WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Полиморфные варианты генома человека и риск развития острого инсульта

На правах рукописи

Бондаренко Елена Александровна

Полиморфные варианты генома человека и риск развития острого инсульта

03.01.03 – Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Отделе молекулярных основ генетики человека Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Петр Андреевич Сломинский

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Валерий Вячеславович Носиков

ФГУП «ГосНИИ генетика»

кандидат биологических наук

Генинг Леонид Владимирович

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН

Ведущая организация: Учреждение Российской академии

медицинских наук Медико-генетический

научный центр РАМН

Защита диссертации состоится «__»________________2011 г. в _____часов

на заседании Диссертационного совета Д.217.013.01 при ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов» по адресу: 117545, Россия, Москва, 1-ый Дорожный проезд, д.1. Тел: (495) 315-3747.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУП «Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов».

Автореферат разослан «__»________________ 2011

Ученый секретарь

диссертационного совета, Т.Л. Воюшина

кандидат химических наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы

Сосудистые заболевания головного мозга – актуальная медицинская и социальная проблема. На сегодняшний день 9 миллионов человек в мире страдают цереброваскулярными болезнями. Основное место среди них занимают инсульты, каждый год поражающие около 6 миллионов человек и уносящие 4,6 миллиона жизней. Смертность от церебральных заболеваний в экономически развитых странах составляет 11–12% и уступает лишь смертности от заболеваний сердца и опухолей всех локализаций.

В последние годы отмечается рост распространенности заболеваний острыми нарушениями мозгового кровообращения. Ежегодно в России переносят инсульты более 400000 – 450000 человек. При этом наблюдается «омоложение» инсульта с увеличением его распространенности среди лиц трудоспособного возраста (до 64 лет). Инсульт является лидирующей причиной инвалидизации населения. По данным Национального регистра, 31% пациентов, перенесших инсульт, требуется постоянный уход, а 20% не могут самостоятельно ходить. Лишь около 20% выживших больных способны вернуться к прежней работе.

Многочисленные эпидемиологические исследования доказали важность роли генетической составляющей в частоте развития сосудистых заболеваний головного мозга. Инсульт, за исключением относительно редко встречающихся моногенных форм, при которых структурные особенности определенных генов являются определяющим фактором развития заболевания, – это мультифакторное заболевание, в формировании которого имеют значение как внешние (средовые) факторы, так и индивидуальные генетические особенности. Сложность патогенеза создает большие трудности при изучении природы этого заболевания.

В настоящее время в изучении генетической предрасположенности инсульта, равно как и других мультифакторных заболеваний, используются два основных подхода: анализ генетических ассоциаций с полиморфными вариантами кандидатных генов заболевания и полногеномный ассоциативный анализ.

Первоначальные исследования инсульта с применением анализа генетических ассоциаций были сфокусированы на отдельных генах-кандидатах, которые, как предполагалось, вовлечены в биологические процессы, нарушения которых могли приводить к развитию заболевания. Исследовавшиеся гены-кандидаты были ассоциированы, например, с такими патологиями как атеросклероз, тромбозы и артериальная гипертензия. Статистически достоверные ассоциации с различными типами инсульта были показаны для однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) с.1691G>A в гене фактора свертывания крови V (F5), с.20210G>A в гене протромбина (F2), c.675_676delinsG в гене, кодирующем ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1) и полиморфизмов в гене, кодирующем GPIb субъединицу тромбоцитарного рецептора (GP1BA). Белковые продукты этих генов вовлечены в систему гемостаза. Ассоциации с риском развития острого инсульта были показаны и для инсерционно-делеционного (I/D) полиморфизма в гене ангиотензин-превращающего фермента (ACE). Однако полученные данные не дают однозначного ответа на вопрос об их патогенетической роли в развитии инсульта. Для изучения вклада полиморфизмов генов в риск развития заболевания необходимо учитывать и этническую компоненту. В российской популяции полиморфизмы c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1 изучены достаточно слабо.

Применение новейших технологий полногеномного анализа сцепления в семьях позволило выявить два ранее неизученных гена, показавших высокую ассоциацию с риском развития ишемического инсульта в исландской популяции – фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), и ALOX5AP, кодирующий активатор 5-липоксигеназы. В последние несколько лет полногеномный ассоциативный анализ на выборках большого объема из разных этнических групп выявил еще 11 новых локусов, которые могут быть вовлечены в патогенез острого и, в частности, ишемического инсультов.

Проведение работ по анализу полиморфизмов генов, которые могут быть вовлечены в патогенез инсульта, позволит с одной стороны лучше понять причины и механизмы развития этого заболевания, а с другой – разработать молекулярно-генетические тесты для определения риска развития острого инсульта и его ранней диагностики. Возможность проведения доклинической диагностики этого заболевания позволит начать разработку принципов и подходов профилактического лечения.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы являлись поиск и анализ генетических маркеров риска развития острого инсульта, а также его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

  1. Проведение анализа полиморфных ДНК-маркеров в кандидатных генах острого инсульта F2, F5, GP1BA, ACE, ALOX5AP и PDE4D у пациентов с ишемическим и геморрагическим инсультом.
  2. Поиск новых ДНК-маркеров острого инсульта с использованием метода полногеномного ассоциативного анализа.

Научная новизна и практическая значимость работы

Впервые в диссертационной работе определены частоты полиморфных вариантов генов ALOX5AP (SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25) и PDE4D (SNP41, SNP87, SNP45) у больных острым, ишемическим и геморрагическим инсультом и здоровых индивидов, принадлежащих к русскому этносу.

Проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов генов F2, F5, GP1BA, PAI-1, ACE с риском развития острого инсульта и его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции. С помощью программы «GMDR» исследованы межгенные взаимодействия у больных острым, ишемическим и геморрагическим инсультом и здоровых индивидов, принадлежащих к русскому этносу.

Выявлены генетические маркеры риска развития заболевания у индивидов с острым, ишемическим и геморрагическим инсультом, а также изучена их взаимосвязь с этими заболеваниями с учетом пола в российской популяции.

Впервые проведен корреляционный анализ между полиморфизмами c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1, g.11417_11704del287 гена ACE, SNP41, SNP87, SNP45 гена PDE4D, и SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25 гена ALOX5AP и клиническими характеристиками острого инсульта.

Впервые с помощью технологии ДНК-микрочипов проведен полногеномный ассоциативный анализ (GWAS) острого ишемического инсульта в российской популяции и выявлены новые ДНК-маркеры этого типа инсульта.

Результаты работы вносят вклад в общее представление о генетических основах предрасположенности к инсульту. Полученные данные позволяют оценить роль ряда генетических систем в развитии острого инсульта и его подтипов – ишемического и геморрагического, и являются основанием для разработки молекулярно-генетических методов определения лиц с повышенным риском развития данных заболеваний. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфных участков генов-кандидатов инсульта могут использоваться для медико-генетического консультирования с целью раннего выявления лиц с высоким риском развития заболевания и проведения донозологической профилактики. Учитывая результаты генотипирования больных острым инсультом и его подтипами, можно выделить группы пациентов с более тяжелым течением заболевания и дифференцировать у них лечебно-профилактические мероприятия, что важно для прогностических целей.

Публикации

Основные результаты исследования опубликованы в 10 работах, включая 6 статей в ведущих рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для защиты диссертаций.

Апробация диссертации

Результаты, полученные в данной работе, были представлены на III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины» (1-4 октября 2009 г., Ростов-на-Дону, Россия), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (14-18 мая 2010г., Ростов-на-Дону, Россия), на конференциях Европейского Общества Генетики человека (ESHG) (28-31мая 2011г., Амстердам, Нидерланды) и «The biology of genomes» (10-14 мая 2011г., Cold Spring Harbor, New York). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании Ученого совета ИМГ РАН 17 октября 2011 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 26 октября 2011 г.

Структура и объем диссертации

Диссертация включает: введение; обзор литературы; материалы и методы исследования; результаты и обсуждение; заключение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 304 источников, среди которых 19 источников отечественной и 285 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на страницах машинописного текста, содержат таблицу и рисунков.

Содержание работы

Материалы и методы исследования

В настоящей работе был проведен анализ группы больных острым инсультом, славян из российской популяции, в остром периоде церебрального инсульта, поступивших в неврологическую клинику ГКБ №31 кафедры фундаментальной и клинической неврологии ГОУ ВПО Российского государственного медицинского университета Росздрава за период 2007-2010 гг., соответствовавших критериям включения в исследование (N=1234). Возраст больных составлял от 18 до 98 лет (средний возраст 67,6 ± 12,3). В исследование вошло 611 женщин и 623 мужчины. Диагноз острый инсульт был поставлен на основании анализа совокупности данных анамнеза, физикального обследования, исследовании соматического и неврологического статусов, биохимических показателей крови и клинико-инструментальной диагностики. В качестве контроля использовалась группа славян из российской популяции в количестве 717 человек без инсультов в анамнезе. Возраст составлял от 20 до 88 лет (средний возраст 46,3 ± 11,4). В данной группе 46% мужчин и 54% женщин. Все образцы крови были взяты с информированного согласия исследуемых лиц.

Для типирования полиморфных вариантов изучаемых генов-кандидатов острого инсульта и проведения полногеномного ассоциативного анализа были использованы препараты ДНК, полученные из цельной крови с использованием набора «AxyPrep Blood GDNA Miniprep Kit» («Axygen», США) согласно рекомендациям производителя. Выделение геномной ДНК из лейкоцитов венозной крови образцов контрольной группы проводилось стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Sambrook et al., 1989).

Анализ полиморфизмов c.20210G>A гена F2 (rs1799963), c.1691G>A гена F5 (rs6025), (-5)T>C Kozak гена GP1BA (rs2243093), c.675_676delinsG гена PAI-1 (rs34857375), SG13S114 (rs10507391), SG13S32 (rs9551963), SG13S89 (rs4769874), SG13S25 (rs17222814) гена ALOX5AP и SNP87 (rs2910829), SNP41 (rs152312), SNP45 (rs12188950) гена PDE4D проводили методом ПЦР в реальном времени с использованием TaqMan зондов. Праймеры и зонды для анализа однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) генов F2, F5, GP1BA, SG13S25 гена ALOX5AP, SNP45 гена PDE4D подбирали с помощью программы Vector NTI Suite 9 (Invitrogen, Carlsbad, CA, США). Система «праймеры-зонд» для полиморфизма c.675_676delinsG гена PAI-1 была опубликована ранее (Wiklund et al., 2005), SG13S32 и SG13S114 гена ALOX5AP (Kajimoto et al., 2005), SG13S89 гена ALOX5AP (Hsieh и др., 2008) и SNP41, SNP87 гена PDE4D (Hsieh et al., 2009). Для амплификации 16 интрона гена АПФ, содержащего делецию 256 п.н., использовали ранее опубликованные праймеры (Rigat et al., 1992).

Статистическая обработка полученных данных проводилась с использованием пакета программ STATISTICA (data analysis software system, version 6.0. www.statsoft.com). Для расчета отношения шансов применяли программное обеспечение GraphPad InStat (США) (http://www.graphpad.com/). Для расчёта соответствия распределения генотипов в популяционной выборке закону Харди-Вайнберга использовали программное обеспечение Hardy-Weinberg equilibrium calculator (http://www.oege.org/software/hwe-mr-calc.shtml). Анализ межгенных взаимодействий проводился с помощью программы GMDR (Generalized Multifactor-Dimensionality Reduction) (http://sourceforge.net/projects/gmdr/).

Для проведения полногеномного ассоциативного анализа были сформированы две выборки: выборка больных острым инсультом (N=1290) и контрольная выборка, состоящая из независимых выборок из Ивановской, Владимирской, Смоленской, Курской и Тверской областей (N=740). Полногеномный анализ проводился ЗАО «Геноаналитика», Россия с использованием ДНК-микрочипов «HumanCytoSNP-12 v.2» ("Illumina", США). Статистическая обработка результатов полногеномного ассоциативного анализа проводилась с помощью программного обеспечения «Genome Studio» "Illumina", США, «SNP & Variation Suite v.7», "Golden Helix", США.

Результаты исследования

    1. Анализ генов-кандидатов острого инсульта.
      1. Анализ ОНП в генах, кодирующих белки системы свертывания крови и гемостаза

Было изучено 4 полиморфных локуса генов, белковые продукты которых вовлечены в систему гемостаза – c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1. Частоты генотипов и аллелей сравнивали между группами больных острым (N=1232) ишемическим (N=1009) геморрагическим (N=222) инсультом и контрольной выборкой (N=717), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу. Достоверным считали уровень значимости p<0.05.

Анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов F2, F5, GP1BA и PAI-1 не выявил достоверных различий между группами больных острым инсультом, его подтипами (ишемическим и геморрагическим) и контрольной группой. Для ОНП c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5 и (-5)T>C Kozak гена GP1B не было показано достоверных отличий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин. Только для ОНП c.675_676delinsG гена PAI-1 в группе женщин с острым инсультом в анамнезе наблюдается статистически достоверное увеличение частоты аллеля 5G по сравнению с соответствующей ей по полу контрольной группой (p=0.04, ОШ=1.2; 95%ДИ 1.0–1.5). Таким образом, полиморфизмы c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5 и (-5)T>C Kozak гена GP1B не влияют на риск развития острого инсульта, а также его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции. Данные полиморфизмы не увеличивают риск развития острого инсульта, как у мужчин, так и у женщин. Ассоциация с полиморфизмом c.675_676delinsG в гене PAI-1 наиболее выражена у женщин. Наличие аллеля 5G увеличивает риск развития острого инсульта в 1.2 раза, и не оказывает влияние на риск развития данного заболевания у мужчин.

      1. Анализ g.11417_11704del287 полиморфизма в гене, кодирующем ангиотензин-превращающий фермент (ACE).

Наиболее изученным полиморфизмом в гене ACE является инсерционно-делеционный полиморфизм (I/D полиморфизм) в 16 интроне, который заключается в наличии (вставка, или инсерция – аллель I) или отсутствии (выпадение, или делеция – аллель D) фрагмента в 287 п.н. (Alu-повтор). Данный полиморфизм был ассоциирован с активностью ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови и тканях. Показаны статистически достоверные ассоциации между различными подтипами инсульта и D/D генотипом на выборках европейского и неевропейского происхождения. В настоящей работе был проведен анализ I/D полиморфизма (g.11417_11704del287) гена ACE. Частоты генотипов и аллелей сравнивали между группами больных острым инсультом (N=1100), ишемическим (N=903), геморрагическим инсультом (N=195) и контрольной выборкой (N=458), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу.

Проведенный сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного варианта g.11417_11704del287 гена ACE показал отсутствие ассоциаций с острым инсультом и его подтипами. Наличие аллеля D не влияло на риск развития острого инсульта ни у мужчин, ни у женщин.

      1. Анализ полиморфизмов rs10507391 (SG13S114), rs9551963 (SG13S32), rs4769874 (SG13S89) и rs17222814 (SG13S25) в гене ALOX5AP

Был проведен анализ полиморфизмов SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25 гена ALOX5AP. Частоты генотипов и аллелей данных ОНП сравнивали между группами больных острым (N=1234), ишемическим (N=1009), геморрагическим (N=222) инсультом и контрольной выборкой (N=717), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу.

Для ОНП SG13S89 гена ALOX5AP не было обнаружено статистически достоверных ассоциаций с риском развития острого инсульта или его подтипов – ишемического и геморрагического. Для данного ОНП не было показано достоверных различий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин.

Для ОНП SG13S32 гена ALOX5AP не было выявлено статистически достоверных ассоциаций с риском развития острого и ишемического инсульта. В выборке больных геморрагическим инсультом носители аллеля С (лица с генотипами A/C и C/C) встречались на 6.7% чаще, чем в контроле (p=0.04; ОШ=1.5; 95%ДИ 1– 2.3) (табл.1). Для данного ОНП гена ALOX5AP, также как и для локуса SG13S89, не наблюдалось достоверных различий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин.

Таблица 1. Частоты генотипов и аллелей однонуклеотидных полиморфизмов (ОНП) в гене ALOX5AP

ОНП Острый инсульт Ишемический инсульт Геморрагический инсульт Контрольная группа
SG13S114 TT/TA/AA (T/A) 0.54/0.39/0.07 (0.73/0.27) 0.54/0.38/0.08 (0.73/0.27) 0.55/0.40/0.05 (0.75/0.25) 0.50/0.40/0.10 (0.70/0.30)
SG13S32 AA/AC/CC (A/C) 0.22/0.50/0.28 (0.47/0.53) 0.23/0.49/0.28 (0.48/0.52) 0.17/0.55/0.28 (0.44/0.56) 0.23/0.51/0.26 (0.49/0.51)
SG13S89 GG/GA/AA (G/A) 0.92/0.08/0 (0.96/0.04) 0.92/0.08/0 (0.96/0.04) 0.93/0.07/0 (0.96/0.04) 0.93/0.07/0 (0.97/0.03)
SG13S25 GG/GA/AA (G/A) 0.78/0.20/0.02 (0.88/0.12) 0.78/0.20/0.02 (0.88/0.12) 0.80/0.18/0.02 (0.89/0.11) 0.85/0.14/0.01 (0.92/0.08)

Для локуса SG13S114 гена ALOX5AP были обнаружены статистически достоверные различия в частоте распространения аллелей между группами острого, ишемического инсульта и контрольной группой. В группах острого и ишемического инсульта аллель T встречался чаще, чем в контрольно группе (p=0.02, p=0.04, соответственно; ОШ=1.2, 1.2, соответственно; 95%ДИ 1–1.4, 1–1.4, соответственно). В группе больных геморрагическим инсультом различия в частоте встречаемости аллеля T по сравнению с контрольной группой не достигают уровня статистической значимости (p=0.05) (табл.1). Для ОНП SG13S114 не наблюдалось достоверных различий в частотах распространения генотипов и аллелей между больными острым инсультом и соответствующими контрольными группами мужчин и женщин.

Наиболее сильные ассоциации с риском развития острого и ишемического инсульта были показаны для ОНП SG13S25 в гене ALOX5AP. Так, в группах больных острым и ишемическим инсультом частота генотипов G/A и A/A была выше, чем в контроле (p=0.0006, p=0.0004 – соответственно). У носителей аллеля A полиморфного маркера SG13S25 риск развития острого инсульта был выше в 1.6 раза (p=0.0002; 95%ДИ 1.3–2.1), а ишемического – в 1.7 раза (p=0.0001; 95%ДИ 1.3 – 2.1). В группах больных геморрагическим инсультом и контрольной группе разница в частоте встречаемости генотипов и аллелей не достигает уровня статистической значимости (p=0.17; p=0.11). При сравнении группы мужчин с острым инсультом в анамнезе с соответствующей по полу контрольной группой не было обнаружено достоверных различий в частоте встречаемости генотипов и аллелей полиморфизма SG13S25. В группе женщин с аналогичным диагнозом такие различия были статистически значимы (p=0.0013 – для генотипов; p=0.0003 – для аллелей).

Таким образом, было показано, что аллель T полиморфизма SG13S114 и аллель A полиморфизма SG13S25 в гене ALOX5AP увеличивают риск развития острого инсульта в 1.2 раза (95%ДИ 1.0–1.4) и 1.6 раза (95%ДИ 1.3–2.1), соответственно, а ишемического в 1.2 раза (95%ДИ 1.0–1.4) и 1.7 раза (95%ДИ 1.3–2.1), соответственно. У женщин, носителей аллеля A полиморфизма SG13S25, риск развития острого инсульта в 1.8 раза выше (95%ДИ 1.3 – 2.5), но данный полиморфизм не вносит вклад в развитие острого инсульта у мужчин. ОНП SG13S114 и SG13S25 не вносят существенного вклада в риск развития геморрагического инсульта. У носителей аллеля С полиморфного маркера SG13S32 риск развития геморрагического инсульта выше в 1.5 раза по сравнению с контрольной группой (95%ДИ 1.0–2.3).

Точный механизм, посредством которого полиморфные варианты в гене ALOX5AP могут влиять на риск развития инсульта, до настоящего времени не изучен. Все ОНП, для которых были показаны ассоциации с повышенным риском развития инсульта и его подтипов, не приводят к замене аминокислот в белке. Можно предположить, что вариант SG13S25, который расположен в промоторной области гена ALOX5AP, и варианты SG13S114 и SG13S32, расположенные в интронах, могут оказывать влияние на уровень транскрипции гена, или находиться в неравновесии по сцеплению с другими, неидентифицированными ОНП, оказывающими влияние на транскрипцию, сплайсинг, стабильность мРНК гена или эффективность ее трансляции.

      1. Анализ полиморфизмов rs152312 (SNP41), rs2910829 (SNP87), rs12188950 (SNP45) в гене PDE4D

Был проведен анализ полиморфизмов SNP87 (rs2910829), SNP41 (rs152312), SNP45 (rs12188950) в гене, кодирующем фосфодиэстеразу 4D (PDE4D). Частоты генотипов и аллелей сравнивали между группами больных острым (N=1234), ишемическим (N=1009), геморрагическим (N=222) инсультом и контрольной выборкой (N=717), а также между выборками больных острым инсультом и контрольной группой, дифференцированными по полу.

Для ОНП SNP41, SNP87 и SNP45 в гене PDE4D не было обнаружено достоверных ассоциаций и риском развития острого и ишемического инсульта. При сопоставлении частот генотипов и аллелей в группах больных геморрагическим инсультом и контроле, не было выявлено достоверных различий для ОНП SNP87 и SNP45 (p=0.45, p=0.2 – для генотипов; p=0.24, p=0.73 – для аллелей). В тоже время в группе больных геморрагическим инсультом частота генотипа C/T полиморфизма SNP41 была выше на 4.9%, а частота генотипа С/С – ниже на 4.9%, чем в контрольной группе (p=0.04). SNP41 располагается в некодирующей области, фланкирующей экзон D7-1 гена PDE4D. Хотя функциональная роль данного ОНП гена PDE4D еще не ясна, можно предположить, что он может оказывать влияние на ферментативную активность в целом посредством изменения профиля экспрессии определенных изоформ фермента, что подтверждается данными других исследователей.

Для ОНП SNP41, SNP87 и SNP45 гена PDE4D не наблюдалось достоверных различий в частотах распространения генотипов и аллелей между группами женщин и мужчин больных острым инсультом и соответствующими им по полу контрольными группами.

    1. Корреляционный анализ ДНК-маркеров с основными клиническими проявлениями инсульта в группе больных острым инсультом

Был проведен корреляционный анализ между полиморфизмами c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1, g.11417_11704del287 гена ACE, SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25 гена ALOX5AP и SNP87, SNP41, SNP45 гена PDE4D и клиническими характеристиками инсульта:

  1. тяжесть состояния и выраженность неврологического дефицита по шкале инсульта Национального института здоровья США (NIHSS) на 1-е, 7-е и 21-е сутки.
  2. степень функционального восстановления нарушенных неврологических функций по модифицированной шкале Рэнкина на 3-е, 14-е, 21-е сутки и через 3 месяца после начала заболевания;
  3. индекс повседневной активности Бартел на 21-е сутки и через 3 месяца после начала заболевания;
  4. оценка степени нарушения сознания и комы по шкале Глазго на 1-е сутки;
  5. объем зоны поражения головного мозга.

Для оценки ассоциаций между полиморфными вариантами изучаемых генов и клиническими характеристиками больных был использован ранговый коэффициент корреляции по Спирмену (Spearman Rank Order Correlations). Дальнейший анализ полученных достоверных корреляций значений количественных признаков у лиц с разными генотипами был проверен с использованием однофакторного дисперсионного анализа (ANOVA). Статистически значимыми считали различия при р<0,05 (Реброва, 2002).

Статистически достоверные корреляции были выявлены только между полиморфизмом c.1691G>A гена F5 и степенью тяжести состояния больного и выраженностью неврологического дефицита. Через 3 месяца поле начала лечения происходило снижение выраженности симптомов инсульта как у носителей генотипа G/G (средний балл по шкале Рэнкина 2.4), так и у носителей генотипа G/A (средний балл по шкале Рэнкина 0.16) (Рис. 1). Но, в тоже время, G/A генотип был ассоциирован с более легким течением заболевания, более низким уровнем инвалидизации, а G/G генотип – с развитием более тяжелых форм инсульта, с более тяжелой симптоматикой и функциональными нарушениями.

Рисунок 1. Зависимость степени тяжести состояния больного и выраженности неврологического дефицита (по модифицированной шкале Рэнкина) с полиморфизмом c.1691G>A гена F5 через 3 месяца после развития заболевания.

    1. Анализ ассоциаций между различными комбинациями изучаемых ОНП в выборках больных острым инсультом и контрольной группе

С помощью программы «GMDR» были определены двух- и трех-локусные комбинации полиморфизмов c.20210G>A гена F2, c.1691G>A гена F5, (-5)T>C Kozak гена GP1BA, c.675_676delinsG гена PAI-1, g.11417_11704del287 гена ACE, SG13S114, SG13S32, SG13S89, SG13S25 гена ALOX5AP и SNP87, SNP41, SNP45 гена PDE4D в выборках больных острым, ишемическим, геморрагическим инсультом и контрольной группе. Для каждой группы заболевания были выявлены модели с максимальным уровнем тестируемой точности (табл.2).

Таблица 2. Анализ двух- и трех-локусных моделей межгенного взаимодействия в выборках больных острым, ишемическим и геморрагическим инсультом и контрольной группе.

Острый инсульт Ишемический инсульт Геморрагический инсульт
Лучшая двух-локусная модель ALOX5AP rs17222814 ACE g.11417_11704del287 ALOX5AP rs17222814 ACE g.11417_11704del287 PAI-1 rs34857375 PDE4D rs152312
Лучшая трех-локусная модель ACE g.11417_11704del287 ALOX5AP rs9551963 PAI-1 rs34857375 ACE g.11417_11704del287 ALOX5AP rs10507391 PAI-1 rs34857375

Значение величины тестируемой сбалансированной точности (Testing Ball. Acc.) для всех исследованных моделей не превышало критического уровня для мультилокусных моделей и обнаруженные межгенные взаимодействия не были статистически значимыми. Внесение поправок по полу и возрасту в двух- и трех-локусные модели не оказывало влияния на значение величины тестируемой сбалансированной точности и исследованные комбинации ДНК-маркеров, вероятно, не оказывают достаточного влияния на риск развития острого инсульта и его подтипов – ишемического и геморрагического.

    1. Полногеномный ассоциативный анализ ишемического инсульта

Для поиска новых ДНК-маркеров острого инсульта был проведен анализ 990 больных ишемическим инсультом и 772 лиц из популяционных выборок с использованием ДНК-микрочипов «HumanCytoSNP-12 v.2» (Illumina, США). Данные микрочипы позволяют анализировать около 300000 генетических маркеров и обеспечивают плотное и однородное покрытие всего генома. В состав итоговой контрольной выборки вошли независимые выборки из Ивановской, Смоленской, Курской и Тверской областей Российской Федерации.

Чтобы избежать получения ложноположительных результатов и для оценки генетической гетерогенности выборок был проведен анализ контрольной выборки и выборки больных ишемическим инсультом методом главных компонент. Выборки из Ивановской, Владимирской, Смоленской, Курской и Тверской областей занимают на графике одну область, что свидетельствует об их генетическом родстве. Выборка больных острым инсультом занимает на графике одну область с независимой контрольной выборкой, за исключением образцов больных ишемическим инсультом, отличающихся от основной группы по первой и второй главным компонентам и образующих на графике своеобразный «шлейф» (рис.2).

Рисунок 2. Результаты анализа независимой контрольной выборки и выборки больных ишемическим инсультом методом главных компонент. Зеленый цвет – больные ишемическим инсультом, синий цвет – образцы контрольной группы.

 Результаты анализа независимой контрольной выборки и выборки-2

Рисунок 3. Результаты анализа независимой контрольной выборки и выборки больных ишемическим инсультом методом главных компонент после исключения образцов больных ишемическим инсультом, образующих «шлейф»). Зеленый цвет – больные ишемическим инсультом, синий цвет – образцы контрольной группы.

Данный график анализа главных компонент двух выборок также свидетельствует об относительной однородности вошедших в них этнических компонент. На рис. 3 представлены результаты анализа независимой контрольной выборки и выборки больных ишемическим инсультом, после исключения из анализа образцов, образующих «шлейф». Выборка больных острым инсультом в этом случае образует на графике однородную область с контрольной выборкой, а специфический «шлейф» отсутствует. В дальнейший полногеномный ассоциативный анализ были включены обе модели: модель А, состоящая из выборки больных ишемическим инсультом (N=990) и контрольной выборки (N=772), и модель Б, состоящая из выборки больных ишемическим инсультом (N=885) и контрольной выборки (N=772) после исключения из анализа образцов, образующих «шлейф». Анализ ассоциаций между однонуклеотидными ДНК-маркерами и развитием острого инсульта проводили в рамках трех типов наследования – доминантного, аддитивного и рецессивного.

1.4.1. Доминантный тип наследования

В рамках доминантного типа наследования анализ моделей А и Б выявил ОНП с наибольшим значением величины p – rs1842993, расположенный на 7 хромосоме, rs2243684, расположенный на 21 хромосоме, rs8094024, расположенный на 18 хромосоме и rs241698 – в интронной области гена FHIT (fragile histidine triad gene) (табл.3).

Таблица 3. Результаты полногеномного ассоциативного анализа между ДНК-маркерами с наибольшим значением величины p и развитием ишемического инсульта. Модель А и модель Б. Доминантный тип наследования.

ДНК-маркер Хромосома Локус Значение величины p
Модель А Модель Б
rs1842993 7 межгенная область между псевдогенами LOC100128575 и LOC100129985 2.9х10-8 1.6х10-8
rs2243684 21 межгенная область 5.2х10-7 2.2х10-7
rs8094024 18 межгенная область вблизи псевдогена RSL24D1P11 7.6х10-6 3.4х10-5
rs241698 3 Ген FHIT (fragile histidine triad gene) 5.3х10-6 1.1х10-5

1.4.2. Аддитивный тип наследования

При анализе модели А максимальный уровень статистической значимости достигнут для ОНП rs2243684 (p=7.9х10-7) и rs1842993 (p=1.7х10-6) (табл.4). Эти же ДНК-маркеры были выявлены и при анализе в рамках доминантного типа наследования. При анализе модели Б, кроме ОНП rs2243684 и rs1842993, для еще одного ОНП – rs6506070 – значение величины p достигало уровня полногеномной значимости (p=3,1х10-6). ОНП rs6506070 расположен в интроне гена, кодирующего миомезин 1, который играет важную роль в поддержании правильной упаковки миозиновых филаментов в мышцах.

Таблица 4. Результаты полногеномного ассоциативного анализа между ДНК-маркерами с наибольшим значением величины p и развитием ишемического инсульта. Модель А и модель Б. Аддитивный тип наследования.

ДНК-маркер Хромосома Локус Значение величины p
Модель А Модель Б
rs2243684 21 межгенная область 7.9х10-7 3.4х10-7
rs1842993 7 межгенная область между псевдогенами LOC100128575 и LOC100129985 1.7х10-6 9.5х10-6
rs6506070 18 Интрон гена MYOM1 (myomesin 1) 3.9х10-5 3.1х10-6
      1. Рецессивный тип наследования

В рамках рецессивного типа наследования наибольшего уровня значимости при анализе модели А достигают 2 ОНП: rs4487900 (p=3.5x10-6) и rs6905808 (p=7.4x10-6), а при анализе модели Б rs4487900 (p=4.7x10-6) и rs4077515 (p=5.4x10-6) (табл.5).

Таблица 5. Результаты полногеномного ассоциативного анализа между ДНК-маркерами с наибольшим значением величины p и развитием ишемического инсульта. Модель А и модель Б. Рецессивный тип наследования.

ДНК-маркер Хромосома Локус Значение величины p
Модель А Модель Б
rs4487900 9 интрон гена SDCCAG3 (serologically defined colon cancer antigen 3) 3.5х10-6 4.67х10-6
rs6905808 6 межгенная область, вблизи гена SLC22A23 (solute carrier family 22, member 23). 7.3х10-6 2.43x10-3
rs4077515 9 Миссенс полиморфизм в гене CARD9 (caspase recruitment domain family, member 9) 1.7х10-5 5.4х10-6

Значение величины p для ОНП rs6905808, показавшего высокий уровень статистической значимости при анализе модели А, при анализе модели Б не достигает уровня статистической значимости (p=2.43x10-3) в рамках этой же модели наследования. Высокий уровень статистической значимости в модели Б имеет ОНП rs4077515 (p=5.4x10-6), который в модели А составлял p=1.7х10-05.

rs4487900 локализован в интроне гена SDCCAG3 (serologically defined colon cancer antigen 3), входящего в состав в состав протяженного гаплоблока длиной ~120 kb. В данный гаплоблок входят также гены GPSM1, LOC728489 (DNLZ), SNAPC4, CARD9, PMPCA, INPP5E и KIAA0310. Белок, кодируемый геном SDCCAG3, вовлечен в регуляцию экспрессии рецептора фактора некроза опухоли (TNF) на поверхности клеток и в анти-апоптотический механизм TNF-сигнального пути. Было показано, что определенные ОНП в генах SNAPC4 и PMPCA могут иметь статистически достоверный эффект cis – действия на экспрессию гена CARD9 (Pointon et al., 2010).

ОНП rs6905808 расположен в межгенной области вблизи гена SLC22A23 (solute carrier family 22, member 23). Белок, кодируемый данным геном, относится к большому семейству трансмембранных белков, участвующих в транспорте органических ионов, а также некоторых лекарств, токсинов и эндогенных метаболитов через клеточные мембраны.

ОНП rs4077515 – ОНП c.35G>A в гене CARD9 (caspase recruitment domain family, member 9), приводящий к замене p.Ser12Asn. Белок CARD9 играет главную роль в регуляции врожденного иммунитета и функционирует как цитозольный белок, участвующий в передачи сигнала.

Таким образом, в результате полногеномного ассоциативного анализа было выявлено 7 новых ДНК-маркеров, ассоциированных с ишемическим инсультом - rs1842993, rs2243684, rs6905808, rs241698, rs6506070, rs4487900, rs4077515. Наиболее сильная ассоциация показана в рамках доминантной модели наследования для двух ДНК-маркеров: rs1842993, расположенного на хромосоме 7p11.2, и rs2243684 на хромосоме 21q21.1.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ роли генетических факторов в патологии человека имеет большое значение для понимания причин и механизмов развития многих заболеваний. В настоящее время для многих моногенных заболеваний уже осуществлено картирование генов на хромосомах, анализ их структуры, а также описаны мутации, определяющие данные заболевания. На современном этапе развития геномики особое внимание уделяется исследованию молекулярно-генетических механизмов формирования мультифакториальных заболеваний, развитие которых обусловлено как генетическими факторами, так и факторами внешней среды.

Инсульт является одной из наиболее важных проблем современного общества, поскольку участвует в формировании основных показателей здоровья населения – общей смертности и инвалидизации. Многочисленные эпидемиологические и генеалогические исследования доказали важность роли семейной отягощенности в частоте развития сосудистых заболеваний мозга.

Были достигнуты значительные успехи в понимании молекулярно-генетических механизмов реализации ишемического повреждения мозга в рамках моногенных патологических состояний таких, как CADASIL. Однако исследования молекулярно-генетических основ полигенных мультифакториальных форм инсульта хотя и многочисленны, но не дают однозначного ответа о механизмах их патогенеза. Наиболее сильные ассоциации с риском развития острого инсульта и его подтипов – ишемического и геморрагического были показаны для генов-кандидатов F2, F5, GP1BA, ACE. Отдельные работы не выявляли положительной корреляции между данными полиморфными маркерами в данных генах-кандидатах и риском развития инсульта. Это может быть связано как с недостаточным размером выборок, так и отсутствием четкого определения патогенетических вариантов инсульта. Кроме того, велика вероятность, что структурные особенности ряда рассматриваемых генов-кандидатов определяют не столько независимый риск, сколько формирование модифицируемых факторов риска, а значит, не имеют отношения к формированию индивидуальной генетической предрасположенности, как независимого фактора риска развития инсульта. Кроме того, различные гены могут быть ответственны за различные патогенетические варианты инсульта.

Завершение проекта по картированию гаплотипов в геноме человека (HapMap), а также создание ДНК-микрочипов высокой плотности сделали возможным проведение полногеномного ассоциативного анализа заболеваний как моногенных, так и сложнонаследуемых. Данный метод позволяет выявлять новые, ранее не изучавшиеся в исследованиях вида «случай – контроль» ДНК-маркеры, которые могут быть ассоциированы с развитием той или иной патологии. Исторически первым для поиска генов-кандидатов инсульта был применен полногеномный анализ сцепления, основанный на генетическом картировании семей или расширенных родословных с использованием различных типов ДНК-маркеров. Наиболее сильная ассоциация была показана для двух генов, роль которых в патогенезе инсульта ранее не исследовалась – гена фосфодиэстеразы 4D (PDE4D) и гена активатора 5-липоксигеназы (ALOX5AP).

Проведенные полногеномные ассоциативные анализы острого инсульта на выборках различных этносов выявили 11 новых ДНК-маркеров, ассоциированных с инсультом. Интересно, что в данных исследованиях не было показано ассоциаций для генов–кандидатов, которые ранее были описаны в исследованиях вида «случай – контроль».

Целью настоящей работы являлись поиск и анализ генетических маркеров риска развития острого инсульта, а также его подтипов – ишемического и геморрагического в российской популяции. Для этого был проведен анализ полиморфных ДНК-маркеров в кандидатных генах острого инсульта F2, F5, GP1BA, ACE, ALOX5AP и PDE4D у пациентов с различными клиническими формами острого инсульта из российской популяции. Полиморфизмы rs1799963 гена F2, rs6025 гена F5, rs2243093 гена GP1BA, g.11417_11704del287 полиморфизм гена ACE, SG13S89 (rs4769874) гена ALOX5AP и полиморфизмы SNP87 (rs2910829) и SNP45 (rs12188950) гена PDE4D, а также их комбинации не влияли на патогенез этих заболеваний у больных из г. Москвы.

Были показаны ассоциации полиморфизмов SG13S114 (rs10507391) и SG13S25 (rs17222814) гена ALOX5AP с острым и ишемическим инсультом. Наличие аллеля T полиморфного варианта SG13S114 увеличивало риск развития ишемического инсульта в 1.2 раза (95%ДИ 1 – 1.4). Ассоциация с развитием острого инсульта полиморфного варианта SG13S25 (rs17222814) гена ALOX5AP носит сложный характер. Она наблюдается у пациентов с ишемическим инсультом (p<0.0001, ОШ=1.6), и более сильно выражена у женщин (p=0.0003, ОШ=1.8). Данные полиморфизмы не оказывали влияния на риск развития геморрагического инсульта.

Для полиморфизмов SG13S32 (rs9551963) гена ALOX5AP и SNP41 (rs152312) гена PDE4D показаны ассоциации с геморрагическим инсультом. У лиц с генотипами C/T и T/T полиморфного варианта SNP41 (rs152312) риск развития геморрагического инсульта был выше в 1.2 раза, а наличие аллеля С по полиморфизму SG13S32 (rs9551963) гена ALOX5AP увеличивало риск данной патологии в 1.5 раза (p=0.04).

При оценке распределения генотипов по полиморфному варианту rs6025 гена F5 у пациентов с различной степенью функционального восстановления нарушенных неврологических функций была выявлена достоверная корреляция. G/A генотип был ассоциирован с более легким течением заболевания и более низким уровнем инвалидизации, чем генотип G/G.

Для поиска новых ДНК-маркеров острого инсульта был проведен полногеномный ассоциативный анализ с использованием ДНК-микрочипов «HumanCytoSNP-12 v.2» («Illumina», США). Было выявлено 7 новых локусов, ассоциированных с ишемическим инсультом (rs1842993, rs2243684, rs6905808, rs241698, rs6506070, rs4487900, rs4077515). Наиболее сильная ассоциация показана в рамках доминантного типа наследования для ДНК-маркера rs1842993, расположенного на хромосоме 7p11.2 (p=2.910-8). Кроме того, не было обнаружено достоверных ассоциаций с локусами, для которых были показаны ассоциации с острым инсультом или его подтипами в других полногеномных ассоциативных исследованиях.

Таким образом, с одной стороны, полученные данные подтверждают участие ряда генетических систем в определении риска развития различных вариантов острого инсульта. С другой стороны, сравнение полученных данных с данными, имеющимися в литературе, указывает на крайне высокую гетерогенность таких генетических факторов и их вовлеченность в патогенез острого инсульта в разных исследованиях различных ДНК-маркеров. Это можно объяснить с одной стороны, этнической неоднородностью выборок в различных исследованиях. Частоты генотипов ДНК-маркеров, для которых были показаны ассоциации с риском развития инсульта, могут в значительной степени варьировать в различных популяциях, и, соответственно, различается величина их вклада в патогенез заболевания. Кроме того, для различных этнических групп генетические факторы риска развития заболевания могут отличаться. Однако во многих исследованиях отсутствует четкое разделение пациентов по типу инсульта. Вероятно, за различные патогенетические варианты инсульта могут отвечать различные гены-кандидаты. Так, например, в данной работе было показано, что полиморфизмы SG13S114 и SG13S25 вносят вклад в риск развития ишемического инсульта и не оказывают влияние на патогенез геморрагического. А полиморфизмы SG13S32 гена ALOX5AP и SNP41 гена PDE4D, напротив, показали ассоциацию с риском развития геморрагического инсульта. Учитывая все вышеизложенное, необходимо продолжение работы по поиску ДНК-маркеров риска развития острого инсульта и его подтипов, с учетом популяционной стратификации формируемых выборок и необходимостью более строго подхода к клиническому описанию больных.

Выводы:

  1. Показаны ассоциации полиморфизмов SG13S114 (rs10507391) и SG13S25 (rs17222814) гена активатора 5-липоксигеназы (ALOX5AP) с ишемическим инсультом. Для полиморфизмов SG13S32 (rs9551963) гена ALOX5AP и SNP41 (rs152312) гена фосфодиэстеразы 4D (PDE4D) показаны ассоциации с геморрагическим инсультом.
  2. Ассоциация с развитием острого инсульта полиморфного варианта SG13S25 (rs17222814) гена ALOX5AP носит сложный характер. Она наблюдается только у пациентов с ишемическим инсультом (p<0.0001, ОШ=1.6), и более сильно выражена у женщин (p=0.0003, ОШ=1.8).
  3. Обнаружены ассоциации полиморфизма rs6025 гена фактора свертывания крови V (F5) с параметрами, характеризующими степень функционального восстановления нарушенных неврологических функций через 3 месяца после острого инсульта. Генотип G/A ассоциирован с более легким течением заболевания и снижением уровня инвалидизации.
  4. Полиморфизмы rs1799963 гена фактора свертывания крови II (F2), rs6025 гена фактора свертывания крови V (F5), rs2243093 гена -цепи тромбоцитарного рецептора GPIb (GP1BA), g.11417_11704del287 полиморфизм гена ангиотензин-превращающего фермента (ACE), SG13S89 (rs4769874) гена активатора 5-липоксигеназы (ALOX5AP) и полиморфизмы SNP87 (rs2910829) и SNP45 (rs12188950) гена фосфодиэстеразы 4D (PDE4D), а также их комбинации, не ассоциированы с развитием острого, ишемического и геморрагического инсульта и не оказывают влияния на течение этих заболеваний у больных из г. Москвы.
  5. В результате полногеномного ассоциативного анализа выявлено 7 новых ДНК-маркеров, ассоциированных с ишемическим инсультом (rs1842993, rs2243684, rs6905808, rs241698, rs6506070, rs4487900, rs4077515). Наиболее сильная ассоциация показана в рамках доминантной модели наследования для ДНК-маркера rs1842993, расположенного на хромосоме 7p11.2 (p=2.8610-8).

Список Публикаций по теме диссертации

  1. Т.В. Тупицына, Е.А. Бондаренко, А.Ю. Боцина, И.М. Шетова, С.А. Лимборская, В.И. Скворцова, П.А. Сломинский. «Роль полиморфных вариантов гена индуцибельной NO-синтазы NOS2 в формировании инфаркта мозга у больных с острым ишемическим инсультом», Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2010, №3, с. 3 – 7.
  2. Е.А. Бондаренко, Т.В. Тупицына, П.А. Сломинский, И.М. Шетова, Н.А. Шамалов, А. Ю. Боцина, В.И. Скворцова, С.А. Лимборская «Полиморфизм гена фосфодиэстеразы 4Д (PDE4D) у больных острым инсультом г. Москвы», Генетика, 2010, Т.46, №6, с.861-864.
  3. Е.А. Бондаренко, Е.И. Мокан, Н.И. Барбакар, Т.В. Тупицына, П.А. Сломинский, И.М. Шетова, Н.А. Шамалов, А.Ю. Боцина, В.И. Скворцова, С.А. Лимборская «Анализ полиморфных вариантов гена PDE4D у больных острым инсультом в молдавской популяции», Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2011, №2, с. 5 – 8.
  4. Е.А. Бондаренко, П.А. Сломинский, С.А. Лимборская, И.М. Шетова, Д.Ю. Тимофеев, В.И. Скворцова «Полиморфные варианты гена ALOX5AP и риск развития острого инсульта в российской популяции», Генетика, 2011, Т. 47, № 4, с. 570–573
  5. В.И. Скворцова, С.А. Лимборская, И.М. Шетова, П.А. Сломинский, Н.А. Шамалов, Е.А. Бондаренко, Д.Ю. Тимофеев «Ассоциация полиморфизма гена фосфодиэстеразы 4Д (PDE4D) с развитием церебрального инсульта у больных из московской популяции», Журнал неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. Инсульт, 2011, №4, С.3-7.
  6. Е.А. Бондаренко, И.М. Шетова, Н.А. Шамалов, Е.И. Мокан, Н.И. Барбакар, Г.С. Курочкин, С.С. Протопоп, Л.Т. Лысый, П.А. Сломинский, С.А. Лимборская, В.И. Скворцова «Анализ ДНК-маркеров и предрасположенности к острому ишемическому инсульту в российской и молдавской популяциях» Генетика, 2011, Т. 47, № 10, с. 1393–1401.
  7. Е.А. Бондаренко, Т.В. Тупицына, И.М. Шетова, А.Ю. Боцина «Ген фосфодиэстеразы 4Д (PDE4D) и риск развития острого инсульта больных из г. Москвы». Материалы III Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины», 2009 г., с. 137.
  8. Е.А. Бондаренко, Т.В. Тупицына, И.М. Шетова, А.Ю. Боцина, В.И. Скворцова, С.А. Лимборская «Полиморфные варианты гена PDE4D у больных с острым инсультом из Москвы». Материалы VI съезда Российского общества медицинских генетиков, 2010 год, стр.27.
  9. SA Limborska, PA Slominsky, EA Bondarenko, AV Khrunin, A Metspalu, IM Shetova, VI Skvortsova «Genome wide association study for acute stroke in Russians». Abstracts of papers presented at the 2011 meeting on “The biology of genomes”, 10.05 – 14.05 2011, Cold Spring Harbor, New York, p.173
  10. E. Bondarenko, I. Shetova, N. Shamalov, P. Slominsky, S. Limborska, V. Skvortsova Abstracts of papers presented at the 2011 meeting on European Society of Human Genetics, 28.05 – 31.05 2011, p.266.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.