предоставлены проф. М. Мутанен в рамках работы по стипендии CIMO. Часть работы выполнена на клетках линии НС11, первично полученных из эпителия молочной железы мышей на среднем сроке беременности (Merlo et al., 1995).

Материалы, использованные в работе.

Реактивы для проведения электрофореза в полиакриламидном и агарозном гелях, сахароза, детергенты, реагенты для ферментативных реакций, смесь ингибиторов протеаз приобретены у фирмы «Sigma», США; неорганические соли – у фирмы «Merсk», Германия; кислоты, щелочи и хлороформ – у фирмы «Вектон», Россия. Реагенты для проведения хемилюминесцентного иммуноблотинга приобретены у фирмы «Amersham», Великобритания. Для выделения тотальной РНК использован реактив “TRIzol Reagent”, “Invitrogen” (Великобритания). Ферменты, буферные смеси, растворы солей и праймеры для обратной транскрипции приобретены у фирмы «Амплисенс» (Москва). Реактив для определения концентрации белка по Брэдфорду, твердый Cu-хелатирующий агент Chelex-100 и белковые маркеры для электрофореза произведены фирмой “BioRad” (США), ДНК-маркеры – фирмой «Сибэнзим» (Новосибирск).

Антитела. Моновалентные поликлональные кроличьи антитела к ЦП сыворотки крови крысы получены к высокоочищенному препарату ЦП крысы. Для получения антител к CTR1 был использован 15-членный пептид, по последовательности соответствующий участку: 17TMQPSHHHPTTSASH31. Пептид синтезирован ООО «НПФ Верта», СПб, Россия. Кролики породы шиншилла иммунизированы конъюгатом пептида с гемоцианином из гемолимфы камчатского краба по общепринятой схеме. Специфичность антител проверена методом конкуренции с пептидом и по их связыванию Р15/BSA. Антитела к глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназе (Г3ФД), -актину и к полноразмерной рекомбинантной СОД1 приобретены у фирмы “Аbcаm”, США.


Методы исследования.

Извлечение отделов мозга крыс. Крыс подвергали анестезии фенобарбиталом, 60мг/кг массы тела, проводили интракардиальную перфузию 50 мл теплого PBS, содержащего 10 Ед/мл гепарина. Мозг помещали на охлажденную чашку Петри и иссекали отделы в соответствии с атласом (Mitro, Palkovits, 1981). Материал хранили при температуре -70 °С. Забор спинномозговой жидкости (СМЖ) производили под эфирным наркозом из затылочной цистерны, в которую вводили полиэтиленовый капилляр, соединенный с микрошприцом системы Гамильтон. Кровь собирали из шейных или хвостовых сосудов. После образования сгустка сыворотку отделяли центрифугированием. Растворимые белки из содержимого желудков экстрагировали следующим образом. 100 мг содержимого желудка гомогенизировали в 200 мкл PBS, содержащего коктейль ингибиторов протеаз, гомогенат инкубировали на льду 30 мин, центрифугировали 10000g 5 мин. Для исследования использовали надосадочную жидкость.

Субклеточные фракции выделяли методом дифференциального и равновесного центрифугирования, как описано ранее (Васин и др., 2005). Тотальную РНК изолировали с использованием реактива “TRIzol Reagent” в полном соответствии с инструкцией производителя. Полученные препараты РНК (А260/280 = 1,9) по данным электрофореза в 1 % агарозном геле не содержали примесей ДНК и продуктов деградации РНК.

Гель-электрофорез ПЦР-продуктов проводили в 1% агарозном геле, гели окрашивали бромистым этидием. В качестве маркеров использовали ДНК-маркеры молекулярных весов длиной 250—10000 п.н. фирмы «Сибэнзим», Новосибирск.

Синтез кДНК проводили в реакции обратной транскрипции (ОТ) на тотальной РНК со случайными праймерами. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) на полученных кДНК использовали уникальные праймеры, подобранные по программе Gene Runner 3.0. Детали проведения анализа описаны ранее (Платонова и др., 2005).

Иммуноблотинг. Электрофорез белков проводили в 10% или 8%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) с или без додецилсульфата натрия (SDS) по методу Laemmli (1970). Перенос белков из ПААГ на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли полусухим методом. В качестве вторых антител использовали антикроличьи (или антимышиные) козьи гамма-иммуноглобулины, конъюгированные с пероксидазой хрена. Иммунные комплексы визуализировали хемилюминесцентным методом. Количественный (ракетный) иммуноэлектрофорез. Концентрацию полипептидов ЦП определяли методом количественного иммуноэлектрофореза, как подробно описано ранее (Платонова и др., 2005). Выявление ЦП окрашиванием геля орто-дианизидином, специфическим хромогенным агентом, проводили в соответствии с методом, предложенным Owen и Smith (1961). Определение активности СОД1 проводили в геле. Активные зоны выявляли в соответствии с ранее описанным методом (Vives-Bauza et al., 2007). Измерение концентрации металлов. Кусочки ткани взвешивали, гомогенизировали 1 : 4 в смеси 5% SDS и 5% NaOH, нагревали до полного растворения. Во фракции градиента сахарозы добавляли по 100 мкл лизирующей смеси и прогревали до полного растворения материала. Биологические жидкости использовали без подготовки. Концентрацию металлов определяли методом атомно-абсорбционной спектрометрии с электротермической атомизацией и зеемановской коррекцией неселективного поглощения на спектрометре фирмы «Perkin-Elmer», Model 4100ZL, США. Концентрацию белка определяли по методу Лоури или Брэдфорда. В качестве количественного стандарта использовали ВSА. Статистическую обработку данных проводили по программе ANOVA, значимыми различиями считали различия Р 0.05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Для изучения связи между обменом меди и экспрессией генов медьтранспортных белков в мозгу при различных состояниях метаболизма меди в организме был использован общий подход. В тканях и биологических жидкостях определяли концентрацию меди и железа, транспорт которого связан с обменом меди. В качестве контроля измеряли концентрацию цинка, метаболизм которого не сопряжен ни с обменом меди, ни с обменом железа. Активность генов определяли методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа. В исследование были взяты гены медьтранспортных белков (CTR1, АТР7А и АТР7В), внеклеточные (ЦП и ГФИ-ЦП) и внутриклеточные купроэнзимы – СОД1 и СОХ. ЦП рассматривается также и как универсальный донор меди для клеток негепатоцитарных рядов. Для сравнения состояния антиоксидантной системы был определен также уровень экспрессии гена, кодирующего СОД2, ­ марганец зависимую супероксиддисмутазу, локализованную только в матриксе митохондрий. В ряде опытов измерена относительная концентрация зрелых транскриптов гена, кодирующего предшественник -амилоидного белка (АРР), который, возможно, осуществляет внеклеточное примембранное восстановление Cu(II) в Cu(I), необходимое для ее импорта в клетки. О содержании белковых продуктов генов ЦП, CTR1 и СОД1 судили по данным полуколичественного иммуноблотинга. Данные о содержании белка СОД1 и ЦП сопоставлены с ферментативной активностью названных купроэнзимов.

1. Онтогенетические изменения метаболизма меди в отделах мозга лабораторных крыс. Мониторинг постнатальных изменений метаболизма меди проведен в отделах мозга с относительно высоким (гипофиз и гипоталамус) и относительно низким (кора, мозжечок, миндалевидное тело, гиппокамп) уровнем обмена меди, а также в клетках эпендимы (сосудистое сплетение). Работа выполнена на 5-ти подгруппах крыс (в каждой не менее 5 животных), возраст которых соответствует различным типам метаболизма меди в печени. Первую группу (новорожденные) составили животные с эмбриональным типом метаболизма меди (подгруппы 5- и 10-суточные крысы). Вторую группу (детский период) также составили две подгруппы: 20- и 30-суточные животные. В этом возрасте у крыс в печени уже произошла смена эмбрионального типа метаболизма меди, но ее концентрация в мозгу еще не достигла уровня, соответствующего взрослым животным. Третью группу (взрослые) составили молодые половозрелые крысы (~120-суточные крысы).

1.1. Изменение концентрации меди в отделах мозга крыс в течение развития. Результаты измерения концентрации меди в отделах мозга с 5-дневного возраста до 4-месячного суммированы в таблице 1. Они показывают, что в коре и гиппокампе происходит увеличение концентрации меди. В миндалевидном теле она практически одинаковая на 5-е и 120-е сутки, но заметно увеличивается в течение первых 20 дней жизни, а затем снижается. В мозжечке концентрация меди достоверно возрастает примерно в два раза.

Таблица 1. Изменение концентрации меди в отделах мозга крыс в течение развития.

Отдел мозга Концентрация меди (нг/мг белка) в дни после рождения
5-ый 10-ый 20-ый 30-ый 120-ый
Первая группа Вторая группа Взрослые
Кора 21.6±6.13 25.9±1.51 32.7±8.59 24.5±1.56 24.9±3.01
Мозжечок 17.5±1.14 25.5±0.51 23.7±1.17 25.3±1.02 32.3±3.56
Гиппокамп 24.3±0.7 21.0±0.49 35.2±3.52 28.1±2.52 32.8±3.21
Миндалина 10.5±1.2 32.0±8.1 30.7±7.27 18.9±1.56 11.8±0.51
Гипофиз 47.2±3.28 31.4±2.42 48.1±7.87 35.3±1.67 43.5±3.52
Гипоталамус 91.9±8.48 96.3±17.9 103.4±7.79 42.0±2.05 55.6±0.81
*Сосудистое сплетение 42.4±7.69 134.4±4.15 100.6±7.89 42.3±2.36 2.5±0.26

Приведены средние значения по измерениям у 5-ти крыс в каждой группе. *Измерения проведены в группе из 8 крыс.

Наименьшим изменениям подвергается содержание меди в гипофизе, однако, оно достоверно выше, чем в коре, гиппокампе, мозжечке и миндалевидном теле. У новорожденных крыс самая высокая концентрация меди определяется в гипоталамусе, но в нем она, в отличие от других отделов мозга, не повышается в течение развития, а, напротив, снижается почти в два раза.

Самые заметные изменения в содержании меди в течение развития обнаружены в сосудистом сплетении. Здесь концентрация меди при рождении почти в 20 раз выше, чем у взрослых, затем она повышается и начинает снижаться после 20-го дня жизни. У взрослых удельное содержание меди в сосудистом сплетении самое низкое по сравнению с другими структурами мозга. Эти изменения сходны с теми, которые имеют место в печени при эмбриональном типе метаболизма меди и его смене на взрослый тип. Данные однозначно показывают, что в течение постнатального развития в мозгу крыс происходят регион-специфические изменения содержания меди. Они приводят к повышению концентрации меди в нервной ткани и ее снижению в клетках эпендимы.

1.2. Внутриклеточное распределение меди в мозгу 10-дневных крыс. Сравнительный анализ внутриклеточного распределения меди в мозгу и печени новорожденных и взрослых крыс был осуществлен следующим образом. Постъядерные супернатанты гомогенатов, полученных из равных по весу кусочков печени и мозга 10- и 120-дневных крыс фракционировали в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы. Во фракциях градиента определяли содержание меди. Количество меди, открываемой в органеллах, относили к ее общему содержанию. Результаты показали, что у взрослых концентрация меди в мозгу выше, чем в печени (33 против 16 мкг/г сырой ткани). У новорожденных, напротив, концентрация меди в печени многократно, почти в 30 раз, превышает таковую в мозгу (700 против 23 мкг/г сырой ткани). Таким образом, в течение развития концентрация меди в печени падает (16 против 700 мкг/г сырой ткани), а в мозгу повышается (33 против 23 мкг/г сырой ткани). Эти результаты полностью совпадают с данными, известными по литературе. Обобщенные данные по внутриклеточному распределению меди в печени и мозге в течение развития приведены в таблице 2. Они показывают, что в клетках печени новорожденных основная часть меди локализуется в цитозоле и во фракции внутриклеточных мембран, которую составляют микросомы, аппарат Гольджи и везикулы. При переходе на взрослый тип метаболизма меди ее содержание в цитозоле снижается.

Таблица 2. Распределение меди в клеточных компартментах печени и мозга крыс в течение развития.

Клеточный компартмент Доля меди от ее общего содержания, %
печень мозг
новорожденные взрослые новорожденные взрослые
Цитоплазма 40 22 11 9
Внутриклеточные мембраны 38 37 50 46
Митохондрии 9 21 19 21
Лизосомы 11 10 11 18
Пероксисомы 2 10 9 6

Основная часть меди выявляется во фракции внутриклеточных мембран. Повышается и относительное содержание меди в митохондриях. В клетках мозга 10-дневных и взрослых крыс медь распределяется одинаково и сходно с печенью взрослых: основная часть меди присутствует во фракции внутриклеточных мембран и в митохондриях. Такой рисунок распределения хорошо объясняет известное участие этих клеточных компартментов в метаболизме меди. Так, цитозоль и митохондрии являются местами локализации соответственно СОД1 и СОХ, основных клеточных купроэнзимов, а во фракции внутриклеточных мембран формируются такие купроэнзимы, как ЦП, ГФИ-ЦП, пептидилглицин -гидроксилирующая монооксигеназа, тирозиназа и допамин--монооксигеназа. В лизосомах клеток мозга взрослых крыс по сравнению с 10-дневными крысами содержание меди выше. Возможно, это связано с накоплением в них нейромеланина. Таким образом, механизмов депонирования меди, подобных механизмам, существующим в печени новорожденных, в мозгу новорожденных нет, а наблюдаемое в онтогенезе повышение содержания меди в отделах мозга, за исключением сосудистого сплетения, вероятно, связано с активацией синтеза купроэнзимов в онтогенезе.

1.3. Экспрессия генов медьтранспортных белков в отделах мозга 10-дневных крыс. В работе определена квазистационарная концентрация мРНК, кодирующих ЦП, ГФИ-ЦП, CTR1, АТР7А, АТР7В, АРР, СОД1, СОД2 и Сox4i1 (субъединица 4 изоформа 1 СОХ). Измерение проведено в отделах мозга крыс на 10-е и 120-е сутки жизни. В работе результаты представлены в виде гистограмм, рассчитанных по данным трехкратных измерений. В качестве внутреннего стандарта всегда использовали данные ОТ-ПЦР, полученные для -актина. Разница значений не составляла больше 10%. Для иллюстрации на рис. 1 приведены протоколы ОТ-ПЦР анализа экспрессии взятых в рассмотрение генов. Видно, что профиль экспрессии генов – органоспецифичен, а длины продуктов амплификации соответствуют предсказанным.

А С

В D

Рис. 1. Примеры протоколов ОТ-ПЦР анализа. А – электрофорез амплификатов, полученных на РНК, выделенных из мозга 10-дневных крыс: 1 – -актин, 2 – ЦП, 3 – ГФИ-ЦП, 4 – CTR1, 5 – CTR2, 6 - маркеры. В – то же: 1 – АРР, 2 – СОД1, 3 – СОД2, 4 – Сox4i1, 5 – маркеры. С – РНК изолирована из мозга 19-дневных эмбрионов: 1 – АТР7А, 2 – АТР7В, 3 – АРР, 4 – СОД1, 5 – СОД2, 6 – Сox4i1, 7 – маркеры. D – РНК изолирована из печени взрослых крыс: 1 – -актин, 2 – мтЦП, 3 - АТР7А, 4 – АТР7В, 5 – CTR1, 6 – ЦП, 6 – ГФИ-ЦП, 7 – АРР, 8 – маркеры. Дорожки считать слева направо.

Результаты измерений показали, что ген CTR1 экспрессируется во всех отделах взрослых и 10-суточных крыс. У новорожденных относительное содержание CTR1-мРНК только в коре и мозжечке выше, чем у взрослых крыс. В гипофизе активность этого гена у новорожденных и взрослых крыс не отличается. В гиппокампе, миндалевидном теле и особенно в гипоталамусе и в сосудистом сплетении относительный уровень CTR1-мРНК у взрослых крыс выше. Ген АРР также экспрессируется во всех отделах мозга крыс обеих групп. Относительная концентрация АРР-мРНК выше у взрослых крыс. Самым низким уровнем экспрессии гена АРР характеризуется кора. Во всех исследованных отделах мозга новорожденных крыс экспрессируются гены обеих Cu(I)-АТРаз, однако, активность гена АТР7В ниже активности гена АТР7А, а уровень экспрессии обоих генов у новорожденных ниже, чем у взрослых. У новорожденных ген АТР7А с наибольшей активностью экспрессируется в гипоталамусе, гиппокампе и в сосудистом сплетении, а активность гена АТР7В выше в гиппокампе и в сосудистом сплетении. В целом, результаты позволяют считать, что в мозгу в постнатальный период развития активность генов медьтранспортных белков растет, а профиль Cu-АТФаз изменяется.

1.4. Изменения экспрессии гена церулоплазмина в мозгу развивающихся крыс. Существенные отличия обнаружены в экспрессии гена ЦП. О ней судили по относительному содержанию изоформ, образующихся в результате альтернативного сплайсинга: мРНК, кодирующей секреторный ЦП, и мРНК, программирующей синтез ГФИ-ЦП. Полный протокол одного из этих опытов приведен на рисунке 2 (вкладка). Видно, что во всех исследуемых отделах мозга взрослых крыс преимущественной изоформой продукта транскрипции гена ЦП является мРНК, кодирующая ГФИ-ЦП, а у новорожденных – мРНК секреторного ЦП. Исходя из того, что ЦП-мРНК и ГФИ-ЦП мРНК являются продуктами одного и того же гена, который активен только в клетках глии (Платонова и др., 2005), мы определили прямое соотношение этих мРНК. Оказалось, что у новорожденных крыс в мозжечке, гиппокампе, миндалевидном теле и гипоталамусе обе изоформы образуются примерно в одинаковых количествах (соотношение ЦП-мРНК/ГФИ-ЦП мРНК колеблется около 1). В гипофизе и, особенно, в коре у 10-дневных крыс образование ЦП-мРНК существенно превышает образование ГФИ-ЦП мРНК. У взрослых крыс во всех отделах, исключая гиппокамп, отношение ЦП-мРНК/ГФИ-ЦП мРНК ниже 1, что указывает на преимущественное образование в них ГФИ-ЦП мРНК. Только в сосудистом сплетении и новорожденных, и взрослых крыс ГФИ-ЦП мРНК и ЦП-мРНК образуются примерно в равных соотношениях. Полученные данные однозначно показывают, что уровень образования секреторного ЦП в нервных клетках у новорожденных крыс выше, чем у взрослых. Напротив, формирование ГФИ-ЦП происходит значительно интенсивнее у взрослых. Повышение концентрации меди в коре, гиппокампе и мозжечке в течение развития может быть прямо связано с увеличением уровня ГФИ-ЦП. Об этом можно с уверенностью судить, так как в ходе перфузии ЦП удаляется, в то время как ГФИ-ЦП остается связанным с клеточной поверхностью. В пользу этого предположения свидетельствует и тот факт, что в мозгу взрослых крыс, по данным  Транскрипционная активность гена церулоплазмина в отделах мозга-4

Рис. 2. Транскрипционная активность гена церулоплазмина в отделах мозга взрослых и новорожденных крыс. А – схема соответствия праймеров на кДНК ЦП, с помощью которых выявляли мРНК ГФИ-ЦП (вверху) и мРНК растворимого ЦП (внизу).

Б – электрофорез продуктов ОТ-ПЦР, полученных на препаратах тотальной РНК, выделенной из различных отделов мозга взрослых (а) и новорожденных (б) крыс. В – электрофореграмма типичных препаратов РНК, использованных в работе. 1 – кора, 2 – мозжечок, 3 – гиппокамп, 4 – миндалевидное тело, 5 – гипофиз, 6 – гипоталамус, 7 – сосудистое сплетение. bp – пар оснований.

 Активность СОД1 в цитозоле мозга новорожденных (1) и взрослых (2)-5

Рис. 4. Активность СОД1 в цитозоле мозга новорожденных (1) и взрослых (2) крыс. А – окрашивание геля на присутствие СОД1 после нативного электрофореза, В – иммуноблотинг тех же образцов с антителами к СОД1. 3 – цитозоль печени взрослых крыс.

Рис. 5. Содержание СОД1 в цитозоле отделов мозга контрольных (1 – 3) и Ag-крыс (4 – 6) по данным иммуноблотинга (А). 1 и 4 – кора, 2 и 5 – мозжечок, 3 и 6 – гиппокамп. Нижний ряд – иммуноблотинг этих же образцов цитозоля с антителами к ГД3ФД. В – активность СОД1, выявляемая в этих же образцах. Вверху: активность СОД1, выявляемая в геле, внизу: иммуноблотинг этих же образцов с антителами к СОД1 после нативного электрофореза в ПААГ. Обозначения, как на блоке А.

Рис. 6. Обнаружение СОД1 в межмембранном пространстве митохондрий методом иммуноблотинга после электрофореза в ПААГ в денатурирующих (А) и нативных (С) условиях, а также по ферментативной активности (В). 1 и 3 – кора, 2 и 4 – мозжечок. 1 и 2 – контрольные крысы, 3 и 4 – Ag-крысы.

Рис. 7. Влияние пищевого серебра на оксидазную активность ЦП. А – ПААГ после электрофореза в нативных условиях окрашен орто-дианизидином; 1 – сыворотка крови контрольной самки; 2 – то же, Ag-самка. 3 и 4 – смеси равных объемов сывороток от трех 10-дневных крыс; 5 и 6 – то же, Ag(10)-крысы. На дорожку нанесено по 1 мкл сыворотки. 7 – смесь содержимого желудков трех Ag(10)-крыс (20 мкл), 8 – то же, контроль. В – иммуноблотинг с антителами к ЦП крысы. 1 – сыворотка крови контрольной самки; 2 – то же, Ag-самка. 3 и 4 – смеси равных объемов сывороток от трех Ag(10)-дневных крыс; 5 и 6 – то же, 10-дневные крысы. На дорожку нанесено по 0.1 мкл сыворотки. 7 – смесь содержимого желудков трех Ag(10)-крыс (5 мкл), 8 – то же, контроль.

 Относительное содержание CTR1-мРНК в плазматических мембранах печени-9

Рис.9. Относительное содержание CTR1-мРНК в плазматических мембранах печени (1, 2, 5 и 6) и мозга (3, 4, 7 и 8) контрольных (нечетные) и опытных крыс (четные). 1 – 4: новорожденные, 5 – 8: взрослые. Стрелкой показано положение в геле BSA.

Рис. 10. Содержание (А) и активность (В) СОД1 в цитоплазме, выделенной из печени (1, 2, 5 и 6) и мозга (3, 4, 7 и 8). контрольных (нечетные) и опытных крыс (четные). 1 – 4: новорожденные, 5 – 8: взрослые.

Рис. 11. Выявление полипептидов СОД1 в цитозоле (слева) и в МПМ (справа). Слева: А – иммуноблотинг цитозоля, выделенного из коры, мозжечка и гиппокампа контрольных крыс (1-3) и с индуцированным фибриллогенезом (4-6). Вверху – антитела к СОД1, внизу – антитела к ГДЗФД. В: то же, вверху – гель окрашен на активность СОД1, внизу – иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях. Справа: иммуноблотинг МПМ, выделенного из коры (1 и 3) и мозжечка (2 и 4) контрольных крыс (1 и 2) и крыс с МДАТ (3 и 4). Вверху: иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в SDS-ПААГ, в центре: активность СОД1, выявляемая в геле, внизу: иммуноблотинг с антителами к СОД1 после электрофореза в 10% ПААГ в неденатурирующих условиях.

А

В  С Влияние опухолевого роста у Min мышей на метаболизм меди в печени.-15 С

Рис. 12. Влияние опухолевого роста у Min мышей на метаболизм меди в печени. А: содержание оксидазного ЦП в крови 70-дневных мышей; 1 – 5: Min мыши, 6 – 8: С57BL/6J мыши; 9 – образец крови крысы. Образцы по 1 мкл сыворотки крови подвергнуты электрофорезу в 7.5% ПААГ, который затем окрашен орто-дианизидином.. В: результаты обработаны с помощью программы “Scion Image”. С: экспрессия генов медьтранспортных белков.

иммуногистохимического окрашивания, ГФИ-ЦП присутствует во всех клетках, выстилающих желудочки и в клетках глии (Платонова и др., 2005; Повалихин, 2007). В то же время мы не наблюдали окрашивания срезов мозга новорожденных антителами к ЦП при использовании той же техники (данные не приводятся).

1.5. Содержание меди и ЦП в СМЖ крыс в течение развития. В сыворотке крови и в образцах СМЖ, взятых у 8- и 14-суточных крыс, а также у взрослых половозрелых и лактирующих крыс, была измерена концентрация меди и ЦП методами атомно-абсорбционной спектрометрии и количественного иммуноэлектрофореза, соответственно. Измерения показали, что концентрация ЦП у этих животных составляет 59, 81, 358 и 512 мг/л, а концентрация меди – 200, 240, 700 и 1040 мкг/л, соответственно. Во всех образцах крови на 1 молекулу ЦП приходится примерно 5-6 атомов меди. Наблюдаемое низкое содержание ЦП и меди в крови новорожденных и его повышение в течение развития полностью соответствует данным литературы. У всех исследованных животных концентрация меди в СМЖ оказалась одинаковой и равной примерно 15 мкг/л. При этом содержание ЦП в СМЖ не зависит от его концентрационных колебаний в сыворотке крови и составляет около 3 мг/л, что почти в 100 раз меньше, чем в сыворотке взрослых крыс. Иммунопреципитация ЦП из ликвора приводит к перемещению 97% меди в осадок. Это означает, что практически все атомы меди, циркулирующие в СМЖ, ассоциированы с ЦП, молекула которого содержит около 10 атомов меди. Обработка образцов ликвора смолой Chelex-100 удаляет примерно 35% ионов меди. Следовательно, из 10 атомов меди, связанных с 1 молекулой ЦП, 3 – 4 атома связаны слабо.

1.6. Изменения активности генов, кодирующих внутриклеточные купроэнзимы. В тотальной фракции мРНК, изолированной из отделов мозга 10- и 120-дневных крыс, была определена относительная концентрация зрелых транскриптов генов, кодирующих СОД1, СОД2 и Сox4i1. Фермент СОД1 является основным цитозольным купроэнзимом, концентрация которого строго зависит от обмена меди (Suazo et al., 2008). Для него в качестве партнера по системе антиоксидантной защиты была использована СОД2. Для оценки экспрессии мультисубъединичного комплекса СОХ была выбрана изоформа 1 субъединицы 4 (Cox4i1). Выбор определили следующие соображения. Экспрессия гена Cox4i1 строго коррелирует со сборкой и функционированием зрелой СОХ, поэтому по уровню активности этого гена можно судить об активности СОХ в целом. К тому же Cox4i1 экспрессируется в клетках мозга и печени (Richter, Ludwig, 2003). Помимо этого, ядерный ген, кодирующий ее, в отличие от митохондриальных генов, содержит интроны, что позволяет адекватно использовать ОТ-ПЦР анализ. Найдено, что гены СОД1, СОД2 и Cox4i1 экспрессируются во всех отделах мозга, но у новорожденных относительный уровень их активности ниже, чем у взрослых крыс.

1.7. Распределение СОД1 в цитозоле и в межмембранном пространстве митохондрий мозга новорожденных и взрослых крыс. В следующей серии опытов было определено сравнительное содержание белка СОД1 в печени и мозге новорожденных крыс, распределение его между цитозолем и межмембранным пространством митохондрий (МПМ). Опыты этой серии проводили на целом мозге. Для этого мозг измельчали ножницами, из кашицы отбирали весовые аликвоты, из которых получали субклеточные фракции. Образцы для электрофореза строго выравнивали по белку. Относительное содержание СОД1 определяли методом иммуноблотинга. Результаты представлены на рисунке 3. Они показывают, что содержание белка СОД1 в печени и взрослых, и новорожденных крыс в несколько раз выше, чем в мозгу. У новорожденных и в мозгу, и в печени содержание СОД1 ниже, чем у взрослых. Эти данные полностью согласуются с данными ОТ-ПЦР анализа. Обращает на себя внимание внутриклеточное распределение белка СОД1 у новорожденных: в МПМ и печени, и мозга СОД1 едва обнаруживается (рис. 3). Данные, приведенные на рисунке 4 (вкладка), показывают, что ферментативная активность цитозольной СОД1 из клеток мозга и печени, по положению в геле соответствует зоне, выявляемой антителами к СОД1. Это означает, что в мозгу соотношение апо-СОД1 и холо-СОД1 у взрослых и новорожденных не отличается.

Рис. 3. Выявление СОД1 в субклеточных фракциях печени (столбцы 1 и 3) и мозга (столбцы 2 и 4) взрослых (столбцы 3 и 4) и новорожденных (столбцы 1 и 2) крыс методом иммуноблотинга. А – цитозоль, В – межмембранное пространство митохондрий, С – иммуноблотинг белков цитозоля с антителами к -актину.

2. Влияние дефицита оксидазного ЦП в крови на метаболизм меди в мозгу взрослых и новорожденных крыс. Для изучения влияния дефицита меди на экспрессию генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в мозгу взрослых крыс был применен известный экспериментальный прием – добавление в корм солей серебра, снижающих содержание оксидазного ЦП и меди в сыворотке крови крыс (Prybil et al., 1981). Мы показали, что у крыс (Ag-крысы), вскармливаемых в течение четырех недель ионами серебра (50 мг AgCl/кг массы тела), в крови циркулирует апо-ЦП, серебро накапливается в печени, метаболизм меди в печени не изменяется (Клотченко и др., 2008). У Ag-крыс, как показало измерение в целом мозге, концентрация серебра незначительно превышает фон. Чтобы установить, распределяется ли серебро в мозгу равномерно или аккумулируется локально, концентрация серебра была определена в отделах мозга Ag-крыс. Параллельно в этих же образцах определяли концентрацию меди и железа, так как конкурентное поступление серебра может снижать уровень меди и образование медьсодержащих ферроксидаз (ЦП и ГФИ-ЦП), дефицит которых приводит к нарушению баланса железа в клетках. Также измеряли и концентрацию цинка, которая может служить в качестве контроля специфичности действия серебра. Результаты показали, что за время эксперимента ни в одном из отделов мозга, за исключением гипофиза (Р<0.05), серебро не аккумулируется. Отклонения в концентрации меди и железа найдены только в гипоталамо-гипофизарной системе. Так, концентрация меди достоверно снижается в гипоталамусе (в два раза), а в гипофизе содержание железа увеличивается в пять раз. Концентрация цинка в гипофизе повышается в два раза.

По данным ОТ-ПЦР анализа экспрессия генов медьтранспортных белков (СTR1, АТР7А и АТР7В), а также гена ЦП в отделах мозга Ag-крыс почти полностью подавляется, гена АРР – существенно снижается. При этом во всех отделах, включая гипофиз и гипоталамус, steady state уровень мРНК, кодирующих СОД1, СОД2 и Сox4i1, не меняется.

У Ag-крыс содержание иммунореактивных полипептидов СОД1 в цитозоле, полученном из клеток коры, мозжечка и гиппокампа, определенное методом иммуноблотинга, не меняется, как и активность этого фермента (рис. 5, вкладка). Эти результаты хорошо согласуются с данными ОТ-ПЦР анализа.

В отличие от контрольных животных, у Ag-крыс в МПМ обнаруживается белок СОД1, демонстрирующий ферментативную активность (рис. 6, вкладка).

Таким образом, дефицит церулоплазминовой меди в крови, к тому же практически полный в течение последней из четырех недель эксперимента, не влияет на содержание меди, железа и цинка в коре, мозжечке, гиппокампе и в миндалевидном теле взрослых крыс. При этом не меняется и уровень экспрессии генов внутриклеточных купроэнзимов. Однако распределение СОД1 у Ag-крыс отличается от такового у контрольных крыс: в то время как у контрольных крыс митохондриальная СОД1 едва определяется, у Ag-крыс она почти равномерно распределяется между цитозолем и митохондриями. Возможно, что у Ag-животных источником атомов меди для СОД1 становятся митохондрии, выполняющие роль депо меди у млекопитающих (Cobine et al., 2006).

Обращают на себя внимание изменения концентрации меди, железа и цинка в гипоталамо-гипофизарной системе. Они показывают, что снижение уровня образования ЦП в гипоталамусе, возможно, влияет на освобождение железа из клеток гипофиза. Интересно, что именно в гипоталамусе взрослых крыс не только самая высокая концентрация меди (табл. 1), но и самый высокий уровень экспрессии секреторного ЦП (рис. 2, вкладка) и АТР7В. В то же время в гипофизе уровень образования ГФИ-ЦП превышает таковой в других отделах мозга. Локальное резкое повышение концентрации железа в гипофизе, позволяет считать, что ЦП, синтезирующийся в этой системе, играет важную роль в экспорте железа. Понимание наблюдаемого эффекта требует дополнительных исследований.

Полученные данные показывают, что полный дефицит церулоплазминовой меди приводит к потере активности генов медьтранспортных белков, при этом ни концентрация меди, ни активность внутриклеточных купроэнзимов не меняются. Результаты позволяют предположить, что в клетках мозга существует система, сохраняющая ионы меди в условиях их общего дефицита и активность генов медьтранспортных белков регулируется поступлением меди в мозг.

3. Влияние AgCl на метаболизм меди в печени и мозгу крыс при эмбриональном типе метаболизма меди. Исследование проведено на печени и мозге 10-дневных крыс (обозначены – Ag(10)-крысы), вскармливаемых самкой, в корм которой с первого дня после родов добавляли AgCl. За эти 10 суток у взрослых Ag-крыс уровень оксидазного ЦП в крови снижается примерно в два раза.

В проведенном эксперименте центральными вопросами были:

1) поступает ли серебро в клетки молочной железы лактирующей крысы?

2) поступает ли серебро в молоко?

3) если да, то, как оно распределяется в организме Ag(10)-крыс?

4) изменяется ли метаболизм меди в печени и мозгу Ag(10)-крыс?

В качестве контроля использовали 10-дневных крыс, родившихся одновременно с крысами экспериментальной группы. Масса тела Ag(10)-крыс достигает 16.8±1.9 г (n=8). К этому же времени у контрольных животных она составляет 21.0±2.5 г (n=8). Разница в 25% оказалась незначимой. Животные обеих групп не отличались по показателям физического развития (появление шерстного покрова, вставание, вращение хвостом, отлипание ушной раковины). В печени и мозгу этих крыс были определены концентрация и внутриклеточная локализация ионов серебра и меди, измерены относительное содержание зрелых транскриптов генов медьтранспортных белков и купроэнзимов, а также их белковых продуктов. Исследование проводили на целом мозге. Все измерения у 10-дневных крыс повторены дважды. Каждый образец ткани, крови и мочи состоял из аликвот, взятых от трех животных. Таким образом, данные для новорожденных являются средними значениями для шести животных. В опыте участвовали только две взрослые крысы, взятые на 10-й день лактации: контрольная и получавшая с кормом AgCl с первого дня после родов.

Результаты, представленные на рисунке 7 (вкладка), показывают, что у вскармливающей самки, получавшей серебро в течение 10 дней, уровень оксидазного ЦП в крови снижается, а в кровотоке циркулирует неоксидазная форма ЦП. У Ag-крыс в крови появляется неоксидазная форма ЦП с большей подвижностью, чем холо-ЦП. Заметно снижается оксидазная активность и в сыворотке крови Ag(10)-крыс. При этом уровень иммунореактивного ЦП не меняется. В экстрактах содержимого желудков у Ag(10)-крыс, в отличие от контрольных 10-дневных крыс, оксидазный ЦП не обнаруживается. В то же время в них присутствует белок ЦП. В экстрактах содержимого желудков серебро выявляется в количестве почти в 40 раз превышающее фоновое. Это означает, что серебро поступает в молочную железу и, не влияя на уровень экспрессии гена ЦП, блокирует встраивание атомов меди в активные центры ЦП молока. Обращает на себя внимание тот факт, что в экстрактах содержимого желудков концентрация меди не снижается. Таким образом, серебро с молоком поступает в ЖКТ новорожденных. О том, всасывается ли оно из ЖКТ, судили по данным измерения его распределения в организме. Результаты показали, что у Ag(10)-крыс концентрация серебра в крови заметно выше фона, концентрация меди при этом не снижается. Ag(10)-крысы аккумулируют серебро в печени примерно в 10 раз интенсивнее, чем в мозгу. Однако накопление меди в печени, характерное для эмбрионального типа метаболизма меди, у Ag(10)-крыс не нарушается: у них, как и у контрольных 10-дневных крыс, концентрация меди в печени многократно превышает таковую у взрослых крыс. Это указывает на то, что при эмбриональном типе метаболизма меди в клетках печени существует особый путь для ее накопления. Ионы серебра не конкурируют с медью за транспорт по этому пути. В мозгу содержание меди у Ag(10)-крыс не меняется.

Профили распределения меди и серебра в клетках печени Ag(10)-крыс полностью совпадают (рис. 8). Оба элемента определяются в цитозоле, мембранах эндоплазматического ретикулума и в митохондриях. Данные ОТ-ПЦР анализа показали, что в печени Ag(10)-крыс активность генов медьтранспортных белков и купроэнзимов не меняется. В мозгу под действием пищевого серебра резко снижается относительная концентрация ЦП-мРНК. Уровень экспрессии других генов, взятых в рассмотрение, меняется мало. Это подтверждается и данными иммуноблотинга для CTR1 и СОД1 (рис. 9 и 10, вкладка).

 Распределение ионов серебра и меди в клеточных компратментах печени-17


Рис. 8. Распределение ионов серебра и меди в клеточных компратментах печени Ag(10)-крыс. Постъядерный супернатант гомогената печени анализировали методом изопикнического центрифугирования в ступенчатом градиенте концентраций сахарозы (см. Методы). По оси абсцисс – номер фракции градиента; по оси ординат – концентрация Ag и Cu, мкг/л.

Результаты этой части работы однозначно показывают, что атомы серебра абсорбируются в ЖКТ млекопитающих и переносятся по внеклеточным пространствам и внутри клетки по тому же пути, что и атомы меди. К тому же на всех этапах переноса во всех компартментах организма атомы серебра «упакованы» в молекулы таким образом, что они остаются в обменной форме. Способность ионов серебра создавать дефицит меди в крови без существенных изменений синтеза купроэнзимов может быть использована как средство снижения уровня меди при нейродегенеративных заболеваниях и в качестве средства для подавления роста опухолей, которые нуждаются de novo в большем количестве меди, ассоциированной с ЦП, чем нормальные клетки (Cohen et al., 1979; Linder et al., 1979; Campbell et al, 1981). Для разработки таких подходов необходимы дополнительные разносторонние исследования. В рамках такой задачи оценка метаболизма меди была проведена в мозгу крыс с индуцированным фибриллогенезом и у Min мышей.

3.3. Изменение метаболизма меди в мозгу крыс с экспериментально индуцированным фибриллогенезом. В этой части работы представлены результаты изучения уровня экспрессии генов медьтранспортных белков у крыс с экспериментально вызванным фибриллогенезом, МДАТ, путем прямого введения в мозг нейротоксического пептида -амилоида (см. раздел «Методы»). В отделах мозга крыс с МДАТ была измерена концентрация меди, железа и цинка. Результаты показали, что концентрация меди в коре, мозжечке и гиппокампе достоверно снижается. Резкое снижение концентрации меди происходит в гипофизе и в гипоталамусе. При этом концентрация железа в отделах мозга практически не меняется. В то же время в сосудистом сплетении многократно увеличивается удельное содержание и меди, и железа. Во всех отделах мозга, исключая миндалевидное тело и сосудистое сплетение, наблюдается значимое снижение концентрации цинка. Изменения концентрации d-элементов в мозгу крыс с МДАТ совпадают с изменениями их концентрации в отделах мозга пациентов с паталогоанатомически подтвержденным диагнозом БА (Andraisi et al., 2000).

Экспрессия генов медьтранспортных белков у крыс с МДАТ претерпевает драматические изменения. Так, ни в одном из исследуемых отделов мозга не удалось обнаружить мРНК, кодирующие ЦП, ГФИ-ЦП, АТР7А и АТР7В. На низком уровне сохраняется активность генов CTR1 и АРР. Анализ экспрессии этих генов был проведен и в печени этих животных. Результаты показали, что введение нейротоксического пептида в мозг не влияет ни на профиль, ни на уровень экспрессии генов медьтранспортных белков в печени (Федотова и др., 2006).

За период проведения эксперимента (21 день) содержание СОД2-мРНК практически не меняется, количество зрелых транскриптов гена СОД1 снижается только в гиппокампе. Уровень Cox4i1 снижается равномерно по отделам. Однако снижение мРНК купроэнзимов, в отличие от мРНК медьтранспортных белков, при индуцированном фибриллогенезе существенно менее значительное.

В коре, мозжечке и гиппокампе было измерено относительное содержание белка СОД1 и ее ферментативная активность (рис. 11, вкладка). Представленные результаты демонстрируют, что в отделах мозга полипептиды СОД1 синтезируются, однако, уровень активности цитозольной СОД1 во всех исследованных отделах мозга снижен. В МПМ, выделенном из митохондрий коры и мозжечка, активность СОД1 выявлена (рис. 11, вкладка).

Так как для болезни Альцгеймера характерным является снижение уровня ЦП и меди в мозгу (Klevay, 2008), можно предположить, что МДАТ является подходящей моделью для изучения определенных аспектов БА у человека.

3.4. Изменение метаболизма меди в опухолях. Для того чтобы оценить связь между обменом меди и опухолевым ростом, метаболизм меди был изучен у Min мышей. Мыши этой линии получены методом химического мутагенеза из линии C57BL/6J. Изменения вызваны мутацией в гене АРС (adenomatosis poliposis coli), кодирующем онкосупрессор, входящий в состав комплекса, формирование которого регулируется через Wnt-сигнальный путь. Гомозиготы Арс-/- не жизнеспособны. У 100% гетерозигот (мыши АрсMin, Min мыши), выращенных на рационе, богатом жирами, на всем протяжении кишечного тракта развивается до 30 и более аденом. Процесс начинается с 60-дневного возраста с роста аденом, на поздних сроках появляются аденокарциномы, но образование метастазов не отмечено. Эти мыши живут примерно 120 дней. Эксперименты проводили на образцах печени, стенки кишечника и аденомах, полученных от 70-дневных Min мышей. В качестве контроля использовали мышей линии C57BL/6J того же возраста. В опыте участвовали 3 контрольные мыши и 6 Min мышей. ЦП сыворотки крови выявляли в геле окрашиванием орто-дианизидином, проявившиеся зоны анализировали с помощью программы “Scion Image”. Результаты показывают (рис. 12, А и В, вкладка), что у Min мышей содержание ЦП в крови увеличивается на 50% (Р<0.05). По данным ОТ-ПЦР анализа (рис. 12, С, вкладка) в печени Min мышей активность гена ЦП примерно в три раза выше, чем в печени контрольных мышей. Более того, относительная концентрация АТР7В-мРНК и CTR1-мРНК также достоверно выше. Помимо этого, в клетках печени Min мышей мы наблюдали экспрессию АТР7А и ГФИ-ЦП. Ген АТР7А в культивируемых гепатоцитах (линия HepG2) не экспрессируется, не образуется в них и ГФИ-форма ЦП-мРНК. При ОТ-ПЦР анализе РНК, полученной из ткани печени эти две мРНК, как правило, выявляются в небольших количествах. Это объясняют тем, что печень, помимо гепатоцитов, содержит клетки, экспрессирующие эти мРНК (например, купферовские клетки, клетки эндотелия). В нашем случае относительное количество мРНК ГФИ-ЦП и АТР7А, определяемое в печени Min мышей, нельзя отнести к загрязнению. В составе тотальной РНК, выделенной из клеток кишечного эндотелия и аденом, продуктов экспрессии генов ЦП и АТР7В не найдено. В некоторых препаратах выявлялись следы АТР7А. В то же время во всех этих тканях эффективно экспрессируются ген CTR1. При этом уровень экспрессии этого гена повышается в ряду дикий типMin мышиаденомы (рис. 13). Представленные результаты позволяют считать, что Min мыши являются подходящей моделью для изучения механизмов, влияющих на активацию генов метаболизма меди в печени при росте опухолей различной локализации. Такие данные могут быть ценными для понимания транс-регуляции экспрессии гена ЦП и помогут понять феномен повышения содержания ЦП в крови млекопитающих

 Экспрессия гена CTR1 в клетках кишечника мышей. По оси абсцисс:-18

Рис. 13. Экспрессия гена CTR1 в клетках кишечника мышей. По оси абсцисс: относительные единицы.

при развитии опухолей и научно обоснованно использовать этот показатель в качестве биомаркера для оценки роста опухоли.

ВЫВОДЫ

1. В мозгу крыс в течение развития происходят регион-специфические изменения распределения меди. Параллельно происходит смена профилей экспрессирующихся генов медьтранспортных белков: у новорожденных из двух медьтранспортных АТФаз преимущественно экспрессируется АТФаза Менкеса, у взрослых в мозгу активируется ген, кодирующий АТФазу Вильсона. Из двух сплайс-форм мРНК церулоплазмина у новорожденных преимущественно формируется мРНК, кодирующая секреторную форму ЦП, у взрослых – мРНК, кодирующая мембранную изоформу (ГФИ-ЦП). Это позволяет определить метаболизм меди в мозгу новорожденных как эмбриональный тип, смена которого на взрослый происходит в разных отделах мозга не одновременно.

2. У Ag-крыс наблюдается накопление серебра и изменение концентрации меди, железа и цинка только в гипоталамо-гипофизарной системе. На фоне дефицита церулоплазминовой меди в крови активность генов медьтранспортных белков в клетках мозга снижается, уровень экспрессии внутриклеточных купроэнзимов не меняется.

3. У новорожденных крыс ионы серебра поступают в организм с молоком и аккумулируются в печени в тех же компартментах, где накапливается медь. У животных снижается оксидазная активность ЦП крови, но не меняется уровень экспрессии гена этого белка в печени. В мозгу относительная концентрация мРНК, кодирующей секреторный ЦП, падает.

4. Фибриллогенез, индуцированный введением в мозг фрагмента нейротоксического пептида -амилоида, вызывает в клетках нервной ткани снижение концентрации меди и цинка. При этом экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов падает. В печени экспрессия генов медьтранспортных белков и купроэнзимов у этих животных не меняется.

5. Изменения метаболизма меди в сосудистом сплетении в течение развития отличаются от изменений в других рассмотренных отделах мозга и сходны с таковыми в печени при смене эмбрионального типа метаболизма меди на взрослый. У МДАТ-крыс в сосудистом сплетении не происходит снижения концентрации меди и цинка. Отличия метаболизма меди в клетках сосудистого сплетения по сравнению с клетками нервной ткани, вероятно, связаны с мезенхимальным происхождением этого отдела.

6. При дефиците меди в сыворотке крови (Ag-крысы) и нарушении обмена меди (МДАТ-крысы) цитозольная апо-СОД перемещается в митохондрии и переходит там в холо-форму. При этом, по-видимому, в качестве источника меди используется митохондриальный пул меди.

7. Рост аденом у мышей линии ApcMin сопровождается повышением уровня и изменением профиля экспрессии генов медьтранспортных белков в печени. Повышается уровень экспрессии гена CTR1 в тканях кишечника и аденомах.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Клотченко С. А., Цымбаленко Н. В., Соловьёв К. В., Скворцов А. Н., Затуловский Е. А., Бабич П. С., Платонова Н. А., Шавловский М. М., Пучкова Л. В., Броджини М. Влияние ионов серебра на метаболизм меди и экспрессию генов медьтранспортных белков в печени крыс // Доклады Академии Наук, 418 (4): 549—552, 2008.

2. Platonova N., Scotti M., Babich P., Bertoli G., Mento G., Meneghini V., Egeo A., Zucchi I. Merlo G.R. TBX3, the gene mutated in ulnar-mammary syndrome, promotes growth of mammary epithelial cells via repression of p19ARF, independently of p53 // Cell Tissue Res. 328(2): 301-316, 2007.

3. Федотова Ю. О., Бабич П. С., Платонова Н. А., Клотченко С. А., Цымбаленко Н. В., Пучкова Л. В., Сапронов Н. С. Экспрессия медьтранспортных генов в мозге крыс при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа // Доклады Академии Наук, 409 (4): 555—558, 2006.

4. Бабич П.С., Цымбаленко Н.В., Пучкова Л.В. Онтогенетические изменения активности генов медьтранспортных белков и купроэнзимов в отделах мозга крыс. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 736.

5. Цымбаленко Н.В., Клотченко С.А., Затуловский Е.А., Скворцов А.Н., Бабич П.С., Шавловский М.М., Пучкова Л.В. Влияние ионов Ag на метаболизм Cu и синтез купроэнзимов у крыс. Сборник материалов IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 г., Новосибирск. С. 510.

6. Babich P., Platonova N., Tsymbalenko N., Puchkova L. Brain-region specific copper metabolism in rats with copper deficiency induced by Ag-ions. European Journal of Human Genetics, 2008, V. 16, sup. 2, pp. 139-140. (EHG, conference, Barselona, Spain, 2008).

7. Zatulovskiy E.A., Skvortsov A.N. Tsymbalenko N.V., Babich P.S., Ilyeichyova E.Yu., Shavlovsky M.M., Broggini M., Puchkova L.V. The model to study effects of blood serum copper deficiency on d-element metabolism in liver and brain of rodents. Abstract book of 38th International Conference on Coordination Chemistry, Jerusalem, Israel, July, 2008, P. 310.

8. Бабич П.С. Пучкова Л.В., Мутанен М. Метаболизм меди в печени и эпителии кишечника у Min-мышей до и после развития аденом. Сборник материалов 12-й Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века», 2007 Пущино.

9. Бабич П. С., Федотова Ю. О., Клотченко С. А., Платонова Н. А. Изменение метаболизма меди при экспериментальной деменции альцгеймеровского типа. Сборник материалов 10-й Пущинской школы-конференции молодых учёных «Биология — наука XXI века», Пущино, 17—21.05.2006, с. 65—66.

10. Babich P. Fedotova J.O. Copper transporting genes expression in bran regions of the rats with experimental dementia of Alzheimer’s type. 17th European Students Conference, Berlin, Germany, October 8–12, 2006, book of abstracts, p. 4.

Работа поддержана грантами РФФИ № 03-04-48748 и № 06-04-49786, III Итальянской правительственной программой совместных научных программ Италия-Россия № 10-RB18; стипендией CIMO (Central for International Mobility, Финляндия) NTM-07-4748/WC10; а также грантами правительства Санкт-Петербурга (2007 и 2008 гг.).

Polina S. Babich

Summary of the PhD-thesis “Copper metabolism in the rat brain at the different states” (carried out at the Department of Molecular Genetics, Research Institute of the experimental medicine, and at the chair of Biophysics of St.-Petersburg State Polytechnic University, St.-Petersburg, and at the Department of Applied Chemistry and Macrobiology in University of Helsinki, Helsinki, Finland)

Background. Copper is necessary for mammals at all developmental period, since it is present in the active centers of vitally important enzymes. Simultaneously, copper ions have toxic effect because they initiate oxidation of various biomolecules. Copper deficiency during development has a long-term effect on central nervous system activity, while excess of copper can lead to severe diseases. The planning of the work is based on our data which were obtained previously. It was shown that concentrations of copper and ceruloplasmin (Cp) rise up to 7 times in cerebrospinal fluid (CSF) in rats fed with baby formula. Others in vitro shown that cultured neurons loss iron ions and their membranes undergo the depolarization if medium Cp concentration is higher than it is in CSF. It is possible that abnormalities in brain copper balance in newborns can be result in long term effects on central nervous system function. However there are not clear data on copper metabolism in bran of the newborns as well as on connection between different states of organism and copper metabolism in brain.

The present study aimed to clarify connection between physiological states and copper metabolism.

The animal models. The work is performed on the four animal models:

1) Newborn and adult rats – models of embryonic and adult types of copper metabolism;

2) Adult rats consumed AgCl with feeder during 4 weeks – model of copper deficiency in blood serum (Ag-rats); bonus model – newborn rats fed by milk from Ag-rat;

3) Rats with fibrillogenesis induced by administration of the neurotoxic fragment of -amiloid into ventricle of brain – model of dementia of Alzheimer’s type (MDAT-rats);

4) ApcMin mice – model of cancer development.

Investigation was done for cortex, cerebellum, hippocampus, amygdaloidal body, hypophysis, hypothalamus, choroid plexus, liver, blood serum, and CSF.

Methods. Activity of genes was estimated by semiquantitative RT-PCR-analysis. The copper transporting genes (CTR1, АТР7А, АТР7В, APP), extracellular cuproenzymes (Cp, GPI-Cp), and intracellular cuproenzymes (SOD1 and COX (Cox4i1)) were analyzed. Relative level of Cp, CTR1, and SOD1 proteins were estimated by immunoblotting analysis. Enzymatic activity of Cp and SOD1 were measured by “in-gel” assay. Cp concentration was fixed by rocket immunoelectrophoresis. Subcellular fractions were isolated by equilibrium ultracentrifugation. Mitochondrial intermembranous space was obtained using swelling-shrinking-freezing-thaw procedure. Concentrations of Cu, Fe, Zn and Ag in tissues and fluids were measured by atomic absorptive spectrometry Data are expressed as means ±S.D. Statistical comparisons were made using Student’s t-test. Differences were considered significant at P<0.05.

Results. Copper concentration was measured in brain of 5-, 10-, 20-, 30-, and 120-day-old rats. Each group contained 5 animals. The data shown, that during this time copper concentration rises in cortex, cerebellum, and hippocampus; doesn’t change in hypophysis, and reduces in hypothalamus. Cu-transporting gene profiles also had been changed during development. So ATP7A has been expressing in brain of newborns mainly, and its expression level increases in adult brain. Alternatively, ATP7B gene is much more active in brain of adult animals. A splice-form mRNA of secretory Cp is typical for brain departments in newborns mainly. On the contrary Cp-mRNA isoform coding GPI-Cp is prevalent for brain of adult rats. Also during development the concentration of the intracellular cuproenzymes increases in all brain regions. Thus copper metabolism in brain of newborn rats is different with it in adult ones as well as copper metabolism in liver. Perhaps, it could be definite as embryonic type of copper metabolism in brain.

It is known that consuming of Ag salts with feeder results in drop of copper concentration in plasma, and simultaneously silver accumulates in liver. Using this model we shown that Cp, CTR1, ATP7A/B genes expression are don’t change in liver of Ag-rats. In brain, silver is accumulated by hypothalamus-hypophysis system only. Here copper concentration decreases, and iron increases. Zinc concentration doesn’t change. Cu-transporting genes activity is decreased in Ag-rats brain, but expression of Cu-enzymes genes doesn’t change.

In next experiments the model “Dam-rat treated with AgCl feeds the newborns during 10 days” was used (Ag(10)-rats). It was shown that Ag is transferred with milk into gastro-intestinal tract of newborns, absorbed, and accumulated by liver. In liver of Ag(10)-rats silver distributes within the same compartments which accumulate Cu, exactly. Besides these animals have low level of Cp oxidative activity in blood serum, but expression profile of Cp gene and copper transporting genes weren’t changed in liver of them. In their brain, Cp gene activity is suppressed. Expression of intracellular cuproenzymes didn’t change.

We found that concentration of copper and zinc is decreased in MDAT-rats within all investigated regions of brain, excluding choroids plexus. Expression of Cu-transporting genes is decreased in the brain of MDAT animals as well as Cu-enzymes expression. In the same time expression of examined genes doesn’t change in liver.

When copper turnover is disturbance (Ag- and MDAT-rats), apo-SOD1 passes to mitochondria, and turns into holo-enzyme herein. The same process described for yeast, where mitochondria maintain a pool of copper.

It is well known that tumor growth is accompanied by blood Cp level increasing. But data on nature of this phenomenon are absent. However it could be suggest that tumor growth could be regulated by copper status in organism. To carry out the approaches to check this assumption we studied copper transporting genes expression in ApcMin-mice. It was shown that the growing of adenomas entails the increasing of expression level of Cu-transporting genes (CTR1, ATP7B, and Cp) and activation of ATP7A gene in liver. At the same time CTR1 expression increases for about 30% in non-malignant intestines and near up to 2 times in adenomas in Min-mice.

Список сокращений, использованных в тексте автореферата

APP предшественник -амилоидного белка

ATP7A АТФаза Менкеса

ATP7B АТФаза Вильсона

COX цитохром-с-оксидаза

CTR1 транспортер меди 1

Cu-ATPазы медьтранспортные АТФазы

PBS солевой буфер

SDS додецил сульфат натрия

TBE трис-боратный буфер

TE трис-ЭДТА буфер

а.о. аминокислотный остаток

АФК активные формы кислорода

ГФИ гликозилфосфатидил инозитоловый якорь

ЖКТ желудочно-кишечный тракт

МДАТ модель деменции альцгеймеровского типа

МПМ межмембранное пространство митохондрий

МТ металлотионеин

СМЖ спинномозговая жидкость

СОД1 Cu,Zn-супероксиддисмутаза

СОД2 Mn-супероксиддисмутаза

ЦНС центральная нервная система

ЦП церулоплазмин



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.