WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Изучение, разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм

На правах рукописи

Безруков Владислав Михайлович

Изучение, разработка и стандартизация

микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм

03.00.07 – микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2006

Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Быков Анатолий Сергеевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Воропаева Светлана Дмитриевна

доктор биологических наук Раковская Ирина Валентиновна

Ведущая организация:

ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени

И.И. Мечникова РАМН

Защита состоится «___» ___________ 2006 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.08 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49)

Автореферат разослан «___»___________ 2006 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук,

профессор Миронов Андрей Юрьевич

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Уреаплазменная инфекция продолжает оставаться одной из актуальных проблем клинической микробиологии. Возбудители - Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum часто колонизируют урогенитальную систему человека. Обычно наблюдается бессимптомное носительство уреаплазм среди клинически здоровых лиц. Вместе с тем, уреаплазменная инфекция может сопровождаться развитием патологических процессов, в числе которых негонококковый уретрит, хориоамнионит, преждевременные роды, поражение дыхательной системы и ЦНС у преждевременно родившихся детей, артриты у лиц со сниженным иммунитетом и др. (Гамова Н.А., 1993; D. Taylor-Robinson, 1996; Раковская И.В., 1999; M. Abele-Horn et al., 2000; C. Skevaki, D.A. Kafetzis, 2003). В связи с этим, существует необходимость в объективном и достоверном выявлении Ureaplasma spp. в клиническом материале.

Лабораторные методы исследований играют решающую роль в диагностике уреаплазменной инфекции вследствие отсутствия четких клинических проявлений, широкого распространения бессимптомного носительства и частого сочетания уреаплазм с другими инфекционными агентами. Несмотря на широкое использование в настоящее время молекулярно-биологических методов диагностики уреаплазменной инфекции, микробиологический метод сохранил позиции наиболее достоверного и информативного метода, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять бактерии рода Ureaplasma, определять их количество в исследуемом клиническом материале, а также чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам (K.B. Waites et al., 2001; Дмитриев Г.А., 2003).

Культивирование уреаплазм, чрезвычайно требовательных к составу питательных сред, связано с рядом трудностей, в числе которых отсутствие сред определенного состава, сложность состава сред, необходимость максимального соответствия состава питательным потребностям бактерий рода Ureaplasma, а также необходимость оценки ростовых свойств сред и их отдельных компонентов (Раковская И.В., 1999; K.B. Waites et al., 2001).

В настоящее время отмечается тенденция перехода от классических микробиологических исследований к современным технологиям анализа; при этом большее значение придается оптимизации, стандартизации, а также упрощению и автоматизации метода. Весьма перспективным является использование микротест-систем, избавляющих практических микробиологов от трудоемких работ и позволяющих получить стандартные, воспроизводимые результаты (Скала Л.З. и соавт., 2004).

Стремление к усовершенствованию и стандартизации микробиологического метода реализовано разработкой и внедрением в практику за рубежом ряда наборов для выявления и идентификации урогенитальных микоплазм, определения их количества и чувствительности к антибактериальным препаратам, в числе которых «Mycoplasma Lyo», «Mycoplasma IST» (bioMerieux, Франция); «Mycoplasma Duо», «Mycoplasma SIR» (Bio-Rad, Франция); «Mycofast All-In», «Mycofast Evolution 2», «Mycofast US» (International Microbio, Франция). Показано, перечисленные выше наборы обладают высокой диагностической эффективностью (M. Sillis, 1993; M. Abele-Horn et al., 1996; S.A. Poulin, R.B. Kundsin, 1997; Гладкова Н.С. и соавт., 1999; R. Aaltone et al., 2002; F.-C. Cheah et al., 2005). Однако в России эти диагностические наборы имеют ограниченное использование, прежде всего, в связи с их достаточно высокой ценой; некоторые из них недоступны вообще.

В нашей стране еще недостаточно решена проблема микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, хотя имеются питательные среды лабораторного изготовления для выявления Ureaplasma spp.; однако, производственный выпуск данных препаратов, разрешенных для использования в Российской Федерации, отсутствует.

В свете сказанного, несомненно важнейшей задачей является совершенствование микробиологического метода как основного, наиболее объективного и информативного метода диагностики уреаплазменной инфекции. Перечисленные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.

Цель исследования – разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp..

Задачи исследования

1. Разработать селективную питательную среду для культивирования Ureaplasma spp.. Изучить рост штаммов уреаплазм на предложенной среде. Оценить селективные свойства среды и пригодность для выявления уреаплазм в образцах клинического материала.

2. Разработать транспортную среду для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала.

3. Разработать метод оценки роста уреаплазм на основе измерения оптической плотности культур в процессе роста на предложенной питательной среде.

4. Разработать методику оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в лабораторных условиях.

5. Создать микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. и внедрить ее в практику здравоохранения.

6. Разработать методику оценки качества микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. в клинико-эпидемиологических испытаниях.

7. Разработать программу проведения государственных испытаний микротест-системы совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитетом МИБП.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложенная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест» обеспечивает стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции.

2. Методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяют определить концентрацию уреаплазм в исследуемом материале.

3. Изменение оптической плотности среды в экспоненциальной фазе роста культуры Ureaplasma spp. в стандартных условиях культивирования отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм.

4. Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста культур тест-штамма в средах сравнения и испытуемой в стандартных условиях позволяет оценить ростовые свойства испытуемой среды.

5. Критерий диагностической эффективности U=U(P) позволяет в клинико-эпидемиологических испытаниях определить ценность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.

Научная новизна

В связи с необходимостью усовершенствования микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, нами разработаны селективная питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. и транспортная среда для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала. На основе разработанных сред впервые предложена микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. - «Уреаплазма Микротест».

Использование микротест-системы позволяет: 1) выявлять и идентифицировать бактерии рода Ureaplasma; 2) определять обсемененность исследуемого материала уреаплазмами, что важно для оценки их этиологической роли в развитии патологических процессов в урогенитальной системе; 3) оценивать чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам, являющуюся основанием для рационального выбора антибактериальной терапии и одновременно дифференциально-диагностическим критерием идентификации (по отношению штаммов Ureaplasma spp. к антибиотикам групп макролидов и линкозамидов).

Впервые предложен оригинальный метод определения концентрации уреаплазменных культур в экспоненциальной фазе роста по измерению оптической плотности среды, что позволило разработать метод строгой оценки ростовых свойств питательной среды в условиях лаборатории и стандартизовать инокулят при определении чувствительности штаммов Ureaplasma к антибактериальным препаратам.

Впервые разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp., основанный на анализе кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в средах сравнения и испытуемой.

Разработана программа клинико-эпидемиологических испытаний диагностической микротест-системы с использованием принципов доказательной медицины. Показана высокая диагностическая эффективность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.

Научно-практическая значимость

В теоретическом плане проведенные исследования расширяют представления о биологических свойствах бактерий рода Ureaplasma; позволяют оптимизировать методические подходы к определению количества уреаплазм в культурах и образцах клинического материала и стандартизовать процесс выявления и идентификации Ureaplasma spp..

Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология производства микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Разработаны и утверждены фармакопейная статья предприятия ФСП № 42-0115624405 на микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест»; инструкция по применению препарата № 01-041/135-05 и производственный регламент № 01897593-00805.

Получен патент 2265656 на разработанную питательную среду для выявления Ureaplasma spp. и способ диагностики.

Полученный фактический материал представляет интерес при конструировании препаратов для диагностики урогенитальных микоплазмозов другой этиологии, например, вызванных Mycoplasma hominis.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004); 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); научной конференции кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ММА им. И.М. Сеченова (14 июня 2006 года, протокол № 29).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 в центральной печати.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 39 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. В работе использовано 39 отечественных и 223 зарубежных источников литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали штаммы микроорганизмов: 1) Ureaplasma spp. и Mycoplasma hominis коллекционные, из коллекции живых культур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (U. parvum серотип 1, U. urealyticum серотип 8, M. hominis Н-34) и авторской коллекции штаммов урогенитальных микоплазм, выделенных от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И.М. Сеченова (U. parvum 455, 465, 468, 481; U. urealyticum 1Т, 2Т; M. hominis 199, 205, 233), а также свежевыделенные от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И.М. Сеченова; 2) коллекционные штаммы бактерий (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Proteus morganii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis), а также штамм Candida albicans из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.

Для культивирования штаммов Ureaplasma spp. использовали питательную среду для выявления Ureaplasma spp. (Шипулин Г.А., Безруков В.М., 2004); стандартный бульон 10С (M.C. Shepard, C.D. Lunceford, 1978) и дифференциальный агар А7 (M.C. Shepard, C.D. Lunceford, 1976). Для культивирования штаммов M. hominis использовали стандартный бульон 10В (K.B. Waites et al., 2001). Коллекционные штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также штамм Candida albicans культивировали на питательном агаре, приготовленном на основе сердечно-мозговой вытяжки.

Штаммы Ureaplasma spp. засевали в 10 мл питательной среды, инкубировали при температуре 37 оС в течение 16-20 часов. Затем 100 мкл культуры в экспоненциальной фазе роста (о чем свидетельствовало начало изменения цвета питательной среды с желтого на красный) засевали вновь в 10 мл среды роста, инкубировали при температуре 37 оС в течение 16-20 часов до момента начала изменения цвета среды. Подготовленные таким образом культуры уреаплазм находились в экспоненциальной фазе роста и содержали минимальное количество нежизнеспособных клеток.

Культивирование уреаплазм в жидкой питательной среде в стандартных условиях проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах (Sarstedt, Германия) в объеме среды 250 мкл. Для предотвращения испарения среды, а также улетучивания и распространения аммиака, в лунки вносили по 70 мкл стерильного минерального масла. Оптическую плотность среды в процессе роста культур измеряли с помощью планшетного фотометра MRX (Dynex technologies, Inc., США) при длине волны 570 нм.

Штаммы Ureaplasma spp. также культивировали на дифференциальном агаре А7 при температуре 37 оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 72 часов.

Штаммы M. hominis засевали в 10 мл бульона 10B и инкубировали при температуре 37 оС в течение 36-48 часов до момента изменения цвета среды с красного на малиновый.

Культуры коллекционных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий и Candida albicans пересевали в пробирку и чашку Петри с питательным агаром и инкубировали при температуре 37 оС в течение 18-20 часов. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяли визуально на чистоту роста и отсутствие диссоциации и пересевали в пробирку со скошенным питательным агаром. После инкубации посевов при температуре 37 оС в течение 18-20 часов культуры штаммов смывали с поверхности агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида, доводили концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандарту мутности, что соответствует примерно 109 клеток/мл. Полученные взвеси разводили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 108 клеток/мл.

Для определения количества жизнеспособных клеток Ureaplasma spp. готовили серию 10-кратных (от 10-1 до 10-8) и 2-кратных (от 10-4 до 0,062510-4; от 10-5 до 0,062510-5; от 10-6 до 0,062510-6) разведений культуры уреаплазм в питательной среде. Каждое разведение вносили по 250 мкл в 10 лунок культурального планшета, в лунки добавляли по 70 мкл стерильного минерального масла. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37 оС в течение 72 часов. Затем подсчитывали в каждом ряду количество лунок, в которых произошло изменение цвета среды вследствие роста уреаплазм. Число цветообразующих единиц (ЦОЕ50) рассчитывали по методам L.J. Reed, H. Muench (1938) и B. Behrens, C. Karber (1935). Наиболее вероятное количество (НВК) бактерий рассчитывали по методу D.J. Finney (1952) и с использованием таблиц НВК (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967).

Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам проводили микрометодом серийных разведений в жидкой питательной среде. Для этого штаммы Ureaplasma spp., находящиеся в экспоненциальной фазе роста, культивировали при температуре 37 оС в течение 16-24 часов в 96-луночных планшетах под слоем минерального масла в 250 мкл питательной среды, содержащей доксициклин, эритромицин, кларитромицин, мидекамицин, джозамицин, азитромицин, линкомицин, клиндамицин, ципрофлоксацин и офлоксацин в концентрации 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16 и 32 мкг/мл и спирамицин в концентрации 40, 50 и 60 мкг/мл. Концентрация уреаплазм в среде составляла 104±0,2104 клеток/мл. Минимальную ингибирующую концентрацию антибактериального препарата определяли как наименьшую концентрацию препарата, ингибирующую рост (т.е. предотвращающую изменение цвета питательной среды) в течение 16-24 часов инкубации посевов в термостате.

Для идентификации Ureaplasma spp. методом ПЦР использовали систему олигонуклеотидных праймеров, специфичных для генов 16S рРНК Ureaplasma spp. и позволяющих идентифицировать вид уреаплазм (Безруков В.М. и соавт., 1998).

Определение количества копий генома Ureaplasma spp. проводили методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием TaqMan-зондов. В качестве мишени для праймеров и TaqMan-зонда в геноме Ureaplasma spp. использовали участок гена 16S рРНК. Зонд с красителем Fam использовали для детекции ДНК Ureaplasma spp., зонд с красителем Joe – для детекции неконкурентного внутреннего контрольного образца. ДНК Ureaplasma spp. выделяли с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ» (ЦНИИ эпидемиологии) из 100 мкл культуры с добавлением 1,0104 копий/мл неконкурентного внутреннего контрольного образца для оценки эффективности выделения и амплификации. ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием набора «Ureaplasma species – FRT» (ЦНИИ эпидемиологии) в термоциклере с системой детекции флюоресцентного сигнала в режиме реального времени «Rotor Gene 3000» (Corbett Research, Австралия). Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – анализировали с помощью программного обеспечения Rotor-Gene Analysis Software v.6.0. Для количественной оценки содержания копий генома Ureaplasma spp. была приготовлена линейка калибраторов с концентрациями 2,5103; 2,5104; 2,5105 и 2,5106 копий/мл. Для оценки эффективности выделения и амплификации ДНК была приготовлена линейка калибраторов для внутреннего контрольного образца с концентрациями 1,0103; 1,0104 и 1,0105 копий/мл. Эффективность выделения ДНК и амплификации составляла 80-90%.

Для построения графиков зависимости оптической плотности среды от времени штаммы Ureaplasma spp., находящиеся в экспоненциальной фазе роста, разводили питательной средой и вносили по 250 мкл в лунки 96-луночного планшета, затем в каждую лунку добавляли по 70 мкл стерильного минерального масла. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37 оС. Измерение оптической плотности среды в процессе роста культур осуществляли с помощью планшетного фотометра при длине волны 570 нм в моменты времени 4, 17, 21, 24, 28, 30, 41 и 45 часов инкубации в термостате. Для каждого штамма через полученные экспериментальные значения оптической плотности среды строили кубический сплайн – кривую вида s(t)=a3t3+a2t2+a1t+a0, позволяющую точно соединять измеренные точки. Коэффициенты a0, a1, a2, a3 вычисляли для каждого промежутка между соседними замерами, исходя из условий совпадения сплайна с опытными данными и непрерывности самого сплайна и его первой и второй производных s'(t)=3a3t2+2a2t+a1 и s"(t)=6a3t+2a2 в точках замеров. Точка перегиба t* сплай­на s(t) отвечала двум условиям: s"(t*)=0, s'(t*)0.

Результаты определения численности бактерий в исходной пробе, основанные на определении количества жизнеспособных клеток методами ЦОЕ50 и НВК и копий генома методом ПЦР-РВ, сравнивали с помощью критерия Блэнда–Альтмана (С. Гланц, 1999). Данные организовывали парами: (ПЦР-РВ – ЦОЕ50) и (ПЦР-РВ – НВК). Для каждого набора пар измерений вычисляли их разность и полусумму, затем для разностей находили среднее значение и стандартное отклонение. Среднее значение разностей характеризовало систематическое расхождение между методами, а стандартное отклонение разностей - степень разброса результатов. Оценкой значения измеряемой величины (численности бактерий) служила полусумма пары. Если во всех парах разности лежали в пределах двух стандартных отклонений от среднего значения, то с достоверностью 0,95 оба подхода давали одинаковые результаты, т.е. наблюдаемые между ними расхождения не являлись значимыми. Далее строили графики, в которых для каждого замера по оси абсцисс откладывалась полусумма результатов (ПЦР-РВ – ЦОЕ50) и (ПЦР-РВ – НВК), а по оси ординат – их разность. По виду графиков проверяли, зависит ли расхождение от значения измеряемой величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка питательной среды для выявления Ureaplasma spp.

Для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала необходим комплекс сред, состоящий из двух компонентов: основного - питательной среды, предназначенной для обеспечения оптимальных условий для роста бактерий рода Ureaplasma; и вспомогательного - транспортной среды, назначение которой заключается в обеспечении оптимальных условий для сохранения жизнеспособности Ureaplasma spp. в образцах клинического материала, разведении исследуемого клинического материала для устранения (или снижения) эффекта ингибиторов роста уреаплазм и предотвращения размножения в образцах сопутствующей микрофлоры.

При разработке питательной среды для культивирования и выявления уреаплазм учитывали следующие их биологические свойства: 1) сложные питательные потребности вследствие простоты организации и ограниченных биосинтетических возможностей; 2) высокую требовательность к составу питательной среды; 3) потребность для роста в холестероле; 4) уреазную активность и потребность для роста в мочевине; 5) рост в жидких питательных средах без помутнения; 6) устойчивость к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки бактерий, а также к полимиксинам, линкомицину и амфотерицину В.

Питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала должна максимально соответствовать следующим требованиям: 1) обеспечивать рост «всего своего», т.е. всех штаммов уреаплазм; 2) полностью подавлять рост «всего чужого», т.е. сопутствующих микроорганизмов. В соответствии с этим основными направлениями разработки являлись улучшение ростовых и повышение селективных свойств среды.

Решение поставленной задачи возможно при выборе оптимальных условий: 1) состава основы среды; 2) источников факторов роста уреаплазм; 3) концентрации лошадиной сыворотки; 4) набора и концентрации антибиотиков, обеспечивающих селективные свойства среды; 5) рН-индикатора, необходимого для визуализации роста уреаплазм.

При выборе основы среды и источников факторов роста предпочтение отдавалось стандартизованным компонентам, позволяющим уменьшить вариации ростовых свойств различных серий среды. В качестве основы питательной среды использовали регламентированные в производстве компоненты питательных сред, применяемые для культивирования наиболее требовательных микроорганизмов – сердечно-мозговую вытяжку (20 г/л) и триптозу (10 г/л) (Difco Manual, 1998). В качестве источников низкомолекулярных веществ, необходимых для роста уреаплазм, использовали дрожжевой экстракт (3 г/л) (Difco Manual, 1998) и среду 199 (4,95 г/л) (J.F. Morgan et al., 1950). Содержание лошадиной сыворотки в питательной среде увеличили до 25% с целью восполнения дефицита некоторых факторов, необходимых для роста уреаплазм, и повышения буферной емкости среды.

В качестве селективных добавок использовали антибиотики, не влияющие на рост Ureaplasma spp., но активные в отношении различных бактерий и грибов - ампициллина натриевую соль (1 г/л), ванкомицина гидрохлорид (0,05 г/л), полимиксина В сульфат (0,01 г/л), линкомицина гидрохлорид (0,03 г/л) и амфотерицин В (0,01 г/л).

В качестве рН-индикатора использовали феноловый красный (0,05 г/л), поскольку изменение цвета культуральной среды в процессе роста уреаплазм происходило четко на фоне желтого собственного цвета среды и в одной области спектра, что позволяло регистрировать изменение оптической плотности среды с помощью спектрофотометра.

Содержание мочевины в питательной среде составляло 0,5 г/л, L-цистеина гидрохлорида – 0,125 г/л; значение рН среды в пределах 6,1-6,3.

Известно, что уреаплазмы чрезвычайно чувствительны к неблагоприятным условиям окружающей среды. Для обеспечения сохранения жизнеспособности уреаплазм в исследуемом материале нами была создана транспортная среда, являющаяся производной питательной среды. Транспортная среда отличается от питательной отсутствием мочевины и линкомицина гидрохлорида. Транспортная среда обеспечивает сохранение жизнеспособности уреаплазм при температуре 18-23 оС до 5 часов и при температуре 2-8 оС до 96 часов.

Предложен способ применения разработанных сред, предполагающий внесение исследуемого клинического материала в транспортную среду, приготовление серии разведений образца в питательной среде, культивирование в 96-луночных планшетах под слоем минерального масла. Выделение культуры уреаплазм основано на создании условий, при которых выделяемый микроорганизм количественно преобладал в накопительной культуре. Это было достигнуто селективной обработкой исследуемого материала антибиотиками в транспортной среде и в процессе инкубации посевов в термостате, а также последовательным разведением материала в питательной среде до содержания единичных (или одной) клеток микроорганизмов в объеме среды.

Рост Ureaplasma spp. в питательной среде сопровождается изменением цвета среды с желтого на красный, без помутнения (рис. 1).

Одноэтапные выделение и идентификация бактерий рода Ureaplasma основаны на следующих культурально-биохимических свойствах: 1) росте в богатой питательной среде, содержащей лошадиную сыворотку; 2) уреазной активности; 3) росте без помутнения культуральной среды; 4) устойчивости к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной бактерий (ампициллину, ванкомицину), а также к полимиксину В, линкомицину и амфотерицину В.

Изучение ростовых и селективных свойств разработанной питательной среды, проведенное на чистых культурах микроорганизмов показало, что среда обеспечивала рост всех исследованных коллекционных и свежевыделенных штаммов Ureaplasma spp. и ингибировала рост штаммов M. hominis, а также других представителей микрофлоры (табл. 1).

Рис. 1. Посев образцов клинического материала в питательную среду для выявления Ureaplasma spp.. 1, 3, 4, 6-8, 10, 11 – есть рост уреаплазм; 2, 5, 9, 12 – отсутствует рост уреаплазм.

Таблица 1

Результаты исследования ростовых и селективных свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала при посеве чистых культур микроорганизмов

Наименование микроорганизмов Количество штаммов Исходная концентрация в среде, кл/мл Количество штаммов, выросших в питательной среде
Ureaplasma spp. 28 104 28
Mycoplasma hominis 8 105 0
Neisseria gonorrhoeae 1 106 0
Enterococcus faecalis 1 106 0
Escherichia coli 1 106 0
Proteus morganii 1 106 0
Proteus vulgaris 1 106 0
Proteus mirabilis 1 106 0
Staphylococcus aureus 1 106 0
Streptococcus agalactiae 1 106 0
Lactobacillus acidophilus 1 106 0
Candida albicans 1 106 0

В то же время, при посеве чистых культур микроорганизмов на питательную среду сравнения (10С) наблюдался рост Escherichia coli, Proteus spp. и Candida albicans, сопровождавшийся выраженным помутнением среды и формированием придонного осадка. Рост Proteus spp. сопровождался также изменением цвета среды с желтого на красный.

Вместе с тем, при посеве образцов клинического материала в разработанную среду в сравнении со стандартной средой 10C наблюдали увеличение количества выделенных штаммов Ureaplasma spp. и значительное снижение роста сопутствующих микроорганизмов (табл. 2, 3).

При посеве в разработанную питательную среду всех 87 образцов клинического материала, которые были положительными в ПЦР с праймерами, специфичными для генов 16S рРНК Ureaplasma spp., наблюдался рост уреаплазм. Все выросшие культуры являлись культурами Ureaplasma spp.. Доказательством этого являлись положительный результат в ПЦР с праймерами, специфичными для генов 16S рРНК уреаплазм, и рост на агаре А7 с образованием мелких (порядка 20-60 мкм), с характерной морфологией, темно-коричневых колоний (положительный уреазный тест).

Таблица 2

Рост Ureaplasma spp. при посеве клинического материала на известной (10C) и предлагаемой среде для культивирования и выявления Ureaplasma spp.

Питательная среда Количество произведенных посевов Количество образцов, положительных в ПЦР Количество выделенных культур
10C 197 87 76
предлагаемая среда 197 87 87

Таблица 3

Рост сопутствующих микроорганизмов при посеве клинического материала на известной (10C) и предлагаемой среде для культивирования и выявления Ureaplasma spp.

Питательная среда Количество произведенных посевов Количество образцов, в которых наблюдался рост сопутствующих микроорганизмов
10C 197 42
предлагаемая среда 197 1

При этом из 87 положительных в ПЦР образцов на стандартной среде 10C выделено только 76 культур уреаплазм. При посеве 42 образцов клинического материала наблюдался рост сопутствующих микроорганизмов, проявившийся в выраженном помутнении среды и образовании придонного осадка. Признаки роста сопутствующих микроорганизмов на разработанной нами среде были только при посеве только 1 образца.

Кроме того, рост Ureaplasma spp. на разработанной питательной среде наблюдался при большем разведении исследуемого материала, что свидетельствовало о более высокой ее чувствительности (табл. 4).

Таблица 4

Рост Ureaplasma spp. при посеве клинического материала в разных разведениях на известной (10C) и предлагаемой среде для культивирования и выявления Ureaplasma spp.

Разведение исследуемого материала Количество образцов с ростом Ureaplasma spp. на среде 10C Количество образцов с ростом Ureaplasma spp. на предлагаемой среде
10-1 76 87
10-2 76 87
10-3 69 87
10-4 50 72

Таким образом, использование предложенной питательной и транспортной среды позволяет с высокой эффективностью выявлять бактерии рода Ureaplasma в образцах клинического материала.

Количественная оценка роста бактерий рода Ureaplasma в жидкой питательной среде

В процессе разработки питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. мы столкнулись с необходимостью количественного учета роста уреаплазм. Одной из задач нашего исследования являлось определение концентрации бактерий в культурах Ureaplasma spp., выращенных в разра­бо­тан­ной питательной среде. Определение количества клеток в культурах уреаплазм необходимо для оценки ростовых свойств питательной среды, а также определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам. Кроме того, определение количества условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma в образцах клинического материала необходимо для установления их этиологической роли в патологии человека.

Количественная оценка роста Ureaplasma spp. сопряжена с определенными трудностями, так как многие из методов определения концентрации бактериальных культур неприменимы в отношении уреаплазм.

Мы сопоставили два подхода к нахождению численности бактерий рода Ureaplasma, основанные на определении количества жизнеспособных клеток и копий генома.

Для определения количества жизнеспособных клеток уреаплазм исследуемый образец разводили в питательной среде до такой степени, чтобы при взятии пробы из образца бактерии могли как оказаться, так и не оказаться в ней (рис. 2). Значения кон­цен­трации получали путем статистического анализа экспериментальных результатов. Нами были испытаны два метода расчета численности жизнеспособных клеток Ureaplasma spp.: 1) метод определения наи­более вероятного количества (НВК) бактерий, примененный ранее для оценки количества нетребовательных к условиям культивирования микроорганизмов (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967); 2) метод 50% дозы цветообразующих единиц (ЦОЕ50) со статистической обработкой результатов по L.J. Reed, H. Muench (1938) и B. Behrens, C. Karber (1935).

 Серия последовательных 10-кратных (а) и 2-кратных (б) разведений для-4

Рис. 2. Серия последовательных 10-кратных (а) и 2-кратных (б) разведений для определения количества жизнеспособных клеток U. parvum 465.

Количество копий генома уреаплазм определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).

Для различных штаммов Ureaplasma spp. в экспоненциальной фазе роста результаты, полученные методами НВК, ЦОЕ50 и ПЦР-РВ достаточно близки (табл. 5). Для уточнения того, насколько хорошо это совпадение, мы применили критерий Блэнда-Алтмана (С. Гланц, 1999). Выясни­лось, что достоверностью 0,95 методы НВК и ЦОЕ50 дают те же результаты, что и ПЦР-РВ.

Таблица 5

Накопление клеток уреаплазм по данным трех методов исследования

Штамм уреаплазм Метод Накопление клеток на время инкубации Количество клеточных делений за 4 часа Время генерации, часов
17 часов 21 час
ПЦР-РВ 1,1·106 2,4·106 2,18 1,83
НВК 1,0·106 2,2·106 2,20 1,82
ЦОЕ50 1,0·106 2,1·106 2,10 1,90
455 ПЦР-РВ 5,0·105 1,1·106 2,20 1,82
НВК 4,0·105 9,0·105 2,25 1,78
ЦОЕ50 4,4·105 8,9·105 2,02 1,98
465 ПЦР-РВ 1,8·105 4,0·105 2,22 1,80
НВК 1,8·105 3,8·105 2,11 1,90
ЦОЕ50 2,1·105 4,3·105 2,04 1,96
481 ПЦР-РВ 8·105 1,7·106 2,13 1,87
НВК 7,8·105 1,7·106 2,19 1,82
ЦОЕ50 1,0·106 2,1·106 2,10 1,90

Таким образом, примененные для Ureaplasma spp. методы НВК бактерий и ПЦР-РВ позволяли определить концентрацию уреаплазм в исследуемых образцах. Использование метода серийных разведений с соответствующей статистической обработкой дало надежный способ количественного определения бактерий рода Ureaplasma, позволяющий про­­во­дить дальнейшую идентификацию и определение чувствительности штаммов уреаплазм к антибактериальным препаратам, а также оценивать ростовые свойства разных серий разработанной нами пита­тель­ной среды и отдельных ее компонентов. Определение числа жизнеспособных клеток методами НВК и ЦОЕ50 более пригодно к использованию в практических лабораториях. При этом метод ЦОЕ50 требует математических расчетов; в то время как для нахождения НВК бактерий созданы таблицы (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967), что позволяет оценивать концентрацию уреаплазм, не прибегая к сложным вычислениям.

Нами предложены стандартные условия культивирования. Стандартные условия обеспечиваются культивированием в 96-луночных планшетах, лунки которых имеют одинаковые размеры; в одинаковом объеме среды (в 250 мкл); под слоем минерального масла, предотвращающего улетучивание аммиака и испарение культуральной среды. Благодаря использованию стандартных условий культивирования нами были получены данные, позволяющие предположить, что изменение ОП среды в процессе роста культур Ureaplasma spp. может количественно отражать накопление клеток уреаплазм.

Изучение взаимосвязи ОП среды и количества накопленных бактериальных клеток легло в основу разработки спектрофотометрического экспресс-метода определения концентрации культур Ureaplasma spp. в процессе их роста.

Показанные на рис. 3 и 5 графики изменения ОП среды в процессе роста различных штаммов Ureaplasma spp. в жидкой питательной среде, независимо от их начальной концентрации, имели типичный ступенькообразный вид и состояли из 3-х фаз: 1) длительной латентной фазы с низким постоянным значением ОП; 2) сменяющей ее короткой фазы экспоненциального роста ОП; 3) фазы замедления роста и выхода на высокий уровень ОП, далее почти не меняющийся. Кривая изменения ОП имела характерную точку – точку перегиба, до которой ОП росла с ускорением, а после нее – с замедлением, что соответствовало переходу от второй фазы к третьей. Форма кривой изменения ОП среды в процессе роста не зависела от посевной дозы, и соответственно, времени культивирования. На рис. 3 видно, что значения ОП в точках перегиба кривых, соответ­ствую­щих разным разведениям, отличались незначительно, но мо­мен­­ты точки перегиба были существенно различны. Зависимость момента перегиба кривой изменения ОП среды от лога­риф­ма разведения культуры показана на рис. 4; эта зависи­мость линейная, что свидетельствовало о том, что характер роста ОП вплоть до этого момента действительно близок к экспоненциальному.

Рис. 3. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. urealyticum 2Т в разведениях 10-1 (1), 10-2 (2), 10-3 (3), 10-4 (4). Исходная концентрация уреаплазм составляла 106 клеток/мл. Рис. 4. Зависимость момента перегиба кривой изменения оптической плотности среды в процессе роста штамма U. urealyticum 2Т от логарифма разведения культуры.

Мы использовали два подхода для изучения накопления бактерий в процессе роста культур Ureaplasma spp., основанные на определении количества: 1) жизнеспособных клеток методами ЦОЕ50 и НВК; 2) копий генома методом ПЦР-РВ. При культивировании Ureaplasma spp. в питательной среде наблюдалась последовательная смена фаз. Графики накопления жизнеспособных клеток штаммов Ureaplasma spp. (при условии, если исходные культуры находились в экспоненциальной фазе роста) имели типичный вид и включали 3 основные фазы развития бактериальных популяций (рис. 6): 1) фазу экспоненциального роста, характеризующуюся максимальной скоростью накопления клеток и увеличением численности в геометрической прогрессии; 2) короткую стационарную фазу (всего 4 часа) – фазу максимального накопления в культуре жизнеспособных клеток (для разных штаммов Ureaplasma spp. в пределах 1,2·106-2,8·106 клеток/мл); 3) фазу отмирания с резким снижением жизнеспособности культуры (за 12 часов количество жизнеспособных клеток снижалось более, чем в 104 раз).

График накопления копий генома Ureaplasma spp. в процессе роста культуры, показанный на рис. 6, состоял из 2-х фаз: 1) фазы экспоненциального роста, практически идентичной аналогичной фазе накопления жизнеспособных клеток; 2) стационарной фазы, характеризующейся максимальным накоплением копий генома, которое соответствует максимальному накоплению жизнеспособных клеток, но без снижения в фазе отмирания культуры.

Рис. 5. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штаммов U. parvum 455, 468, 481 и U. urealyticum 2Т. Исходная концентрация штаммов 455 – 1,2104; 468 - 3104; 481 - 2104; 2Т - 4103 клеток/мл среды. Рис. 6. Накопление жизнеспособных клеток (НВК) и копий генома (ПЦР-РВ) штамма U. parvum 455.

В экспоненциальной фазе роста уреаплазменных культур деление клеток происходило синхронно с репликацией ДНК, и соответственно, содержание копий генома отражало накопление жизнеспособных клеток. Полное соответствие этих двух показателей позволило сделать вывод о том, что одна ЦОЕ, выявляемая с помощью методов НВК или ЦОЕ50, соответствовала одной клетке Ureaplasma spp.. Кроме того, по-видимому, в процессе роста культур уреаплазм не происходило образования «многоядерных» клеток, содержащих несколько нуклеоидов.

Данные проведенного нами сопоставления изменения ОП среды и накопления клеток в процессе роста Ureaplasma spp. представлены в табл. 7. Латентную фазу продолжительностью 14-17 часов с низким значением ОП среды (в пределах 0,52-0,54) наблюдали от момента внесения уреаплазм в питательную среду до накопления в культуре не менее 2·105 клеток/мл. Затем происходил выраженный рост ОП: латентная фаза сменялась фазой экспоненциального роста ОП. Фаза экспоненциального роста ОП до момента максимальной скорости изменения ОП (точки перегиба) несущественно отличалась среди различных штаммов. При дальнейшем увеличении в процессе роста культуры ОП до значения в пределах 1,0-1,2, соответствующего перегибу кривой изменения ОП, скорость накопления клеток снижалась и культура вступала в стационарную фазу роста. Таким образом, экспоненциальный рост ОП среды наблюдался при накоплении в культуре достаточно большого количества клеток Ureaplasma spp., что соответствовало поздней экспоненциальной фазе роста. ОП среды и соответствующее ей накопление клеток в фазе экспоненциального роста ОП приведены в табл. 8.

Таблица 7

Изменение оптической плотности среды и накопление клеток в процессе роста культур Ureaplasma spp.

Фаза кривой изменения оптической плотности среды Соответствующая фаза роста культуры
латентная лаг-фаза и экспоненциальная до накопления 2105 клеток/мл
экспоненциального роста экспоненциальная
точка перегиба замедление роста и вступление в стационарную фазу
замедления роста стационарная и отмирания

Таблица 8

Накопление клеток Ureaplasma spp. в экспоненциальной фазе роста оптической плотности среды

оптическая плотность среды накопление клеток в 1 мл среды
0,6 0,6106 ± 0,2106
0,7 0,9106 ± 0,2106
0,8 1,3106 ± 0,3106
0,9 1,6106 ± 0,4 106
1,0 1,8106 ± 0,6106
1,11 1,9106 ± 0,6106
1,2 1,9106 ± 0,6106

Таким образом, измерение ОП среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в разработанной питательной среде в стандартных условиях культивирования позволяет оценить накопление жизнеспособных клеток уреаплазм. Полученные нами результаты использованы для контроля качества питательной среды и стандартизации инокулята при определении чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам.

Оценка ростовых свойств питательной среды для выявления Ureaplasma spp.

Оценка ростовых свойств разных серий питательной среды для выявления Ureaplasma spp., а также основных ее компонентов, является важнейшим этапом приготовления среды, необходимым для успешного обнаружения уреаплазм в образцах клинического материала.

Нами предложен оригинальный метод оценки ростовых свойств питательной среды, основанный на анализе кривых изменения ОП среды. Оценка ростовых свойств включает в себя 2 этапа: 1). Культивирование тест-штамма Ureaplasma spp. в среде сравнения и испытуемой в стандартных условиях в течение одного и того же времени при одинаковой концентрации тест-штамма в контрольных и опытных лунках. 2). Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в среде сравнения и испытуемой.

Кривые изменения ОП среды будут одинаковыми в том случае, если условия культивирования тест-штамма в контрольных и опытных лунках также одинаковы. Это возможно при соблюдении следующих условий: 1) культивировании в стандартных условиях; 2) инкубации в течение одного и того же времени; 3) одинаковой концентрации тест-штамма Ureaplasma spp. в контрольных и опытных лунках (условия 1-3 задаются при постановке методики); 4) одинаковых ростовых свойствах питательных сред (сравнения и испытуемой). На рис. 7 представлены кривые изменения ОП в процессе роста тест-штамма в средах, обладающих одинаковыми ростовыми свойствами.

Изменение (ухудшение, обусловленное присутствием ингибиторов роста уреаплазм) ростовых свойств испытуемой среды сопровождалось изменением накопления клеток и, как следствие, изменением кривой зависимости ОП среды от времени. В процессе роста штамма U. parvum 455 в питательной среде, содержащей 250 мМ хлорида натрия (известно, что уреаплазмы высоко чувствительны к изменению осмотического давления среды), наблюдали увеличение латентной фазы, а также снижение скорости изменения ОП среды в экспоненциальной фазе (рис. 8).

Таким образом, изменение ОП среды в процессе роста культур тест-штамма в питательных средах сравнения и испытуемой, отражающее накопление жизнеспособных клеток, при соблюдении определенных условий (стандартных условий культивирования в планшетах, одинаковой концентрации клеток тест-штамма в начальный момент в контрольных и опытных лунках, одинаковом времени инкубации) позволяет сравнить ростовые свойства сред. Предложенный метод позволяет проводить сравнение сред в процессе роста культур как по интегральному показателю (площади под кривыми изменения ОП), так и по отдельным показателям (продолжительности латентной фазы, скорости изменения ОП, значения ОП в точке перегиба кривых).

Рис. 7. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. parvum 468 в питательной среде сравнения (1) и испытуемой среде (2). Концентрация жизнеспособных клеток уреаплазм в начальный момент составляла 2104 клеток/мл (1, 2). Рис. 8. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. parvum 455 в питательной среде сравнения (1) и испытуемой среде (2). Испытуемая среда содержала 250 мМ хлорида натрия. Концентрация жизнеспособных клеток уреаплазм в начальный момент составляла 2104 клеток/мл (1, 2).

Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp.

к антибактериальным препаратам

Бактерии рода Ureaplasma являются условно-патогенными микроорганизмами; вместе с тем при наличии клинических проявлений заболевания, при доказанной этиологической значимости уреаплазм назначают антибактериальные препараты (АБП).

Нами предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде и основанный на использовании пограничных концентраций препаратов. Пограничные концентрации АБП позволяют отнести штаммы уреаплазм к определенной группе по степени чувствительности (чувствительных, умеренно-чувствительных и устойчивых). По нашему мнению, пограничные концентрации должны отражать МИК50 и МИК90, которые являются основными показателями, характеризующими активность АБП. Минимальная пограничная концентрация, разделяющая чувствительные и умеренно-чувствительные штаммы, соответствует МИК50; максимальная, дифференцирующая умеренно-чувствительные и устойчивые штаммы - МИК90. Значения МИК, которые были определены классическим микрометодом серийных разведений АБП в жидкой питательной среде, представлены в табл. 9.

Таблица 9

Минимальные ингибирующие концентрации антибактериальных препаратов

Антибактериальный препарат Минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл
пределы колебаний МИК50 МИК90
минимальное значение максимальное значение
доксициклин 0,125 16,0 0,25 2,0
эритромицин 0,25 16,0 2,0 8,0
азитромицин 0,125 4,0 0,5 2,0
кларитромицин 0,125 4,0 2,0 4,0
мидекамицин 0,125 4,0 2,0 4,0
джозамицин 0,125 4,0 2,0 4,0
спирамицин 32,0 > 60,0 - -
линкомицин > 32,0 - - -
клиндамицин 32,0 - - -
ципрофлоксацин 0,5 8,0 2,0 4,0
офлоксацин 0,5 4,0 2,0 4,0

Установленные значения МИК50 и МИК90 использовали для приготовления ряда питательных сред с АБП для оценки чувствительности клинических штаммов Ureaplasma spp. методом пограничных концентраций (рис. 9, табл. 10).

Рис. 9. Определение чувствительности одного из штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам методом серийных разведений с использованием пограничных концентраций. Клм5 – клиндамицин 5 мкг/мл; Лм30 – линкомицин 30 мкг/мл; Крм2, Крм4 – кларитромицин 2, 4 мкг/мл; Азм2 – азитромицин 2 мкг/мл; См50 – спирамицин 50 мкг/мл; Эм2, Эм8 – эритромицин 2, 8 мкг/мл; Мм2, Мм4 – мидекамицин 2, 4 мкг/мл; Дм2, Дм4 – джозамицин 2, 4 мкг/мл; Оф2, Оф4 – офлоксацин 2, 4 мкг/мл; Цф2, Цф4 – ципрофлоксацин 2, 4 мкг/мл; Дц2 – доксициклин 2 мкг/мл. К+ положительный контроль; К- отрицательный контроль.

Получены данные, свидетельствующие о существовании штаммов Ureaplasma spp. с различной степенью чувствительности к АБП. Большинство исследованных штаммов были высоко чувствительны к доксициклину и макролидам (за исключением эритромицина и спирамицина, обладающих меньшей активностью). Доксициклин и макролиды ингибировали рост большинства штаммов уреаплазм (от 72,8% для мидекамицина и до 100% для азитромицина) в низкой концентрации (МИК 2 мкг/мл). Однако, наряду со штаммами Ureaplasma spp., обладающими высокой чувствительностью к доксициклину и макролидам, были выявлены устойчивые штаммы. Так, 2,9% штаммов были устойчивы к доксициклину, 3,8% - к эритромицину, 0,7% - к мидекамицину, 0,2% - к джозамицину. При этом не выявлено ни одного штамма, устойчивого к азитромицину и кларитромицину. Менее эффективными in vitro в отношении Ureaplasma spp. оказались фторхинолоны. Значительное количество исследованных штаммов было устойчиво к ципрофлоксацину и офлоксацину (42,7% и 17,9%, соответственно). Высоко чувствительными к ципрофлоксацину и офлоксацину оказались только 37,2% и 44,9% штаммов, соответственно.

Таблица 10

Распределение штаммов Ureaplasma spp. (общее количество 452) по степени чувствительности к антибактериальным препаратам

Антибактериальный препарат Абсолютное число и процент штаммов
чувствительных умеренно-чувствительных устойчивых
доксициклин1 439 (97,1) - 13 (2,9)
эритромицин 89 (19,7) 346 (76,5) 17 (3,8)
азитромицин2 452 (100) - 0
кларитромицин 416 (92) 36 (8) 0
мидекамицин 327 (72,3) 192 (27) 3 (0,7)
джозамицин 392 (86,7) 59 (13,1) 1 (0,2)
спирамицин3 - 178 (39,4) 274 (60,6)
линкомицин 0 0 452 (100)
клиндамицин 0 0 452 (100)
ципрофлоксацин 168 (37,2) 91 (20,1) 193 (42,7)
офлоксацин 203 (44,9) 168 (37,2) 81 (17,9)

Примечание.

1, 2 Использовали одну пограничную концентрацию доксициклина и азитромицина 2 мкг/мл, дифференцирующую штаммы уреаплазм на чувствительные и устойчивые.

3 Использовали одну пограничную концентрацию спирамицина 50 мкг/мл, дифференцирующую штаммы уреаплазм на умеренно-чувствительные и устойчивые.

Как и следовало ожидать, все исследованные штаммы Ureaplasma spp. были устойчивы к линкозамидам линкомицину и клиндамицину. При этом, как отмечено ранее, все штаммы были чувствительны к макролидам азитромицину и кларитромицину. Предлагаем использовать такое различное отношение штаммов к указанным антибиотикам как дополнительный дифференциальный признак для идентификации бактерий рода Ureaplasma spp..

Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствовали о целесообразности определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП. Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП in vitro может служить, во-первых, основанием для рационального выбора антибактериальной терапии, направленной на элиминацию уреаплазм из организма, и, во-вторых, дополнительным критерием идентификации штаммов уреаплазм по их чувствительности к антибиотикам группы макролидов азитромицину и кларитромицину и устойчивости к антибиотикам группы линкозамидов линкомицину и клиндамицину.

Разработка микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма микротест» и оценка ее диагностической эффективности в государственных испытаниях

На основе предложенных сред нами разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Микротест-система предназначена для культивирования штаммов Ureaplasma spp. в стандартных условиях; выявления и идентификации Ureaplasma spp. в образцах клинического материала; определения концентрации жизнеспособных клеток в культурах Ureaplasma spp. и образцах клинического материала; а также определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП.

В состав микротест-системы входят пять компонентов: транспортная среда, среда роста, среды с АБП, стерильное минеральное масло, стерильный 96-луночный планшет. Стандартный формат планшетов делает их пригодными для проведения как визуального, так и автоматизированного учета результатов исследования с помощью планшетных фотометров.

Основным преимуществом микротест-системы «Уреаплазма микротест» является стандартизация микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции, позволяющая получить достоверные, воспроизводимые результаты. Нами это было достигнуто стандартизацией основных компонентов микротест-системы (использование стандартизованных компонентов сред, соблюдение технологии приготовления, оценка ростовых свойств питательной среды и ее отдельных компонентов) и методики проведения исследования (микротест-система содержит все необходимые для проведения исследования компоненты, методика исследования изложена в виде инструкции по применению микротест-системы).

Обусловленная широким распространением бессимптом­ного носительства уреаплазм и отсутствием четких клинических проявлений уреаплазменной инфекции невозможность разделения на опытную («больных») и контрольную («здоровых») группы затрудняла оценку микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях.

В связи с этим нами была разработана и использована новая методика сравнительной оценки эффективности микротест-системы, предназначенной для диагностики инфекции, вызыва­е­мой условно-патогенными бактериями рода Ureaplasma. Методика позволяет вы­числять критерий диагностической эффективности U в условиях отсутствия четкого деления на опытную и контроль­ную группы. В такой ситуации показатель чувствительности Se нельзя найти из опытов с достаточной точностью, но показатель специфичности Sp можно определить по группе пациентов с отрицательными результатами ПЦР, т.е. с достоверным отсутствием возбудителя. Критерий диагностической эффективности: U(P) = P·Se + (1–P)·Sp характеризует точность диагностического препарата, т.е. насколько правильно микротест-система выявляет наличие или отсутствие возбудителя при распространенности заболева­ния P.

Нами предложено ранее не применявшееся понятие доли всех положительных результатов тестов W (отно­ше­ние общего числа положительных тестов к общему числу всех тестов). Se, Sp и W связаны между собой формулой: W = PSe + (1–P)(1–Sp). Исходя из этого: Se = (W – (1–P)(1–Sp)) / P и, соответственно, U (P) = W – (1–P)·(1–2Sp). На основе данных, полученных при проведении государственных испытаний и представленных в табл. 11, строили графики зависимости U от P: U = U(P).

Таблица 11

Результаты выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала с использованием микротест-системы «Уреаплазма микротест» и контрольных сред (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и bioMerieux) и в ПЦР

Питательная среда Результаты посева Результаты ПЦР
положительный результат отрицательный результат
«Уреаплазма микротест» (1) Рост Ureaplasma spp. 141 2
Отсутствие роста Ureaplasma spp. 2 60
ГУ НИИЭМ (2) Рост Ureaplasma spp. 141 2
Отсутствие роста Ureaplasma spp. 2 60
bioMerieux (3) Рост Ureaplasma spp. 143 0
Отсутствие роста Ureaplasma spp. 0 62

Из графиков U=U(P), показанных на рис. 10, видно, что микротест-система «Уреаплазма Микротест», имеет диагностическую эффективность такую же как питательная среда ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и соизмеримую с диагностической эффективностью среды bioMerieux.

Рис. 10. Диагностическая эффективность U микротест-системы «Уреаплазма микротест» (1), питательных сред для выявления Ureaplasma spp. ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (2) и bioMerieux (3) в зависимости от распространенности заболевания P.

Таким образом, разработанная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест», обеспечивающая стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции, обладает высокой диагностической эффективностью.

ВЫВОДЫ

1. Разработаны питательная среда для культивирования бактерий рода Ureaplasma, обладающая высокими ростовыми и селективными свойствами, и транспортная среда, обеспечивающая оптимальные условия для сохранения жизнеспособности уреаплазм. Использование сред позволяет эффективно выявлять Ureaplasma spp. в образцах клинического материала.

2. Показано, что примененные для Ureaplasma spp. методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени могут быть использованы для определения концентрации уреаплазм в исследуемом материале.

3. Показано, что изменение оптической плотности среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в стандартных условиях культивирования на разработанной питательной среде отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм в поздней экспоненциальной фазе роста культур.

4. Разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. на основе анализа кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в стандартных условиях культивирования в средах сравнения и испытуемой. Метод позволяет дифференцировать ростовые свойства разных серий указанной среды, а также отдельных ее компонентов.

5. Предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде, с использованием пограничных концентраций.

6. Разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma urealyticum (Ureaplasma spp.) «Уреаплазма микротест», обеспечивающая стандартизацию выявления, оценки количества и определения чувствительности бактерий рода Ureaplasma к антибактериальным препаратам.

7. Разработана методика оценки качества микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях, позволяющая определить диагностическую эффективность препарата, предназначенного для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Безруков В.М., Назаренко Е.Г., Доронина Е.П., Екимов А.Н., Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т., Говорун В.М. Клиническое значение определения биоваров Ureaplasma urealyticum с использованием ПЦР-диагностики. «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» Сборник трудов под редакцией академика РАМН Ю.М. Лопухина. Москва, 1998. С. 31-34.
  2. Безруков В.М., Бердникова З.Е., Шобухова Т.С. «Метод оценки питательных сред для диагностики уреаплазмоза». Материалы Международной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы». Санкт-Петербург, 2003, с. 50.
  3. Шипулин Г.А., Безруков В.М. Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов. Патент РФ 2265656 С1, 2004.
  4. Безруков В.М., Шобухова Т.С. Новые микротест-системы для выявления и идентификации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век». Саратов, 2004, с. 32-33.
  5. Безруков В.М., Шобухов А.В. Определение Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде методом наиболее вероятного количества. Материалы научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». Нижний Новгород, 2004, с. 255-258.
  6. Безруков В.М., Шобухов А.В., Шобухова Т.С. Об условиях применимости метода наиболее вероятного количества для определения концентрации бактерий Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде. Тезисы 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». Москва, 2004, с. 9-10.
  7. Безруков В.М., Шобухов А.В., Шобухова Т.С. Сравнение методов определения Ureaplasma urealyticum. Тезисы международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирск, 2004, с. 225.
  8. Безруков В.М., Шипулин Г.А. «Уреаплазма микротест» и «Микоплазма микротест» - новые микротест-системы для диагностики урогенитальных микоплазмозов. Сборник трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» под редакцией академика РАМН В.И. Покровского, М., 2004, т.1, с. 10-12.
  9. Жуховицкий В.Г., Шобухова Т.С., Спирина Г.В., Шмелева Л.П., Кириллов М.Ю., Шарая В.С., Безруков В.М., Парашина В.А. Сравнительная оценка диагностических препаратов с учетом прогностической ценности. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004, № 6, с. 53-55.
  1. Безруков В.М., Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шалунова Н.В., Шобухова Т.С., Жуховицкий В.Г. Оценка диагностической ценности ПЦР-тест-систем по результатам государственных испытаний. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005, № 2, с. 69-73.
  2. Безруков В.М., Шобухов А.В. О применении жидкой селективной питательной среды для количественного определения U. urealyticum. Клиническая лабораторная диагностика. 2005, № 9, с. 31.
  3. Гамова Н.А., Безруков В.М. Сравнение диагностической ценности различных сред для выделения из клинического материала U. urealyticum и M. hominis. Клиническая лабораторная диагностика. 2005, № 9, с. 32-33.
  4. Медуницын Н.В., Волкова Р.А., Бондаренко В.М., Жуховицкий В.Г, Безруков В.М., Шобухов А.В., Петухов В.Г., Шобухова Т.С., Горбунов М.А., Быков А.С. К вопросу о программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препаратов при регистрации их в Российской Федерации. Биопрепараты. 2006, № 1 (21), с. 23-27.
  5. Безруков В.М., Цеслюк М.В., Шобухов А.В., Шобухова Т.С., Быков А.С. Разработка стандарта цветности для определения концентрации уреаплазменных культур в жидкой питательной среде. Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». Нижний Новгород, 2006, с. 145-147.
  6. Безруков В.М., Быков А.С., Цеслюк М.В., Шобухов А.В. Технология количественной оценки концентрации уреаплазменных культур в жидкой питательной среде. Технологии живых систем. 2006, т. 3, № 2, с. 28-37.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АБП – антибактериальный препарат

МИБП – медицинский иммунобиологический препарат

МИК – минимальная ингибирующая концентрация

МИК50 – минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост не менее 50% исследованных штаммов

МИК90 – минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост не менее 90% исследованных штаммов

НВК – наиболее вероятное количество

ОП – оптическая плотность

ПЦР – полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени

ФСП – фармакопейная статья предприятия

ЦОЕ – цветообразующая единица



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.