WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Изучение белковых антигенов helicobacter pylori на основе моноклональных антител

На правах рукописи

Вечканов Евгений Михайлович

ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ АНТИГЕНОВ

HELICOBACTER PYLORI

НА ОСНОВЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ




03.00.04 – биохимия

03.00.07 – микробиология

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону

2007

Работа выполнена на кафедре биохимии и микробиологии государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Ростовский государственный университет» и в лаборатории «Гибридом» Федерального государственного учреждения здравоохранения Ростовского-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательского противочумного института Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Алексеева Л. П.

доктор биологических наук, профессор Лукаш А. И.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, доцент Терновская Л. Н.

доктор биологических наук, профессор Погорелова Т. Н.

Ведущая организация: Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт

эпидемиологии и микробиологии имени Пастера.

197101, Санкт-Петербург, ул. Мира, 14

Защита диссертации состоится: «26» апреля 2007 г. в 14-30 час на заседании диссертационного совета Д.212.208.07. по биологическим наукам в Южном Федеральном университете (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105, актовый зал)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Южного Федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148).

Автореферат разослан «21» марта 2007г.

Учёный секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук В. В. Бабенко

1. Общая характеристика работы

Актуальность исследования.

Роль Helicobacter pylori в возникновении гастродуоденальной патологии считается доказанной и подтверждённой современными исследованиями микробиологов, клиницистов и эпидемиологов (Аруин Л. И., 1999). Ежегодные данные ВОЗ, свидетельствующие о стремительном расширении круга лиц, поражённых этим возбудителем, ставят проблему хеликобактериоза в один ряд с важнейшими проблемами мирового здравоохранения. Только в СНГ и России ежегодный прирост заболеваемости хроническими гастритами и язвенной болезнью желудка и двенадцатиперстной кишки составляет более 1 млн. случаев, из которых от 60% до 90% составляют хеликобактер-ассоциированные. Особую значимость данной патологии придаёт официальная констатация Helicobacter. pylori как канцерогена I класса, иницирующего запуск патологических реакций, малигнизации тканей (ВОЗ., 1995).

Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Helicobacter. pylori в желудке человека. Однако, в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Helicobacter pylori. Несмотря на допускаемые симбиотические взаимоотношения человека и Helicobacter pylori, это микроорганизм всё же является одним из самых существенных факторов риска развития язвенной болезни желудка, язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, хронического гастрита, аденокарциномы желудка (Negrini R. et al., 1991). В связи с этим изменилось представление о методах лечения и диагностики этих заболеваний.

Разработано большое количество методов диагностики, позволяющих выявлять и идентифицировать этот микроорганизм. Развитие и усовершенствование этих методов помогло в получении ценной информации об эпидемиологии хеликобактериоза, сыграло большую роль в понимании патогенеза этой инфекции. Это, в свою очередь, позволило разработать наиболее эффективные схемы противохеликобактерной терапии и мероприятия, направленные на профилактику хеликобактериоза.

Ни один из существующих методов диагностики Helicobacter pylori - инфекции не универсален. Пределы возможностей этих методов могут быть ограничены не только их чувствительностью, но, зачастую зависят от возраста пациента, его индивидуальных особенностей, стадии заболевания, а также индивидуальных особенностей течения инфекции. Среди наиболее распространённых методов диагностики хеликобактерной инфекции выделяют: бактериологический, гистологический, уреазный тест, молекулярно-биологический (ПЦР-исследование), серологический методы. Все перечисленные методы имеют свои достоинства и недостатки. Из недостатков приведённых методов можно указать следующие: инвазивность, трудоёмкость и необходимость в специальном оборудовании для бактериологического метода, инвазивность и квалифицированные персонал для гистологического исследования, недостаточная чувствительность для уреазного теста, трудности в интерпретации значимости положительного результата в ПЦР-исследовании.

Для выделения и культивирования хеликобактерий в исследовательской практике используются различные питательные среды. Рецепты применяемых сред известны, однако их воспроизведение в лабораторных условиях затрудняется сложностью приобре­тения всего перечня добавок и факторов элективности. Трудновыполнимы также жесткие требования к газовой среде культивирования, которая должна состоять из 5% кислорода, 10% углекислого газа и 85% азота. Решению этих проблем служит разработанная в Ростовском ПЧИ питатель­ная среда для выделения и культивирования хеликобактерий элективная (СЭХ) (Ломов Ю. М., Харабаджахян Г. Д., Мазрухо А. Б., Шелохович А. И., 2000). В основу идеи создания среды заложен принцип полной комплектности препарата, гарантирующий оптимальный уровень его ростовых свойств. Оценка качества, элективных и ростовых свойств среды является важной составной частью успешной работы по выделению и наработке биомассы микроорганизма.

Среди диагностических методов особое место занимают серологические методы исследования. Одним из таких методов является метод обнаружения Helicobacter pylori с помощью моноклональных антител (МКА). Использование моноклональных антител, получаемых к белковым антигенам клеток Helicobacter pylori, является оправданным вследствие неинвазивности, чувствительности и специфичности тест-системы для обнаружения этого микроорганизма у пациента на их основе. Моноклональные антитела являются сегодня наиболее эффективным инструментом, с помощью которого возможно, с одной стороны, проведение тонких исследований антигенной композиции микробной клетки, выяснение функций отдельных антигенных детерминант, с другой - повышение чувствительности и специфичности серологического анализа, создание на их основе новых, более точных и быстрых методов идентификации и дифференциации.

Выяснение биологических и иммунохимических свойств антител и распознаваемых ими антигенов является необходимым условием их последующего успешного применения в диагностических целях, и нашей задачей было изучение свойств МКА, секретируемых гибридомой В10, полученной в лаборатории «гибридом» Ростовского противочумного института.

Цель работы:

Целью настоящего исследования явилось характеристика белковых антигенов Helicobacter pylori на основе моноклональных антител и определение возможности их использования для создания новой тест-системы по обнаружению данного микроорганизма.

Задачи исследования:

В работе были поставлены следующие задачи:

  1. Культивирование, получение колоний и наращивание биомассы микроорганизма Helicobacter pylori.
  2. Экспериментальная оценка элективной питательной среды для выделения и культивирования Helicobacter pylori (СЭХ), полученной в Ростовском НИПЧИ.
  3. Фракционирование и характеристика белковых антигенов методом электрофореза в полиакриламидном геле, денситометрии, спектрофотометрии и флуорометрии.
  4. Получение гибридом-продуцентов моноклональных антител к антигенам Helicobacter pylori и характеристика их свойств.
  5. Выявление белкового антигена Helicobacter pylori, против которого направлены моноклональные антитела гибридом-продуцентов.
  6. Выделение, очистка и характеристика препарата белкового антигена из клеток Helicobacter pylori путём гель-электрофореза и иммуноблоттинга с использованием полученных моноклональных антител.
  7. Исследование возможности использования полученных моноклональных антител в качестве основы тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.
  8. Оценка диагностической значимости моноклональных антител в серологическом методе диагностики Helicobacter pylori – инфекции.

Научная новизна.

В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Helicobacter pylori. Показана эффективность питательной среды в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Helicobacter pylori. Питательная среда обладает элективностью в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и про­тея, позволяя четко дифференцировать колонии возбудителя хеликобактериоза от сопутствующей микрофлоры.

В результате проведённых исследований созданы гибридомы-продуценты моноклональных антител, строго специфичных в отношении белковых антигенов микробных клеток Helicobacter pylori. Показано отсутствие перекрёстной активности моноклональных антител гибридомы В10 с микроорганизмами, имеющими антигенное родство с Helicobacter pylori.

Впервые методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной белковой формой УФ абсорбционного спектра и спектра флуоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.

В теоретическом отношении полученные материалы расширяют имеющиеся представления о белково-антигенной организации Helicobacter pylori.

Впервые оценена возможность применения полученных моноклональных антител гибридомы В10 для изучения антигенной структуры штаммов Helicobacter pylori. и создания тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

Научно-практическая значимость работы.

В результате исследования показано, что использование среды СЭХ в практических медицинских учреждениях по­зволит значительно повысить эффективность исследования материала, подозри­тельного на обсемененность хеликобактериями.

Получена коллекция гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к белковым антигенным детерминантам Helicobacter pylori, которая хранится в жидком азоте в библиотеке гибридом Ростовского противочумного института. Произведено депонирование гибридомы.

Характеристика моноклональных антител, продуцируемых гибридомой В10 и белков-антигенов Helicobacter pylori, явилась необходимой основой для оценки возможности создания тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

Материалы диссертации используются при чтении общего курса «Биотехнология» и спецкурса «молекулярная иммунология» на кафедре биохимии и микроюиологии Ростовского госуниверситета.

По материалам диссертации планируется создание и введение в клинико-лабораторную практику тест-системы скрининга Helicobacter pylori – инфекции.

Основные положения, выносимые на защиту.

  1. В результате проведённых исследований показана эффективность элективной питательной среды для культивирования микроорганизма Helicobacter pylori. Показана эффективность в обеспечении ростовых свойств микроорганизма Helicobacter pylori
  2. Охарактеризован фракционный состав белков Helicobacter pylori методами гель-электрофореза и денситометрии.
  3. Получен набор стабильных гибридных культур, продуцирующих моноклональные антитела к антигенным детерминантам Helicobacter pylori, не обладающих перекрёстной реактивностью с гетерологичными микроорганизмами. Среди полученного набора по оптимальным характеристикам отобрана для дальнейшего использования гибридная культура В10.
  4. Методом иммуноблоттинга идентифицирован белковый антиген, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10. Проведено выделение данного белкового антигена. Антиген термолабилен, имеет молекулярную массу 30 ± 1 кДа, типичные белковые адсорбционные спектры и спектры флюоресценции, не содержит связанных липидов, углеводов и нуклеиновых кислот.
  5. Показана диагностическая значимость полученных моноклональных антител гибридомы В10.

Апробация диссертационной работы.

Материалы диссертации докладывались и обсуждались на научных конференциях биолого-почвенного факультета Ростовского государственного университета (Ростов-на-Дону, 2003-2006), а также были представлены на 2, 3, 4 международной межвузовской конференции молодых учёных «Обмен веществ при адаптации и повреждении» Ростовского государственного медицинского университета (Ростов-на-Дону, 2003-2005).

Материалы диссертации апробированы на совместном заседании кафедры биохимии и микробиологии Ростовского госуниверситета и лаборатории гибридом ФГУЗ «Ростовского противочумного института»

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, из них две в центральной печати. Личный вклад автора 100%.

Объём и структура диссертации.

Диссертация изложена на 155 страницах, включая библиографию. Работа состоит из введения и 4 глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка использованной литературы. Библиографический указатель включает 142 источника, из них 73 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 35 рисунками и 20 таблицами.

2. Материалы и методы исследования.

Лабораторные животные.

В работе использовали белых мышей-самок инбредной линии BALB/c в возрасте 6-10 недель с целью получения иммунных спленоцитов и перитонеальных макрофагов, индукции асцитных опухолей.

Бактериальные штаммы и антигены.

В качестве источника микроорганизма Helicobacter pylori использовали референтные штаммы Helicobacter pylori NCTS 11637, полученные из музея живых культур из числа имеющихся в ГИСК им. Л.А.Тарасевича, и 4 штамма хеликобактерий, выделенные в РПЧИ из биоптатов слизистой оболочки желудка больных гастритом и язвенной болезнью. Наращивание биомассы микроорганизма и получение колоний осуществляли на питательной среде для выделения и культивирования возбудителя хеликобактериоза, разработанной в РПЧИ.

Элективная питательная среда для выделения и культивирования Helicobacter pylori.

Среда СЭХ пред­ставляет собой комплект, включающий основу среды в стерильной агаризованной форме в бутылях БКЗ-450 и добавки (стимуляторы роста и смесь антибиотиков).

Культивирование штаммов Helicobacter pylori.

Тест-штаммы выращивались в течение 72 ч при 37°С в микроанаэростате с трёхкомпонентной газовой средой (5% кислорода, 10% углекислого газа, 85% азота) на среде СЭХ. Для получения кокковидной формы микроорганизма, выращенные культуры дополнительно оставляли на 72 ч при 37°С.

Оценка качества среды.

Для проверки ингибирующих свойств среды использовали следующие тест-штаммы: Е. coli АТСС 25922, S. sonnei 10391, S. flexneri I A 8516, S. typhi 10476 С. albicans АТСС 24433, P. vulgaris NCTC 3132.

Клеточные линии позвоночных.

В работе использовались мышиные миеломные клетки NS0. Культивирование мышиных миеломных клеток NSO проводили в ростовой среде RPMI-1640, дополненной 10% сыворотки плода коровы (СПК), 2mМ L-глутамина и 10 mМ Hepes.

Иммунизация лабораторных животных и получение поликлональной сыворотки.

Мышей иммунизировали микробными клетками H. рylori, убитых мертиолятом (0,01%). Иммунизацию мышей проводили по следующей схеме: каждому животному трехкратно с интервалом две недели вводили внутрибрюшинно в полном адъюванте Фрейнда (ПАФ) 0,1 мл инактивированной взвеси H. pylori (108 клеток/мл, то есть 107 клеток/мышь).

Получение гибридных клеток.

Слияние селезеночных клеток мыши с миеломой NS0 проводили в соответствии с методикой, описанной Fazekas et al (1980). Определение антителопродукции гибридом проводили методом ТИФА. Клонирование и реклонирование клеточных культур осуществляли методом предельного разведения (Goding, 1986).

Фракционирование и выделение белков Helicobacter pylori. Электрофорез белков в полиакриламидном геле.

Электрофорез белков в комплексе с SDS проводился в системе, предложенной Лэммли (Laemmli, 1970). Визуализацию результатов электрофореза осуществляли путём окраски геля Coomassie brilliant blue и «Stains-all».

Иммуноферментные методы.

Для обнаружения МКА в супернатантах гибридом применялся твердофазный иммуноферментный анализ. Тестирование осуществляли иммуноферментным набором для скрининга гибридом (Calbiochem).

Иммуноферментный анализ дот-блот.

Проводился аналогично ТИФА, но на нитроцеллюлозе. Результат реакции учитывали визуально (Нго и соавт., 1988).

Метод непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител (НИФМ).

Мазки Helicobacter pylori обрабатывались нефлюоресцирующими антителами и далее флуоресцирующей антиглобулиновой сыворотко. Препараты просматривались в люминесцентном микроскопе.

Иммуноблоттинг

Осуществляли в течение 25 мин, с ограничением по току 2мА/см2. Визуализацию белковых фракций осуществляли Ponceau. Инкубацию иммуноблота осуществляли в растворе моноклональных антител 1:100, 1:250, 1:500. В качестве вторичных антимышиных иммуноглобулинов использовался готовый набор, коанъюгированных с пероксидазой хрена - Goat Anti-Mouse Immunoglobulins-Peroxidase Conjugate Calbiochem® Immunochemicals.

Элюирование белкового антигена

Осуществляли путём вырезания интересующей нас белковой фракции из пластины полиакриламидного геля. Концентрацию белка во фракции определяли методом Лоури.

Исследование спектров поглощения и собственной флуоресценции белка препарата.

УФ-спектры поглощения определяли на спектрофотометре Флюорат-панорама.

(Люмекс, Россия) и спектрофотометре 8453Е Spectroscopy в интервале 200 – 650 нм.

Денситометрический метод обработки результатов гель-электрофореза и используемое программное обеспечение.

Электрофореграмму документировали методом сканирования в отражённом свете и анализировали с помощью денситометрического программно-аппаратного комплекса Videodensitometr SORBFIL Ver. 1.6.0.212. Производился расчет количества белка в каждой фракции. Статистическую обработку результатов и определение необходимого объема выборки проводили по стандартным методам биометрии с привлечением программных средств Statistica v. 6.0.

3. Результаты исследования и их обсуждение

3.1. Культивирование бактериальных штаммов Helicobacter pylori и характеристика полученных колоний

Наращивание биомассы микроорганизма и получение колоний осуществляли на питательной среде для выделения и культивирования возбудителя хеликобактериоза, разработанной в РПЧИ. Посевы инкубировали при 37°С в течение 6 суток, используя металлический микроанаэростат с трехкомпонентной газовой средой (5 % О2, 10 % СО2, 85 % N2).

А Б

Рис. 1. Фото участка чашки Петри с колониями Helicobacter pylori, выращенных на селективной питательной среде (А), фото Helicobacter pylori (увеличение 10х40, окраска по Грамму) (Б)

Фото полученных колоний показано на рисунке 1. Хеликобактеры - круглые, выпуклые, полупрозрачные, каплевидные, диамет­ром не менее 0,5 мм. При стереомикроскопировании в косо-падающем свете имеют зеленовато-желтый (золотистый) оттенок.

3.2. Оценка качества среды элективной хеликобактерной (СЭХ)


Оценку качества питательной среды СЭХ производили по физико-химическим и биологическим показателям: чувствительность, скорость роста, стабильность основных биологических свойств колоний, показатель ингибиции. Физико-химические показатели испытанных серий среды СЭХ представ­лены в таблице № 1.

Таблица 1.

Физико-химические показатели среды

Показатели По фармакопейной статье Результаты контроля СЭХ
Серия № 3 Серия № 4 Серия № 5
Описание Основа – непрозрачный студень чёрно-серого цвета с включениями активированного угля Соотв. Соотв. Соотв.
Растворимость Стимуляторы роста № 1 и № 2 должны полностью растворяться в 2 мл воды очищенной в течение 1 мин. Стимулятор роста № 3 должен эмульгироваться в 5 мл воды очищенной в течение 15 мин после предварительного измельчения его. Соотв. Соотв. Соотв.
Прозрачность и цветность Препарат, предварительно расплавленный, налитый в чашку Петри слоем 5-6 мм, непрозрачен, чёрно-серого цвета с включениями и осадком активированного угля. Соотв. Соотв. Соотв.
рН От 6,8 до 7,0 6,95 6,93 6,94
Аминный азот, % От 0,075 до 0,095 0,082 0,081 0,084
Хлориды, % От 0,5 до 0,6 0,53 0,53 0,57
Прочность студня среды, г От 180 до 240 220 230 220
Температура плавления Не менее 800С Соотв. Соотв. Соотв.
Температура застудневания Не менее 30 и не более 37 0С Соотв. Соотв. Соотв.
Продолжительность плавления Агаризованная основа должна полностью расплавляться в кипящей водяной бане в течение 40 +-10 мин Соотв. Соотв. Соотв.
Стерильность Препарат должен быть стерилен после выдерживания в течение 44-48 ч при температуре (37+-1) 0С и последующих 14 суток при температуре 20-25 0С Стерилен Стерилен Стерилен

Изученные параметры соответствовали аналогичным показате­лям, заложенным в Фармакопейной статье. Результаты исследования биологических свойств среды СЭХ представлены в таблице № 2. Хеликобактерии всех пяти взятых в опыт штаммов вырастали из посевной дозы 100 микробных клеток, что соответствует разведению микробной взвеси 10-6, тогда как чувстви­тельность контрольной среды (хеликобактерный элективный агар) была на порядок ниже (разведение 10~5). Скорость роста Н. pylori и ингибирующая способность обеих сред была одинаковой.

Таблица 2.

Биологические показатели среды

Показатели Штаммы По фармакопейной статье Результаты контроля
СЭХ Серия № 3 СЭХ Серия № 4 СЭХ Серия № 5 ХКЭА
Показатели чувствительности, скорости роста NCTC 11637 10-6 Через (72+-2)ч инкубации диаметр колоний не менее 0,5 мм 10-6 10-6 10-6 10-6
№ 1 10-6 10-6 10-6 10-5
№ 2 10-6 10-6 10-6 10-5
№ 3 10-6 10-6 10-6 10-5
№ 4 10-6 10-6 10-6 10-5
Показатель ингибиции E. coli 18 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3
S. flexneri 1A8516 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3
S. sonnei 10391 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3
S. typhi 10476 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3
C. albicans ATCC 24433 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4
P. vulgaris NCTC 3232 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5

Хеликобактеры - круглые, выпуклые, полупрозрачные, каплевидные, диамет­ром не менее 0,5 мм. При стереомикроскопировании в косо-падающем свете имеют зеленовато-желтый (золотистый) оттенок. Эшерихии - круглые, гладкие, сероватые, диаметром 2-4 мм. Шигеллы - круглые, гладкие, блестящие, полупрозрачные, диаметром 2-3 мм. Сальмонеллы - круглые, гладкие, полупрозрачные, диаметром 2-3 мм. Кандиды - гладкие, белые, плотные, диаметром 3-4 мм. Протей - беловато-матового цвета, диаметром 2-3 мм, без роения.

3.4. Получение и первичный скрининг гибридом-продуцентов моноклональных антител (МКА) к белкам Helicobacter pylori

Проводилось слияние иммунных селезёночных клеток мыши с миеломой NS0 (см. рисунок. 2 А).

А Б

Рис. 2. Фото клеток миеломы NS0 (А) и фото клеток гибридом (Б)

Проведение гибридизации позволило получить и исследовать антителообразующую активность в общей сложности 384 первичных культур. Наблюдение за ростом клонов осуществляли с помощью инвертированного микроскопа Reichert. Фото первичной культуры гибридом приведено на рисунке 3 Б.

Определение антителопродукции гибридом проводили методом ТИФА. Первичное тестирование в ТИФА проводили на клетках H.pylori, убитых мертиолятом. Доля антителопродуцентов, выявленных при первичном тестировании составила 57 культур (15 %). Представление о количестве иммуноглобулинов в культуральной жидкости испытуемых гибридом получили на основании интенсивности окрашивания опытных проб в ТИФА. На рисунке 3 отражены данные о продукции МКА гибридомами, в зависимости от времени.

 Диаграмма зависимости количества антителопродуцирующих клонов от-4

Рис. 3. Диаграмма зависимости количества антителопродуцирующих клонов от времени.


Большая часть полученных первично положительных клонов в первые недели после слияния утрачивала способность продуцировать антитела. Этот процесс протекал особенно интенсивно в течение первых трех недель. С целью достижения стабилизации антителопродукции, а также пролиферативной активности, культуры были подвержены неоднократному клонированию.

Представление о количестве иммуноглобулинов в культуральных жидкостях испытуемых гибридом получили на основании интенсивности окрашивания опытных проб в ТИФА, интенсивности свечения хеликобактера с использованием метода непрямой иммунофлюоресценции моноклональных антител.

В таблице 3 приведены показатели конечных титров МКА, обеспечивающих положительную реакцию с исследуемым антигеном. Титры антител в культуральных жидкостях разных гибридом варьировали в весьма широких пределах от 1:2 до 1:500 при сравнительно одинаковых размерах гибридных клонов.

Таблица 3.

Показатели количественного содержания антител в КЖ гибридом


МКА гибридом
Титры МКА из КЖ в серологических реакциях
ТИФА НИФМ
1 D2 1:300 1:20
2 G12 1:500 1:10
3 Е1 1:500 1:10
4 F7 1:50 1:5
5 В10 1:500 1:20
6 А8 1:50 1:2
7 В4 1:50 1:5
8 С5 1:50 1:2
9 С8 1:100 1:5
10 D10 1:10 -
11 E8 1:50 1:5
12 G10 1:10 -

Высокая антителопродукция наблюдалась у гибридом G12, E1 и В10 (титр в ТИФА ~ 1:500). В результате, из имеющихся гибридом, была отобрана клеточная линия В10, стабильно продуцирующая МКА и характеризующаяся высокой степенью антителопродукции.

3.5. Оценка специфичности МКА гибридом, полученных к Helicobacter pylori, в дот-блот ИФА.

Определение специфичности МКА проводили анализом дот-блот. Результаты исследования представлены в таблице 4. Как видно, МКА гибридом D2, G12, El, F7, В10 дают положительную реакцию только с клетками Helicobacter pylori, т. е. МКА этих гибридом строго специфичны в отношении белковых антигенов Helicobacter pylori и не вступают в реакцию с другими антигенами тестируемых микроорганизмов.

Таблица 4.

Оценка специфичности МКА к поверхностным детерминантам H.pylori

МКА гибридом Helicobacter pylori V. cholerae Y. pestis F. tularensis L. pneumo-phila
D2 + - - - -
G12 + - - - -
Е1 + - - - -
В10 + - - - -
F7 + - - - -


3.6. Оценка преципитирующих свойств МКА

С целью оценки плотности экспонирования белковых детерминант, узнаваемых соответствующим им МКА, ставили реакцию иммунопреципитации в геле. Результаты исследования приведены на рисунке 4 и в таблице 5. Известно, что МКА образуют преципитат с комплементарными эпитопами, если последние часто встречаются в составе биополимеров.

Таблица 5.

Преципитирующие свойства МКА

МКА гибридом Реакция иммунопреципитации
1 G12 +
2 B10 +
3 D2 -
4 E1 -
5 F7 -
6 С8 -

Примечание: “–” – реакция отрицательная.

Рис. 4. Результаты иммунопреципитации в геле

Условные обозначения: А — Helicobacter pylori, 1 — G12; 2 — В10; 3 - D2; 4 – Е1, 5-F7; 6- C8

Полученные МКА гибридом D2, E1, F7, C8 из культуральнаой жидкости не обладают преципитирующей активностью, в то время как МКА гибридом G12 и В10 обладают ярко выраженной преципитирующей активностью, что свидетельствует о высокой частоте узнаваемых ими эпитопов.

3.7. Определение класса полученных иммуноглобулинов

Изотипический анализ МКА проводили методом ТИФА с использованием кроличьих моноспецифических антисывороток к тяжелым цепям иммуноглобулинов мыши (Calbiochem).

Таблица 6.

Класс и титр антител в культуральных жидкостях гибридом

МКА гибридом Класс Ig Титры МКА из КЖ в ТИФА
1 D2 IgG 1:300
2 G12 IgG 1:500
3 Е1 IgG 1:250
4 F7 IgG 1:50
5 В10 IgG 1:500

Результаты анализа показали, что все МКА полученных гибридом являются иммуноглобулинами класса IgG (таблица 6). Колебания титров антител были в пределах от 1:50 до 1:500. К числу наиболее эффективных гибридом-продуцентов МКА следует отнести В10 отличающейся высокой антителопродукцией и хорошими ростовыми свойствами. Таким образом, на основании экспериментальных результатов, из нескольких стабильных гибридом-продуцентов МКА была выбрана одна линия гибридом В10, моноклональные антитела которой в дальнейшем получали в препаративных количествах и использовали в дальнейшей работе, для изучения белков-антигенов Helicobacter pylori.

3.8. Фракционирование белков Helicobacter pylori

Электрофорез проводился в концентрирующем геле из расчёта 10 В/см, в разрешающем 180 В/см, в течение 4-5 часов по достижению лидирующего красителя бромфенолового синего нижнего края геля в 6 повторностях. Всё опыты проводились в идентичных условиях. После проведения электрофореза окрашивание белковых фракций осуществляли с помощью красителя Кумасси R-250. В результате электрофоретического фракционирования были получены «белковые профили», один из которых представлен на рисунке 5. Из приведённого рисунка «белкового профиля» видно, что проведённое электрофоретическое фракционирование выявило 11 основных белковых фракций, имеющих молекулярную массу, находящуюся в пределах 15 – 65 kDa. Видимых различий в составе белковых фракций между кокковидной и вегетирующей формами не выявлено.

 Результаты электрофоретического фракционирования белков Helicobacter-6

Рис. 5. Результаты электрофоретического фракционирования белков Helicobacter pylori в полиакриламидном геле, в присутствии детергента SDS.

Условные обозначения: проба № 1 — маркёры молекулярной массы (белковые метчики), проба № 2, № 3, № 4 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы, проба № 5, № 6, № 7 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы, проба № 8 – отрицательный контроль. Слева стрелкой показано направление миграции белковых фракций и шкала длины.

Полученные данные молекулярных масс белковых фракций по всем опытам, были обработаны программой математической статистики «Statistica» v. 6.0 с целью получения усреднённых значений молекулярных масс белковых фракций. Результаты статистической обработки представлены в таблице 8.

Таблица 8.

Статистическая обработка значений М белковых фракций

Номер фракции Кол-во Вариантов Среднее значение M Станд. откл. Станд. ошибка
№ 1 6 20792,00 541,99 204,85
№ 2 6 23342,71 1745,31 659,66
№ 3 6 27313,43 1626,20 614,64
№ 4 6 30811,14 858,092 324,32
№ 5 6 33794,14 1293,86 489,03
№ 6 6 35980,00 1552,46 586,77
№ 7 6 38674,43 1549,05 585,48
№ 8 6 41898,71 3415,39 1290,89
№ 9 6 47059,57 3695,75 1396,86
№ 10 6 57558,43 3375,45 1275,80
№ 11 6 64398,71 2621,20 990,72


3.9. Денситометрическое исследование белковых фракций Helicobacter рylori

Для денситометрического исследования проводили гель-электрофорез проб со стандартами бычьего сывороточного альбумина различных концентраций. Ниже на рисунке 6 представлен соответствующий электрофоретический профиль.



№ 1 № 2 № 3 № 4 № 5 № 6 №7

 Электрофорез Helicobacter pylori на полиакриламидном геле в-7

 Электрофорез Helicobacter pylori на полиакриламидном геле в-8

Рис. 6. Электрофорез Helicobacter pylori на полиакриламидном геле в присутствии детергента SDS и белковых «стандартов» бычьего сывороточного альбумина

Условные обозначения: проба № 1 – белковые метчики; проба № 2, № 3, № 4 – белковые «стандарты» бычьего сывороточного альбумина в концентрации 100 мкг/мл, 70 мкг/мл и 20 мкг/мл соответственно; проба № 5 – лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы; проба № 6 – лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы, проба № 7 – отрицательный контроль, стрелкой указано расстояние от белковой фракции до фронта красителя.

Производился количественный расчёт показателей белковой фракции по цифровой фотографии. В результате были получены данные о количестве белка в каждой из белковых фракций (рисунок 7) и его % содержании к общей сумме белка (рисунок 8).

 Диаграмма количественного содержания белка в каждой фракции -9

Рис. 7. Диаграмма количественного содержания белка в каждой фракции




Рис. 8. Диаграмма % содержания белка в белковой фракции к сумме.

3.10. Сравнительное исследование белковых фракции Helicobacter pylori методом иммуноблоттинга

Для проведения исследования белковых фракций Helicobacter pylori методом иммуноблоттинга осуществляли перенос фракционированных белков с пластины полиакриламидного геля, полученного в ходе предыдущего опыта, отображённого на рисунке 9, на микропористую нитроцеллюлозную мембрану по методу Bjerrum and Schafer-Neilsen.

 Иммуноблотограмма белковых антигенных фракций Helicobacter pylori -10

Рис. 9. Иммуноблотограмма белковых антигенных фракций Helicobacter pylori

Условные обозначения: проба № 1- маркёры молекулярной массы (белковые метчики); проба № 2- лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы, обработанной МКА гибридомы В10; проба № 3- лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы, обработанной специфической поликлональной сывороткой; проба № 4- лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы, обработанной нормальной мышиной сывороткой; проба № 5- лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы, обработанной МКА гибридомы В10; проба № 6- лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы, обработанной специфической поликлональной сывороткой; проба № 7- лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы, обработанной нормальной мышиной сывороткой; проба № 8 – отрицательный контроль.

Согласно результатам иммуноблоттинга (см. рисунок 9), моноклональные антитела гибридомы В10 взаимодействуют с белковой фракцией № 4 Helicobacter pylori, что соответствует белковому антигену со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа. Также показано, что данный белковый антиген присутствует в равной степени как у труднодиагностируемой кокковидной, так и у вегетирующей форм. Антитела специфической поликлональной сыворотки взаимодействуют с несколькими белковыми антигенами, а именно с фракциями № 1 (М = 20792 Да), № 2 (М = 23342 Да), № 4 (М = 30811 Да), № 6 (М = 35980 Да ) № 9 (М = 47059 Да).

3.11. Оценка термолабильности антигена Helicobacter pylori, выявляемого МКА гибридомы В10

Оценивалась термолабильность белкового антигена, к которому были получены антитела гибридомы В10, методом дот-блот. Результаты опыта приведены ниже на рисунке 10

Проба № 1 Проба № 1а Проба № 2 Проба № 2а Проба № 3

Рис. 10. Оценка термолабильности белкового антигена методом дот-блот.

Условные обозначения: проба № 1- микробные клетки Helicobacter pylori убитые мертиолятом и обработанные МКА в рзведении 1/5; проба № 1а - микробные клетки Helicobacter pylori убитые мертиолятом и обработанные МКА в рзведении 1/50; проба № 2- микробные клетки Helicobacter pylori убитые мертиолятом и нагреванием при 1000 С в течение 30 минут, обработанные МКА в разведении 1/5, проба № 2а- микробные клетки Helicobacter pylori убитые мертиолятом и нагреванием при 1000 С в течение 30 минут, обработанные МКА в рзведении 1/50; проба № 3- отрицательный контроль.

МКА не обнаруживают белковый антиген при термической обработке проб № 2 и 2а. Таким образом белковый антиген является термолабильным.

3.12. Ультрафиолетовые спектры поглощения и флуоресценции белка

Из полиакриламидных пластин гелей вырезали полоски, содержащие фракцию № 4 белка-антигена, дающего положительную реакцию с моноклональными антителами гибридомы В10 предыдущих опытов. Белок элюировали из полиакриламидного геля. Определяли концентрацию полученного очищенного белкового антигена по методу Лоури. Концентрация белкового антигена составляла 0,5 мг/мл.

Снимали спектр поглощения в единицах оптической плотности в диапазоне от 220 до 650 нм, с шагом 10 нм. Результаты измерений на рисунке 11. Также снимался спектр флуоресценции от 220 до 700 нм, с шагом 10 нм. Результаты измерений приведены на рисунке 12. Интенсивность флуоресценции измеряли в условных единицах вблизи максимума спектра, кроме того оценивали его положение и форму.

Рис. 11. Спектр поглощения белкового препарата (фракция №4).

 Типичная форма спектра флуоресценции белкового препарата.-17

Рис. 12. Типичная форма спектра флуоресценции белкового препарата. (фракция № 4)

Исследование спектра препарата фракции № 4 выявило типичный белковый спектр поглощения. В диапазоне (погл) 210-240 нм оптическое поглощение составило 2,00-3,50, что соответствует спектру поглощения пептидных групп белка, при (погл) 280 нм оптическое поглощение составило 1,25, что соответствует суммарному поглощению ароматических аминокислот триптофана, фенилаланина и тирозина. В остальном диапазоне (погл) 290-650 нм отсутствуют максимумы поглощения. Размытые максимумы поглощения белка являются следствием светорассеяния (опалесценции) раствора.

Представленный на рисунке 15 спектр флуоресценции является типичным для белкового препарата при рН = 7,0, положение максимума при длине волны возбуждения (возб) 280 нм и максимуме (эм) эмиссии 350-360 нм составила 182 ± 0,1 и соответствует максимуму флуоресценции триптофана.

3.13. Определение небелковых компонентов белкового антигена

Проводился реэлектрофорез белкового антигена Helicobacter pylori, против которого были направлены моноклональные антитела гибридомы В10. После проведения электрофореза окрашивание фракции белкового антигена осуществляли с помощью красителя «Stains-all» Особенностью данного красителя является то, что гликопротеиды, белки, липиды и даже нуклеиновые кислоты окрашиваются одновременно. Для красителя характерно, что разные по своей природе биополимеры окрашиваются в различные цвета: гликопротеиды - в синий, белки - в красный, липиды - в желто-оранжевый, ДНК - в синий, а РНК - в голубовато-пурпурный.

В результате электрофоретического фракционирования и окраски была получена электрофоретическая картина, представленная на рисунке 13.

Рис. 13. Результаты электрофоретического фракционирования белков Helicobacter pylori в полиакриламидном геле, и окраски красителем «Stains-all»

Исходя из окраски фракции белкового антигена, следует, что белковый антиген представлен белковой составляющей, без выраженной липидной и углеводной части.

3.14. Оценка использования полученных МКА в диагностике Helicobacter pylori инфекции

В настоящем исследовании использовался клинический материал от 36 пациентов, страдающих гастродуоденальной патологией. Все пациенты были мужчинами в возрасте от 18 до 30 лет. В качестве клинического материала использовались биоптаты язвенно - эррозивного поражения желудка и двенадцатиперстной кишки.

Каждую пробу разделяли на две части. Первую часть пробы использовали для микробиологического исследования на наличие возбудителя Helicobacter pylori. Другую часть биоптата использовали для проведения дот-ифа с МКА гибридомы В10. Результаты исследования приведены в таблице 16 и рисунке 14.

Таблица 16.

Данные по обнаружению Helicobacter pylori разными методами

пациент Результат дот-ифа исследования Результат микроб. исследования
пациент Результат дот-ифа исследования Результат микроб. исследования
Титр МКА 1/5 Титр МКА 1/50 Титр МКА 1/5 Титр МКА 1/50
1 + + + 19 - - -
2 + + + 20 - - -
3 - - - 21 - - +
4 - - - 22 - - -
5 - - - 23 - - -
6 - - - 24 - - -
7 - - - 25 - - -
8 - - - 26 + + +
9 - - - 27 - - -
10 - - - 28 - - -
11 - - - 29 + + +
12 + + + 30 - - -
13 - - - 31 - - -
14 + + + 32 - - -
15 - - - 33 - - -
16 - - - 34 + + +
17 + + + 35 - - -
18 - - - 36 - - -

Условные обозначения: + положительная реакция; - отрицательная реакция.

Из результатов исследования, пробы № 1, 2, 12, 14, 17, 26, 29, 34 имели положительный результат на наличие белкового антигена Helicobacter pylori. Результаты ИФА дот-блот соотносились с результатами микробиологического исследования на основе питательной среды СЭХ на наличие микроорганизма Helicobacter pylori. Пробы № 1, № 2, № 12, № 14, № 17, № 21, № 26, № 29, № 34 имеют положительный результат с использованием метода микробиологических сред. Остальные пробы имели отрицательный результат. Результаты исследования показали наличие Helicobacter pylori микробиологическим методом у 9 (25%) человек из 36 пациентов. ИФА анализом, с использованием МКА гибридомы В10, был подтвержден положительный результат у 8 (88 %)человек из 9 пациентов, с микробиологически подтверждённым диагнозом..

 Диаграмма обнаружения Helicobacter pylori у пациентов страдающих-20

Рис. 14. Диаграмма обнаружения Helicobacter pylori у пациентов страдающих гастродуоденальной патологией с помощью ИФА дот блот и микробиологическим методом обнаружения микроорганизма на питательных средах.

Доля пациентов с отрицательными результатами исследований на наличие возбудителя хеликобактериоза составила 75%, у 25% пациентов было подтверждено наличие возбудителя микробиологическим методом, а у 22% иммуноферментным методом.

При проведении сравнительного анализа чувствительности иммунохимических методов на основе МКА и поликлональных сывороток был получен результат, заключающийся в том, что в 33,3 % случаев поликлональная сыворотка не выявила наличие возбудителя Helicobacter pylori в образцах, с подтвёрждённым бактериологическим методом результатом. Оценена «эффективность» антител на основе поликлональной сыворотки и МКА гибридомы В10, приведённая на рисунке 15.

 Диаграмма эффективности иммунохимических методов на основе МКА и-21

Рис. 15. Диаграмма эффективности иммунохимических методов на основе МКА и поликлональных сывороток.

Полученные данные коррелируют с тем фактом, что поликлональные гетерогенные сыворотки содержат большое разнообразие антител, отличающихся своей специфичностью, аффинитетом и физико-химическими свойствами. Состав поликлональной сыворотки, ее антительный «репертуар», во многом зависят от схемы введения антигена и от индивидуальной реакции организма на антиген. Таким образом, ожидать от поликлональной сыворотки высокой эффективности и специфичности по отношению к возбудителю не приходится. Кроме того, у различных пациентов возможны вариации «антигенной представленности» Helicobacter pylori, что в условиях применения поликлональной сыворотки с пулом антител, приводит к снижению эффективности и % выявляемости микроорганизма. Препарат же моноклональных антител содержит продукт единственного клона плазматических клеток, направленный к строго определенной антигенной детерминанте Helicobacter pylori, причём одинаково представленной у различных штаммов микроорганизма. и обладающий всегда одинаковыми физико-химическими характеристиками, и сродством к антигену. При применении гибридомной биотехнологии используются высокоаффинные антитела с заданной нужной специфичностью. Именно поэтому применение моноклональных антител в диагностике позволяет значительно увеличить специфичность и чувствительность тест-системы и как следствие более высокий процент диагностики.

Таким образом, в результате исследований были получена гибридома, стабильно продуцирующая МКА к эпитопам белкового антигена Helicobacter pylori. Были определены иммунохимические свойства и эпитопная направленность полученных МКА. Охарактеризован белковый антиген Helicobacter pylori, против которого направлены МКА, полученной гибридомы. Доказана возможность использования полученных МКА в клинической практике. Всё вышеперечисленное позволяет рекомендовать МКА, продуцируемые гибридомой В10, в перспективе, как эффективную основу для создания тест-системы, по обнаружению Helicobacter pylori.

Выводы

  1. Показана эффективность питательной среды (СЭХ), разработанной в РПЧИ, в обеспечении ростовых свойств Helicobacter pylori, а также её элективность в отношении энтеробактерий, дрожжевой флоры и протея.
  2. В результате гибридизации миеломы NSO и иммунных спленоцитов белых мышей-самок инбредной линии BALB/c получены гибридомы-продуценты моноклональных антител к белковым антигенным детерминантам Helicobacter pylori.
  3. Установлена возможность использования полученных моноклональных антител для обнаружения Helicobacter pylori в реакциях ИФА, дот-ИФА, непрямой иммунофлуоресценции и иммунопреципитации.
  4. В процессе исследования выявлена стабильная гибридома В10 с высокой пролиферативной активностью и антителопродукцией, моноклональные антитела которой отвечают диагностическим требованиями и могут быть использованы для разработки новых современных тест-систем.
  5. Определён фракционный состав белков Helicobacter pylori методом гель-электрофореза. Выявлено и охарактеризовано 11 основных белковых фракций с молекулярной массой от 20 до 65 кДа.
  6. Установлено, что моноклональные антитела, продуцируемые гибридомой В10, отличаются высокой специфичностью в отношении Helicobacter pylori. Методом иммуноблоттинга выявлен белковый антиген со средней молекулярной массой 30 ± 1 кДа, против которого направлены моноклональные антитела гибридомы В10.
  7. Выявленный белковый антиген был оценен как термолабильный, с типичной формой УФ абсорбционного спектра флуоресценции, характерной для белка.
  8. На клиническом материале показана эффективность использования моноклональных антител гибридомы В10 в диагностике Helicobacter pylori – инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

  1. Вечканов Е. М. Изучение антигенных детерминант Helicobacter pylori с помощью моноклональных антител // Известия Высших учебных заведений Северо-Кавказский регион. Приложение. Естественные науки. – 2006. - № 2. - С. 38-44., - 0,03 п. л.,- личный вклад 60%

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Вечканов Е. М. Использование моноклональных антител в диагностике и исследовании антигенных детерминант Helicobacter pylori // Электронный журнал "Исследовано в России", - 2005. - № 138, - С. 1396-1402.,- личный вклад 65%
  2. Вечканов Е. М. Оценка специфической активности моноклональных антител против Helicobacter pylori иммуноферментным анализом // В Сб. тр. 5 межд. конф. «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, РостГМУ., 2006. - С. 29-31. – 0,084 п. л., - личный вклад 50%
  3. Вечканов Е. М. Апробация и характеристика моноклональных антител, полученных к микроорганизму Helicobacter pylori // В Сб. тр. аспирантов и соискателей Ростовского государственного университета. – Ростов-на-Дону: Изд. РГУ. – 2005.-т. 11. – С. 61-63. – 0,09 п. л., - личный вклад 75%
  4. Вечканов Е. М. Исследование белковых антигенов Helicobacter pylori с помощью метода иммуноблоттинга. // В Сб. тр. 3 межд. конф. «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону, РостГМУ., 2003. - С. 30-31. – 0,084 п. л., - личный вклад 50 %

Список использованных сокращений.

МКА – моноклональные антитела

АОК – антителообразующие клетки

ПАФ – полный адъювант Фрейнда

Ig – иммуноглобулин

ИФА – иммуноферментный анализ

КЖ – культуральная жидкость

ПААГ – полиакриламидный гель

SDS – додецилсульфат натрия

СЭХ – среда элективная хеликобактерная

ХКЭА – хеликобактерный элективный агар

ТИФА – твёрдофазный иммуноферментный анализ

РПЧИ – Ростовский противочумный институт



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.