WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Роль эндогенных и микробных фитаз в процессе получения и сбраживания ржаного сусла

На правах рукописи

ЖУЛЬКОВ АНДРЕЙ ЮРЬЕВИЧ








Роль эндогенных и микробных фитаз

в процессе получения и сбраживания ржаного сусла



Специальность: 03.00.04 – Биохимия






АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата технических наук



Москва 2009


Диссертационная работа выполнена на кафедре «Биохимия и зерноведение»

ГОУ ВПО «Московский государственный университет пищевых производств»

Научный руководитель: – доктор технических наук,

профессор

Карпиленко Геннадий Петрович

Официальные оппоненты: – доктор технических наук,

профессор

Траубенберг Светлана Евгеньевна


– кандидат биологических наук,

доцент

Шатилова Татьяна Ивановна



Ведущая организация: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН





Защита состоится «__» декабря 2009 г. в __ часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.212.148.07 при ГОУВПО «Московский государственный университет пищевых производств» по адресу: 125080, Москва, Волоколамское шоссе, д.11, ауд.____, корпус ___.

Автореферат размещен на сайте www.mgupp.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО МГУПП.

Отзывы на автореферат, заверенные печатью учреждения, просим направлять ученому секретарю Совета.

Автореферат разослан «___ » ___________ 2009 г.

Ученый секретарь Совета

д.т.н., ст. н.с. Богатырева Т.Г

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы

Рожь, наряду с пшеницей, является основным сырьем, перерабатываемым на этиловый спирт. Она из-за проблем, связанных с получением в ряде случаев вязких технологических сред относится к трудно перерабатываемому сырью. Вместе с тем, рожь имеет, по сравнению с пшеницей, такие особенности биохимического состава, в частности, активный комплекс собственных ферментов, которые при определенных условиях можно рассматривать как позитивные.

Однако, существующие технологические режимы низкотемпературных механико-ферментативных схем переработки сырья, внедренные на отечественных спиртовых заводах, в должной степени не используют этот факт.

Известно, что кроме активных амилаз, протеаз, рожь обладает и фитазной активностью. Применение фитазы, как эндогенной, так и микробной приводит к разложению зернового фитина, который представляет собой смесь кальциевых и магниевых солей фитиновой кислоты и является преобладающей формой накопления фосфора в зерне.

Продукты гидролиза фитина – инозит и фосфорная кислота имеют большое технологическое значение для спиртового производства. Неорганические фосфаты, проявляют свое действие при стерилизации, сохраняя сахара в слабокислых условиях и при брожении, стабилизируя кислотность бражек. Фосфор необходим для роста и развития дрожжевых клеток. Гидролиз фитина способствует снижению расхода ферментных препаратов, так как фитин зернового сырья выступает как ингибитор многих ферментов. Кроме того он позволяет высвободить ценные микроэлементы, такие как кальций, цинк, магний и др.

Процесс гидролиза фитина может быть осуществлен под действием как эндогенных, так и микробных фитаз. Следует отметить, что в настоящее время исследователи проявляют значительный интерес к поиску микроорганизмов – продуцентов фитаз. О применении микробных фитаз в промышленных условиях в нашей стране говорить пока рано, однако, разработки зарубежных ученых свидетельствуют о перспективности их использования.

Выше изложенное свидетельствует о том, что исследования, посвященные разработке научных основ технологии этанола из зерна ржи, базирующейся на изучении данных о распределении фитина в зерне ржи и его гидролиза под действием эндогенных и микробных фитаз, являются актуальными и перспективными.

1.2. Цели и задачи исследования

Целью данной работы является исследование биотехнологических процессов деструкции фитина зерна ржи под действием эндогенной и микробной фитазы и выявлении их роли в процессах получения и сбраживания ржаного сусла.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие задачи:

– охарактеризовать фитазный комплекс фуражного зерна ржи и его фракций;

– разработать схему выделения и очистки фитазы из фракции шелухи зерна ржи;

– изучить действие зерновой и микробной фитазы на стандартном и зерновом субстрате;

– разработать процессуальную схему получения ржаного сусла с использованием фитаз, на основе дифференцированного способа переработки зерна;

– исследовать процесс получения ржаного сусла с использованием фитаз;

– исследовать процесс сбраживания ржаного сусла, полученного с

использованием зерновой и микробной фитаз;

– выявить влияние действия фитаз на содержание этилового спирта и летучих примесей в бражке.

1.3. Научная новизна

Впервые проведено комплексное исследование по изучению фитазного комплекса сырья спиртового производства и выявлена роль эндогенной и микробной фитаз в технологии этанола из зерна ржи.

Разработана схема выделения и очистки зерновой фитазы. Получен препарат фитазы из зерна ржи со степенью очистки 105 раз. Определены оптимумы рН и температуры при действии эндогенной и микробной фитаз на стандартном и зерновом субстрате.

На основе изучения кинетики гидролиза фитина фракции шелухи зерна ржи, научно обоснована эффективность процесса получения ржаного сусла, предусматривающего дифференцированный способ переработки зерна.

В результате проведения модельных опытов установлено, что среди ряда факторов, зависящих от гидролиза фитина и влияющих на процесс сбраживания ржаного сусла, основным является ингибирующее действие фитина на ферменты ржи, ферментных препаратов и спиртовых дрожжей.

Впервые выявлено влияние качественных показателей ржаного сусла, полученного с использованием эндогенной и микробной фитаз, на процесс его сбраживания, содержание этанола и летучих примесей в зрелой бражке, в зависимости от используемой расы спиртовых дрожжей.

1.4. Практическая значимость

Данные, полученные в ходе проведения экспериментов, позволяют рационально использовать сырье и микробные ферментные препараты с активной фитазой в технологии этанола.

Предложенный дифференцированный способ переработки зерна ржи дает возможность эффективно гидролизовать фитин сырья и повысить качественные характеристики осахаренного сусла.

Рекомендуемые режимы и стадия внесения микробной фитазы позволяет интенсифицировать процесс сбраживания, увеличить выход спирта, при одновременном снижении летучих примесей в бражке.

1.5. Апробация работы

Материалы диссертации представлены на V и VI Научно-практических конференциях с международным участием «Высокоэффективные технологии, методы и средства их реализации» (Москва, 2007г., 2008г.); VІI Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств» (Могилев, 2009г.).

1.6. Публикации

По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в т.ч. 4 публикации в научных журналах рекомендованных ВАК.

1.7. Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов и библиографии, включающей 192 источника. Работа изложена на 165 страницах, содержит 23 таблицы и 34 рисунка.

2. Обзор литературы

В обзоре литературы обобщены сведения о строении и биохимическом составе зерна ржи, а также об особенностях его переработки в спиртовом производстве. Дана характеристика ферментативного комплекса зерна ржи и ферментных препаратов, применяемых в технологии этанола. Основное внимание уделено фитазам – ферментам, гидролизующих фитин. Рассмотрены вопросы, касающиеся влияния состава сусла на эффективность процесса его сбраживания.

3. Экспериментальная часть

3.1. Материалы и методы исследования

В работе использовали фуражное зерно ржи, полученное со спиртового завода ОАО «Алвист» (Тверская область).

Ферментные препараты:

  • Термамил – термоустойчивая бактериальная -амилаза (Novozymes);
  • Коверзим – глюкоамилаза (Ende Industries);
        • Кормофит – микробная фитаза, продуцируемая грибной культурой Penicillium canescens (Россия)
  • Спиртовые дрожжи: S. cerevisiae раса XII, сухие дрожжи «Angel» (Китай) и «Фермиол» (США).

Показатели качества зерна ржи определяли в соответствии с ГОСТами. Содержание водорастворимого белка определяли по методу Лоури (Lowry et. al., 1951); аминный азот – методом формольного титрования, активность фитазы – колориметрическим методом (Синицин и др., 2006), в качестве стандартного субстрата использовали рисовый фитин (Sigma, США). Гель-хроматографию проводили с использованием геля Toyoperl HW-55F.

Бродильную активность дрожжей определяли весовым методом, содержание растворимых сухих веществ, кислотность и рН сусла – общепринятыми в спиртовой промышленности методами. Концентрацию спирта и действительного экстракта в зрелой бражке осуществляли дистилляционным методом. Определение побочных продуктов брожения проводили методом газовой хроматографии согласно ГОСТ 30536-97, с использованием газового хроматографа HP-FFAP (США).

3.2. Исследование фитазного комплекса зерна ржи

С целью прогнозирования режимных параметров процесса переработки зерна ржи, направленных на эффективный гидролиз фитина сырья необходимо было на первом этапе работы определить общее содержание данного компонента в зерна и его распределение в зерновке.

В качестве объектов исследования использовали помол ржи, а также фракции периферических частей зерна, которые получали двумя способами:

– рассевом помола с выделением крупки;

– последовательным снятием с зерновки внешних оболочек с получением образцов шелухи.

Установлено (табл. 1), что максимальное количество фитина содержится в образце Шелуха III (15% снятия). В данной фракции концентрируется около 90% от общего количества фитина сырья.

Таблица 1 – Содержание зольных соединений и фитина в зерне и

его периферических частях

Сырье Массовая доля фракции, % Массовая доля, % на с. в. Процент от исходного в зерне, %
Зола Фитин Зола Фитин
Зерно 100 1,20 0,40 100 100
Крупка 15 1,97 1,43 24,6 53,6
Шелуха I 5 6,20 0,76 25,8 9,5
Шелуха II 10 4,72 1,39 39,3 34,8
Шелуха III 15 4,39 2,32 54,9 87,0
Шелуха IV 20 2,95 1,80 49,2 90,0

Далее в работе была определена фитазная активность зерна ржи и его периферических частей (табл. 2).

Таблица 2 – Фитазная активность зерна ржи и его периферических частей

Сырье Фитазная активность
FTU, ед/г сырья FTU ед/г фитина сырья
Зерно 0,03 7,50
Крупка 0,08 5,61
Шелуха I
Шелуха II 0,06 4,29
Шелуха III 0,19 8,33
Шелуха IV 0,14 8,06

Установлено, что фитазная активность в образцах шелухи в первую очередь определяется процентом снятия наружных частей зерна. Так в образце Шелуха I (5% снятия) фитазная активность практически не определяется. Максимальная активность фитазы выявлена в образце Шелуха III (15% снятия), она превышает активность в целом зерне более чем в 6 раз. Именно поэтому данный образец использован для выделения зерновой фитазы.

3.3. Выделение и очистка фитазы из оболочек зерна ржи

Разработанная схема выделения и очистки фитазы ржи включала следующие этапы: экстракцию водой в соотношении 1 : 10, ступенчатое осаждение сульфатом аммония, гель-хроматографию на колонке с TSK- gel Toyopearl HW – 55F.

На рисунке 1 представлены данные по гель-хроматографии белковой фракции, полученной осаждением сульфатом аммония от 40 до 60% насыщения. Из шести основных фракций фитазная активность обнаруживается лишь в одной – 18 фракция (II пик), выходящей с объемом элюции 76 мл, что соответствует 80000 Да.

 ракционирование зерновой фитазы методом гель-хроматографии На-0

Рисунок 1 Фракционирование зерновой фитазы методом гель-хроматографии

На рисунке 2 приведена схема выделения и очистки фитазы ржи, по которой был получен препарат фитазы из зерна ржи со степенью очистки 105 раз (табл. 3).

Таблица 3 – Очистка фитазы из зерна ржи

Этап Белок по Лоури, мг/мл Фитазная активность Удельная активность, ед/мг белка Степень очистки
[РО4 3], г/л
1. Экстракция Н2О 0,077 0,075 0,97 1
2. Осаждение (NH4)2SO4 40 - 60% насыщения 0,041 0,280 6,83 7,04
3. Гель-хроматография на колонке c TSK-gel Toyopearl HW-55F 0,018 1,84 102,3 105,3

 хема выделения и очистки препарата фитазы из зерна ржи -1

Рисунок 2 Схема выделения и очистки препарата фитазы из зерна ржи

Экспериментально установлено, что фитаза ржи имеет оптимум рН 4,5 – 5,0, как при действии на стандартном субстрате, так и зерновой смеси. Подкисление затора до рН 3,0, либо проведение процесса при естественном рН замеса 6,3 снижает уровень фитазной активности до 40%. Температурный оптимум составляет 40-450С. Температура 65-700С – вторая основная пауза механико-ферментативного способа обработки сырья характеризуется активностью фитазы на зерновом субстрате на уровне 40-50% от максимальной, на стандартном – снижается до остаточной 5-10%. Прогрев замеса при температуре выше 700С приводит почти к полной инактивации фитазы ржи.

    1. Характеристика ферментного препарата фитазы микробного происхождения

Ферментный препарат фитазы под названием Кормофит, разработан учеными РАН и используется как кормовая добавка к сухим кормам. Помимо фитазы, продуцируемой грибной культурой Penicillium canescens, препарат содержит карбогидразы – ферменты, расщепляющие полисахариды, такие как целлюлоза, -глюканы, ксиланы, гемицеллюлозы, декстрозы.

Методом гель-хроматографии на колонке c TSK-gel Toyopearl HW-55 была определена молекулярная масса микробной фитазы, которая составила 12000 23000 Да.

При изучении влияния рН на активность исследуемого препарата Кормофит установлено, что оптимум рН при гидролизе фитина зернового субстрата сдвигается в кислую область относительно стандартного субстрата и соответствует рН 4,5 – 5,0, в то время как на стандартном имеет значение оптимума 5,5.

Также можно отметить, что в целом расширяется диапазон рН, при котором Кормофит работает достаточно активно. При рН 4,0 и 6,0 на зерновом субстрате активность составляет около 80% от максимальной (рис. 3).

 лияние рН на активность ферментного препарата Кормофит При-2

Рисунок 3 Влияние рН на активность ферментного препарата Кормофит

При исследовании влияния температуры (рис. 4) на активность ферментного препарата Кормофит установлено, что температурный оптимум при действии на стандартный субстрат имеет четко выраженный пик при 45°С. Снижение температуры до 35°С и увеличение ее до 55°С сопровождается уменьшением фитазной активности соответственно до 70% и 50%.

Исследование влияния температуры на активность препарата, проведенное на зерновом субстрате, показало, что оптимум температуры сдвигается в область более высоких температур, также расширяется диапазон варьирования температур, при которых Кормофит проявляет достаточно высокую активность.

 лияние температуры на активность ферментного препарата Кормофит-3

Рисунок 4 Влияние температуры на активность ферментного

препарата Кормофит

3.5. Получение ржаного сусла с использованием зерновой фитазы

Получение ржаного сусла проводили по механико-ферментативному способу (режим Регламента). В соответствии с ним измельченное зерно поступает в смеситель, куда подают воду в соотношении 1:3 (1:4) и -амилазу. Замес выдерживают при температуре около 500С в течение 20-30 мин (первая пауза). Затем его быстро нагревают до 70-750С и выдерживают в течение 120-150 мин. (вторая пауза) при постоянном перемешивании. Далее готовый замес подогревают до 95-980С и выдерживают в непрерывном потоке при перемешивании в течение 90-120 мин (третья пауза).

Общая продолжительность водно-тепловой обработки замеса составляет 3-4 часа. Ферментные препараты дозируются в зависимости от их активности на 1 г. условного крахмала: 1,5-2,0 ед. АС (либо 0,2-0,4 ед. АС при использовании термостабильных препаратов) и 6,0-6,5 ед. ГлС на стадию осахаривания (четвертая пауза), которая протекает при температуре 56-580С в течение 30 мин.

Данная технологическая схема использована в качестве базовой для разработки режимов получения сусла из ржи с участием собственных ферментов зерна, в частности фитазы. Для этого снижена температура обработки замеса на первой паузе с 500С до 40–450С, так как данный температурный интервал является, как установлено, оптимальным для действия зерновой фитазы и увеличена ее продолжительность с 30 мин до 2-х часов.

Кроме того, в работе исследовано влияние исходной активной кислотности замеса на процесс получения сусла из зерна ржи.

Установлено (табл. 4), что предложенное изменение режима не оказывает влияния на активную кислотность сусла. Вероятно, ферментативный гидролиз фитина сырья под действием собственных фитаз ржи при данном способе получения сусла протекает слабо. Причиной тому может быть недостаточная фитазная активность ржи, равная, в зависимости от партии зерна ржи, 0,03-0,04 ед. FTU/г зерна и незначительная концентрация фитина в перерабатываемом сырье, а также его реологические характеристики. Известно, что ржаные замесы обладают повышенной вязкостью.

Таблица 4 – Влияние продолжительности обработки замеса на активную и титруемую кислотность сусла

Время обработки замеса, при 40-450С, мин рН сусла Кислотность сусла, град.
30 6,3 0,23
60 6,1 0,25
120 6,2 0,28
180 6,2 0,30

Альтернативным вариантом получения сусла может быть выделение фракции из зерна, в которой сосредоточены фитин и фитаза ржи и ее предварительная обработка. Ранее установлено, что дифференцированная переработка зерна является эффективным способом в спиртовой отрасли.

Принципиальная процессуальная схема предлагаемого способа переработки зерна ржи приведена на рисунке 5. Она включает в себя стадию шелушения зерна и обработку шелухи в смеси с водой, в том числе с подкислением до рН 5,0, и обработкой при t=40-450С. Дифференцированный способ переработки ржи позволяет, во-первых, повысить уровень фитазной активности в расчете на 1 г сырья до 0,20-0,25 ед. FTU; во-вторых, сократить затраты, связанные с использованием серной кислоты, вносимой для подкисления и создания оптимального уровня рН для действия фитазы ржи; в-третьих, такое техническое решение дает возможность сохранить или снизить незначительно рН всего замеса, что в свою очередь, определяет эффективность гидролиза крахмала термостабильной -амилазой препарата Термамил, имеющей оптимум рН в нейтральной зоне.

Зерно ржи

Шелушение (15%)

Фракция шелухи Фракция эндосперма

Вода

Н2SO4

обработка смеси одноступенчатое дробление

при t=40-450С, рН 5,0-5,2

Помол

Вода

-амилаза

Замес

Водно-тепловая и ферментативная обработка

Разваренная масса

глюкоамилаза

Осахаренное сусло

Рисунок 5 Процессуальная схема получения ржаного сусла на основе дифференцированного способа переработки зерна

В работе были получены и проанализированы по основным показателям качества следующие образцы осахаренного сусла.

Контроль I – режим получения сусла из исходного зерна ржи по Регламенту.

Контроль II – режим получения сусла из исходного зерна ржи по Регламенту с измененной первой паузой (t=40-450С, Т=3 часа).

Опыт I – предлагаемый способ с выделением 15% шелухи, ее смешиванием с водой при гидромодуле 1 : 10 и обработкой при естественном рН замеса в течение 3-х часов при t=40-450С, вводом обработанного затора из шелухи в смесь измельченной фракции эндосперма с водой и дальнейшем проведением процесса по режиму Регламента.

Опыт II – процесс вели аналогично Опыту I, но с подкислением замеса из шелухи до рН 5,0.

Опыт III – вели аналогично Опыту II с увеличением продолжительности обработки шелухи до 10-ти часов.

Сравнительная характеристика образцов осахаренного сусла, приведенная в таблице 5, показывает, что дифференцированная подготовка сырья улучшает технологические показатели сусла: повышается массовая доля сухих веществ в среднем на 0,9-2,1%, сбраживаемых углеводов на 0,9-2,0%, растет видимая доброкачественность сусла.

Лучшим является Опыт III, в котором на стадии обработки шелухи смесь подкисляли до рН 5,0 (оптимум для действия фитазы ржи) и увеличивали продолжительность выдержки до 10-ти часов.

Таблица 5 – Сравнительная характеристика образцов осахаренного сусла

Показатели Вариант получения сусла
Контроль I Контроль II Опыт I Опыт II Опыт III
Массовая доля сухих веществ, % 14,2 14,8 15,1 15,9 16,3
Массовая доля сбраживаемых углеводов, % 10,9 11,4 11,8 12,5 12,9
Массовая доля сахаров, % 4,9 5,5 4,9 5,2 6,5
Массовая доля аминного азота, % 0,061 0,074 0,055 0,055 0,079
Титруемая кислотность, град. 0,18 0,24 0,19 0,20 0,25
Видимая доброкачественность, % 76,7 77,0 78,1 78,6 79,1
    1. Получение сусла с использованием микробной фитазы

В связи с длительностью процесса гидролиза фитина зерна ржи под действием эндогенных фитаз в работе исследовали возможность ускорения стадии предобработки фракции шелухи путем использования микробных фитаз.. Норма внесения препарата Кормофит составила 0,2 ед.FTU/г шелухи или 0,03 ед.FTU/г зерна; гидромодуль: сырье : вода варьировался в пределах от 1 : 4 до 1 : 10. Процесс гидролиза проводили при температуре 40 – 45 0С, рН 5,0 – 5,2.

Анализ данных, представленных на рисунке 6, позволяет сделать следующие выводы:

  1. Дополнительное внесение в смесь шелухи с водой микробной фитазы в рекомендуемой дозировке интенсифицирует процесс гидролиза фитина ржи. При равном гидромодуле (1 : 10) в контрольном образце степень гидролиза фитина через 6 часов составляет около 40%, тогда как в опытном уже через 2 часа превышает 80%.
  2. Снижение гидромодуля замедляет процесс деструкции фитина ржи. Вероятнее всего, данный факт может быть связан с высокой вязкостью проб, полученных при низком гидромодуле.
  3. Оптимальными условиями протекания процесса предобработки фракции шелухи на основе гидролиза фитина ржи под действием эндогенной и микробной фитаз являются : гидромодуль 1 : 8 1 : 10; продолжительность – 2-3 часа.

 идролиз фитина ржи под действием эндогенной и микробной фитазы -4

Рисунок 6 Гидролиз фитина ржи под действием эндогенной и микробной фитазы

На следующем этапе работы исследовали влияние способа получения сусла, которое получали по двум вариантам: Вариант А – классический метод переработки зерна в соответствии с режимами Регламента; Вариант Б – дифференцированный метод переработки зерна с выделением фракции шелухи и ее предварительной предобработки при 40 – 45 0С в течение 3-х часов, а также стадии и норм внесения микробной фитазы на отдельные показатели качества сусла.

Установлено (табл. 6), что внесение ферментного препарата с активной фитазой на стадию осахаривания разваренной массы независимо от варианта его получения не приводит к повышению массовой доли сухих веществ в сусле (даже в случае увеличения нормы в 2 раза). Определяющим является норма внесения фитазы на стадию предобработки шелухи. Так, уменьшение количества препарата Кормофит с 0,03 ед.FTU/г зерна (оптимальная доза) до 0,015 ед.FTU/г зерна сопровождается снижением содержания сухих веществ в сусле с 16,1% до 15,5%.

Таблица 6 – Изменение содержания сухих веществ и свободных сахаров

в зависимости от варианта получения осахаренного сусла

Вариант получения сусла Норма внесения фитазы, ед FTU/г зерна Массовая доля в сусле, %
на стадию предобработки шелухи на стадию осахаривания С.В. Р.В.
Вариант А 1. 2. 3. 4. – – – – – 0,015 0,030 0,060 14,8 14,8 15,0 14,9 5,5 5,6 5,8 6,7
Вариант Б 5. 6. 7. 8. 9. 0,030* 0,015 0,015 0,015 0,015 – – 0,015 0,030 0,060 16,1 15,5 15,4 15,6 15,5 6,4 5,3 5,7 6,0 6,9

* – оптимальная доза внесения микробной фитазы, позволяющая гидролизовать

фитин ржи примерно на 90%

Показано, что целесообразнее вносить препарат полностью на стадию предобработки фракции шелухи, а не в два приема.

3.7. Исследование процесса сбраживания ржаного сусла,

полученного с использованием зерновой и микробной фитазы

Предложенная схема переработки ржи, основанная на выделении фракции шелухи и стадии ее предобработки позволяла:

  • проводить глубокий гидролиз фитина сырья, являющегося ингибитором ряда ферментов;
  • накапливать в осахаренном сусле остатки фосфорной кислоты;
  • повышать показатели качества сусла, в том числе увеличивать массовую долю в нем сбраживаемых углеводов, свободных сахаров, аминного азота и др.

Для выявления влияния на процесс сбраживания сусла каждого из перечисленных факторов и установления наиболее значимого в работе была изучена динамика выделения диоксида углерода на модельных опытах.

В качестве основного сырья для приготовления сусла, предназначенного к сбраживанию, для выявления влияния первых двух факторов, в данной серии экспериментов использовали фракцию эндосперма, выбор которой основывался следующими причинами. Во-первых, в ней содержалось минимальное количество фитина и фитазы ржи, что позволяло, при необходимости, исключить их влияние на процессы, протекающие при получении сусла и его сбраживании. Во-вторых, рядом исследователей установлено, что фракция эндосперма в отличие от исходного зерна ржи характеризуется существенным снижением количества некрахмальных полисахаридов. Последние влияют не только на вязкость сред на отдельных этапах переработки зерна, но могут играть и экранирующую роль, снижающую доступность крахмала сырья к ферментативному воздействию.

Для получения сопоставимых результатов по сериям был выбран следующий режим переработки сырья. Помол, полученный после дробления фракции эндосперма, которая представляла собой зерновку после удалении 15 % внешних поверхностных слоев, разделяли на две части. Меньшую (15 % от общей массы помола) смешивали с водой (гидромодуль 1 : 10), подкисляли раствором H2SO4 (или смесью двух кислот H2SO4 и H3PO4) до рН = 5,0 и проводили обработку при 40-45 0С в течение трех часов.

При получении опытных образцов сусла к помолу добавляли определенное количество сухого рисового фитина.

В Серии 1 (С1) для подкисления среды использовали раствор H2SO4.

В Серии 2 (С2) подкисление также осуществляли раствором H2SO4. В смесь добавляли ферментный препарат Кормофит с дозировкой 10 ед FTU/г фитина сырья, что позволяло проводить полный гидролиз фитина

В Серии 3 (С3) для подкисления среды использовали растворы H2SO4 и H3PO4. Последний вносили в количествах, соответствующих 100%-ному гидролизу фитина, содержащегося в пробе.

Далее предварительно обработанную часть помола направляли на соединение с основной частью (85% от общей массы измельченного сырья) и проводили механико-ферментативную обработку и осахаривание разваренной массы по режиму Регламента. Всего было получено десять образцов сусла:

  • К – контроль (без внесения фитина);
  • О1 (С1); О1 (С2); О1 (С3) – опыт с внесением 0,5 % фитина к массе помола;
  • О2(С1); О2 (С2); О2 (С3) – опыт с внесением 1,0 % фитина к массе помола;
  • О3 (С1); О3 (С2); О3 (С3) – опыт с внесением 2,0 % фитина к массе помола.

В образцы сусла вносили спиртовые дрожжи. Сбраживание контролировали по выделению СО2. Анализ, полученных данных позволяет сделать следующие выводы:

    1. Процесс сбраживания зависит от присутствия фитина в сусле, причем, с увеличением его массовой доли в пределах от 0,5 % до 2,0 % закономерно снижается как интенсивность брожения, так и абсолютное количество выделившегося СО2. К примеру, через 24 часа сбраживания контрольного образца образовалось 7,25 г СО2 на 100 г сусла, а в опытных – соответственно 7,00; 6,25 и 5,80 г СО2 на 100 г сусла. Процесс сбраживания контрольного образца завершался на 10-15 часов раньше, чем опытных.
    2. Ферментативный гидролиз фитина, осуществленный под действием микробной фитазы, повышает эффективность сбраживания ржаного сусла. Причем, наибольшая интенсивность сбраживания соответствовала пробе О3 (С2), в которой на стадии получения сусла использовали максимальное количество фитина. Вместе с тем, уровень различий в динамике выделения диоксида углерода в опытных образцах сусла, подвергнутых гидролизу фитина не столь существенный, как для образцов без гидролиза.
    3. Дополнительное внесение в сусло H3PO4 в концентрациях, соответствующих полному гидролизу фитина, в количествах близких к его содержанию в зерне – проба О1 (С3) практически не влияет на процесс сбраживания; при больших концентрациях H3PO4 сбраживание незначительно интенсифицируется на первых этапах.

Для получения более наглядной зависимости влияния варианта получения сусла на интенсивность сбраживания сусла был рассчитан часовой прирост СО2 на 100 г сусла. На рисунке 8 приведены данные по сбраживанию контрольного и опытных образцов сусла, полученных с максимальным количеством фитина, внесенным в замес (2,0 % к массе помола). Лучшим по динамике часового прироста СО2 являлся образец сусла О3(С2) в котором при его получении использована микробная фитаза.

 нтенсивность сбраживания ржаного сусла в зависимости от варианта-5

Рисунок 8 Интенсивность сбраживания ржаного сусла в зависимости от варианта его получения

Таким образом, среди первых двух факторов более значимым является ингибирующее действие фитина на отдельные группы ферментов как эндогенного, так и микробного происхождения. В меньшей степени на процесс сбраживания влияет дополнительное накопление в сусле остатков фосфорной кислоты. Возможно, данный факт связан с тем, что зерновое сусло с позиции фосфорного питания для дрожжей и так является полноценным.

На следующем этапе работы выявлено влияние расы спиртовых дрожжей на динамику выделения дрожжей диоксида углерода при сбраживании сусла, полученного с использованием эндогенной и микробной фитаз. Для сбраживания применяли спиртовые дрожжи S. cerevisiae расы XII, а также сухие дрожжи “Angel” (Китай) и “Фермиол” (США). Последние относятся к термотолерантным и работают при температуре 33–35 0С.

Установлено, что получение сусла из ржи по дифференцированной схеме переработки зерна с использованием фитаз (опытный вариант), по сравнению с классической схемой (контрольный вариант) интенсифицирует процесс сбраживания. Длительность брожения сокращается в среднем на 12 – 18 часов.

Также показано, что в контрольном варианте за первые 18 – 24 часа исследуемые расы дрожжей по уменьшению интенсивности сбраживания располагаются в следующий ряд: Раса XII “Angel” “Фермиол”.

При сбраживании опытных образцов сусла данная зависимость меняется (рис. 9). Максимальная интенсивность выделения СО2 выявлена при сбраживании сусла дрожжами “Фермиол”. В целом за первые 12 – 18 часов исследуемые расы дрожжей по уменьшению интенсивности сбраживания располагаются в следующий ряд: “Фермиол” “Angel” Раса XII.

 лияние расы дрожжей на интенсивность сбраживания ржаного сусла-6

Рисунок 9 Влияние расы дрожжей на интенсивность сбраживания ржаного сусла опытного варианта (Вариант III)

Таким образом, установлено, что гидролиз фитина ржи под действием эндогенной и микробной фитаз оказывает большее позитивное действие в случае сбраживания сусла (по показателю выделения СО2) сухими спиртовыми дрожжами.

Вместе с тем известно, что сухие спиртовые дрожжи более чувствительны, по сравнению с традиционными к присутствию в сбраживаемой среде ингибиторов, так как важнейшей их особенностью является повышенная проницаемость мембран.

3.8. Анализ зрелой бражки по содержанию этилового спирта

и летучих примесей

Полученные образцы зрелой бражки были проанализированы на содержание этилового спирта (табл. 7). Установлено, что концентрация этилового спирта в дистилляте зависит от: расы используемых дрожжей и способа получения осахаренного сусла.

Максимальный выход спирта обнаружен в пробах бражки, полученных с использованием сухих дрожжей. Так, для контрольного варианта крепость дистиллята при сбраживании сусла дрожжами “Angel” и “Фермиол” составила 7,07 – 7,10 об.%, против 6,92 об.% для образца, где использовали дрожжи расы XII.

Таблица 7 – Содержание этилового спирта в зрелой бражке

Вариант получения сусла Раса дрожжей Продолжительность брожения, час. Концентрация спирта, об.%
1 Вариант I Чистая культура расы XII 72 6,92
2 Вариант II Чистая культура расы XII 66 7,23
3 Вариант III Чистая культура расы XII 66 7,19
4 Вариант I Сухие дрожжи “Angel” 72 7,10
5 Вариант II Сухие дрожжи “Angel” 66 7,29
6 Вариант III Сухие дрожжи “Angel” 66 7,24
7 Вариант I Сухие дрожжи “Фермиол” 66 7,07
8 Вариант II Сухие дрожжи “Фермиол” 48 7,30
9 Вариант III Сухие дрожжи “Фермиол” 48 7,26

В опытных вариантах значения соответственно составляют 7,29 – 7,30 об.% и 7,24 – 7,26 об.%. Причем можно отметить, что в случае продолжительного гидролиза (10 часов) фитина ржи под действием собственной фитазы (Вариант II) накапливается больше этилового спирта, чем при более кратковременном (2 часа) гидролизе под действием эндогенной и микробной фитаз (Вариант III). Возможно, данный факт связан с более глубоким гидролизом гемицеллюлоз фракции шелухи под действием ферментного комплекса ржи и, как следствие, с улучшением технологичности получаемых сред. Кроме того, он может быть следствием накопления повышенного количества аминокислот, что способствует снижению уровня потребления дрожжами сбраживаемых углеводов. Однако, с технологической точки зрения предпочтителен Вариант III получения сусла.

На завершающем этапе работы проведены исследования по анализу зрелой бражки на содержание вредных примесей. Полученные данные (табл. 8, 9) позволили сделать следующие выводы:

        • Минимальное количество примесей содержат образцы бражки, полученные с применением дрожжей расы XII и “Фермиол”. Сухие дрожжи “Angel” накапливают значительно больше примесей за счет фракции сивушных масел;
        • Метаболизм дрожжей расы XII характеризуется накоплением в бражке ацетальдегида. Этой фракции накапливается примерно 2,5 – 3,0 раза больше, чем при использовании сухих дрожжей;
        • Основная доля примесей приходится на фракцию сивушных масел, причем в ней преобладает изоамилол.

Таблица 8. – Сравнительный анализ содержания летучих примесей в контрольных образцах бражки (получение сусла по Варианту I)

Летучие примеси, мг/дм3 безводного спирта Чистая культура раса XII Сухие дрожжи
“Angel” * “Фермиол” **
Ацетальдегид 747,50 304,15 345,80
Этилацетат 140,09 211,08 165,19
Метанол ( об.%) 0,0080 0,0061 0,0044
1-Пропанол 401,92 904,77 301,27
2-Пропанол 1,90 5,30 4,01
Изобутанол 1390,21 1540,15 1080,75
1- Бутанол 7,00 10,16 5,03
Изоамилол 3400,18 6009,5 4681,13
Общее количество примесей 6088,80 8985,11 6583,18

* время сбраживания 72 часа, t = 28–300С; ** время сбраживания 66 ч, t = 33–350С

Таблица 9. – Сравнительный анализ содержания летучих примесей в опытных образцах бражки (получение сусла по Варианту II)

Летучие примеси, мг/дм3 безводного спирта Чистая культура раса XII Сухие дрожжи
“Angel” * “Фермиол” **
Ацетальдегид 65093 297,07 330,42
Этилацетат 77,65 155,80 120,71
Метанол ( об.%) 0,0075 0,0060 0,0050
1-Пропанол 312,03 810,85 272,14
2-Пропанол 3,17 4,24 2,92
Изобутанол 1042,80 1495,61 944,73
1- Бутанол 5,54 9,90 7,74
Изоамилол 2970,67 5572,42 4150,00
Общее количество примесей 5062,79 8345,89 5828,66
% к общему количеству в контроле 83,1 92,9 88,25

* время сбраживания 66 часа, t = 28–300С; ** время сбраживания 48 часов, t = 33–350С

В процентном отношении наиболее существенно в зависимости от варианта получения сусла изменяется содержание альдегидов, в меньшей степени эфиров и сивушных масел. Возможно это связано с тем, что в процессе длительной предобработки фракции шелухи в Варианте II идет достаточно глубокий гидролиз крахмала сырья под действием эндогенных амилаз, среди которых, как известно, преобладает -амилаза. Накопившиеся на этой стадии сахара на последующих этапах механико-ферментативной обработки могут вступать в реакцию меланоидинообразования, которая, в свою очередь, является источником образования альдегидов.

В целом изучение процессов на стадии сбраживания осахаренного сусла показывает, что предлагаемая схема переработки ржи с использованием дрожжей расы XII и “Фермиол” позволяет повысить крепость бражки на 0,2-0,3об.% и снизить содержание в ней летучих примесей на 20-25%, в том числе, за счет фракции альдегидов почти в 2 раза.

Выводы

  1. Впервые определены содержание фитина и фитазная активность в зерне ржи и его периферических частях. Установлено, что во фракции Шелухи (15% снятия) концентрируется до 90% от общего количества фитата сырья, ее фитазная активность достигает максимума (0,19 ед.FTU/г сырья для данной фракции против 0,03 ед.FTU /г для зерна).
  2. Разработана схема выделения и очистки зерновой фитазы. Получен препарат фитазы из зерна ржи со степенью очистки 105 раз.
  3. Определены оптимумы рН и температуры при действии эндогенной и микробной фитаз на стандартном и зерновом субстрате. Для зерновой фитазы оптимум рН 5,0, температуры 40 – 45 0С, для микробной фитазы – рН 4,5 – 5,5, температуры 45 – 55 0С.
  4. Проведена сравнительная характеристика образцов осахаренного сусла в зависимости от вариантов переработки ржи. Показано, что дифференцированная подготовка сырья, заключающаяся в выделении фракции шелухи и ее обработке при рН 5,0 и температуре 40 – 45 0С в течение 10 часов улучшает показатели сусла: повышает массовую долю сухих веществ на 0,9 – 2,0%, ОРВ на 0,9 – 2,0%.
  5. Установлено, что дополнительное внесение в смесь фракции Шелухи и воды микробной фитазы в рекомендуемой дозировке (0,2 ед.FTU/ г шелухи) интенсифицирует процесс гидролиза фитина ржи, при этом его продолжительность сокращается с 10-ти до 2-х часов.
  6. Обоснована стадия внесения микробной фитазы. Выявлено, что лучшими показателями качества характеризуются образцы сусла, в которых вся рекомендованная норма фитазы вносится на стадию предобработки шелухи. Дробное внесение фитазы (на стадию предобработки и на стадию осахаривания) снижает содержание С.В. в сусле с 16,1% до 15,5%.
  7. Изучена на модельных опытах динамика выделения диоксида углерода в зависимости от вариантов получения сусла (массовой доли фитина; подкисления среды H2SO4; H2SO4 и H3PO4; внесения ферментного препарата Кормофит). Установлено, что с увеличением массовой доли фитина в сырье от 0,5% до 2,0% снижается интенсивность брожения сусла; дополнительное внесение H3PO4 в концентрациях, соответствующих полному гидролизу фитина ржи практически не влияет на процесс сбраживания; ферментативный гидролиз фитина сырья повышает эффективность сбраживания ржаного сусла.
  8. Исследована динамика выделения диоксида углерода при получении сусла по предлагаемому способу с предобработкой шелухи и показано, что по интенсивности сбраживания спиртовые дрожжи можно расположить в следующий ряд: “Фермиол” “Angel” Раса XII.
  9. Изучено влияние варианта получения сусла и используемой расы дрожжей на содержание этилового спирта в зрелой бражке. Установлено, что сбраживание опытных образцов сусла, полученных по схемам, предусматривающим гидролиз фитина сырья, характеризуется большим накоплением этанола (7,19 – 7,30 об.% против 6,92–7,10 об.% для контроля). Максимальное количество этанола содержит бражка, полученная с использованием сухих дрожжей “Фермиол” и “Angel”.
  10. Методом газовой хроматографии определен качественный и количественный состав летучих примесей в образцах дистиллята бражки. Установлено, что на накопление примесей влияют: вариант получения сусла и раса спиртовых дрожжей.
  11. На основании проведенных экспериментов рекомендуется следующий способ получения и сбраживания ржаного сусла:

– выделение из зерна ржи фракции Шелухи в количестве 15% от общей массы сырья, смешивание ее с водой при гидромодуле 1 : 10, внесение микробной фитазы (0,2 ед. FTU/ г шелухи) и предобработка при рН 5,0, температуре 40 – 45 0С в течение 2 часов;

– смешивание обработанной фракции Шелухи с оставшейся фракцией Эндосперма (общий гидромодуль 1 : 4), проведение обработки в соответствии с режимом механико-ферментативного способа по Регламенту.

– сбраживание осахаренного сусла с использованием спиртовых дрожжей расы XII или “Фермиол”.

Разработанный способ позволяет повысить крепость бражки на 0,2–0,3 об.% и снизить содержание в ней летучих примесей в среднем на 20 – 25%, в том числе за счет фракции альдегидов, почти в 2 раза.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Жульков А.Ю. Исследование фитазного комплекса зерна ржи [Текст] / Витол И.С., Жульков А.Ю., Карпиленко Г. П. // В сб.: V Научно-практической конференции с международным участием «Высокоэффективные технологии, методы и средства их реализации», Москва, 2007, с. 171 – 172.
  2. Жульков А.Ю. Метод оценки степени растворения крахмала при получении осахаренного сусла Крикунова Л.Н., Жульков А.Ю., Карпиленко Г.П. // Производство спирта и ликероводочных изделий. 2008, № 1, с. 12 – 14.
  3. Жульков А.Ю. Выделение и характеристики фитазы ржи [Текст] / Жульков А.Ю., Витол И.С., Карпиленко Г.П. // В сб.: VI Научно-практической конференции с международным участием «Высокоэффективные технологии, методы и средства их реализации», Москва, 2008, с. 77 – 79.
  4. Жульков А. Ю. Выделение фитазы из оболочек зерна ржи [Текст] / Жульков А. Ю., Карпиленко Г.П. // Тезисы докладов VII Международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств», Могилев, 2009, с. 93.
  5. Жульков А.Ю. Роль зерновой фитазы при производстве и сбраживании ржаного сусла. Часть I. Исследование фитазного комплекса ржи [Текст] / Жульков А.Ю., Витол И.С., Карпиленко Г.П. // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2009, № 5, с. 50 – 55.
  6. Жульков А.Ю. Роль зерновой фитазы при производстве и сбраживании ржаного сусла. Часть II. Способы и режимы получения сусла [Текст] / Жульков А.Ю., Витол И.С., Карпиленко Г.П. // Хранение и переработка сельхозсырья. – 2009, № 6, с. 48 – 50.
  7. Жульков А.Ю. Исследование процесса сбраживания ржаного сусла, полученного с использованием зерновой и микробной фитаз [Текст] / Жульков А.Ю., Витол И.С., Карпиленко Г.П. // Вестник МИТХТ им. М.В. Ломоносова, 2009, т. 4, № 5, с.31 – 36.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.