WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Пр о тотипы сибиреязвенных вакцин на основе генно-инженерных бациллярных штаммов и синт е зируемых ими антигенов

На правах рукописи

Микшис Наталья Ивановна

прототипы сибиреязвенных вакцин

на основе генно-инженерных бациллярных штаммов

и синтезируемых ими антигенов

03.00.07 – микробиология

03.00.15 – генетика

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Саратов – 2009

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

Член-корреспондент Российской Академии

медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Доктор биологических наук, профессор Попов Юрий Алексеевич

Официальные оппоненты:

Член-корреспондент Российской Академии

наук, доктор медицинских наук, профессор Пименов Евгений Васильевич

Доктор медицинских наук, доцент Бойко Андрей Витальевич

Доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»

Защита состоится «_____» _________________ 2009 г. в ______ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

(410005, г. Саратов, ул. Университетская, 46; e-mail: microbe@san.ru)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан ____________________ 2008 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский

общая характеристика работы

Актуальность исследования

Bacillus anthracis – грам-положительный, спорообразующий микроорганизм, вызывающий опасное зооантропонозное инфекционное заболевание, поражающее восприимчивых животных и людей. Ежегодно практически во всех регионах мира регистрируются многочисленные случаи сибиреязвенной инфекции. Данные мониторинга за развитием эпидемической ситуации в России свидетельствуют о неуклонном росте неблагополучных по сибирской язве территорий (Онищенко Г.Г., 2008). Расширение нозоареала патогенного микроорганизма, способного длительно сохраняться и накапливаться в окружающей среде, может привести к увеличению эпидемических проявлений сибиреязвенной инфекции (Черкасский Б.Л. с соавт., 2002). Крупнейшая вспышка сибирской язвы в Зимбабве в 1978 – 1979 гг. охватила почти 10 тысяч человек и унесла около 450 жизней (Davies J., 1982, 1983, 1985). В России в период с 2003 по 2007 гг. было зарегистрировано 43 подтвержденных случая заболевания сибирской язвой людей, из них 3 - с летальным исходом (Государственный доклад, 2007; Онищенко Г.Г., 2008). Повышение уровня заболеваемости отмечалось в 2004 году - 16 случаев в 5 областях Российской Федерации (Ясинский А.А. с соавт., 2005).

Высокая патогенность сибиреязвенного микроба в сочетании с уникальной устойчивостью споровых форм к воздействию факторов внешней среды, ставят его в разряд крайне опасных биологических агентов, имеющих потенциальную угрозу применения в качестве оружия массового поражения (Spencer R., Wilcox M., 1993; Redmond C. et al., 1998; Spencer R., Lightfoot N., 2001). Осуществленная в 2001 году рассылка контаминированной спорами B. anthracis корреспонденции вызвала панику среди населения США и привела к гибели пяти человек от легочной формы заболевания (Jernigan J. et al., 2001; Bush L. et al., 2001; Brachman P., 2002).

В системе ветеринарных и медико-санитарных мер, направленных на обеспечение эпидемиологического благополучия по сибирской язве, центральное место принадлежит вакцинации сельскохозяйственных животных и людей. Наиболее длительный и напряженный иммунитет обеспечивают живые сибиреязвенные вакцины. Однократное подкожное введение одной дозы распространенной в мире ветеринарной вакцины B. anthracis Sterne 34F2 защищает животных от заражения возбудителем сибирской язвы в течение года (Turnbull P., 1991). В России живая вакцина на основе штамма B. anthracis СТИ-1 используется для профилактики сибирской язвы у людей. В практике ветеринарной медицины применяется штамм B. anthracis 55, полученный специалистами Всесоюзного научно-исследовательского института ве­теринарной вирусологии и микробиологии на основе природного бескапсульного изолята (Гаврилов В.А. с соавт., 1997). Существенным недостатком живых вакцин является относительно высокий уровень реактогенности (Turnbull P. et al., 1986; Ivins B. et al., 1990; Stepanov A. et al., 1996). Побочные эффекты связаны с воздействием на организм человека или животного токсичных продуктов жизнедеятельности вакцинных штаммов.

Рекомендованные для иммунопрофилактики живые вакцины получены в середине прошлого столетия классическими способами аттенуации вирулентных штаммов возбудителя сибирской язвы. В геноме B. anthracis присутствуют высокомолекулярные репликоны - pXO1 и pXO2 (Mikesell P. et al., 1983; Green B. et al., 1985; Uchida I. et al., 1985; Okinaka R. et al., 1999). В процессе аттенуации происходит элиминация плазмиды pXO2, детерминирующей синтез капсулы. В отсутствие капсулы сибиреязвенный микроб чувствителен к фагоцитозу и при попадании в макроорганизм не способен реализовать свой патогенный потенциал. Плазмида pXO1 содержит детерминанты, кодирующие синтез протективного антигена (ПА), отечного и летального факторов, входящих в состав экзотоксина бинарного действия. Отечный и летальный факторы, взаимодействуя с протеолитически активированным ПА, формируют токсичные комплексы, вызывающие структурные и функциональные изменения в восприимчивом организме (Leppla S., 1991). Вместе с тем, иммуногенный потенциал ПА сибиреязвенного микроба послужил основанием для создания на его основе химических вакцин.

Используемые в США и странах Западной Европы химические вакцины ввиду особенностей технологии получения их компонентов из аттенуированных культур B. anthracis, неизбежно содержат минимальные примеси отечного и летального факторов (Turnbull P. et al., 1991). Именно с данными продуктами связывают аллергические реакции, возникающие почти у 30 % вакцинированных в США людей (National communicable disease center, 1970; Swanson-Biearman B., Krenzelok E., 2001). Бесклеточные вакцины индуцируют выработку антител в высоких титрах и в ранние сроки, но для поддержания напряженного иммунитета необходимо проведение ревакцинаций.

В России для специфической профилактики сибирской язвы у людей и животных разработана также комбинированная вакцина, представляющая собой композицию спор вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 и бесклеточного препарата ПА адсорбированного на геле гидроокиси алюминия (Садовой Н.В. с соавт., 1998; Кожухов В.В. с соавт., 2002).

Достижения биологической и медицинской наук за последние несколько десятилетий изменили представления о средствах специфической профилактики инфекционных болезней. Развитие иммунологии, генетики и биохимии позволило приблизиться к разгадке тайн природы о клеточных и молекулярных механизмах взаимодействия макро- и микроорганизмов. В этих условиях аттенуированные штаммы утрачивают свою актуальность. В конструировании вакцин нового поколения на первый план выходят рекомбинантные технологии.

Кодирующий синтез ПА ген pag клонировали в штаммах различных бактериальных видов: Escherichia coli (Алимов А.П., Павлов В.М., 1995; Vodkin M., Leppla S., 1983; Gupta P. et al., 1999; Chauhan V. et al., 2001); B. subtilis (Тедиков В.М., Добрица А.П., 1993; Ivins B., Welkos S., 1986; Baillie L. et al., 1998(а)); B. anthracis (Barnard J., Friedlander A., 1999; Cohen S. et al., 2000); Francisella tularensis (Дармов И.В. с соавт., 1999); Salmonella typhimurium (Coulson N. et al., 1994; Garmory H. et al., 2003; Stokes M. et al., 2007) и Lactobacillus casei (Zegers N. еt al., 1999). В качестве экспрессирующих систем предлагались также вирусы (Iacono-Connors L. et al., 1991) и трансгенные растения (Azhar A. et al., 2002; Hull A. et al., 2005; Chichester J. et al., 2007). Однако далеко не во всех случаях удалось решить проблемы стабилизации гибридных молекул и оптимизации параметров экспрессии клонированных генов.

Отвечающие современным требованиям профилактические препараты должны разрабатываться с учетом всего арсенала накопленных знаний о структуре, свойствах, молекулярной природе, генетической детерминации, путях синтеза и регуляции факторов патогенности и иммуногенности инфекционного агента. Все вышеизложенное определяет актуальность планируемой диссертационной работы,

целью которой является: разработка комплексного подхода к созданию средств специфической профилактики сибирской язвы на основе рекомбинантных технологий.

Задачи исследования:

  1. На основании экспериментальных данных о факторах иммуногенности и патогенности возбудителя сибирской язвы хромосомной детерминации создать коллекцию оптимальных реципиентов для генетического конструирования штаммов-продуцентов биологически-значимых антигенов сибиреязвенного микроба.
  2. Сконструировать стабильные авирулентные рекомбинантные штаммы-продуценты протективного антигена B. anthracis. Оценить эффективность продукции протективного антигена штаммами с клонированным геном pag.
  3. Разработать условия безопасной и экологичной технологии получения протективного антигена сибиреязвенного микроба. Сконструировать стабильный аспорогенный рекомбинантный штамм-продуцент протективного антигена, перспективный для производства основного компонента химических сибиреязвенных вакцин.
  4. Оптимизировать экспериментальную схему выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерным продуцентом. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантного протективного антигена, осуществить его биохимическую и иммунохимическую характеристику. В экспериментах in vivo показать возможность применения рекомбинантного протективного антигена для осуществления специфической профилактики сибирской язвы.
  5. Оценить иммуногенный потенциал белков S-слоя B. anthracis. Получить эффективные продуценты экскретируемого компонента S-слоя. Выделить, очистить, идентифицировать и охарактеризовать протеины Sap и ЕА1.
  6. Изучить иммуногенность и остаточную вирулентность генно-инженерных штаммов в сравнении с лицензированными препаратами живых сибиреязвенных вакцин. Оценить перспективы рекомбинантных штаммов в плане создания на их основе менее реактогенных живых вакцин.
  7. Определить основные направления использования генетически сконструированных штаммов и синтезируемых ими биологически значимых белковых продуктов.

Научная новизна исследования:

С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба и применением рекомбинантных технологий разработана комплексная экспериментальная система, включающая: а) протеазодефицитные и аспорогенные реципиентные штаммы B. anthracis; б) сконструированные на их основе стабильные, эффективные и безопасные продуценты иммуногенных антигенов; в) перспективные для создания ареактогенной химической вакцины препараты протективного антигена и компонентов S-слоя; г) генно-инженерный штамм B. anthracis, являющийся прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.

Впервые получены стабильные и эффективные генно-инженерные продуценты ПА на основе бесплазмидных производных отечественных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.

Разработаны условия безопасной и экологичной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Сконструирован не образующий спор стабильный рекомбинантный авирулентный штамм B. anthracis, продуцирующий ПА в 4 - 5 раз больше, чем вакцинные штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. Установлено, что двукратная иммунизация кроликов дозой 50 мкг очищенного препарата ПА, выделенного из аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis 55TПА1Spo-, обеспечивает защиту 100 % животных от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.

В экспериментах на лабораторных животных показана перспективность использования рекомбинантного штамма B. anthracis СТИТПА-1 для создания менее реактогенной и эффективной живой сибиреязвенной вакцины. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 107 спор сконструированных штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Генно-инженерные штаммы не обладают остаточной вирулентностью для морских свинок и мышей линии BALB/с.

Впервые у штаммов возбудителя сибирской язвы обнаружены различия в продукции in vitro одного из белков S-слоя – Sap. Среди природных изолятов и аттенуированных производных B. anthracis обнаружены культуры, не продуцирующие Sap в среду выращивания.

Показано, что условия температурной элиминации плазмид в лабораторных условиях способствуют возникновению спонтанных Sap- мутаций.

На основании изучения вирулентности изогенных производных B. anthracis 81/1 установлено, что спонтанные мутации, приводящие к сочетанному нарушению протеолитической, гемолитической активности, пигментсинтеза и пигментсорбции не вызывают значительного изменения патогенности штаммов B. anthracis. Спонтанные мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением почти на два порядка степени патогенности штамма для беспородных белых мышей. Результаты изучения вирулентности спонтанных аспорогенных мутантов, инсерционного Spo- мутанта и сконструированного Spo+ трансдуктанта свидетельствуют о влиянии на патогенность продуктов генов, находящихся в непосредственной близости от генов spo оперона или в функциональном взаимодействии с ними.

В основу эффективной селекции протеазодефицитных и аспорогенных штаммов B. anthracis положена выявленная корреляция экспрессии хромосомных признаков - протеолиза, гемолиза, пигментсорбции, пигментсинтеза и спорообразования.

Научная новизна и приоритетность выполненных исследований подтверждена 7 патентами Российской Федерации на изобретения: № 2321628 - рекомбинантный штамм B. anthracis СТИТПА-1 (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2321629 - аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55ТПА-1 Spo- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба; № 2180349, № 2180916, № 2180917 и № 2180350 – аспорогенные штаммы B. anthracis, являющиеся продуцентами сибиреязвенных антигенов или реципиентами для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов; № 2193597 - способ получения аспорогенных штаммов B. anthracis.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонирована система штаммов B. anthracis, необходимая для изучения генетической детерминации факторов патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы, направленного конструирования продуцентов биологически-значимых макромолекул, лабораторного и промышленного получения иммуногенных антигенов сибиреязвенного микроба. Она включает 25 бациллярных штаммов, в том числе: а) стабильные и эффективные рекомбинантные продуценты ПА сибиреязвенного микроба - B. anthracis СТИТПА-1 (КМ96), B. anthracis 55ТПА-1 (КМ95) и B. subtilis WB600ПА-1 (КМ199); б) аспорогенный рекомбинантный продуцент ПА - B. anthracis 55TПА-1Spo- (КМ97); в) продуценты белка S-слоя (Sap) - B. anthracis Sterne H1 и B. anthracis 71/12H2 (КМ87 и КМ88); г) коллекцию реципиентных бесплазмидных штаммов для экспериментов по генетическому конструированию - B. anthracis 55T (КМ92(2)) и его аспорогенный мутант (КМ92(3)), аспорогенный мутант B. anthracis СТИT (КМ91), инсерционный аспорогенный мутант B. anthracis SterneT (КМ90), спонтанный и инсерционный Sap- мутанты B. anthracis SterneT (КМ93 и КМ94); д) коллекцию из 11 изогенных штаммов B. anthracis - ди-, моно- и бесплазмидных производных B. anthracis 81/1 (КМ86(1-11)), различающихся по степени выраженности хромосомных признаков: протеолитической, гемолитической активности, способностей к сорбции и синтезу пигмента, спорообразованию; е) спонтанные аспорогенные мутанты вакцинных штаммов B. anthracis Sterne 34F2 и B. anthracis 55 (КМ89 и КМ92).

Перечисленные штаммы использовались при выполнении НИР "Кон­ст­руи­ро­ва­ние рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных си­би­ре­яз­вен­ных вак­цин" (2001 - 2002 гг.), "Разработка и совершенствование средств и методов профилактики и лечения опасных и особо опасных заболеваний" (2002 - 2004 гг.) в рамках Федеральных целевых научно-технических программ: «Создание методов и средств защиты населения и среды обитания от опасных и особо опасных патогенов в чрезвычайных ситуациях природного и техногенного характера”, "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники". С применением депонированных штаммов проведены: хоздоговорная НИР с НИИ микробиологии МО РФ - "Получение аспорогенных производных вакцинных штаммов B. anthracis" (2000 г.), а также плановые НИР: "Изучение хромосомных факторов патогенности возбудителя сибирской язвы" (1997 - 2001 гг.), "Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин" (2002 - 2004 гг.), «Использование препаратов протективного антигена и белков S-слоя для создания средств диагностики и профилактики сибирской язвы» (2006-2008 гг.). Аспорогенные штаммы B. anthracis (КМ89-92) применяются при проведении научно-технических разработок, проводимых в ФГУ «48 Центральный научно-исследовательский институт МО РФ» и ФГУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии Роспотребнадзора».

Материалы диссертации вошли в практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней», утвержденное руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (12.12.07 г.).

По материалам диссертации составлены методические документы, одобренные Ученым советом и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб»: пособие для научных сотрудников - «Выделение в популяциях Bacillus anthracis фенотипов, различающихся по протолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию» (30.04.99 г.); методические рекомендации - «Комплекс методических подходов к определению продукции протективного антигена сибиреязвенного микроба» (17.04.07 г.) и «Селекция штаммов сибиреязвенного микроба, продуцирующих белок Sap S-слоя» (27.06.07 г.).

Материалы диссертации представлены в лекционных циклах по генетике бактерий - на курсах специализации и повышения квалификации врачей и биологов при РосНИПЧИ «Микроб», на биологическом факультете Саратовского Государственного университета имени Н.Г. Чернышевского и биотехнологическом факультете Саратовского Государственного аграрного университета имени Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

  1. С применением комплексного подхода, учитывающего дополнительные сведения о факторах иммуногенности и патогенности B. anthracis и использующего рекомбинантные технологии, создана экспериментальная система для конструирования сибиреязвенных вакцин. Ее компонентами являются: коллекция протеазодефицитных и аспорогенных бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis; генно-инженерные бациллярные штаммы с высокой продукцией биологически активного протективного антигена, в том числе - стабильный аспорогенный продуцент; очищенные препараты рекомбинантного протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба; высокоиммуногенный штамм B. anthracis с клонированным геном pag.
  2. Рекомбинантные штаммы B. anthracis СТИТПА-1, B. anthracis 55ТПА-1 и B. subtilis WB600ПА-1 - безопасные, стабильные и эффективные продуценты протективного антигена сибиреязвенного микроба. Генно-инженерные штаммы не содержат детерминанты синтеза основных факторов вирулентности возбудителя сибирской язвы, сохраняют биологические свойства при пассировании в селективных условиях и секретируют в пять раз больше иммуногенного антигена, чем вакцинные культуры B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55.
  3. Генно-инженерные штаммы с гибридным репликоном pUB110PA-1 обладают высокой иммунологической эффективностью. Однократная иммунизация биомоделей (мышей линии BALB/с, морских свинок) дозой 3 - 5 107 спор рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИТПА-1и B. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие напряженного иммунитета с высокими значениями титров антител к протективному антигену и эффективно защищает от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы.
  4. Рекомбинантный аспорогенный штамм B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) при пассировании in vitro не реверсирует к спорообразующему фенотипу и в селективных условиях сохраняет способность к репликации гибридной плазмиды, определяя концепцию экологичной и безопасной технологии производства химической сибиреязвенной вакцины. Генно-инженерный штамм синтезирует биологически активный протективный антиген - двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного продукта обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма возбудителя сибирской язвы.
  5. Белки S-слоя B. anthracis являются дополнительными факторами иммуногенности хромосомной детерминации на основании изучения протективных свойств очищенных белковых препаратов и изогенных Sap+ и Sap- штаммов B. anthracis. Спонтанные или индуцированные мутации в штаммах B. anthracis, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, сопровождаются снижением на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и представлены на международных конференциях: 3-й международной конференции по сибирской язве (Плимут, Великобритания, 1998), 2-ой международной конференции по молекулярной биологии Bacillus cereus, Bacillus anthracis и Bacillus thuringiensis (Таос, Нью-Мексико, США, 1999), 1-ой международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции «Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Межгосударственной научно-практической конференции «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ» (Саратов, 2007); на Российских конференциях: 2-ой Всероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Саратов, 1998); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - ХХI век» (Саратов, 2004); IX Всероссийской научно-практическая конференция «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2004); ХХ Российской конференции по электронной микроскопии (Черноголовка, 2004); Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (Суздаль, 2005); Российском медицинском форуме «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); IX съезде всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); а также на юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 1998) и ежегодных научных конференциях РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 2000-2008).

Публикации. Основное содержание работы отражено в 48 научных публикациях, из которых 12 статей в рекомендованных ВАК изданиях, 16 тезисов в сборниках международных и Российских конференций, 7 патентов.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, списка принятых обозначений и сокращений, обзора литературы, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 66 отечественных и 250 зарубежных источников. Общий объем диссертации составляет 297 страниц машинописного текста. Текст иллюстрирован 47-ю рисунками.

Содержание диссертации

Материалы и методы. При проведении собственных исследований было использовано 77 штаммов B. anthracis и 3 - B. subtilis, из них 48 - получены в ходе настоящего исследования.

В качестве питательных сред использовали бульон BHI («Difco», США), бульон и агар Хоттингера, L-бульон и L-агар (Маниатис Т. с соавт., 1984), в которые при необходимости добавляли антибиотики: эритромицин (0,1 мкг/мл и 1 мкг/мл), линкамицин (25 мкг/мл), тетрациклин (10 мкг/мл), канамицин (25 или 50 мкг/мл), стрептомицин (25 мкг/мл). Для выделения сибиреязвенного токсина и белков S-слоя штаммы B. anthracis выращивали на среде (S-бульоне), предложенной J. Farchaus et al. (1995). Реакцию радиальной диффузионной преципитации ставили на казаминовой среде C. Thorne and F. Belton (1957) с добавлением сибиреязвенного -глобулина или кроличьих анти-ПА антител. Определение протеолитической, гемолитической активностей и способности к сорбции пигмента проводили на оригинальных средах с казеином, эритроцитами барана (кролика, морской свинки) и конго красным, соответственно. Работы с бактериофагом СP51ts45 осуществляли на питательном бульоне Nutrient broth («Difco», США) и средах для размножения, хранения и разведения фага (Thorne C. et al., 1968). В опытах по определению иммуногенности использовали морских свинок весом 300 - 350 г, беспородных белых мышей или мышей линии BALB/с весом 18 - 20 г. Для получения специфических антител к белковым препаратам использовали кроликов весом от 2,5 до 3 кг.

микробиологические и иммунологические методы. Определение видовых признаков сибиреязвенных штаммов проводили согласно регламентирующему документу - «Инструкции и методические указания по лабораторной, клинической диагностике, профилактике и лечению сибирской язвы у людей» (М., 1980). Для микроскопического исследования клеток штаммов B. anthracis суточную агаровую культуру засевали в BHI и инкубировали 3 часа с аэрацией при температуре 37 0С. Определение протеолитической активности проводили после инкубации посевов при температуре 37 0С в течение 24 часов. Через 48 часов инкубации на этой же среде регистрировали син­те­з жел­то­го диф­фу­ндирующего пиг­мен­та. Учет ре­зуль­та­тов на сре­де с эрит­ро­ци­та­ми про­во­дили че­рез 72 ча­са инкубации при температуре 37 0С. Для оценки признака пигментсорбции куль­ту­ру B. anthracis ин­ку­би­ровали при температуре 37 0С в те­че­ние 18 ча­сов, за­тем ос­тав­ля­ли при ком­нат­ной тем­пе­ра­ту­ре на 48 ча­сов. Способность к споруляции определяли сравнением жизнеспособности прогретых (при температуре 65 0С в течение 30 минут) и непрогретых культур. Дополнительно способность к образованию спор проверяли при микроскопическом исследовании мазков, окрашенных фуксином Циля.

Подготовку споровой взвеси сибиреязвенных культур, определение ЛД50 и иммуногенности штаммов B. anthracis проводили согласно регламенту производства №831-98 вакцины сибиреязвенной живой, а также в соответствии с методическими рекомендациями - «Основные требования к вакцинным штаммам сибиреязвенного микроба для иммунизации людей» (2002). Индексы иммунитета определяли как отношение ЛД50 заражающей культуры иммунизированных и интактных лабораторных животных. Для получения антител к белкам S-слоя применяли модифицированную схему J. Farchaus et al. (1995). Кроликов иммунизировали четырехкратно очищенными препаратами Sap или ЕА1 в дозе 100 мкг на инъекцию. Анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА в дозе 50 мкг семикратно с интервалом в 2 недели.

Генетические и молекулярно-генетические методы. Трансдукцию фагом СР51ts45 проводили согласно процедуре, описанной C. Thorne et al. (1968). Конъ­ю­га­ци­он­ные скннре­щи­ва­ния осуществляли на мем­бран­ных фильт­рах по D. Lereclus et al. (1986) в мо­ди­фи­ка­ции И.В. Бра­ги­на с со­авт. (1990). Электростимулируемую трансформацию штаммов B. anthracis проводили по методике С.А. Еремина с соавт. (1990), штамма B. subtilis WB600 - по методу P. Brigidi et al. (1990). Для получения инсерционных мутантов, опосредованных интеграцией Tn917 в хромосому B. аnthracis, использовали разработанную нами ранее методику.

В экспериментах по элиминации резидентных плазмид из клеток B. аnthracis за основу были взяты методики P. Mikesell et al. (1983) и B. Green et al. (1985). Выделение ДНК высокомолекулярного репликона pXO1 осуществляли по методу R. Kaspar, D. Robertson (1987). ДНК плазмиды pUB110 из штамма B. subtilis выделяли с помощью коммерческого набора для выделения и очистки плазмид (QIAGEN, США). Выделение гибридных плазмид из штаммов B. anthracis осуществляли модифицированным способом C. Kado and S. Liu (1981). Результаты электрофорезов в агарозном геле сканировали с помощью гель-документирующей системы ViTran (Биоком, Россия). Полимеразную цепную реакцию в модификации И.Тучкова с соавт. (1991) осуществляли на программируемом амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Россия) с диагностическими праймерами на последовательности гена pag. Рестрикцию выделенной плазмидной ДНК проводили в соответствии с рекомендациями фирмы производителя ферментов Sigma (США) или MBI Fermentas (Литва). Для плазмиды pXO1 - 40 мкг ДНК инкубировали с 10 мкл фермента в 100 мкл рестрикционной смеси в течение 9 часов при температуре 37 0С. После инкубации смесь прогревали при 65 0С в течение 15 минут. Клонирование гена pag осуществляли по стандартным методикам (Маниатис Т. с соавт., 1984) с модификациями. Элюцию 6 т.п.н. фрагмента плазмиды pXO1 осуществляли по методу G. Dretzen et al. (1981). Стабильность гибридных плазмид оценивали согласно методикам, предложенным J. Barnard, A. Friedlander (1999) и S. Cohen et al. (2000).

Биохимические методы. Электрофоретическое разделение протеинов осуществляли в 10 % полиакриламидном геле в вертикальной камере (Amersham, США) при силе тока 50 мА в течение 5 часов. Концентрацию белка в препаратах определяли общепринятыми методами: по М. Брэдфорду (Практическая химия белка, 1989) и спектрофотометрически (Скоупс Р., 1985). Аминокислотный состав белков определяли по методике S. Moore, W. Stein (Практическая химия белка, 1989) на базе института биохимии и физиологии растений и микроорганизмов АН России (г. Саратов). Хроматографическую очистку Sap осуществляли в соответствии с рекомендациями J. Farchaus et al. (1995). Белок ЕА1 экстрагировали из клеточных стенок с помощью SDS-буфера, очищали двухэтапной ионно-обменной хроматографией на гидроксиапатите. ПА выделяли из рекомбинантных штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и 55ТПА-1(Spo-). Хроматографическую очистку ПА проводили согласно рекомендациям C. Quinn et al. (1988) с модификациями. Ионобменную хроматографию препарата осуществляли на колонке с Macro Prep 50Q (Bio-Rad, США). Высокая степень очистки препарата ПА достигалась за счет гель фильтрации на сефакриле 300 НR (Bio-Rad, США).

биофизические методы. Для электронной микроскопии препараты белков S-слоя предварительно дважды диализовали, окрашивали 1,5 % раствором фосфорно-вольфрамовой кислоты или 2 % раствором уранил-ацетата. Ультратонкие срезы контрастировали насыщенным спиртовым раствором уранилацетата при температуре 56 0С в течение 10 минут. Подготовку препаратов для иммуноэлектронной микроскопии проводили согласно процедуре, описанной J. Farchaus et al. (1995), с собственными модификациями. Все препараты просматривали на электронном микроскопе JEM-7A (Япония) при ускоряющем напряжении 80 кВ. Мечение антител коллоидным золотом для иммуноэлектронной микроскопии проводили по методике Л.А. Дыкмана (1996). Регулярность ультраструктуры полученных протеинов подтверждали сканирующей атомно-силовой микроскопией (Коннов Н.П. с соавт., 2002).

Иммунохимические методы. Для анализа иммуноспецифичности препарата проводили иммуноблотинг по методу H. Towbin et al. (1979). Перенос белков на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C (Amersham, США) проводили при силе тока 0,4 А и напряжении 100 V в течение 1,5 часов. Титр антител к протективному антигену в сыворотках иммунизированных животных и количественную оценку уровня продукции ПА рекомбинантными штаммами определяли с помощью дот-анализа и твердофазного ИФА (Фримель Г., 1987).

Экспериментальные материалы обрабатывали посредством статистических методов, описанных И.П. Ашмариным, А.А. Воробьевым (1962). Уровень значимости (Р) для различия между средними значениями вычисляли при помощи t критерия Стьюдента-Фишера.

Результаты исследований

Экспериментальные основы для создания эффективных сибиреязвенных вакцинных препаратов

Одна из первых задач настоящего исследования - осуществление поиска еще не идентифицированных факторов патогенности и иммуногенности сибиреязвенного микроба, детерминируемых хромосомными генами. Прежде всего, нас интересовала перспектива получения оптимального реципиентного штамма B. anthracis для генетического конструирования продуцирующего ПА бациллярного рекомбинанта. Внимание было обращено на признаки протеолиза (Prt), гемолиза (Hly), пигментсорбции (CR), пигментсинтеза (Ydp) и спорообразования (Spo) возбудителя сибирской язвы, по версиям разных авторов коррелирующих с вирулентностью (Цыганкова О.И., 1993; Еремин С.А. с соавт., 1999; Uchida I., 1985; Koehler T. et al., 1992; Worsham P., Sowers M., 1993).

Протестировав 14 штаммов B. anthracis, выявили гетерогенность их популяций, выражающуюся в одновременном присутствии клонов с различной экспрессией перечисленных признаков. Отмечен координированный характер изменения свойств. Клетки, хорошо сорбирующие пигмент из среды роста, как правило, обладали высокой активностью протеолитических, гемолитических ферментов и синтезировали желтый пигмент - фенотип Prt+Hly+CR+Ydp+. Отсутствие способности к сорбции конго красного сочеталось с нарушением протеолиза, гемолиза, пигментсинтеза - фенотип Prt-Hly-CR-Ydp-. Аспорогенные клоны отличались морфологией колоний и характером роста в жидких питательных средах.

В ходе экспериментов было установлено, что гетерогенность популяций штаммов B. anthracis является следствием диссоциации отдельных клонов с фенотипом Prt+Hly+CR+Ydp+. Образование промежуточных форм укладывается в явление фенотипической изменчивости (Головлев Е.Л., 1998). Появление стабильных при пассировании in vitro и in vivo вариантов Prt-Hly-CR-Ydp-Spo+ или Prt-Hly-CR-Ydp-Spo-, скорее всего, результат му­тационных событий, завершающих диссоциацию типичного штамма возбудителя сибирской язвы.

Обнаружено различие состава популяций природных вирулентных (преобладание фенотипа Prt+Hly+CR+Ydp+) и аттенуированных (преобладание фенотипа Prt-Hly-CR-Ydp-Spo+ или Prt+Hly-CR-Ydp-Spo-) культур сибиреязвенного микроба (рис. 1). Штаммы B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis Wright были представлены исключительно клетками, не экспрессирующими тестируемые признаки (Prt-Hly-CR-Ydp-).

 Популяционная гетерогенность штаммов B. anthracis по признакам-0 Рисунок 1. Популяционная гетерогенность штаммов B. anthracis по признакам протеолитической, гемолитической активности и пигментсорбции. По оси абсцисс – обозначения штаммов B. anthracis: 1 - 81/1; 2 - М28; 3 - М29; 4 - И34; 5 - И35; 6 - И36; 7 - И38; 8 - И302; 9 - 17JB; 10 - Sterne 34F2; 11 - 71/12; 12 - Pasteur; 13 - СТИ-1; 14 - Wright. По оси ординат - количество клонов определенного фенотипа в процентах от общего числа.

На основании изучения популяционных составов ди-, моно- (Cf или T) и бесплазмидных (pf) штаммов B. anthracis, представляющих 8 изогенных систем, установили, что в координации признаков протеолиза, гемолиза, синтеза и сорбции пигментов не участвуют плазмидные гены. Определение механизмов сочетанного изменения свойств заслуживает дальнейшего теоретического осмысления и экспериментального развития. Однако, исходя из задач исследования, приоритет был отдан определению корреляции экспрессии хромосомных признаков с вирулентностью возбудителя сибирской язвы.

С этой целью на основе природного изолята B. anthracis 81/1 сконструировали систему изогенных штаммов, различающихся по составу плазмид и экспрессии хромосомных признаков. Сравнивали вирулентность клонов с диаметрально противоположными фенотипами - Prt-Hly-CR-Ydp-Spo+, Prt+Hly+CR+Ydp+Spo+ и Prt+Hly+CR+Ydp+Spo-. Диплазмидные производные тестировали на модели морских свинок, моноплазмидные (pXO1-pXO2+) - белых мышей. В группе диплазмидных штаммов вирулентность изогенного производного с сочетанными нарушениями хромосомных признаков оказалась даже в 2 раза выше вирулентности исходного варианта - Prt+Hly+CR+Ydp+Spo+. В группе моноплазмидных производных отмечали резкое снижение степени патогенности аспорогенного штамма - в 85 или в 1778 раз - для разных партий животных. Вирулентности клонов с фенотипами Prt-Hly-CR-Ydp-Spo+ и Prt+Hly+CR+Ydp+Spo+ существенным образом не отличались.

Таким образом, сочетанное нарушение способностей к протеолизу, гемолизу, сорбции и синтезу пигментов - признаков, ассоциируемых ранее с вирулентностью возбудителя сибирской язвы, не приводит к значительным изменениям ЛД50 для лабораторных животных (морские свинки, белые мыши). Спонтанные мутации, характеризующиеся изменением фенотипа на Spo-, сопровождаются снижением на 2 - 3 порядка уровня патогенности моноплазмидных производных для белых мышей.

Для того, чтобы определить является ли обнаруженный факт общей тенденцией иди единичным случаем, осуществили генетическое моделирование вирулентности. Во-первых, в бесплазмидный аспорогенный вариант изогенной коллекции с помощью трансдукционного переноса ввели репликон pXO2 из донорного штамма B. anthracis. В экспериментах на белых мышах степень патогенности Spo- трансдуктанта была в 63 раза меньше степени патогенности аналогичной контрольной спорообразующей конструкции. Восстановление функции образования спор посредством трансдукционной передачи хромосомных генов приводило к повышению показателя ЛД50 приблизительно до уровня контрольного штамма. Во-вторых, сконструировали транспозонный аспорогенный мутант и, после генетической передачи в него репликона pXO2, определили значения ЛД50 для белых мышей. В результате Spo- вариант обладал в 10 раз меньшей вирулентностью, чем Spo+ контроль.

Все вышеизложенное позволило заключить, что мутации, приводящие к смене фенотипа со спорообразующего на аспорогенный, затрагивают детерминанты, вовлеченные в реализацию патогенных свойств сибиреязвенного микроба. И хотя, не образующие спор штаммы B. anthracis, ввиду значимости споровых антигенов для иммуногенеза, не имеют больших перспектив в плане создания менее реактогенных живых вакцин, они обладают явными преимуществами в качестве безопасных продуцентов иммуногенных антигенов.

Поэтому следующим этапом исследования было получение аспорогенных производных на основе вакцинных штаммов. Принцип селекции Spo- мутантов базировался на использовании обнаруженной ранее корреляции признаков. В результате проведенных экспериментов удалось получить не образующие спор штаммы - B. anthracis Sterne 34F2Spo- (КМ89), B. anthracis 55Spo- (КМ92), B. anthracis СТИTSpo- (КМ91), B. anthracis SterneTPrt-Spo- (КМ90) и B. anthracis 55TSpo- (КМ92(3)). Аспорогенность перечисленных культур сохранялась при культивировании in vivo, in vitro и после длительного хранения.

Моноплазмидные Spo- варианты сибиреязвенных штаммов могут быть использованы как экологичные и безопасные продуценты сибиреязвенных антигенов, бесплазмидные - в качестве основ для их генетического конструирования. Преимущество практического применения аспорогенных культур заключается в нивелировании риска контаминации рабочих помещений, лабораторного и промышленного оборудования спорами возбудителя сибирской язвы. Необходимо отметить, что почти все полученные штаммы, за исключением B. anthracis КМ89, характеризуются низкой активностью протеолитических ферментов, что крайне важно для потенциальных продуцентов белковых антигенов.

Исходя из деградирующего действия собственных протеаз in vitro, возник вопрос – может ли экспрессия признака протеолиза влиять на функциональную активность ПА in vivo? Для ответа на него провели эксперименты с привлечением двух групп изогенных штаммов. Одна включала Prt-Hly-CR- и Prt+Hly+CR+ фенотипы моноплазмидного (pXO1+pXO2-) производного природного изолята B. anthracis 81/1, другая – такие же варианты вакцинного штамма B. anthracis Sterne 34F2. Морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями тестируемых культур в дозах - 1,25 105 и 8 105 жизнеспособных спор - для изогенных вариантов на основе вирулентного и вакцинного штаммов, соответственно. Через 21 день после иммунизации биомоделей заражали тест-культурой B. anthracis 2-ая вакцина Ценковского.

В результате, индексы иммунитета Prt+ производных вирулентного и вакцинного штаммов даже несколько превосходили показатели протективности изогенных Prt- культур - в 8,0 и 1,3 раз, соответственно. С другой стороны, в поствакцинальный период от иммунизирующей дозы протеазопозитивных производных штаммов B. anthracis Sterne 34F2 и 81/1 пало, соответственно, три и две морские свинки из 20-ти. На введение споровой взвеси протеазонегативных культур было по одному случаю летального исхода. Таким образом, собственные протеазы сибиреязвенного микроба могут несколько повышать протективность синтезирующих их штаммов, выступая, по-видимому, в роли дополнительных антигенов. В то же время, их функциональная активность ассоциируется с более высоким уровнем летальности иммунизированных биомоделей.

Обе эти тенденции подтверждают данные сравнительного изучения протективных свойств еще одного вакцинного штамма - B. anthracis СТИ-1, характеризующегося нарушенной способностью к деградации белковых субстратов. Ввиду отсутствия у него протеазопозитивного изогенного варианта, о чем упоминалось выше, сравнение проводили с Prt+ и Prt- производными на основе B. anthracis Sterne 34F2. В тех же условиях опыта индекс иммунитета B. anthracis СТИ-1 оказался еще меньше (приблизительно в 5 раз) чем у Prt- варианта B. anthracis Sterne 34F2. Летальности морских свинок в поствакцинальный период в этом случае отмечено не было.

Неожиданный интерес возник в связи с обнаруженным различием протективной активности двух протеазонегативных культур - B. anthracis Sterne 34F2 и СТИ-1. Не является ли причиной почти пятикратного превышения индекса иммунитета штамма B. anthracis Sterne 34F2 (Prt-) наличие у него дополнительных иммуногенных антигенов? Подтвердить или исключить такую вероятность на данном этапе исследования не представлялось возможным. Однако в продолжение темы появились оригинальные предположения.

Иммунологическая эффективность белков S-слоя возбудителя сибирской язвы

Опыт работы со штаммами B. anthracis Sterne34F2 и B. anthracis СТИ-1 показывает, что, несмотря на принадлежность к одному виду, они имеют некоторые фенотипические отличия. Наше внимание привлекло сообщение французских авторов, занимающихся исследованием S-слоя сибиреязвенного микроба, о фенотипических особенностях штаммов B. anthracis, дефектных по синтезу одного из компонентов поверхностной паракристаллической структуры. Как известно, S-слой возбудителя сибирской язвы представлен двумя белками - Sap и ЕА1. In vitro микроорганизм сначала синтезирует Sap, затем в течение стационарной фазы происходит замещение Sap на EA1, а освобождающийся протеин выходит в супернатант. Сконструированные I. Etienne-Toumelin et al. (1995) и S. Mesnage et al. (1997) Sap- мутанты штамма B. anthracis Sterne34F2 отличались от Sap+ клонов более крупными колониями, способностью к оседанию в бульоне в виде комочков и образованию очень длинных клеточных цепочек. Мы провели сравнительное микроскопическое исследование штаммов B. anthracis Sterne34F2 и B. anthracis СТИ-1. Клетки выращивали в одинаковых условиях в жидкой питательной среде. Изучение с помощью светового микроскопа показало, что средняя длина микробной цепи, представленной клетками B. anthracis СТИ-1, более чем в двадцать раз превосходит таковую штамма B. anthracis Sterne 34F2.

На основании совпадений феноменологий было сделано предположение, что у вакцинного штамма B. anthracis СТИ-1 нарушена экскреция протеина S-слоя – Sap. Сравнение белковых профилей концентрированных культуральных фильтратов штаммов B. anthracis СТИ-1 и Sterne34F2 продемонстрирвало их различие. В супернатанте B. anthracis СТИ1 отсутствовал белок с электрофоретической подвижностью, соответствующей молекулярной массе протеинов S-слоя возбудителя сибирской язвы (94 кДа). Протестировав 9 бесплазмидных штаммов сибиреязвенного микроба, выявили еще 4 культуры, непродуцирующие Sap в среду культивирования.

Анализ результатов белкового электрофореза концентрированных культуральных фильтратов выявил также штаммы, активно экскретирующие белок Sap - B. anthracis SterneT, 55T, 71/12pf. Ввиду подверженности компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба протеолитической деградации, селектировали Prt- варианты перечисленных культур.

Для выделения препаративных количеств белка S-слоя сибиреязвенного микроба, продуцируемого в среду выращивания (Sap), культуру B. anthracis 71/12pfPrt- засевали в S-бульон и инкубировали при температуре 37 0С с аэрацией в течение 18 часов. Хроматографическую очистку проводили с использованием различных носителей - сефарозы CL-4B, Macro Prep 50Q и гидроксиапатита. Выход белкового продукта составил 60 - 80 мг на 1 литр исходной культуры.

Для выделения компонента S-слоя, прочно связанного с клеточной стенкой (ЕА1), использовали штамм B. anthracis СТИT. Его культуру выращивали в BHI-бульоне при температуре 37 0С с аэрацией в течение 18 часов. Разделение белков клеточного SDS-экстракта проводили при помощи разработанной методики двухэтапной ионообменой хроматографии на гидроксиапатите. Выход составил 80 мг протеина ЕА1 на 1 литр исходной культуры.

Идентификацию выделенных белков в качестве компонентов S-слоя сибиреязвенного микроба осуществляли биохимическими, электронно-микроскопическими и иммуноэлектронно-микроскопическими методами исследования. Как известно, S-слои микроорганизмов состоят из регулярно организованных протеиновых или гликопротеиновых субъединиц. Ультраструктуру белковых препаратов, полученных из культурального фильтрата штамма B. anthracis 71/12pfPrt- и клеточного SDS-экстракта штамма B. anthracis СТИТ, исследовали с помощью электронного микроскопа. При нанометровом разрешении удалось выявить характерное для S-слоя регулярное строение белка - паракристаллическую решетку с упорядоченным расположением цилиндрических пор (рис. 2).

Для белков S-слоев различных микроорганизмов выявлены определенные соотношения аминокислот: значительное количество (40 - 60 %) неполярных; равные доли (по 15 %) кислых и основных; отсутствие (или наличие долей процента) метионина и цистеина (Sleytr U., 1978, 1997; Sara M., Sleytr U., 1996, 2000). Аминокислотный анализ выделенных нами протеинов показал содержание неполярных аминокислот у Sap - 53,5 %, у ЕА1 - 43,3 %. Соотношение кислых и основных для Sap - 16,3 и 20 %, а для ЕА1 –17,3 % и 18,8 %. Метионин и цистеин в обоих белковых препаратах обнаружены не были.

 Электронно-микроскопическая картина ультраструктур белковых-3

Рисунок 2. Электронно-микроскопическая картина ультраструктур белковых препаратов, полученных: А - из культурального фильтрата штамма B. anthracis 71/12pfPrt- (Sap), увеличение - в 200 000 раз; Б – из SDS-экстракта клеточных стенок штамма B. anthracis СТИT (ЕА1), увеличение - в 150 000 раз.

Локализацию антигенов Sap и ЕА1 на поверхности клеток подтверждали иммуноэлектронной микроскопией со специфичными мечеными антителами. Для этого кроликов иммунизировали очищенными белками Sap и ЕА1. Из кроличьих сывороток получали иммуноглобулины и метили их коллоидным золотом. Иммуносорбцию осуществляли на клеточных образцах 18-часовых культур штаммов B. anthracis SterneT и СТИT. После взаимодействия с антителами к ЕА1 клетки обоих штаммов были почти сплошь покрыты непроницаемой для электронов меткой (рис. 3). Меченые антитела к Sap активно сорбировались на поверхности клеток B. anthracis SterneT и в межклеточном пространстве - на конгломератах экскретируемого штаммом белка. В препаратах B. anthracis СТИT частицы коллоидного золота равномерно распределялась в поле зрения в виде единичных включений или небольших скоплений, специфической сорбции антител не отмечалось.

Иммунореактивность выделенных препаратов определяли также постановкой иммуноблота с кроличьими антителами к белкам S-слоя. Кроме очищенных протеинов в реакции иммуноблота исследовали культуральные фильтраты штаммов B. anthracis СТИT и SterneT. После окрашивания нитроцеллюлозной мембраны положительную реакцию взаимодействия со специфичными антителами к

 Результаты иммуноэлектронной микроскопии клеток штаммов B.-6

Рисунок 3. Результаты иммуноэлектронной микроскопии клеток штаммов B. anthracis СТИT (А) и B. anthracis SterneT (Б), обработанных мечеными антителами к белкам S-слоя - ЕА1 (А) и Sap (Б) (увеличение в 20000 и 25 000 раз).

Sap и ЕА1 регистрировали для обоих белковых образцов и культурального фильтрата штамма B. anthracis SterneT (на уровне электрофоретической подвижности, соответствующей молекулярной массе 94 кДа). Образования иммунных комплексов в препарате культурального фильтрата штамма B. anthracis СТИT не отмечалось. Имевшие место перекрестные реакции между антигенами S-слоя возбудителя сибирской язвы объясняются высокой степенью их сродства.

На основании изложенного выше, протеины, выделенные из штаммов B. anthracis 71/12pfPrt- и B. anthracis СТИT, по молекулярной массе, формируемым ультраструктурам, аминокислотному составу и расположению на клеточной поверхности идентифицированы как компоненты S-слоя сибиреязвенного микроба - Sap и ЕА1. Высказанное нами предположение о нарушении у штамма B. anthracis СТИT продукции белка Sap подтвердилось данными иммуноэлектронной микроскопии и иммуноблота со специфичными антителами.

Изучение протективности очищенных препаратов Sap и ЕА1 проводили на модели морских свинок. Лабораторных животных иммунизировали очищенными препаратами Sap, ЕА1, и для сравнения - вакцинным штаммом B. anthracis. Контрольных животных оставляли интактными. Антигены вводили подкожно двукратно в дозе 25 и 50 мкг в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Иммунизацию споровой культурой B. anthracis Sterne 34 F2 осуществляли однократно в дозе 1. 106 спор. После периода, необходимого для формирования иммунитета (21 день), биомоделей заражали штаммом B. anthracis 2ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах 1 · 102 – 1 · 107 КОЕ.

В результате, значения ЛД50 тест-заражающей культуры для морских свинок, иммунизированных белками Sap и ЕА1, оказались в 36,9 и 3,3 больше, чем тот же показатель для интактных животных. Преимущество в защитной способности в данном эксперименте принадлежало Sap. Иммуногенность вакцинного штамма, продуцирующего ПА, вполне предсказуемо почти на три порядка превышала иммуногенность белковых препаратов. Однако обращало на себя внимание, что даже в отсутствие основного иммуногена сибиреязвенного микроба, компоненты S-слоя в определенной степени защищали лабораторных животных.

Изучение влияния белков S-слоя на развитие адаптивного иммунитета in vivo осуществляли с использованием изогенной системы Sар+ и Sар- вариантов B. anthracis SterneT. Мы предположили, что нарушение продукции Sар у штамма B. anthracis СТИ-1 - следствие спонтанных Sap- мутаций, возникающих в процессе культивирования микроорганизма или температурной элиминации плазмид. Смоделировав в опыте соответствующие условия (42,5 0С), осуществили поиск спонтанных Sap- мутантов в популяции одного из вновь полученных бесплазмидных клонов. Прямая селекция по культурально-морфологическим признакам (как было предложено ранее) дала положительный результат. В данном случае для отбора 4-х спонтанных мутантов было протестировано всего 100 произвольных клонов. Отсутствие продукции белка Sар подтверждали данными белкового электрофореза, иммуноблота и иммуноэлектронной микроскопии.

Для изучения влияния Sap- мутации на протективные свойства микроорганизма репликон pXO1 из донорного штамма B. anthracis передали посредством конъюгации в изогенные антибиотикорезистентные реципиенты на основе исходного штамма B. anthracis SterneT и его спонтанного Sap- мутанта - B. anthracis SterneTSap+Smr и B. anthracis SterneTSap-Smr. морских свинок иммунизировали однократно споровыми взвесями трансконъюгантов в концентрации 1 ·  106 КОЕ. Через 21 день опытных и контрольных животных заражали культурой B. anthracis 2ая вакцина Ценковского. Индекс иммунитета штамма на основе Sap- мутанта оказался в 3 раза меньше индекса иммунитета Sap+ варианта. То есть, in vivo белок S-слоя способен усиливать протективную активность продуцирующего ПА штамма сибиреязвенного микроба.

В совокупности результаты, полученные при изучении защитных свойств белковых препаратов Sар и ЕА1, а также изогенных Sар+ и Sар- штаммов B. anthracis, дают основания расценивать компоненты S-слоя возбудителя сибирской язвы как дополнительные факторы иммуногенности хромосомной детерминации. Это обстоятельство необходимо учитывать при селекции или конструировании штаммов сибиреязвенного микроба, претендующих на роль живых вакцин.

Конструирование бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба

В создании вакцин нового поколения приоритет отдается рекомбинантным технологиям. Генетическое конструирование позволяет манипулировать детерминантами синтеза и регуляции факторов иммуногенности и патогенности микроорганизмов, оказывая опосредованное действие на те или иные звенья иммуно- и патогенезов. Трудности возникают на пути обеспечения выраженной экспрессии клонированных генов и стабильности воспроизведения чужеродной генетической информации.

В успешном конструировании безопасных продуцентов иммуногенных антигенов немаловажную роль играет выбор реципиентной культуры и векторной плазмиды. На наш взгляд, для клонирования гена pag оптимальными системами являются протеазодефицитные бациллярные штаммы. Исходя из перспектив использования рекомбинантных штаммов для промышленного производства ПА, поиск реципиентов остановили на генетически охарактеризованном штамме близкородственного бактериального вида - B. subtilis WB600, и бесплазмидных производных вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. В качестве вектора, способного стабильно функционировать в составе бациллярных штаммов, решили использовать плазмиду pUB110, характеризующуюся мультикопийностью, небольшим размером и наличием надежного селективного маркера.

Выделенную из штамма B. anthracis Sterne 34F2 плазмиду pXO1 обработали ферментом BamHI. Образовавшиеся рестрикты, размером от 4 до 25 т.п.н., разделили электрофоретически. Присутствующий среди фрагментов ДНК участок (6 т.п.н), содержащий ген pag (Vodkin M., Leppla S., 1983), элюировали из агарозного геля и лигировали с векторной плазмидой pUB110. Лигированный материал передали при помощи электростимулируемой трансформации в реципиентные клетки B. anthracis СТИT. Антибиотикорезистентные клоны селектировали на среде с сибиреязвенным -глобулином. Для трансформантов с положительной реакцией диффузионной преципитации изучали белковый состав культуральных фильтратов и плазмидные профили выделенных ДНК. После нескольких пассажей в селективных условиях был отобран клон, стабильно наследующий гибридный репликон. Рестрикционный анализ сконструированной плазмиды pUB110PA (~10,5 т.п.н.) показал ее соответствие теоретически возможному варианту включения фрагмента pXO1 в вектор pUB110 (рис. 4). По данным белкового электрофореза и реакции преципитации на среде с сибиреязвенным -глобулином рекомбинантный штамм B. anthracis СТИTПА продуцировал основной иммуноген сибиреязвенного микроба на уровне вакцинной культуры B. anthracis СТИ-1. Прецеденты создания более эффективных рекомбинантных штаммов-продуцентов ПА (Ivins B., Welkos S., 1986; Cohen S. et al., 2000) предопределили продолжение экспериментов.

Как известно, в процессе трансформации бациллярных штаммов с высокой частотой образуются делеционные производные гибридных молекул ввиду особенностей механизмов проникновения экзогенных молекул ДНК в компетентные клетки бацилл (Щелкунов С.Н., 1994; Hahn J., Dubnau D., 1985). Вероятно, с подобными рекомбинационными событиями мы столкнулись, пытаясь переклонировать фрагмент, несущий ген pag. Векторную плазмиду, стратегию клонирования и реципиентный штамм использовали те же, что и в первом случае. Однако при осуществлении селекции на среде с -глобулином были обнаружено несколько клонов, дающих необычно большие зоны диффузионной преципитации – почти в 10 раз превышающие значения, установленные для штаммов B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis СТИTПА. Интересно, что только часть селектированных трансформантов активно синтезировала ПА. Совершенно неожиданно среди изолированных рекомбинантов с большими зонами преципитации выявили клоны, продуцирующие белок S-слоя - Sap. Напомним, что реципиентный штамм не экскретировал Sap.

 Схемы получения гибридных плазмид pUB110РА и pUB110РА1. Стрелками-10

Рисунок 4. Схемы получения гибридных плазмид pUB110РА и pUB110РА1. Стрелками обозначено начало и направление транскрипции гена pag.

Детерминация синтеза белков S-слоя осуществляется хромосомными генами, а регуляция - локализованными на pXO1 областями atxA и pagR. Возможно, в нашем случае в процессе клонирования произошли рекомбинации, затронувшие область негативной регуляции генов pag и sap - pagR область, находящуюся в непосредственной близости от структурного гена pagА (Hoffmaster A., Koehler T., 1999(а); Mignot T. et al., 2003). В то же время, восстановление способности к экскреции белка S-слоя у части трансформантов свидетельствует об интактности гена sap в штамме В. anthracis СТИТ и вовлеченности в мутационный процесс структур, отвечающих за секрецию антигена.

Определяя электрофоретическую подвижность гибридных ДНК, обнаружили репликон, размером 6,5 т.п.н., что на 4 т.п.н. меньше ожидаемого значения (рис. 4). Рестрикционный анализ ДНК плазмиды, обозначенной как pUB110PA1, выявил протяженную делецию, распространяющуюся на нуклеотидные последовательности pUB110 и, возможно, область pagR. Наличие клонированного гена подвердили, осуществив ПЦР с праймерами на последовательности детерминанты синтеза ПА. Положительными следствиями произошедшей в pUB110PA1 делеции стали, с одной стороны – стабильное функционирование генетической конструкции в составе клеток B. anthracis, с другой - высокий уровень продукции ПА штаммом В. anthracis СТИТПА-1, содержащим pUB110PA1.

Успешный опыт воспроизвели на других реципиентах. Гибридный репликон pUB110PA-1 выделили из штамма В. anthracis СТИТПА-1 и электростимулируемой трансформацией передали в штаммы В. anthracis 55ТPrt- и В. subtilis WB600. Изолированные трансформанты по результатам проведенного тестирования содержали плазмиду pUB110PA-1 и локализованный в ее составе ген pag. Клонированный ген хорошо экспрессировался в бациллярных клетках.

При помощи биохимических (белковый электрофорез концентрированных культуральных фильтратов) и иммунохимических (реакция радиальной диффузной преципитации, иммуноблот, дот-анализ и твердофазный ИФА) методов исследования осуществили сравнительную оценку секреции ПА рекомбинантными штаммами и вакцинными культурами. Необходимые для иммунохимических реакций анти-ПА антитела получали из сывороток кроликов, иммунизированных очищенным препаратом ПА, выделенным из штамма B. antracis СТИТПА-1. В результате проведенных исследований все генно-инженерные конструкции, вне зависимости от реципиентной основы, обладали одинаково высоким уровнем продукции ПА. В этой связи, необходимо вспомнить, что в эксперимент были взяты только реципиенты с низкой активностью протеолитических ферментов. На основании данных дот-анализа установлено, что продукция ПА штаммами B. anthracis СТИТПА-1 и B. anthracis 55ТПА-1 в 10 и 6 раз превышала его секрецию клетками соответствующих вакцинных культур - B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. С помощью ИФА определены количественные показатели продукции ПА: 80 - 90 мкг/мл – для рекомбинантов, и 15 - 20 мкг/мл – для вакцин. Высокая продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-1, вероятнее всего является следствием увеличения числа копий гена pag за счет мультикопийности вектора, а также делеции в pagR области, отвечающей за негативную регуляцию синтеза ПА.

Для сконструированных штаммов B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 изучали стабильность репликации гибридной плазмиды in vitro и in vivo. Многократное пассирование культур рекомбинантных штаммов в присутствии селективного антибиотика не приводило к утрате репликона pUB110PA1. В отсутствие селективного давления у всех штаммов отмечали постепенное нарастание темпов элиминации гибридной плазмиды после третьего суточного пассажа. После трехкратных пассажей рекомбинантных культур in vivo все исследованные культуры содержали плазмиду pUB110PA-1. Стабильность гибридного репликона, на наш взгляд, обеспечена правильным выбором вектора pUB110 и делецией сравнительно большой части нуклеотидных последовательностей в результате рекомбинационных изменений.

Совокупность свойств созданных штаммов B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 обуславливает их перспективность в качестве рекомбинантных продуцентов ПА сибиреязвенного микроба. Они могут быть использованы как для лабораторного, так и промышленного получения ПА, так как обладают высоким уровнем продукции ПА, низкой активностью протеолитических ферментов и стабильны при пассировании in vitro и in vivo. По сравнению с вакцинными штаммами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55 рекомбинантные культуры секретируют в 5 раз больше иммуногенного антигена.

В соответствии с современной концепцией технология производства химических сибиреязвенных вакцин должна не только отвечать требованиям биологической безопасности, но и быть экологичной. Имея в виду данное обстоятельство, на следующем этапе исследования поставили задачу создания рекомбинантного продуцента ПА, промышленное и лабораторное культивирование которого не будет сопряжено с риском контаминации помещений и оборудования спорами возбудителя сибирской язвы, чрезвычайно устойчивых к действию факторов внешней среды и дезинфицирующих агентов.

С целью конструирования стабильного аспорогенного рекомбинантного штамма B. anthracis с высоким уровнем продукции ПА и низкой активностью протеолитических ферментов, осуществили генетическую передачу гибридной плазмиды pUB110PA-1 в аспорогенный протеазодефицитный бесплазмидный реципиентный штамм B. anthracis 55ТPrt-Spo-. Исследование изолированных антибиотикорезистентных трансформантов на наличие рекомбинантного репликона pUB110PA-1, клонированного гена pag и активность протеолитических ферментов во всех случаях дало ожидаемые результаты. В процессе изучения стабильности трансформантов было отобрано три клона, сохраняющих гибридную плазмиду в селективных условиях и в течение нескольких пассажей (не более 3-х суток) на средах без антибиотика.

Сравнительную оценку уровней продукции ПА аспорогенными трансформантами проводили с помощью белкового электрофореза концентрированных препаратов культуральных фильтратов, реакции радиальной диффузной преципитации и дот-анализа с анителами к ПА. По результатам всех тестов Spo- рекомбинанты секретировали больше ПА, чем исходный штамм B. anthracis 55. Один из клонов по уровню продукции ПА соответствовал спорообразующим генно-инженерным штаммам. На основании данных твердофазного ИФА клетки B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) экскретировали около 80 мкг/мл ПА.

На модели данного штамма оптимизировали технологию выделения и очистки рекомбинантного ПА. Прежде всего, внесли некоторые коррекции в процесс культивирования. В исследовательских целях штамм B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) выращивали на богатой питательной среде (S-бульоне) в атмосфере с повышенным содержанием СО2, то есть, моделируя условия секреции ПА in vivo. Для промышленных масштабов среда с высоким содержанием дорогостоящих фирменных компонентов - триптона и дрожжевого экстракта, слишком затратна. В качестве альтернативы S-бульону предложен бульон Хоттингера с добавлением дрожжевого аутолизата. Наиболее важным оказалось наблюдение, что в отличие от культур, содержащих pXO1, продукция ПА рекомбинантными штаммами с pUB110PA-1 (в том числе и аспорогенным) не зависит от СО2, ввиду отсутствия у них области, детерминирующей синез СО2 - зависимого транскрипционного регулятора – AtxA (Koehler T. et al., 1994; Hoffmaster A., Koehler T.,1997; Mignot T. et al., 2003).

Выделение ПА осуществляли из 24 часовой бульонной культуры B. anthracis 55ТПА-1(Spo-), выращенной с аэрацией при температуре 37 0С. Культуральный фильтрат очищали при помощи ионообменой хроматографии на Macro Prep 50Q, и гель-фильтрации с использованием Sephacryl-HR300 (рис.5). В результате удалось достичь почти полного освобождения образца от сопутствующих примесей. Специфичность выделенного белка подтверждали постановкой реакции иммуноблота с антителами к ПА. Выход составил 12,8 мг препарата ПА на 1 литр культуры аспорогенного рекомбинатного штамма.

Получение высокоочищенного препарата ПА, не содержащего сопутствующих антигенов сибиреязвенного микроба, является важным шагом на пути конструирования профилактических и диагностических сибиреязвенных препаратов, отвечающих современным требованиям.

 Результаты хроматографической очистки ПА, выделенного из-11

 Результаты хроматографической очистки ПА, выделенного из-12

Рисунок 5. Результаты хроматографической очистки ПА, выделенного из культурального фильтрата аспорогенного продуцента B. anthracis 55ТПА-1Spo-. Треки: 1 культуральный фильтрат B. anthracis 55ТПА-1Spo-; 2 – этап очистки на Macro Prep 50Q; 3 - маркеры молекулярных масс (116,0; 97,0; 66,0; 45,0; 29,0 кДа); 4 - 11 – этап хроматографии на колонке с Sephacryl-HR300.

Перспективы практического использования рекомбинантных бациллярных штаммов и синтезируемых ими иммуногенных антигенов

В задачи заключительного раздела исследования входило изучение биологических свойств рекомбинантного ПА. Оценку протективной активности генно-инженерных штаммов проводили с использованием различных биомоделей. Иммунизацию осуществляли однократно, подкожно. Иммунизирующая доза тестируемых штаммов для мышей линии BALB/с составила 3 107 спор, морских свинок - 5  107. Через 21 день опытных и интактных животных заражали тест-штаммом B. anthracis 2-ая вакцина Ценковского в возрастающих дозах.

На модели мышей линии BALB/с тестировали культуры B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 в сравнении с вакцинными препаратами B. anthracis СТИ-1 и B. anthracis 55. В поствакцинальный период пало 50 % линейных мышей, иммунизированных штаммом B. anthracis 55. Препарат B. anthracis СТИ-1 в иммунизирующей дозе вызвал развитие летального процесса у одной особи. Рекомбинантные штаммы не обладали остаточной вирулентностью. Ввиду превышения допустимого порога летальности при иммунизации, индекс иммунитета и ЛД50 для штамма B. anthracis 55 не определяли. Значение ЛД50 тест-штамма для интактных мышей составило 6,8 103 спор, а для мышей, иммунизированных рекомбинантными культурами - почти на два порядка выше - 6,8 105 спор - для B. anthracis СТИТПА-1; 4,6 105 - для В. subtilis WB600ПА-1; и 3,2 105 спор - для В. anthracis 55ТПА-1. Тот же показатель ЛД50 для контрольного штамма B. anthracis СТИ-1 оказался сопоставимым со значениями, установленными для рекомбинантов - 8,6 105 спор тест-штамма. Соответственно, индексы иммунитета распределились в следующем порядке: для B. anthracis СТИ-1 - 125,9; B. anthracis СТИТПА-1 - 100,0; В. subtilis WB600ПА-1 - 68,1; для В. anthracis 55ТПА-1 - 46,4.

На модели морских свинок изучали протективную активность штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 в сравнении с вакциной B. anthracis СТИ-1. В поствакцинальный период от иммунизирующей дозы штамма B. anthracis СТИ-1 пало семь животных из двадцати взятых в эксперимент (35 %). Летальности лабораторных животных, иммунизированных рекомбинантными штаммами, отмечено не было. Для интактных животных значение ЛД50 тест-штамма составило 1,3 103 спор. Для морских свинок, иммунизированных штаммами B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1, этот показатель оказался на 4 порядка выше - 3,2 107 спор. Вакцинный штамм B. anthracis СТИ-1 обеспечивал более эффективную защиту морских свинок - ЛД50 тест-штамма - 2 108 спор. Индекс иммунитета коммерческой вакцины составил 158480. Индексы иммунитета штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 оказались одинаковыми - 25117, при требовании не менее 20000 для культуры, претендующей на роль сибиреязвенной вакцины. С одной стороны, различие в значениях индексов иммунитета рекомбинантов и контрольного штамма объяснимо техническими особенностями подготовки спор в лабораторных и промышленных условиях. С другой, оно может являться следствием отсутствия у генно-инженерных штаммов детерминант, обуславливающих cинтез ОФ и ЛФ (Pezard C. et al., 1995).

Для подтверждения способности рекомбинантных штаммов вызывать иммунологическую перестройку в организме иммунизированных животных, определяли динамику титра антител. В иммуноферментном анализе исследовали сыворотки крови, взятые на 24-е, 28-е, 32-е и 36-е сутки после введения им дозы 5 107 спор тестируемых штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и B. anthracis СТИ-1. Кроме того, исследовали напряженность иммунитета через два, три, три с половиной и четыре месяца от начала эксперимента. Проанализировав данные, полученные для двух групп животных (по три особи на штамм), выявили следующие закономерности. Титры анти-ПА антител у морских свинок, иммунизированных штаммом B. anthracis СТИТПА-1, в среднем были выше, чем у биомоделей вакцинированных B. anthracis СТИ-1. В случае рекомбинантного штамма B. anthracis СТИТПА-1 титр антител к ПА нарастал к 36-му дню. В случае B. anthracis СТИ-1 максимальный титр отмечали на 32-е сутки, к 36-му дню происходило некоторое его уменьшение. Начиная с 2 месяцев после иммунизации, титры анти-ПА антител в обеих группах постепенно снижались до средних значений 1:1024 - для вакцинного штамма, и 1:512 – для рекомбинантного. В таком соотношении они оставались до конца 4-го месяца наблюдения.

Все вышеиложенное свидетельствует о высокой иммунологической эффективности сконструированных штаммов. Рекомбинантные штаммы выгодно отличаются от контрольных вакцинных препаратов, ввиду отсутствия у них остаточной вирулентности в отношении использованных в экспериментах биомоделей. На основании сравнения индексов иммунитета, первенство в обеспечении защиты лабораторных животных принадлежит штамму B. anthracis СТИТПА-1. На наш взгляд, его «родословная» в сочетании с приобретенными в результате генетического конструирования преимуществами являются основанием расценивать данный рекомбинантный штамм как прототип эффективной и безопасной сибиреязвенной вакцины.

Помимо определения иммуногенных свойств рекомбинантных штаммов изучали протективную активность белкового препарата ПА, выделенного из аспорогенного продуцента B. anthracis 55ТПА-1(Spo-). Лабораторных животных (кроликов) иммунизировали очищенными сибиреязвенными антигенами – ПА и ЕА1, в сочетании с полным адьювантом Фрейнда. Белок S-слоя ЕА1 добавляли в некоторых случаях к ПА, исходя из его иммуногенногенного и иммуномоделирующего действия. Инъекции осуществляли парентерально, двукратно с интервалом в 14 дней. Кроликам первой группы вводили по 50 мкг ПА, второй - по 50 мкг каждого из белков - ПА и ЕА1, третьей - 5 · 107 спор штамма B. anthracis СТИ1 (однократно). Контрольную группу оставляли интактной. В конце поствакцинального периода определяли титры антител к ПА в сыворотках крови иммунизированных животных. Результаты иммуноферментного анализа свидетельствовали о формировании напряженного иммунитета во всех случаях. Выявлены более высокие титры анти-ПА антител у кроликов, иммунизированных белковыми препаратами. Через 21 день после последней инъекции животных заражали 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1. Все интактные особи пали от сибиреязвенной инфекции на третьи сутки. Кролики, иммунизированные ПА или ПА + ЕА1, а также споровой взвесью вакцинного штамма - выжили. Признаков заболевания не отмечали ни в одном из случаев.

Способность рекомбинантного ПА в сравнительно небольшой дозировке обеспечивать защиту 100 % биомоделей от заражения вирулентным штаммом B. anthracis предопределяет главное направление его практического использования – создание средств специфической профилактики сибирской язвы. Высокоочищенный белковый препарат с ярко выраженными протективными свойствами по праву претендует на роль основного компонента современной химической вакцины. Существенный уровень защиты лабораторных животных при одновременном введении ПА и белка S-слоя является серьезным поводом для продолжения работ по совершенствованию рецептуры сибиреязвенной вакцины.

Таким образом, проведенные нами исследования заложили прочный фундамент в успешное решение актуальной задачи получения эффективных и ареактогенных сибиреязвенных вакцин, соответствующих реалиям и возможностям 21-го века.

Преимущества использования генно-инженерных продуцентов заключаются в безопасных и экологичных технологиях получения ПА сибиреязвенного микроба. На основе очищенного рекомбинантного иммуногенного антигена возможно создание менее реактогенных химических вакцин. Сконструированный штамм B. anthracis СТИТПА-1 является оптимальной моделью для улучшенной живой сибиреязвенной вакцины. Экономический эффект от внедрения соответствующих профилактических препаратов будет связан с повышением эффективности вакцинации против сибирской язвы и снижением частоты возникновения побочных реакций.

Выводы

  1. С учетом фундаментальных знаний о факторах патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы и применением рекомбинантных технологий разработаны экспериментальные основы для решения проблемы совершенствования сибиреязвенных вакцин. Многокомпонентная система включает: коллекцию реципиентных штаммов B. anthracis для генетического конструирования, представленную бесплазмидными производными с низкой активностью протеолитических ферментов, нарушением экскреции белка Sap и отсутствием способности к образованию спор; высокоиммуногенные и низкореактогенные генно-инженерные бациллярные штаммы; спорообразующие и аспорогенные рекомбинантные продуценты протективного антигена; высокоочищенные препараты протективного антигена и белков S-слоя сибиреязвенного микроба.
  2. На основе протеазодефицитных бесплазмидных производных бациллярных штаммов созданы генно-инженерные продуценты - B. anthracis СТИТПА-1, В. anthracis 55ТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1, по уровню синтеза протективного антигена (80 - 90 мкг/мл) пятикратно превосходящие вакцинные культуры B. anthracis СТИ1 и B. anthracis 55. Рекомбинантные штаммы содержат структурный ген pag в составе гибридного репликона pUB110PA-1 (6,5 т.п.н.) и стабильно сохраняют биологические свойства при пассировании in vitro и in vivo.
  3. Сконструированные генно-инженерные штаммы обладают высокой иммунологической эффективностью: в иммунизирующей дозе (3 107 спор) они обеспечивают защиту мышей линии BALB/с от заражения тест-штаммом возбудителя сибирской язвы. Однократная иммунизация морских свинок дозой 5 107 спор штаммов B. anthracis СТИТПА-1 и В. subtilis WB600ПА-1 вызывает развитие иммунного ответа, характеризующегося высокими значениями индексов иммунитета и титров антител к протективному антигену. Штаммы с клонированным геном pag не обладают остаточной вирулентностью для мышей линии BALB/с и морских свинок, в отличие от вакцинных культур B. anthracis 55 и B. anthracis СТИ-1. Созданный на основе B. anthracis СТИ-1 штамм B. anthracis СТИТПА-1 является прототипом менее реактогенной живой сибиреязвенной вакцины.
  4. Для создания безопасных и экологичных технологий производства сибиреязвенных профилактических и диагностических препаратов сконструирован аспорогенный рекомбинантный авирулентный продуцент протективного антигена - B. anthracis 55ТПА-1(Spo-). Штамм стабильно наследует гибридный репликон pUB110PA-1, не реверсирует к спорообразующему фенотипу и характеризуется низкой активностью протеолитических ферментов. Уровень продукции ПА аспорогенным рекомбинантом составляет около 80 мкг/мл.
  5. Оптимизирована экспериментальная схема выделения и очистки протективного антигена, синтезируемого генно-инженерными продуцентами. Из аспорогенного штамма B. anthracis 55ТПА-1(Spo-) получен препарат протективного антигена, перспективный в качестве основного компонента химической сибиреязвенной вакцины. Двукратная иммунизация дозой 50 мкг очищенного рекомбинантного протективного антигена обеспечивает защиту 100 % кроликов от заражения 50 ЛД50 высоковирулентного штамма B. anthracis 81/1.
  6. Бесплазмидные производные штаммов B. anthracis при культивировании in vitro различаются по способности к экскреции белка S-слоя - Sap. Получены экспериментальные доказательства нарушения продукции Sap у штамма B. anthracis СТИT. В качестве источников белка Sap предложены протеазонегативные штаммы B. anthracis SterneTPrt- и 2ая вакцина Ценковского pf Prt-. На основании изучения протективных свойств очищенных препаратов белков S-слоя и изогенных Sap+ и Sap- штаммов B. anthracis установлено, что белки Sap и ЕА1 являются дополнительными иммуногенными факторами сибиреязвенного микроба при определяющей роли протективного антигена.
  7. Получены высокоочищенные препараты белков S-слоя сибиреязвенного микроба – Sap и ЕА1. Протеины идентифицированы как компоненты S-слоя B. anthracis на основании молекулярных масс, выявленной паракристаллической ультраструктуры, особенностей аминокислотного состава, иммунореактивности и локализации на поверхности клетки.
  8. На основании результатов экспериментов по моделированию вирулентности установлено, что спонтанные или индуцированные Spo- мутации в штаммах B. anthracis приводят к снижению на 1 - 3 порядка степени их патогенности для белых мышей. Выяснено отсутствие влияния экспрессии хромосомных признаков протеолиза, гемолиза, пигментсорбции и пигментсинтеза на вирулентность сибиреязвенного микроорганизма.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Микшис Н.И., Степанов А.С., Шевченко О.В., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Выделение спонтанных мутантов вирулентного штамма Bacillus anthracis с координированными изменениями синтеза хромосомных генов и влияние плазмидного состава на частоту их образования // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тезисы докладов 2-ой Всероссийской конференции. - Саратов, 1998. - С. 48.
  2. Степанов А.С., Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Изучение феномена внутриштаммовой гетерогенности возбудителя сибирской язвы // Гомеостаз и инфекционный процесс: Тезисы докладов 2-ой Всероссийской конференции. - Саратов, 1998. - С. 66.
  3. Mikshis N., Yeremin S., Shevchenko O., Bolotnikova M., Stepanov A. Influence of chromosome mutations on Bacillus anthracis virulence // 3rd Internetional Conference on Anthrax (19 - 21 September). University of Plymouth. England. - 1998. - P. 61.
  4. Микшис Н.И., Еремин С.А., Шевченко О.В., Болотникова М.Ф., Липницкий А.В., Барков А.М. Влияние спонтанных хромосомных мутаций на вирулентность возбудителя сибирской язвы // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных болезней. Биотехнология. Ветеринария: Материалы юбилейной научной конференции, посвященной 70-летию НИИ микробиологии МО РФ. - Киров, 1998. - С. 165-166.
  5. Микшис Н.И., Шевченко О.В., Еремин С.А., Болотникова М.Ф., Михеева Т.А., Степанов А.С. Популяционная гетерогенность штаммов Bacillus anthracis // Деп. в ВИНИТИ 04.06.98. № 1722 - В.98.
  6. Степанов А.С., Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Выяснение участия детерминантов, локализованных в составе хромосомы B. anthracis, в реализации патогенных свойств возбудителя сибирской язвы // Мо­ле­кулярная ге­нетика, мик­ро­биология и ви­ру­сология. - 1999. - № 1. - С. 20-23.
  7. Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф. Корреляция вирулентности Bacillus anthracis с экспрессией признаков, кодируемых хромосомными генами // Мо­ле­кулярная ге­нетика, мик­ро­биология и ви­ру­сология. - 1999. - № 4. - С. 25-28.
  8. Микшис Н.И., Степанов А.С., Шевченко О.В., Еремин С.А. Изучение феномена внутриштаммовой гетерогенности возбудителя сибирской язвы //Жур­на­л мик­ро­био­ло­гии, эпи­де­мио­ло­гии и им­му­но­био­ло­гии. - 1999. - № 3. - С. 78-79.
  9. Микшис Н.И., Еремин С.А., Шевченко О.В., Болотникова М.Ф. Выделение спонтанных мутантов Bacillus anthracis, различающихся по протеолитической, гемолитической активности, способности к сорбции пигмента и спорообразованию // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 1999. - С. 13.
  10. Mikshis N., Bolotnikova M., Yeremin S., Popov Yu. Search of Bacillus anthracis chromosome determinants of virulence // The 2nd International workshop of the molecular biology of Bacillus cereus, Bacillus anthracis and Bacillus thuringiensis. Taos, New Mexico, USA (August 11-13). - 1999. – P. 10.
  11. Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В. Изучение вирулентности рекомбинантного штамма Bacillus anthracis, полученного в результате трансдукционной передачи хромосомных генов из штамма Bacillus cereus // Мо­ле­кулярная ге­нетика, мик­ро­биология и ви­ру­сология. 2000. - № 4. - С. 12-15.
  12. Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дармов И.В., Дроздов И.Г. Получение аспорогенных штаммов B. anthracis // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2001. - С. 8.
  13. Попов Ю.А., Микшис Н.И. Сибиреязвенные вакцины // Проблемы особо опасных инфекций. - 2002. - №1(83). - С. 21-36.
  14. Микшис Н.И., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Получение спонтанных и индуцированных аспорогенных мутантов Bacillus anthracis // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2002. - С. 16-17.
  15. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Еремин С.А., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Киреев М.Н., Коннов Н.П. Изучение хромосомных факторов патогенности и иммуногенности возбудителя сибирской язвы // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2002. - С. 29-30.
  16. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В., Дармов И.В. Патент РФ на изобретение № 2180349 – штамм Bacillus anthracis КМ89 – продуцент сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №7 от 10.03.2002 г.
  17. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2180916 - штамм Bacillus anthracis КМ92 - продуцент сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №9 от 27.03.2002 г.
  18. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2180917 - штамм Bacillus anthracis КМ90 – основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №9 от 27.03.2002 г.
  19. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2180350 - штамм Bacillus anthracis КМ91 – основа для генетического конструирования продуцентов сибиреязвенных антигенов // Бюллетень №7 от 10.03.2002 г.
  20. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Патент РФ на изобретение № 2193597 – способ получения аспорогенного штамма Bacillus anthracis (варианты) // Бюллетень №33 от 27.11.2002 г.
  21. Микшис Н. И., Болотникова М. Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Еремин С. А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Получение аспорогенных штаммов Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2003. - № 1. - С. 3-11.
  22. Коннов Н.П., Волков Ю.П., Корсакова А.Ю., Данилова Т.В., Микшис Н.И., Мантуров А.О., Кузнецов О.С., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Трансмиссионная электронная и сканирующая силовая микроскопия белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2004. - Вып. 2(88). - С. 34-36.
  23. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Подборонова Н. В., Полунина Т.А. Выделение белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. - 2004. - Вып. 1 (87). - С. 48 - 50.
  24. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А. Характеристика белков S-слоя возбудителя сибирской язвы // Молодые ученые в медицине: Материалы IX Всероссийской научно-практической конференции. - Казань, 2004. - С. 130.
  25. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Болотникова М.Ф., Киреев М.Н. Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Медицинская микробиология – XXI век: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. - Саратов, 2004. - С. 156 - 157.
  26. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П. Иммуноэлектронная микроскопия для характеристики белков S-слоя Bacillus anthracis // Материалы ХХ Российской конференции по электронной микроскопии. – Черноголовка, 2004. - С. 238.
  27. Корсакова А.Ю., Микшис Н.И., Попов Ю.А., Коннов Н.П. Электронно-микроскопическое исследование белков S-слоя сибиреязвенного микроба // Материалы ХХ Российской конференции по электронной микроскопии. – Черноголовка, 2004. - С. 239.
  28. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Клонирование pag гена в протеазо-дефицитных бациллярных штаммах // Молекулярная медицина и биобезопасность: Материалы 1 Международной конференции.- Москва, 2004. - С. 131 -133.
  29. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Иммуногенность белков S-слоя Bacillus anthracis // Молекулярная медицина и биобезопасность: Материалы 1 Международной конференции. – Москва, 2004. - С. 130-131.
  30. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Попов Ю.А., Коннов Н.П., Киреев М.Н., Дроздов И.Г. Продукция белков S-слоя штаммами Bacillus anthracis // Биотехнология. - 2004. - № 5. - С. 22-32.
  31. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Оценка иммунологической эффективности рекомбинантных штаммов с клонированным геном pag // Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции. - Волгоград, 2005. - С. 164-166.
  32. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Клюева С.Н. Иммунологическая эффективность генетически сконструированных бациллярных штаммов, продуцирующих протективный антиген сибиреязвенного микроба // Проблемы особо опасных инфекций. – 2005. - Вып. 2(90). - С. 58 -59.
  33. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Корсакова А. Ю., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Шулепов Д.В., Киреев М.Н., Коннов Н.П., Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Брандзишевский Ю.В., Полунина Т.А. Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Саратов, 2005. - С. 41.
  34. Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Киреев М.Н., Попов Ю.А. Выделение и очистка протективного антигена из рекомбинантного штамма Bacillus anthracis // Окружающая среда и здоровье: Окружающая среда и здоровье: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Суздаль, 2005 г. - С. 212-213.
  35. Кудрявцева О.М., Микшис Н.И., Новикова Л.В., Болотникова М.Ф., Попов Ю.А. Генетическое конструирование продуцентов протективного антигена сибиреязвенного микроба // Окружающая среда и здоровье: Материалы Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов. - Суздаль, 2005 г. - С. 164-167.
  36. Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Дроздов И.Г. Сравнение уровней продукции протективного антигена вакцинным и рекомбинантными штаммами Bacillus anthracis // Санитарная охрана территорий государств-участников СНГ: проблемы биологической безопасности и противодействия биологическому терроризму в современных условиях: Материалы VI Межгосударственной научно-практической конференции. - Волгоград, 2005. - С. 166-168.
  37. Попов Ю.А., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Корсакова А.Ю., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Щуковская Т.Н., Киреев М.Н., Брандзишевский Ю.В., Коннов Н.П. Конструирование рекомбинантных штаммов Bacillus anthracis для создания нового поколения высокоэффективных сибиреязвенных вакцин // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Саратов, 2006. - С. 51.
  38. Кудрявцева О.М., Микшис Н.И., Новикова Л.В, Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Селекция стабильных и эффективных рекомбинантных продуцентов протективного антигена Bacillus anthracis // Проблемы особо опасных инфекций. - 2006. - Вып. 1 (91). - С. 38-41.
  39. Микшис Н.И., Корсакова А.Ю., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Роль компонентов S-слоя в иммуногенности возбудителя сибирской язвы // Жур­на­л мик­ро­био­ло­гии, эпи­де­мио­ло­гии и им­му­но­био­ло­гии. - 2006. - № 1. - С. 29 -32.
  40. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Экспрессия гена синтеза протективного антигена сибиреязвенного микроба в рекомбинантных бациллярных штаммах // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 84.
  41. Микшис Н.И., Шулепов Д.В., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Новикова Л.В., Попов Ю.А. Конструирование рекомбинантного аспорогенного штамма-продуцента протективного антигена сибиреязвенного микроба // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 83-84.
  42. Попов Ю.А., Микшис Н.И. Перспективы создания новых вакцинных препаратов для профилактики сибирской язвы // В сб. «Материалы IX съезда всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». - Москва, 2007. - Т. 1. - С. 91-92.
  43. Щуковская Т.Н., Фирстова В.В., Кравцов А.Л., Клюева С.Н., Попов Ю.А., Микшис Н.И. Оценка приобретенного иммунитета против сибирской язвы по степени повреждения лейкоцитов крови in vitro анатоксином // Проблемы особо опасных инфекций. - 2007. - Вып. 1 (97). - С. 81-85.
  44. Шулепов Д.В., Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Попов Ю.А., Киреев М.Н. Получение высокоочищенного препарата протективного антигена из рекомбинантного аспорогенного штамма Bacillus anthracis // Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в государствах-участниках СНГ: Материалы Межгосударственной научно-практической конференции. - Саратов, 2007. - С. 320-321.
  45. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Шулепов Д.В., Попов Ю.А. Комплекс методических подходов к определению протективного антигена сибиреязвенного микроба // Методические документы и отчеты по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Саратов, 2007. - С. 16.
  46. Микшис Н.И., Кудрявцева О.М., Болотникова М.Ф., Шулепов Д.В., Новикова Л.В., Попов Ю.А., Щуковская Т.Н., Дроздов И.Г., Кутырев В.В. Иммуногенность рекомбинантных бациллярных штаммов с клонированным геном синтеза протективного антигена Bacillus anthracis // Мо­ле­кулярная ге­нетика, мик­ро­биология и ви­ру­сология. - 2007. - № 3. - С. 15-21.
  47. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Кудрявцева О.М. Патент РФ на изобретение № 2321628 – рекомбинантный штамм B. anthracis СТИТПА-1 (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Бюллетень №10 от 10.04.2008 г.
  48. Микшис Н.И., Попов Ю.А., Шулепов Д.В. Патент РФ на изобретение № 2321629 – аспорогенный рекомбинантный штамм B. anthracis 55ТПА-1 Spo- (pUB110PA-1) - продуцент протективного антигена сибиреязвенного микроба // Бюллетень №10 от 10.04.2008 г.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.