Влияние острой гипоксии и верапамила на изменения липидов в инкубированных препаратах миокарда и печени крыс
На правах рукописи
БЕЛЯКОВА Майя Борисовна
Влияние острой гипоксии и верапамила
на изменения липидов в инкубированных препаратах миокарда и печени крыс
03.00.04 - биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
ТВЕРЬ - 2007
Работа выполнена на кафедре биомедицины Тверского государственного университета и на кафедре биологической и биоорганической химии Тверской государственной медицинской академии
Научный руководитель доктор биологических наук,
профессор Панкрушина Алла Николаевна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Соколов Николай Николаевич
кандидат биологических наук, доцент Ильяшенко Дмитрий Владиславович
Ведущая организация: Московский государственный университет, биологический факультет, г. Москва.
Защита состоится 12 ноября 2007 г в ____ ч на заседании диссертационного совета К 212.263.01 в Тверском государственном университете по адресу: 170002, г. Тверь, пр. Чайковского, 70а, корп. 5, ауд. 318.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тверского государ-ственного университета по адресу: 170002, г.Тверь, ул. Володарского, 44а.
Автореферат разослан " " октября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета Костюк Н.В.
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы: Гипоксия считается компонентом большинства патологических состояний, часто предшествуя гибели организма, сопровождая развитие посмертных процессов в органах и тканях [Агаджанян Н.А., 1998]. Одним из важнейших механизмов этих изменений является запуск аутолитических процессов, вызываемый энергодефицитным состоянием [Jordano J.V., 2005], поэтому большое значение для их реализации имеют не только факторы среды переживания, но и условия, предшествовавшие смерти. Аутолиз клетки сопровождается деградацией структурных компонентов мембран, в связи с чем значительный интерес вызывают посмертные изменения липидов. Гипоксия приводит к значительной перестройке обмена липидов, в частности, ограничением их биологического окисления [Шевченко Ю.Л., 2000], поэтому должна неоднозначно влиять на липидный состав переживающих тканей. Число работ, посвященных изучению этой темы, невелико [Грибанов Г.А., 1986; Yanoshita K.R., 1993; Лещенко Д.В., 2003], но они указывают на подверженность посмертных превращений липидов влиянию предшествующих смерти кислородных условий.
Среди факторов, опосредующих развитие гипоксических повреждений, важная роль отводится внутриклеточным ионам кальция, накопление которых сказывается на активности Са2+-зависимых фосфолипаз, индуцируя липолиз структурных липидов, что ведет к нарушению функций мембран и аутолитической гибели клетки. [Siesjo B.K., 1986; Arora A.S. et al, 1996; Trump B.F. et al., 1996]. Одним из методов фармакологической коррекции патологических гипоксических состояний является защита клетки от накопления ионов кальция при помощи блокаторов кальциевых каналов [Jones D.P., 1995, Triggle D.J., 1999], среди которых широко используется верапамил, обладающий кардиопротекторными свойствами и применяемый при коронарной недостаточности. Несмотря на это, малоизученными остаются вопросы о зависимости влияния верапамила на метаболизм липидов от кислородных условий, о специфике реакции липидного компонента различных тканей на применение кальциевого блокатора, о наличии и длительности посмертного протекторного эффекта. Интересными для изучения в этом отношении объектами являются чувствительные к гипоксии, часто ишемизируемые области миокарда – верхушка и межжелудочковая перегородка сердца, а также печень, как место выполнения функций, существенных для реализации защитного действия верапамила: объединения обмена липидов, детоксикации лекарственных средств и метаболической поддержки органов, страдающих от кислородной недостаточности. Характер изменений липидного компонента ткани в ходе ее переживания in vitro может отражать предшествовавшие смерти воздействия и указывать на невыявляемые прижизненно метаболические нарушения [Грибанов Г.А., 1992], в связи с чем оценка влияния коррекции гипоксического состояния организма антагонистом кальция верапамилом на динамику липидного состава миокарда и печени в ходе их посмертной инкубации представляет собой определенный теоретический и практический интерес.
Цель исследования: Целью данного исследования явилось изучение влияния острой гипобарической гипоксии и верапамила на характер изменений липидов миокарда и печени крыс при инкубации in vitro.
Основные задачи:
1. Исследовать изменение характера превращений общих липидов в препаратах миокарда и печени крыс на различных сроках инкубации под влиянием предшествующей гипоксии.
2. Изучить действие верапамила на изменения липидного состава печени и миокарда крыс при инкубации in vitro.
3. Оценить влияние введения верапамила перед острой гипоксией на характер липидных перестроек в переживающих препаратах миокарда и печени крыс.
Научная новизна: В работе представлены новые данные о влиянии острой гипобарической гипоксии на посмертные изменения липидного компонента сердца и печени крыс. На основании полученных результатов показано участие верапамила в регуляции изменений содержания общих липидов и их отдельных представителей в миокарде и печени в обычных условиях и при кислородной недостаточности. Проведена сравнительная характеристика инкубационных изменений липидного компонента печени и сердца крыс под влиянием условий, предшествовавших переживанию: острой гипобарической гипоксии, инъекции верапамила на фоне нормоксических условий, и острой гипоксии с предварительным введением верапамила. Дан анализ возможных метаболических превращений отдельных групп липидов миокарда и печени крыс под влиянием указанных воздействий. Показано, что инкубационная модель может использоваться для получения свидетельств метаболических нарушений, не проявляющихся прижизненным изменением состава тканей вследствие воздействия физических условий (гипоксии) или фармакологических препаратов.
Практическое значение: Результаты исследования могут быть использованы для прогнозирования развития посмертных процессов в печени и сердце в зависимости от кислородных условий, предшествовавших переживанию, от применения лекарственного препарата. Полученные экспериментальные данные необходимо учитывать при разработке ребиотизационных и реанимационных мероприятиий и при трансплантации органов.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
1. Острая гипобарическая гипоксия изменяет липидный состав печени и миокарда крыс. Предшествуя переживанию тканевых препаратов, гипоксия усиливает гидролиз ФЛ и ТГ в печени и миокарде в ходе их инкубации, стимулируя при этом в миокарде также и трансацилазные перестройки: в системе ФЛДГТГ (верхушка сердца) и ФЛДГТГ, ФЛЭХ (перегородка сердца).
2. Однократная инъекция верапамила в дозе 0,6 мг/кг изменяет относительное содержание фракций липидов миокарда и печени. Применение верапамила перед инкубацией тканевых образцов способствовало трансацилазному образованию ФЛ в препаратах верхушечного миокарда, реализации трансацилазных перестановок в системе ФЛДГТГ в инкубированной перегородке сердца и усилению гидролитического распада ФЛ до СЖК на ранних сроках переживания препаратов печени.
3. Введение верапамила (в дозе 0,6 мг/кг) перед острой гипоксией препятствует уменьшению количества ОЛ, характерного для миокарда в гипоксических условиях, но не изменениям содержания отдельных фракций липидов в печени и миокарде. В ходе последующего переживания наблюдается приближение большинства липидных показателей к контрольным значениям, наиболее полное для печени, и наиболее выраженное к 1 ч инкубации всех исследованных препаратов.
Апробация работы: Материалы диссертационного исследования докладывались и обсуждались на III Областной научно-практической конференции молодых ученых «Химия и химическая технология», Тверь, 2001; научной конференции аспирантов и студентов ТвГУ, Тверь, 2001; I Международном конгрессе «Новые медицинские технологии», Санкт-Петербург, 2001; II межвузовской научной конференции молодых ученых, Тверь, 2002; 6-ой и 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука 21 века», Пущино, 2002, 2003; HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress, Montreal, 2003.
Публикации: По теме диссертации опубликовано 12 работ.
Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 182 источника, из которых 126 иностранных. Работа иллюстрирована 18 таблицами и 3 рисунками.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Исследования выполнены на беспородных белых крысах-самцах массой 120-140 г. Острую гипобарическую гипоксию создавали барокамерным методом (1 ч 30 мин при давлении 190-200 мм рт.ст. в барокамере объемом 20л) [Гефтер Ю.М. и соавт., 1962]. Животные были разделены на 4 экспериментальные группы: 1) крысы, получавшие внутрибрюшинно инъекцию физиологического раствора за 2 ч до умерщвления (контрольная группа); 2) крысы, экспонированные непосредственно перед забоем в гипоксических условиях в течение 1 ч 30 мин, получавшие внутрибрюшинную инъекцию физиологического раствора за 30 мин до помещения в барокамеру («гипоксическая» группа); 3) крысы, получавшие внутрибрюшинно инъекцию раствора гидрохлорида верапамила (0,6 мг/кг массы тела) за 2 ч до забоя; 4) крысы, которым вводили внутрибрюшинно раствор гидрохлорида верапамила в дозе 0,6 мг/кг массы тела за 30 мин до помещения в барокамеру и экспонировали в гипоксических условиях (1 ч 30 мин) до момента забоя. Умерщвление животных осуществляли путем декапитации после короткого эфирного наркоза. С соблюдением асептических условий из каждой крысы выделяли на холоду по 5 образцов (массой 20-30 мг) каждой исследуемой ткани (печень, миокард области верхушки сердца, миокард области межжелудочковой перегородки) для анализа на различных сроках инкубации, и после взвешивания начинали их термостатирование (Т=+370С) в нормоксической среде стерильного физиологического раствора. Экстракция липидов [по E.Bligh, W.Dayer, 1959] из препаратов выполнялась после 10 мин, 1ч, 4 ч, 24 ч инкубации, а также сразу после выделения образцов. Выбранные сроки инкубации соответствуют времени клинической смерти, биологической смерти (1 ч, 4 ч) и времени развития глубоких деструктивных процессов [Грибанов Г.А. и соавт., 1993]. Определение содержания общих липидов (ОЛ) производили гравиметрически [Прохорова М.И., 1982], фракционирование осуществляли с применением микротонкослойной хроматографии на силикагеле, определение содержания фракций проводили методом разложения с серной кислотой [Грибанов Г.А., Сергеев С.А., 1980]. Посмертные превращения липидного компонента оценивали по изменениям содержания отдельных липидных фракций [Грибанов Г.А., 1979, 1983]
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Характеристика и возможные биохимические механизмы влияния острой гипобарической гипоксии на изменения липидов миокарда крыс при инкубации in vitro
В сравнении с начальным состоянием (0 мин), после 10 мин инкубации образцов верхушки (рис. 1, К) достоверно возрастает содержание ФЛ и ЭХ, сочетаясь со снижением доли ДГ, Х и СЖК, что указывает на возможность образования ФЛ из ДГ и ЭХ из Х и СЖК. Через 1 ч инкубации этих препаратов выявляется понижение количества ФЛ и накопление продуктов их гидролитического распада – ДГ и СЖК, свидетельствуя о повышении активности фосфолипазы С. Такие же изменения фракций ФЛ и ДГ в сочетании с накоплением ТГ к 4 ч инкубации препаратов верхушки указывают на возможность трансацилирования в системе ФЛДГТГ. Накопление СЖК к 24 ч сопровождалось снижением доли ФЛ и ДГ, что свидетельствовало о гидролитическом распаде последних с участием различных липаз и фосфолипаз.
Таблица 1
Содержание общих липидов (мг%) в препаратах перегородки сердца крыс (М±m, n = 5–10)
| Время Группа инкубации животных | 0 ч | 10 мин | 1 ч | 4 ч | 24 ч |
| Контрольная группа | 3029,5 ±143,0 | 3401,6 ±221,2 | 2782,4 ±164,0 | 3124,6 ±107,4 | 3962,2 ±309,5* |
| Гипоксия | *2373,0 ±100,4 | 3380,2 ±317,1* | 2801,3 ±232,0 | 2582,6 ±221,3 | *2478,3 ±107,8 |
| Верапамил | 2828,5 ±62,9 | 2993,3 ±256,1 | 3569,5 ±311,4* | *2650,3 ±165,6 | 2710,3 ±139,2 |
| Гипоксия-верапамил | °2916,5 ±100,6 | 3092,4 ±267,4 | 2553,7 ±32,3* | 2423,7 ±341,9 | *2728,5 ±159,0 |
Здесь и далее:
* справа - достоверны различия в сравнении с 0 ч ( р<0,05)
* слева - достоверны различия с контролем ( р<0,05)
° слева - достоверны различия с «гипоксической» группой (р<0,05)
Таблица 2
Содержание общих липидов (мг%) в препаратах верхушки сердца крыс (М±m, n = 5–8)
| Время Группа инкубации животных | 0 ч | 10 мин | 1 ч | 4 ч | 24 ч |
| Контрольная группа | 3144,0 ±292,3 | 3292,7 ±155,6 | 2931,7 ±133,6 | 2918,2 ±55,8 | 2608,6 ±157,4 |
| Гипоксия | *2277,9 ±180,9 | *2661,9 ±63,7 | 2993,5 ±350,7 | *3112,9 ±43,8* | 2278,8 ±119,3 |
| Верапамил | 2607,7 ±372,9 | *2503,6 ±160,2 | *3397,6 ±66,6 | *2393,3 ±136,6 | 2156,5 ±264,6 |
| Гипоксия-верапамил | °3647,8 ±308,3 | °2997,0 ± 71,1 | 2902,8 ± 422,2 | 2941,5 ± 353,7 | °*1953,5± 26,5* |
В препаратах перегородки сердца (рис. 2, К) состав фракций стабилен практически на всех сроках инкубации, кроме последнего: к 24 ч происходит снижение ФЛ и накопление СЖК, что связано с повышением активности фосфолипаз в предшествующий период времени. Возрастание массы ОЛ, отмечавшееся к 24ч инкубации в миокарде перегородки (табл.1), может объясняться образованием липидов из нелипидных компонентов клетки, хотя не исключено, что это связано с увеличением полноты экстракции.
После острой гипоксии в миокарде отмечается пониженное количество ОЛ (табл. 1,2). В последние годы для сердца доказана возможность экспорта ТГ в комплексах, подобных –липопротеидам, что защищает его от липогенного апоптоза [Nielsen L.B., 2002], возникающего в гипоксических условиях из-за невозможности утилизации жирных кислот, образующихся вследствие активации фосфолипаз [Braunwald E., 2001]. В верхушке сердца гипоксия вызвала увеличение доли ЭХ (рис. 1,Г). Инкубационные изменения в верхушечном миокарде «гипоксических» крыс проявляются гидролитическим распадом ЭХ к 10 мин, который на других сроках инкубации не наблюдается. К 1 часу инкубации преобладают процессы гидролитической деградации запасных (ТГ) и структурных (ФЛ) липидов вследствие активности липаз [Vusse G.J. et al, 1989] и фосфолипазы С. Отмечающееся к 4 ч инкубации увеличение абсолютного содержания ОЛ и ФЛ происходит с участием трансацилазных превращений ТГ в ФЛ через стадию ДГ. Наблюдающееся после суточной инкубации снижение ФЛ и накопление СЖК может объясняться активностью фосфолипазы С и липаз, гидролитически расщепляющих ФЛ на ДГ и далее на СЖК.
В образцах перегородки (рис.2, Г) гидролитический распад ФЛ выражен в поздний период инкубации (4, 24 ч) и менее явно - к 1 часу, так как на этом сроке снижение количества ФЛ сопровождается увеличением доли других фракций, в том числе гидролитических продуктов (СЖК). Кроме гидролитических механизмов, к 1 ч инкубации возможны и трансацилазные перестановки в системах ФЛДГТГ, ФЛЭХ. К 4 ч переживания образцов перегородки отмечается гидролитический распад ФЛ под действием фосфолипазы С и дальнейшая их деградация с участием ди- и моноглицеридлипаз, так как снижение уровня ФЛ на этом сроке сочетается с одновременным ростом содержания ДГ и СЖК. Деградация ФЛ, отмеченная через сутки инкубации, может объясняться активностью фосфолипазы С, а накопление значительного количества СЖК вместо ДГ - разрушением последних липазами.
Гипоксия, предшествующая инкубации, вызывает отклонения липидных показателей от контрольных значений, которые следует оценить как результат гипоксического повреждения клеток – уменьшение количества
Рис. 1. Изменения содержания липидных фракций в препаратах верхушки сердца при инкубации in vitro.
Группы экспериментальных животных: К – контроль; Г – гипоксия; В – верапамил; Г+В – гипоксия + верапамил.
– 0 ч; – 10 мин; – 1 ч; – 4 ч; – 24 ч
Достоверно (при р<0,05) по сравнению: * – с 0 ч; • – с группой К; – с группой Г; – с группой В.
Рис. 2. Изменения содержания липидных фракций в препаратах перегородки сердца при инкубации in vitro.
Группы экспериментальных животных: К – контроль; Г – гипоксия; В – верапамил; Г+В – гипоксия + верапамил.
– 0 ч; – 10 мин; – 1 ч; – 4 ч; – 24 ч
Достоверно (при р<0,05) по сравнению: * – с 0 ч; • – с группой К; – с группой Г; – с группой В.
структурных липидов, их превращение в запасные липиды [Nielsen L.B., 2002], продукты гидролиза или полная деградация [Zhang J.P. et al, 2007].В перегородке гипоксия приближает срок посмертного гидролитического распада липидов (1 ч), а в препаратах верхушки сердца она оказалась способна отсрочить аутолитические изменения ткани (4 ч).
2. Влияние кальциевой блокады перед гипобарической гипоксией на липидный состав инкубированного миокарда крыс.
Состав липидов миокарда крыс, получавших верапамил, отличается от контрольных повышенным количеством ЭХ, причем в перегородке за счет доли ТГ (рис. 2, В). Изменения в препаратах перегородки, отмеченные через 10 мин инкубации, связаны с гидролитическим распадом ЭХ до Х, а также трансацилазными перестановками в системе ФЛДГТГ. В верхушечном миокарде, напротив, происходит этерификация свободного холестерина и синтез ФЛ из ДГ. Явное влияние верапамила на холестериновые фракции объясняется способностью кальциевых блокаторов связываться с мембранным холестерином [Mason R.P. et al, 1998]. Прирост ОЛ за счет, главным образом, ДГ и ТГ через 1 ч переживания образцов перегородки свидетельствует о включении неэтерифицированных жирных кислот в состав глицеридов. В верхушечном миокарде в этот срок инкубации (рис.1, В) происходит трансацилазное образование ФЛ из ДГ и ТГ. При дальнейшей инкубации (4 ч) образцов верхушки тенденция к образованию ФЛ из ДГ сохраняется, но без участия ТГ. В перегородке после 4-часовой инкубации также наибольшее значение имели трансацилазные механизмы, протекавшие в направлении ФЛДГТГ. Усиление трансацилазных реакций могло быть вызвано угнетением карнитинового транспортера [Tein I., 2003]. Изменения, отмеченные через 24 ч переживания образцов обоих исследованных видов миокарда, объясняются активностью фосфолипазы С и липаз, гидролитически расщепляющих ФЛ на ДГ и далее на СЖК. В образцах верхушки, кроме гидролитических механизмов, отмечалось также участие трансацилазного образования ТГ.
Таким образом, прижизненная блокада кальциевых каналов миокарда вызывает накопление эфиров холестерина, а затем трансацилазные перестройки липидов при переживании препаратов, в перегородке - на всех сроках инкубации, в образцах верхушки сердца – к 1 ч и 4 ч инкубации, задерживая при этом в последних посмертную деградацию структурных липидов.
В препаратах перегородки сердца крыс, получавших инъекцию верапамила перед гипоксией (рис 2, Г+В), после 10 мин инкубации происходят трансацилазные перестановки липидов в системе ТГДГФЛ. После 4 ч инкубации образцов перегородки сердца достоверное снижение ФЛ и Х сопровождается повышением ТГ, ДГ и СЖК, что указывает на гидролиз ФЛ с участием фосфолипазы С и липаз, а также трансацилазное образование ТГ из ФЛ. Снижение уровня ФЛ к концу суток переживания препаратов можно объяснить их гидролитическим распадом с участием различных фосфолипаз, так как отмечается параллельное накопление СЖК и ДГ, а повышение доли ТГ заставляет предполагать трансацилазное образование ТГ из ФЛ. В некоторых исследованиях отмечалась и ранее неэффективность кальциевой блокады в присутствии лизофосфолипидов или СЖК [Xu Y.J. et al, 2002; Gueret G. et al, 2007].
Происходившее при инкубации образцов верхушки сердца (рис.1, Г+В) возрастание доли ФЛ, отмеченное к 10 мин и после 1 ч инкубации, объясняется трансацилазными перестройками в направлении ФЛДГТГ. Достоверное снижение содержания ЭХ и ДГ с повышением доли ТГ к 4 ч инкубации образцов свидетельствовует об образовании ТГ из ДГ, возможно, трансацилазным переносом ЖК с ЭХ. Суточная инкубация приводит к изменениям липидных показателей, характерным для гидролиза с участием липаз. Таким образом, после сочетанного воздействия гипоксии и верапамила для большинства изученных сроков инкубации в образцах миокарда характерна реализация трансацилазных механизмов образования липидов, что отмечается только для некоторых сроков инкубации образцов, полученных после гипоксии.
Протекторное действие верапамила в отношении постгипоксического повреждения липидов в верхушечном миокарде отмечается на ранних сроках переживания (10 мин и особенно к 1 часу), тогда как на поздних сроках инкубации последствия кальциевой блокады скорее деструктивные. Улучшая композицию липидов при раннем переживании препаратов, верапамил отодвигает во времени аутолитическую деградацию мембран, но усугубляет ее к 4 ч. При инкубации образцов перегородки сохраняющее липиды действие верапамила заметно к 1 часу и, менее явно, к отдаленным срокам переживания - к 4 ч и к 24 ч. Полученные результаты показывают, что в препаратах перегородки эффект коррекции верапамилом гипоксического повреждения наступает медленнее, но продолжается дольше по сравнению с верхушечным миокардом.
3. Специфика посмертных изменений липидного состава печени крыс под влиянием предшествующей острой гипоксии и верапамила.
В контрольных образцах печени изменения липидного состава выявлены только на последних сроках инкубации, что выразилось в снижении содержания ФЛ (4 ч и 24 ч) и ТГ (24ч) в сочетании с повышением доли СЖК. Это указывает на активацию гидролитического распада структурных, а затем и запасных липидов с участием липаз и фосфолипаз (рис.3, К). Способность гепатоцитов к детоксификации литических и ксенобиотических продуктов, богатство ферментного состава и разнообразие синтетической деятельности печени в организме, устойчивость к гипоэнергетическим состояниям, видимо, составляют основу тканевой резистентности к быстрой посмертной деградации, поскольку изоляция должна снижать упомянутые виды метаболической нагрузки на печень по сравнению с состоянием in vivo.
После гипоксии в печени животных обнаружено более высокое, чем в контроле, содержание ТГ (рис. 3, Г), что отмечалось и другими исследователями [Bruder E.F. et al, 2005; Li J. et al, 2005]. Это может быть следствием антигипоксической защиты гепатоцита от высвобождения и накопления ЖК путем их связывания в составе ТГ [Listenberger L.L. et al, 2003; Wei Y. et al, 2006], а также затрудненности окисления ТГ из-за дефицита кислорода и переключения печени преимущественно на углеводный обмен в этих условиях. Изменения содержания ОЛ (табл.3) и их фракций, вызванные 10-минутной инкубацией, указывают на преимущественный распад ФЛ с образованием ДГ при участии фосфолипазы С. Изменения, выявленные через час и через 4 ч инкубации, свидетельствуют об усилении гидролиза не мембранных, а запасных глицеридов при помощи липаз. К 24 ч переживания препаратов печени убыль структурных и запасных глицеридов сопровождается накоплением продуктов их гидролиза, характерных для действия липаз и фосфолипаз [Arora A.S. et al, 1996].
Таблица 3
Содержание общих липидов (мг%) в препаратах печени крыс
(М±m, n = 5–8)
| Время Группа инкубации животных | 0 ч | 10 мин | 1 ч | 4 ч | 24 ч |
| Контрольная группа | 6088,4 ±473,3 | 6013,5 ±201,9 | 5513,1 ±241,5 | 5379,8 ±178,0 | 5612,6 ±199,3 |
| Гипоксия | 6569,4 ±566,8 | *4848,5 ±435,9* | 5036,7 ±493,7 | 5064,7 ±603,5 | *4462,9 ±316,1* |
| Верапамил | 5975,3 ±548,9 | 5985,1 ±481,1 | 4997,8 ±436,8 | 6070,2 ±254,8 | 6248,9 ±562,5 |
| Гипоксия-верапамил | 5458,1 ±577,5 | 5348,6 ±412,1 | 4962,2 ±234,8 | 5259,7 ±604,3 | °5643,5 ±340,3 |
Рис. 3. Изменения содержания липидных фракций в ткани печени при инкубации in vitro.
Группы экспериментальных животных: К – контроль; Г – гипоксия; В – верапамил; Г+В – гипоксия + верапамил.
– 0 ч; – 10 мин; – 1 ч; – 4 ч; – 24 ч
Достоверно (при р<0,05) по сравнению: * – с 0 ч; • – с группой К; – с группой Г; – с группой В
Таким образом, под влиянием прижизненной гипоксии происходят ранние гидролитические изменения липидного компонента печени при переживании ее препаратов (10 мин, 1 ч), к 4 ч дальнейшей инкубации аутолитическая деградация структурных липидов замедляется, но усугубляется к концу суток переживания ткани. Эта тенденция отмечается также для препаратов верхушки сердца, но в деталях механизмы и результаты липидных перестроек в переживающих образцах печени специфичны.
После инъекции верапамила в печени крыс изменяется доля различных гидролитических продуктов, запасных и мембранных липидов (рис.3, В). Отмеченное после 10 мин инкубации достоверное возрастание концентрации СЖК в сочетании с параллельным снижением доли ФЛобъясняется гидролизом структурных липидов под действием фосфолипаз А. После часовой инкубации разрушения структурных липидов не происходит, их количество выравнивается с начальным, но связывание СЖК, видимо, затруднено вследствие гипоэнергетического состояния гепатоцитов. Длительная инкубация (4 ч) приводила к таким же изменениям состава липидов печени, как и короткая (10 мин), показывая преобладание гидролитических механизмов, что к 4 ч переживания отмечалось и в контроле. Результаты 24-часовой инкубации печени крыс, получавших верапамил, можно объяснить гидролитической деградацией структурных и запасных липидов с участием фосфолипаз А1, А2 и липаз. Снижение содержания Х в этих препаратах является косвенным свидетельством протекания трансацилазных реакций в системе ФЛХЭХ. Таким образом, прижизненное применение верапамила индуцирует ранний гидролитический распад структурных липидов в переживающих образцах печени крыс, но при продолжении инкубации влияние кальциевого блокатора на липидный компонент практически исчезает.
При сравнении липидных показателей печени крыс, получавших инъекцию верапамила перед острой гипоксией (рис.3, Г+В), с другими группами, отличие от контроля оказалось наиболее выраженным: отмечен повышенный уровень ДГ и пониженный - структурных липидов и СЖК. В свою очередь, контрольные значения содержания липидов значительнее отличаются не от «гипоксических» показателей, а от результатов применения верапамила перед нормоксической и гипобарической экспозицией. Вероятно, введение верапамила оказывает дополнительную нагрузку на печень, что приводит к дисбалансу липидного обмена, в отличие от собственно гипоксии, при которой липидные показатели сходны с контрольными. В ходе инкубации препаратов печени крыс, получавших инъекцию верапамила перед острой гипоксией, обнаружились изменения липидного компонента, свидетельствующие об обновлении структурных липидов при раннем переживании. Так, при отсутствии изменений общего содержания липидов, после 10 мин инкубации возрастает доля ФЛ при снижении количества ДГ [Li J. et al, 2007], что свидетельствует об образовании мембранных липидов из гидролитических продуктов. Эффективность защиты гепатоцитов от аноксической гибели путем связывания кальция отмечалась и ранее [Pastorino J.G. et al, 1995]. В результате дальнейшей инкубации (1 ч) содержание фракций липидов возвращается на исходный уровень, однако к 4 ч инкубации возобновляются их изменения, указывающие на активацию гидролитического разрушения структурных липидов. После 24 ч инкубации убывает доля структурных и запасных глицеридов, что в сочетании с накоплением СЖК свидетельствует о гидролитической деградации липидного компонента с участием липаз и фосфолипаз.
Таким образом, инъекция верапамила не способствует стабилизации липидного компонента печени при жизни, но препятствует развитию постгипоксических инкубационных повреждений липидов, что особенно заметно на ранних сроках переживания и частично проявляется на поздних сроках инкубации. Отмечено сходное действие верапамила и на препараты перегородки сердца, тогда как в верхушечном миокарде протекторный эффект наступал и заканчивался на более ранних сроках. В сравнении с инкубационными изменениями миокарда в этих условиях, печень характеризовалась меньшим участием трансацилазных превращений.
Полученные результаты свидетельствуют о специфике влияния верапамила на превращения липидов в разных тканях при различных сроках переживания в сочетании с кислородной недостаточностью.
ВЫВОДЫ
1. В образцах миокарда, выделенных из верхушки сердца контрольных крыс, к 10 мин инкубации достоверно возрастало содержание фракции ФЛ, ЭХ и уменьшалось количество ДГ, Х и СЖК, при последующей инкубации содержание ФЛ снижалось с параллельным накоплением гидролитических продуктов, а также ТГ к 4 ч. В препаратах перегородки к 24 ч инкубации отмечалось понижение содержания ФЛ и накопление СЖК и ОЛ, на остальных сроках происходило повышение уровня ДГ.
2. Острая гипобарическая гипоксия (1 ч 30 мин 190-200 мм рт.ст.) характеризовалась пониженным количеством ОЛ в миокарде крыс и вызывала однократное увеличение содержания ОЛ в ходе инкубации: после 10 мин для образцов перегородки и после 4 ч – верхушки. В миокарде обеих областей сердца отмечалось снижение ФЛ к 1ч и 24 ч и накопление СЖК к 24 ч. Особенностью образцов перегородки было возрастание доли ДГ, СЖК, ТГ, ЭХ к 1 ч, ДГ и СЖК в сочетании со снижением количества ФЛ - к 4 ч. В верхушечном миокарде после 10 мин инкубации происходил распад ЭХ, к 1 ч – ФЛ и ТГ с накоплением ДГ, к 4 ч отмечалось снижение доли ТГ и СЖК одновременно с увеличением количества ФЛ.
3. Внутрибрюшинное введение крысам верапамила (0,6 мг/кг) увеличивало содержание ЭХ в миокарде. В ходе инкубации образцов верхушки отмечался рост содержания ФЛ (1 ч, 4 ч) и снижение уровня ДГ, СЖК и ТГ (1ч), в препаратах перегородки сердца возрастала доля ДГ, Х, ТГ и снижалось количество ФЛ к 10 мин и 4 ч переживания. Наибольшее сходство липидных показателей с контрольными значениями обнаруживалось через 1 ч инкубации препаратов перегородки и после 24 ч инкубации образцов верхушки сердца.
4. Острая гипоксия на фоне верапамила (внутрибрюшинно 0,6 мг/кг) вызывала в инкубированных препаратах миокарда однократное снижение содержания ОЛ (через 1 ч - в перегородке, после 24 ч - в верхушке сердца) и колебательные изменения количества ТГ; доля ФЛ в образцах перегородки уменьшалась через 10 мин, 4 ч, 24 ч инкубации, увеличиваясь только к 1 ч, а в образцах верхушки сердца - повышалось на ранних сроках инкубации. При сравнении с контрольными показателями наиболее существенными были отличия, отмечавшиеся после 10 мин, 4 ч и 24 инкубации препаратов миокарда, а для образцов верхушки - также и до инкубации (0 мин).
5. При инкубации препаратов печени контрольных крыс отмечалось увеличение количества СЖК и снижение содержания ФЛ после 4 ч и 24 ч инкубации, а также уменьшение доли ТГ после 24 ч. Под влиянием острой гипоксии в препаратах печени крыс после 10-минутной и суточной инкубации происходило снижение содержания ОЛ и ФЛ с параллельным нарастанием доли ДГ, после 1 ч и 4 ч – уменьшение количества ТГ и увеличение содержания СЖК, к концу суток инкубации – все описанные изменения.
6. Введение верапамила (внутрибрюшинно, 0,6 мг/кг) крысам вызывало снижение содержания ФЛ с параллельным накоплением СЖК в течение всей посмертной инкубации печени, а также разрушение ТГ после суток переживания препаратов. Значительные отличия по содержанию отдельных фракций от контрольных образцов печени отмечались до инкубации и после 10 мин переживания.
7. Острая гипоксия на фоне верапамила приводила к повышению содержания ФЛ с понижением доли ДГ и Х к 10 мин инкубации препаратов печени; через 4 и 24 ч инкубации увеличивалось количество СЖК с уменьшением содержания ФЛ (после 4 ч и 24 ч) и ДГ, Х, ТГ (24 ч). Отличия от липидных показателей контрольных образцов выявлены до инкубации и на поздних (4 ч и 24 ч) сроках переживания.
Список публикаций по теме диссертации
- Грибанов Г.А., Белякова М.Б., Лещенко Д.В. и др. Влияние острой гипобарической гипоксии на характер изменений липидов в аутолизирующейся in vitro печени белых крыс // Тез. докл. Viii Областной научно–технической конф. молодых ученых "Химия и химические технологии".- Тверь, 2001.- С. 9.
- Белякова М.Б. Влияние острой гипобарической гипоксии на характер аутолитических изменений липидов миокарда белых крыс. // Тез. докл. научной конференции аспирантов и студентов ТвГУ. - Тверь, 2001. - С. 25-26.
- Грибанов Г.А., Лещенко Д.В., Белякова М.Б. Хронобиологические аспекты влияния острой гипобарической гипоксии на аутолитические изменения липидов головного мозга, миокарда и печени крыс in vitro // Тез. докл. 1 Междунар. Конгр. "Новые медицинские технологии". – СПб, 2001. - С. 123–124.
- Белякова М.Б., Грибанов Г.А., Лещенко Д.В. и др. Изменения липидных показателей головного мозга и миокарда крыс под влиянием острой гипобарической гипоксии при аутолизе in vitro //Тез. докл. 6–ой Пущинской конф. молодых ученых "Биология – наука 21 века". - Пущино, 2002. - С. 276.
- Белякова М.Б., Лещенко Д.В., Головко М.Ю. Изменения липидов миокарда и печени белых крыс после действия острой гипобарической гипоксии при аутолизе in vitro // Тез. докл. II Межвуз. науч. конф. молодых ученых. – Тверь, 2002. - С. 15-16.
- Белякова М.Б., Лещенко Д.В., Грибанов Г.А. и др. Влияние острой гипобарической гипоксии и верапамила на посмертные изменения липидных показателей головного мозга и миокарда крыс // Тез. докл. 7–ой Пущинской конф. молодых ученых "Биология – наука 21 века". - Пущино, 2003. - С. 310.
- Gribanov G.A., Leshchenko J.V., Belyakova M.B. Effect of Acute Hypoxia on Lipid Alterations of Rats’ Brain, Liver and Myocardium During Autolysis in Vitro //HUPO 2nd Annual & IUBMB XIX World Congress, 2003: Abstr.- Montreal, 2003. – Vol. 2.9. Molecular & Cellular Proteomics. – P.985.
- Лещенко Д.В., Белякова М.Б., Боринский Ю.Н., Слюсарь Н.Н. Использование экспериментальной модели аутолиза для изучения действия верапамила на фосфолипидный компонент мозга и печени крыс//Естествознание и гуманизм.- Сборник научных работ.-Под ред. Н.Н. Ильинских. Том 1, №1. - Томск, 2004.-С.43-44.
- Белякова М.Б., Панкрушина А.Н., Лещенко Д.В. Влияние острой гипоксии на посмертные изменения фосфолипидов печени крыс //Естествознание и гуманизм.- Сборник научных работ.-Под ред. Н.Н. Ильинских. Том 2, №3. - Томск, 2005.-С.63.
- Лещенко Д.В., Белякова М.Б., Боринский Ю.Н., Панкрушина А.Н., Макарова И.Л. Действие блокатора кальциевого канала верапамила на посмертные изменения липидов мозга и печени крыс //Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга: сб. статей. – ИЗПУ «Информкнига», М., 2006. – с. 159-162.
- Лещенко Д.В., Белякова М.Б., Боринский Ю.Н., Панкрушина А.Н. Использование модели посмертной инкубации тканей для изучения влияния острой гипобарической гипоксии на изменения липидов головного мозга и миокарда крыс.// Новые технологии в территориальном здравоохранении.- Сб. научно-практ. работ. – под ред. Б.Н.Давыдова. – Тверь, 2006. – с. 59-61.
- Лещенко Д.В., Белякова М.Б., Боринский Ю.Н., Панкрушина А.Н., Костюк Н.В., Гусева В.В.. Влияние верапамила на постгипоксические изменения липидов в препаратах миокарда и мозга крыс при инкубации in vitro//Технологии живых систем, т.4, №2. – М., 2007. - с. 53-59.
СПИСОК СОКРАЩЕНИй
ДГ - диацилглицерины
ОЛ – общие липиды
СЖК – свободные жирные кислоты
ТГ – триацилглицерины
ФЛ – фосфолипиды
Х - холестерин
ЭХ – эфиры холестерина
Диссертант выражает глубокую благодарность и признательность соавторам публикаций за неоценимую помощь в работе.
