WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Клинико-генотипический полиморфизм муковисцидоза среди населения краснодарского края

Представлены сведения о предстоящей защите диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Рукавичкин Дмитрий Васильевич

«Клинико-генотипический полиморфизм муковисцидоза в популяции Краснодарского края»

03.00.15 – генетика;

медицинские науки

Д 001.016.01

ГУ Медико-генетический НЦ РАМН

115478, Москва, ул. Москворечье, 1, МГНЦ РАМН

Тел: 8 (499) 612-86-07

www. med-gen. ru

Предполагаемая дата защиты диссертации – 15 октября 2007 года

Представлена на сайте МГНЦ РАМН – 25.07.2007

Работа принята к защите 09.07.2007

На правах рукописи

Рукавичкин Дмитрий Васильевич

КЛИНИКО-ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МУКОВИСЦИДОЗА

СРЕДИ НАСЕЛЕНИЯ КРАСНОДАРСКОГО КРАЯ

03.00.15 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2007

Работа выполнена в Кубанском государственном медицинском университете (ГОУ ВПО КГМУ Росздрава).

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Голубцов Виктор Иванович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук

Демикова Наталья Сергеевна

кандидат биологических наук

Петрова Ника Валентиновна

Ведущая организация:

ГОУ ДПО Российская медицинская академия последипломного образования

Защита состоится «____» ____________ 2007 г. в _______часов на заседании Диссертационного совета Д 001.016.01. при ГУ МГНЦ РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ МГНЦ РАМН

Автореферат разослан «____» ____________ 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Муковисцидоз (кистозный фиброз; OMIM 219700) – частое моногенное аутосомно-рецессивное заболе­вание, характеризующееся пораже­нием экзокринных желез жизненно важных органов и систем и имеющее обычно тяжелое течение и прогноз [The OMIM database http://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim]. Ген, связанный с развитием муковисцидоза (MB), был картирован в 1989г. в середине длинного плеча 7-й хромосомы (7q31.2). [J.M.Rommens et al., 1989; J.M.Riordan et al., 1989; B.Kerem et al., 1989]. Он состоит из 27 экзонов и охватывает 250000 пар нуклеотидов. Транскрипция гена CFTR приводит к появлению первичного продукта – мРНК, состоящего из 6129 нуклеотидов. Белковый продукт включает 1480 аминокислотных остатков. Белок CFTR, функционируя как цАМФ-зависимый хлорный канал, регулирует работу других хлорных и натриевых каналов, участвует в проведении воды и АТФ, является сенсором внутриклеточного уровня АТФ и медиатором транспорта эндоплазматических пузырьков [J.M.Riordan et al., 1989].

К настоящему времени, по данным Консорциума по муковисцидозу, выделено 1546 мутаций гена CFTR [The CF mutation database 02.03.2007 http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr]. Мутации гена CFTR реализуются недостаточной активностью CFTR-белка, что приводит к аномальным концентрациям хлоридов в просвете протоков дистальных отделов бронхолёгочной системы, поджелудочной железы, протоков потовых желез, тонкого кишечника и семен­ных канатиков. [Л.А.Шабалова и соавт., 2006; N.Reiniger et al., 2005; M.Dahl et al., 2005; E.Marchand et al., 2001; C.Bombieri at al., 2000; P.Noone et al., 200l; M.Tzetis et al., 2001].

По данным Российского центра муковисцидоза, в нашей стране насчитывается более 1800 больных МВ, которые занесены в единый Регистр больных РФ. Согласно расчётам Н.И.Капранова ежегодно в Москве должно рождаться до 50 а в России около 750 больных МВ. Во Франции, в Англии и Германии – от 500 до 800, в США – около 2 тыс., а в мире – более 45000 детей, больных MB, а число гетерозиготных носителей гена насчитывает многие десятки миллионов. [Н.И.Капранов, 1994; Н.И.Капранов, Н.Ю.Каширская, 1997; Т.Ю.Капустина и соавт., 2005, 2006;].

В большинстве стран Европы и Северной Америки частота MB составляет от 1:2000 до 1:4000 новорождённых. Частота MB в разных популяциях РФ существенно варьирует от 1:4860 до 1:12300 живорождённых [Н.В.Петрова, Е.К.Гинтер, 1997, 2001; Н.И.Капранов, 2001, 2006].

Спектр различных мутаций и полиморфизмов гена CFTR обладают выраженной популяционной специфичностью [The CF mutation database 2007 http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr]. Выявление особенностей распространения МВ в Краснодарском крае, анализ частоты и спектра мутаций, приводящих к данному заболеванию, представляют актуальную научную задачу и имеют важное значение для практического здравоохранения. Анализ внегенных и внутригенных полиморфных маркеров гена CFTR открывает новые возможности для исследования генетической структуры популяции.

Целью данного исследования является определение частоты, распространённости, спектра мутаций гена CFTR, источников происхождения мутантных генов муковисцидоза, корреляции между мутациями гена CFTR и клиническими формами муковисцидоза среди населения Краснодарского края.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

  1. Провести ДНК-диагностику и верифицировать спектр генных мутаций у больных муковисцидозом, зарегистрированных на территории Краснодарского края за период 1994-2005г.г.
  2. Провести сравнительный анализ распределения частот аллелей и генотипов внегенных и внутригенных маркеров гена CFTR в выборках нормальных и мутантных хромосом.
  3. Провести генотипическое обследование родителей, сибсов и ближайших родственников пробандов с целью установления источников происхождения мутантных генов.
  4. Проанализировать зависимость между мутациями гена CFTR и клиническими формами муковисцидоза у больных.
  5. Сравнить полученные данные с результатами аналогичных исследований в других регионах и популяциях.
  6. Создать краевой Регистр семей, отягощённых МВ.
  7. Создать банк данных мутаций гена муковисцидоза, зарегистрированных на территории края.
  8. Разработать прогностические и медико-профилактические мероприятия на основе молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза.

Научная новизна работы.

Впервые дана характеристика спектра и частоты мутаций гена CFTR среди больных МВ в Краснодарском крае.

Впервые установлено, что спектр мутаций, у больных МВ в крае, отличается своеобразием по сравнению с ранее изученными регионами России; определены диагностически значимые мутаций для краснодарского региона.

Впервые у больных МВ из Краснодарского края описаны шесть мутаций, которые ранее не выявлялись на территории Российской Федерации: G85E (3 экзон), R117H (4 экзон), R117С (4 экзон), E92K (4 экзон), 2183AAG (13 экзон) и 4006-19del3 (20 интрон).

Впервые получены данные об аллельном и генотипическом разнообразии диаллельных внегенных (XV.2C, KM.19, J3.11, MetH) и внутригенных (M470V, TUB18, TUB20) маркеров и одного внутригенного микросателлитного (IVS6aGATT) маркера гена CFTR у больных МВ среди населения Краснодарского края.

Теоретическая значимость исследования.

Полученные данные о частоте, спектре, территориальном и этническом разнообразии мутаций гена CFTR и восьми полиморфных систем предоставляют новый материал, что может служить базой для дальнейших исследований в области популяционной генетики.

Практическая значимость исследования заключается в оптимизации алгоритма выявления гетерозиготных носителей мутаций гена CFTR, пресимптоматической и пренатальной диагностики МВ, необходимой для осуществления целенаправленной профилактики этого наследственного заболевания в Краснодарском крае. На основании результатов работы создан краевой Регистр семей, отягощённых муковисцидозом и банк данных мутаций гена CFTR, зарегистрированных на территории края. Разработан и внедрён в практику медико-генетической службы Краснодарского края и лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета “Алгоритм молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза”. Материалы работы могут быть использованы в учебном процессе на медицинских и биологических факультетах, а также на курсах повышения квалификации постдипломного обучения врачей общей практики. Результаты исследования введены в рабочую программу по медицинской генетике для студентов IV-го курса лечебного, педиатрического и медико-профилактического факультетов на кафедре биологии с курсом медицинской генетики Кубанского государственного медицинского университета. Результаты молекулярно-генетического исследования используются в работе врачей-педиатров Краевой детской клинической больницы. Имеются акты внедрения.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

  1. В результате молекулярно-генетического исследования гена CFTR выявлено 16 мутаций, что позволило идентифицировать 63,7% всех мутантных аллелей. Спектр мутаций гена CFTR у больных МВ из Краснодарского края имеет свои особенности и отличается от такового в других регионах России.
  2. Описаны шесть мутаций, которые ранее не обнаруживали на территории Российской Федерации.
  3. Анализ частот аллелей и генотипов диаллельных внегенных (XV.2C, KM.19, J3.11, Met H) и внутригенных (M470V, TUB18, TUB20) маркеров и одного внутригенного микросателлитного (IVS6aGATT) маркера гена CFTR выявляет различия между больными и здоровыми по данным полиморфным системам.
  4. Определение корреляций между генотипом больного и клиническими особенностями заболевания, позволяет прогнозировать характер течения МВ, более эффективно осуществлять его лечение и профилактику.
  5. Разработанный оптимальный алгоритм ДНК-диагностики МВ, основанный на молекулярно-генетическом анализе мутаций гена CFTR, позволяет осуществлять пренатальную диагностику МВ и выявлять гетерозиготных носителей мутаций гена CFTR в семьях высокого риска МВ.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

Апробация диссертации.

Результаты исследования были представлены на V съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 24-27 мая 2005г.), Краевой научно-практической конференции для врачей-педиатров “Муковисцидоз” (Краснодар, 16 ноября 2005г.), Краевой научно-практической конференции “Муковисцидоз у детей” (Краснодар, 18 октября 2006г.), межлабораторном семинаре ГУ МГНЦ РАМН (Москва, 4 июля 2007г.).

Структура и объём диссертации.

Диссертация изложена на 171 странице и состоит из введения, об­зора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, заключения, выводов, библиографии 233 источника (103 источника на русском и 130 на иностранных языках) и приложений. Работа содержит 33 рисунка и 35 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использованы результаты медико-генетического обследования 102 больных с клиническим диагнозом муковисцидоз, а также членов их семей, зарегистрированных на территории Краснодарского края, состоящих на учёте в Кубанской межрегиональной медико-генетической консультации, Краевой детской клинической больнице. Диагноз муковисцидоз устанавливался на основании клинико-лабораторных данных, определения хлоридов в потовой жидкости и инструментальных исследований. Для анализа спектра мутаций в крае проанализировано 88 ДНК-заключений, из которых у 75 больных и 83 родственников пробанда была проведена молекулярно-генетическая диагностика в Краснодарском крае, а у 13 больных – проведена выкопировка данных молекулярно-генетических исследований, проведённых в других лечебно-диагностических учреждениях РФ. Также с целью исследования распределения частот аллелей и генотипов внутригенных и внегенных полиморфных локусов гена CFTR в выборке нормальных хромосом была исследована контрольная группа в количестве 70 человек, состоящая из клинически здоровых индивидов.

В качестве материала использовали образцы ДНК, выделенные из лейкоцитов цельной крови или пятен высушенной крови, нанесённых на фильтровальную бумагу. Анализ мутаций гена CFTR и полиморфизма ДНК-маркеров осуществляли амплификацией фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции, с последующим анализом расщепления ферментами рестрикции, детекцией фрагментов ДНК методом электрофореза в полиакриламидных гелях. Определение нуклеотидных последовательностей методом секвенирования проводилось в лаборатории медицинской генетики Ростовского государственного медицинского университета на секвенаторе BeckmanColter SEQ 8000. Материалы были обработаны с помощью пакета программ для медико-биологической статистики Biostat 4.0 [С.Гланц, 1999] и электронными формулами Excel XP.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ ПОЛИМОРФИЗМ МВ

Спектр мутаций гена CFTR у больных МВ в Краснодарском крае

Географическое положение Краснодарского края (Юг России), значительная численность народонаселения (более 5 млн. человек), многонациональный состав (преимущественно русские и украинцы – 89,22%) и своеобразие формирования панмиксной краснодарской популяции (иммигранты из других регионов) – определили необходимость анализа популяционного генетического груза по муковисцидозу среди 587946 новорождённых в крае за период 1994 – 2005 годы.

Всего за указанный период на основании клинико-лабораторных данных (хлориды в поте больных) зарегистрировано 54 ребёнка с диагнозом муковисцидоз. Таким образом, частота МВ среди новорождённых составила 1:10888, что соответствует результатам исследований в других популяциях России и ряда европейских государств [Н.В.Петрова, 1996, 2006; Т.Э.Иващенко, 2000].

Неравномерность распределения больных на территории Краснодарского края определила необходимость подразделения его на 6 регионов сходных по эколого-географическому положению, природно-климатическим характеристикам и социально-экономическому укладу народонаселения – Приазовский, Северный, Центральный, Восточный, Причерноморский и Южный-Предгорный.

С целью изучения спектра и частоты мутаций гена CFTR у больных МВ в Краснодарском крае нами проведён молекулярно-генетический анализ 20 наиболее частых в России мутаций гена CFTR: 10 экзон – F508del, 1677delTA; 2,3 экзоны – CFTRdele2,3(21kb), 394delTT; 13 экзон – 2143delT, 2184insA; 20 экзон – W1282X, 3944delTG; 21 экзон – N1303K; 11 экзон – G542X, G551D, R553X; 7 экзон – R334W, R347P; 19 экзон – S1196X, 3667delTCAA, 3821delT; 4 экзон – L138ins, 621+1GT; 19 интрон – 3849+10kbCT, с последующим секвенированием образцов.

По результатам исследования у 88 больных (176 хромосом) нами выявлено 16 мутаций гена CFTR (рис. 1), при этом мутации обнаружены на 63,7% хромосом в 26 различных генотипах (табл.1).

 Спектр мутаций гена CFTR у больных МВ в краснодарской популяции Как-0 Рис. 1. Спектр мутаций гена CFTR у больных МВ в краснодарской популяции

Как и в большинстве российских популяций наиболее частой мутацией в крае является мутация F508del, которая выявлена в 39,8% исследованных хромосом. При этом мутация F508del обнаружена у 51 больного МВ и встретилась у 37,3% (19 больных) – в гомозиготном состоянии, 29,4% (15 пациентов) в компаунде с другими мутациями и 33,3% (17 больных) – второй мутации не обнаружено данным исследованием.

К диагностически значимым мутациям, приводящим к МВ в крае, помимо F508del, можно отнести мутации CFTRdele2,3(21kb) – 5,1%, 3849+10kbCT – 4,5%, 2183AAG – 3,4%, 2184insA – 1,7%, N1303K – 1,7%, 2143delT – 1,1%, L138ins – 1,1%, W1282X – 1,1%. Мутации R117H, R117C, E92K, G542X, G85E, R347P, 4006-19del3 являются редкими, так как их частота не превышает 1,0%. В результате секвенирования экзонов гена CFTR было идентифицировано 6 мутаций, которые ранее не встречались у больных в российских популяциях: G85E (3 экзон), R117H, R117C и E92K (4 экзон), 2183AAG (13 экзон) и 4006-19del3 (20 интрон). Вместе с тем, в 36,3% исследованных хромосом нам не удалось определить мутацию, которые, по-видимому, локализованы в других регионах гена CFTR на анализируемых хромосомах.

Таблица 1

Генотипы больных МВ в краснодарской популяции

Генотипы Число больных, n Частота
1 F508del / F508del 19 0,49 (43/88)
2 2183AAG / 2183AAG 2
3 F508del / CFTRdele2,3(21kb) 3
4 F508del / 3849+10kbCT 5
5 F508del / 2184insA 2
6 F508del / 4006-19del3 1
7 F508del / E92K 1
8 F508del / L138ins 1
9 F508del / N1303К 1
10 F508del / W1282X 1
11 3849+10kbCT / 2143delT 1
12 CFTRdele2,3(21kb) / 2183AAG 2
13 CFTRdele2,3(21kb) / 3849+10kbCT 1
14 CFTRdele2,3(21kb) / R347P 1
15 CFTRdele2,3(21kb) / W1282X 1
16 N1303К / L138ins 1
17 F508del / N 17 0,29 (26/88)

18 2143delT / N 1

19 2184insA / N 1

20 3849+10kbCT / N 1

21 CFTRdele2,3(21kb) / N 1

22 G542X / N 1

23 G85E / N 1

24 N1303К / N 1

25 R117H / N 1

26 R117C / N 1

27 N / N 19 0,22 (19/88)

ИТОГО: 88 1,00 (88/88)

Примечание: N – мутация не идентифицирована

У больных МВ из европейских регионов России, частота мутации F508del, по данным нескольких независимых исследований, в среднем составляет 50,0% [Т.Э.Иващенко, 2000; Н.В.Петрова, Е.К.Гинтер, 2001]. Полученные нами данные о частоте мутации F508del среди больных с диагнозом МВ, существенно отличаются от результатов исследования европейских популяций России (39,8%), а также от восточно-европейских и сибирских регионов РФ, где она составляла 31,0-33,0% [Г.Ф.Корытина, 2002; О.Н.Одинокова, Л.П.Назаренко, 2006]. Это согласуется с представлением о снижении распространённости мутации F508del в Европе в направлении с северо-запада на юго-восток [The CF mutation database 2007 http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr].

Мутация CFTRdele2,3(21kb) выявлена у 9 больных (5,1%), что несколько ниже распространённости мутации CFTRdele2,3(21kb) среди населения России, около 6,5% [Н.И.Капранов, 2006; Н.В.Петрова, 2006].

Мутация 3849+10kbCT в 19-м интроне была обнаружена у 8 больных на 8-ми хромосомах с частотой 4,5% – это выше чем по России (1,9%) [Н.И.Капранов, 2006; Н.В.Петрова, 2006].

Мутации в 13-м экзоне выявлены у 9 больных: в 4-х случаях мутация 2183AAG (3,4%), в 2-х случаях мутация 2143delT (1,1%) и в 3-х – 2184insA (1,7%). Мутации 2143delT и 2184insA 13 экзона гена CFTR, являются относительно частыми для больных из Центрального региона России, где их суммарная доля составляет около 3,3-4,0% [Т.Э.Иващенко, 2000; Н.И.Капранов, 2006; Н.В.Петрова, 2006], в Северо-Западном регионе России частота этих мутаций гораздо меньше 2,3% [Т.Э.Иващенко, 2000], а в Башкортостане менее 1,0% [Г.Ф.Корытина, 2002]. Мутация 2183AAG ранее не диагностирована среди больных МВ на территории РФ.

При анализе мутаций 4-го экзона гена CFTR на двух хромосомах в компаундном сочетании была обнаружена мутация L138ins, что составляет 1,1%. Эта мутация также является достаточно редкой у больных из других регионов России, встречаясь с частотой 0,3-1,3% [Н.И.Капранов и соавт., 2005; Н.В.Петрова, 2006]. Обнаружены ещё две мутации в 4-ом экзоне гена CFTR: R117H – в армянской семье и R117C в адыгейской семье. Доля мутаций R117H и R117C в краснодарской популяции составляет по 0,6%, каждой. В компаундном сочетании с мутацией F508del в 4-ом экзоне нами обнаружена мутация Е92К (0,6%). Ранее данные мутации (R117H, R117C и Е92К) не встречались на территории Российской Федерации.

Мутация N1303K 21-го экзона была обнаружена у трёх больных с частотой 1,7%. Частота мутации в Центральном, Северном и Северо-Западном регионах России составляет 2,0-4,5% [Т.Э.Иващенко, 2000; Н.В.Петрова, 2006; Н.И.Капранов, 2006], что позволяет её отнести к числу диагностически значимых мутаций. Данная мутация повсеместно распространена в мировых популяциях 0,6-6,4% [J.L.Bobadilla et al., 2002].

Мутация W1282X 20-го экзона гена CFTR обнаружена у 2-х больных в компаундном состоянии: в одном случае в компаунде с мутацией F508del, в другом – с мутацией CFTRdele2,3(21kb), что составило 1,1% среди больных МВ в крае. Мутация W1282X является частой у больных МВ среди евреев-ашкенази (48,0%). В странах Европы частота данной мутации колеблется в пределах 0,5-1,8% и является одной из распространённых мутаций гена CFTR в Центральной и Северо-Западной части России, где её частота составляет 2,7-3,0% [Т.Э.Иващенко, 2000; Н.В.Петрова, 2006; Н.И.Капранов, 2006], а в Башкортостане она является достаточно редкой – 0,7% [Г.Ф.Корытина, 2002].

При ПЦР анализе мутаций 3-го экзона гена CFTR на одной хромосоме была обнаружена мутация G85E. Эта мутация ранее не определена у больных из других регионов России.

При анализе мутаций в 7-м экзоне гена CFTR была обнаружена мутация R347P (в компаунде с CFTRdele2,3(21kb)). Мутация также является достаточно редкой у больных из других регионов России, встречаясь с частотой 0,6% [Н.В.Петрова, 2006].

При анализе мутаций в 11-м экзоне на одной хромосоме была обнаружена мутация G542X (0,6%).

Мутация 4006-19del3 интрона 20 встретилась в популяции Краснодарского края в компаунде с мутацией F508del. Эта мутация ранее не была определена у больных из других регионов России.

Таким образом, для краснодарской популяции по сравнению с другими популяциями РФ характерным является снижение частоты мутации F508del, но повышением частоты мутаций интрона 19 (3849+10kbCT) и экзона 13 (2183AAG), которые в других популяциях относятся в разряду редких (рис. 2). Разнообразие идентифицированных и неидентифицированных мутаций в краснодарской популяции, по-видимому, обусловлено более гетерогенным составом населения края, с учётом истории его формирования. Вместе с тем, значительное число выявленных мутаций гена CFTR идентифицировать не представилось возможным.

По совокупности проведённых молекулярно-диагностических исследований (определение длины продуктов ПЦР и вида гетеродуплексов, пострестрикционный анализ с определением мутации по образованию или потере сайта рестрикции и последующего точного определения нуклеотидной последовательности) – нами идентифицировано 63,7% всех МВ аллелей.

Идентифицировано 26 различных CFTR генотипов, в т.ч. в 49,0% исследований обе хромосомы были с идентифицированными мутациями (гомозиготные и компаундно-гетерозиготные генотипы), в 29,0% – была обнаружена мутация на одной хромосоме, а в 22,0% случаев обе мутантные хромосомы не идентифицированы (таб. 1).

Мутация F508del обнаружена на 70 хромосомах, причём у 19 больных (54,3%) – в гомозиготном состоянии, у 15 больных на 15 хромосомах (21,4%) – в сочетании с другой выявленной мутацией, а у 17 больных – 24,3% на вторых хромосомах мутации не идентифицированы.

Только 47,0% семей являются полностью информативными для прямой диагностики МВ молекулярно-генетическими методами, 29,0% семей – частично информативными, а 24,0% семей – неинформативными. По-видимому, пробанды из неинформативных и полуинформативных семей содержат мутантные аллели, являющиеся либо протяжёнными делециями, которые невозможно выявить использованными методами, либо они локализованы в других районах гена CFTR.

Из 37 мутаций гена CFTR, диагностированных в популяциях РФ, в Краснодарском крае выявлено 16, из которых 6 – G85E, R117H, R117С, E92K, 2183AAG и 4006-19del3 – ранее среди больных МВ в РФ не регистрировались.

 Соотношение мутаций гена CFTR на территории РФ Анализ внутригенных-1 Рис. 2. Соотношение мутаций гена CFTR на территории РФ

Анализ внутригенных (IVS6aGATT, M470V, TUB18, TUB20) и внегенных (XV.2C, KM.19, J3.11, MetH) маркеров в выборках мутантных и нормальных хромосом

В связи с тем, что у больных МВ из Краснодарского края, частота неидентифицированных мутаций остаётся высокой, актуальным является изучение внегенных и внутригенных полиморфных маркерных систем. Установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей внутригенных маркеров гена CFTR: одного микросателлитного – IVS6aGATT, 3-х диаллельных – M470V, TUB18, TUB20 и 4-х диаллельных внегенных систем: XV.2C, KM.19, J3.11, MetH в выборках нормальных и мутантных хромосом с мутацией F508del и хромосомах без данной мутации. Это позволило выявить ассоциации мутации F508del с различными полиморфными системами.

При анализе встречаемости аллелей локуса IVS6aGATT гена CFTR обнаружено абсолютное сцепление аллеля 6 (100,0%) с мутацией F508del(+) (St=-0,8), что согласуется с данными авторов, изучавших особенности распределения аллелей локуса IVS6aGATT у больных МВ и здоровых индивидов в популяциях РФ [Н.В.Петрова, 1996, 2006; Т.Э.Иващенко, 2000]. При анализе распределения частот генотипов маркера IVS6aGATT у больных МВ и здоровых индивидов обнаружено достоверно больше гомозигот 6/6 среди больных МВ (29,3%) и гомозигот 7/7 среди здоровых индивидов – 59,5% (2=22,625, р<0,001).

Определяя частоту аллелей полиморфизма M470V гена CFTR обнаружено абсолютное сцепление аллеля 1 (100,0%) с мутацией F508del(+) (St=-0,593). При анализе распределения частот генотипов маркера M470V установлено статистически достоверное (2=17,257, р<0,001) преобладание генотипа 1/1 в группе больных МВ (56,0%) по сравнению с контролем (22,0%).

Анализ частоты аллелей маркера TUB18 установил, что аллель 1 является самым частым как на мутантных (85,0%), так и на нормальных хромосомах (76,0%), но на мутантных хромосомах с F508del(+) обнаружено выраженное неравновесие по сцеплению (St=-0,327). Частота аллеля 1 (98,0%) достоверно выше (2=9,681, р=0,002) на хромосомах с мутацией F508del(+), нежели на хромосомах без F508del(–) – 81,0% (2=0,719, р=0,396). Статистически достоверных различий частот генотипов 1/1, 1/2 и 2/2 в сравниваемых выборках хромосом не установлено (2=3,981, р=0,137).

При анализе встречаемости частот аллелей маркера TUB20 установлено, что аллель 2 является самым частым как на мутантных (83,0%), так и на нормальных хромосомах (75,0%), но на мутантных хромосомах с F508del(+) обнаружено выраженное неравновесие по сцеплению (St=-0,298). Распределение частот генотипов 1/1, 1/2 и 2/2 маркера TUB20 в сравниваемых выборках нормальных и мутантных хромосом статистически значимых различий не выявило (2=4,312, р=0,116).

Распределение частот аллелей внегенных маркеров показало, что обнаружено выраженное достоверное (2=27,053, р<0,001) неравновесное сцепление аллеля 1 локуса XV.2C (95,0%) с мутацией F508del(+) (St=-0,520). Статистически достоверное преобладание генотипа 1/1 наблюдалось в группе больных МВ (41,0%) по сравнению с контролем (22,0%), а генотип 2/2 достоверно чаще определён в контрольной группе – 25,0% по сравнению с группой больных МВ – 10,0% (2=9,322, р<0,01).

Анализ распределения частот аллелей локуса КМ.19 показал выраженное достоверное (2=51,769, р<0,001) неравновесное сцепление аллеля 2 (91,0%) с мутацией F508del(+) (St=-0,696), что отмечено в других популяциях РФ [Н.В.Петрова, 1996]. Отмечается преобладание частоты генотипа 2/2 (24,0%) в группе больных МВ по сравнению с контролем (3,0%), а генотип 1/1 достоверно выше в контрольной группе – 59,0% по сравнению с группой больных МВ – 19,0% (2=27,727, р<0,001).

При оценке распределения частот аллелей локуса J3.11 не выявлено существенных различий на мутантных и нормальных хромосомах. Вместе с тем, отмечено статистически достоверное преобладание частоты генотипа 1/1 (21,0%) в группе больных МВ по сравнению с контролем (4,0%) (2=12,281, р=0,002).

Анализ встречаемости аллелей локуса MetH показал выраженное достоверное (2 =9,428, р=0,002) неравновесное сцепление аллеля 1 (81,0%) с мутацией F508del(+) (St=-0,288), а аллель 2 достоверно чаще (46,0%) встречается в контрольной группе. При анализе частоты генотипов маркера MetH отмечено статистически достоверное преобладание частоты генотипов 2/2 (25,0%) в группе контроля по сравнению с больными МВ (12,0%).

Было проведено исследование информативности внутригенных маркеров для 17 ядерных семей. Полностью информативной была только лишь система M470V – 5,9%. 50%-ая (частичная) информативность наблюдалась в 70,6% семей по системе M470V, в 64,7% – по IVS6aGATT и по 47,1% для систем TUB18 и TUB20, соответственно для каждой. При использовании каждой маркерной системы отдельно неинформативными остаются 35,3% семей по системе IVS6aGATT, 23,5% – по M470V и по 52,9% для систем TUB18 и TUB20.

При проведении исследования информативности внегенных маркерных локусов в 17 полных семьях, установлено, что полностью информативными семьями по системе J3.11 было 35,3%, по системам KM.19 и MetH – 17,6%, соответственно, для каждой, и 11,8% – для системы XV.2C. 50,0%-ая (частичная) информативность наблюдалась в 88,2% по системе XV.2C, в 64,8% – по KM.19, 58,8% – по J3.11 и 52,9% – по MetH. При использовании каждой маркерной системы отдельно неинформативными остаются 29,5% семей по системе MetH, 17,6% – по KM.19 и 5,9% – по J3.11.

Таким образом, использование внутригенных и внегенных систем по отдельности недостаточно эффективно, поэтому необходимо проведение молекулярно-генетического анализа маркерных систем одновременно с анализом мутаций в гене CFTR. При сочетании данных по всем изученным системам и мутациям гена CFTR доля полностью информативных семей возрастает с 47,0% до 55,0%, частично информативных сокращается с 29,0% до 27,0% и неинформативных уменьшается с 24,0% до 18,0%.

КЛИНИКО-ГЕНОТИПИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МВ В КРАСНОДАРСКОЙ ПОПУЛЯЦИИ

При изучении клинических форм заболевания нами установлено, что 65,0% больных МВ имели смешанную форму различной степени тяжести, лёгочная форма составила 18,8%, а кишечная – 16,2%. По тяжести течения 53,8% больных составляла группа со средней степенью тяжести течения, 31,2% – с тяжёлым течением и 15,0% с лёгким течением.

Установлено, что в группе с «тяжёлыми» генотипами преобладают больные со смешанной формой заболевания (78,0%), тогда как в группе с «мягкими» генотипами лёгочная форма встречается у значительной доли пациентов (44,0%) (2=3,83; p=0,0503; d.f.=1). Кишечный синдром преобладает в большей мере у пациентов в группе с «тяжёлыми» генотипами (93,0%) по сравнению с группой больных с «мягкими» генотипами (56,0%), различия значимы (2=6,29; p=0,0122; d.f.=1). В группе больных с «тяжёлыми» генотипами чаще отмечают тяжёлое течение заболевания (59,0%), а лёгкое течение – только у больных из группы с «мягкими» генотипами; но различия не достоверны (2=1,37; p=0,24; d.f.=1).

Установлено, что частота мутации F508del в группе больных со смешанной и лёгочной формами МВ составила практически поровну – 59,6%, и 60,0%, соответственно. При изучении корреляции мутаций гена CFTR с тяжестью течения заболевания обнаружено, что мутация F508del встречается при всех клинических формах МВ: с тяжёлым течением в 76,0% случаев, со средней степенью тяжести – 51,2%, а с лёгким течением в 16,7%. Больные с неидентифицированными мутациями преобладают при лёгкой тяжести течения заболевания (66,6%) и совсем отсутствует при тяжёлом течении.

При анализе показателей хлоридов в потовой жидкости все больные были разделены на три группы: группа I – больные с содержанием хлоридов 40-60 ммоль/л, II группа – более 61 но менее 100 ммоль/л и III группа – 101 ммоль/л и выше. При анализе показателей хлоридов в поте больных установлено, что средние и высокие величины показателей имеют по 44,4% пациентов, а минимальные показатели – 11,2% больных. При этом смешанная форма МВ преимущественно диагностирована при концентрациях хлоридов от 61 и выше ммоль/л, а лёгочная и кишечная формы при минимальных концентрациях хлоридов (40-60 ммоль/л).

При сопоставлении показателей хлоридов в поте с вариантом мутации установлено, что при значениях хлоридов 61-100 ммоль/л мутация F508del встретилась в 57,7% случаев, а при значениях хлоридов от 101 ммоль/л и выше – в 65,4%. Доля больных с двумя идентифицированными мутациями, у которых хлориды составляли 61-100 ммоль/л, составила 42,3%, а при хлоридах более 101 ммоль/л – 57,7%. При показателях хлоридов в диапазоне 40-60 ммоль/л гомозиготных и компаундных генотипов по идентифицированным мутациям не диагностировано.

Для оценки этнической специфичности в распределении мутаций гена CFTR, был проведён анализ типов брака родителей пробандов с МВ в зависимости от их национальной принадлежности и мест рождения. Большинство больных МВ являлись потомками родителей из однонациональных браков (79,3%), среди которых преобладали браки между русскими (72,0%). Межнациональные браки составили 20,7%.

Среди больных МВ, являющихся потомками русских родителей, 27,9% всех хромосом (176 хромосом) несли мутацию F508del, а при межнациональных браках – 10,8%, большую часть из которых составляли славяне (табл. 2). При определении частоты мутации F508del среди всех хромосом “славянского” происхождения (160 хромосом) – частота её составила 43,1%.

Установлено, что максимальное число больных МВ (78,4%) происходит от родителей одной национальности, из которых большинство русские – 89,9%. При изучении мест рождения родителей, имеющих детей с МВ, установлено, что 47,7% браков заключены между родившимися в Краснодарском крае (эндогамные браки), а 52,3% – экзогамные. Среди эндогамных браков более трети (35,5%) составляют русские семьи, где оба родителя происходят из одного района края, что, по-видимому, определяет величину генетического груза по МВ в исследуемой популяции.

Анализ распределения больных МВ в соответствии с региональной подразделённостью края показал, что в большей степени мутантные гены сосредоточены в Центральном регионе – 35 больных (39,7%) (при этом 22 в Краснодаре). В Южном-Предгорном и Восточном регионах – 16 (18,2%) и 13 (14,8%), соответственно. И в меньшей степени доля МВ хромосом диагностирована в Причерноморском – 10 (11,4%), Северном – 8 (9,1%) и Приазовском регионах – 6 (6,8%).

Несмотря на кажущееся распределение больных, от общего их числа, по регионам – достоверных различий по распространённости заболевания в исследуемых регионах края не выявлено. Существующие отличия в распространённости МВ на территории Краснодарского края, которые наблюдаются между г.Краснодаром и Причерноморским, Восточным и Приазовским регионами – 2,13; 3,894 и 2,08, соответственно, и между Центральным (без г.Краснодара) и Восточным регионами – 1,96, что вероятно является следствием более лучшей организацией диагностики и правильностью постановки клинического диагноза данной патологии у больных Центрального региона, включающий и г.Краснодар, в связи с лучшей организацией работы ЛПУ ближе к краевому центру Кубани.

Установлено, что из 60,2% МВ-хромосом, обладателями которых являются коренные жители края (табл. 3), доля мутации F508del составляет 37,7%, редких аллелей – 21,07% и хромосом с не идентифицированными мутациями – 40,6%. Остальные 39,8% МВ-хромосом были привнесены в краснодарскую популяцию в результате иммиграции родителей из-за пределов края. В этой группе частота мутации F508del составила 42,8%, редких аллелей – 27,2% и не идентифицированных – 30,0%. Мутации G85E, R117H, R117C, E92K и 4006-19del3 ранее не встречались на территории РФ – и возможно являются мутациями привнесенными в исследуемую популяцию на каком-то этапе её формирования.

Важным практическим итогом работы является диагностическая значимость исследованных мутаций гена CFTR для семейного анализа и пренатальной диагностики. Молекулярный скрининг близких родственников пробандов, с идентифицированными мутациями гена CFTR, повысит эффективность активного выявления гетерозиготных носителей с последующим их медико-генетическим консультированием, что является эффективным способом профилактики МВ. На основании данных, полученных в ходе исследования спектра и частоты мутаций гена CFTR у больных МВ в Краснодарском крае, нами оптимизирован алгоритм молекулярно-генетической диагностики гена CFTR в крае (табл. 4), что приобретает особую значимость в связи с началом массового скрининга новорождённых детей на муковисцидоз во всех регионах РФ.

Таблица 2

Распределение спектра мутаций в гене CFTR в Краснодарском крае

в зависимости от национальности и типа брака родителей

Национальность Исследовано хромосом Спектр мутаций
F508del CFTRdele 2,3(21kb) 3849+10kb CT 2183AAG 2184insA N1303К 2143delT L138ins W1282X R117H R117C E92K G542X G85E R347P 4006-19del3 Неизвестная
Однонациональные браки
Русские (n=62) n 124 49 7 8 2 2 3 2 2 2 - - - 1 1 1 1 43
% 70,7 27,9 4,0 4,5 1,1 1,1 1,7 1,1 1,1 1,1 - - - 0,6 0,6 0,6 0,6 24,4
Украинцы (n=1) n 2 2 - - - - - - - - - - - - - - - -
% 1,1 1,1 - - - - - - - - - - - - - - - -
Армяне (n=2) n 4 - - - 4 - - - - - - - - - - - - -
% 2,2 - - - 2,3 - - - - - - - - - - - - -
Адыги (n=2) n 4 - - - - - - - - - - 1 - - - - - 3
% 2,2 - - - - - - - - - - 0,6 - - - - - 1,7
Др.национальности (n=2) n 4 - - - - - - - - - - - - - - - - 4
% 2,2 - - - - - - - - - - - - - - - - 2,2
Всего: (n=69) n 138 51 7 8 6 2 3 2 2 2 - 1 - 1 1 1 1 50
% 78,4 29,0 4,0 4,5 3,4 1,1 1,7 1,1 1,1 1,1 - 0,6 - 0,6 0,6 0,6 0,6 28,3
Межнациональные браки
Славяне (русские, украинцы, белорусы) n 33 18 2 - - 1 - - - - - - 1 - - - - 11
% 18,7 10,2 1,1 - - 0,6 - - - - - - 0,6 - - - - 6,3
Другие национальности n 5 1 - - - - - - - - 1 - - - - - - 3
% 2,9 0,6 - - - - - - - - 0,6 - - - - - - 1,7
Всего: (n=19) n 38 19 2 - - 1 - - - - 1 - 1 - - - - 14
% 21,6 10,8 1,1 - - 0,6 - - - - 0,6 - 0,6 - - - - 8,0

Таблица 3

Распределение спектра мутаций гена CFTR по происхождению в краснодарской популяции

Происхождение аллелей в зависимости от типа брака Исследовано хромосом Спектр мутаций
F508del CFTRdele 2,3 (21kb) 3849+10kb CT 2183AAG 2184insA N1303К 2143delT L138ins W1282X R117H R117C E92K G542X G85E R347P 4006-19del3 Неизвестная
Эндогамный: n 84 31 3 5 - - 1 1 - 1 1 1 1 - 1 - 1 37
% 47,7 17,6 1,7 2,8 - - 0,6 0,55 - 0,6 0,6 0,6 0,6 - 0,6 - 0,6 20,85
в одном районе края n 52 19 - 2 - - - 1 - - 1 1 1 - 1 - - 26
% 29,5 10,8 - 1,1 - - - 0,55 - - 0,6 0,6 0,6 - 0,6 - - 14,65
в разных районах края n 32 12 3 3 - - 1 - - 1 - - - - - - 1 11
% 18,2 6,8 1,7 1,7 - - 0,6 - - 0,6 - - - - - - 0,6 6,2
Гетерогамный: n 92 39 6 3 6 3 2 1 2 1 - - - 1 - 1 - 27
% 52,3 22,2 3,4 1,7 3,4 1,7 1,1 0,6 1,1 0,6 - - - 0,6 - 0,6 - 15,3
хромосомы из края n 22 9 3 2 - 1 - - - 1 - - - - - - - 6
% 12,5 5,1 1,7 1,1 - 0,55 - - - 0,6 - - - - - - - 3,45
хромосомы из др. регионов России n 70 30 3 1 6 2 2 1 2 - - - - 1 - 1 - 21
% 39,8 17,1 1,7 0,6 3,4 1,1 1,1 0,6 1,1 - - - - 0,6 - 0,6 - 11,9
Всего хромосом: n 176 70 9 8 6 3 3 2 2 2 1 1 1 1 1 1 1 64
% 100,0 39,8 5,1 4,5 3,4 1,7 1,7 1,1 1,1 1,1 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 36,3
из районов края n 106 40 6 7 - 1 1 1 - 2 1 1 1 - 1 - 1 43
% 60,2 22,7 3,4 3,9 - 0,55 0,6 0,55 - 1,1 0,6 0,6 0,6 - 0,6 - 0,6 24,3
из регионов России n 70 30 3 1 6 2 2 1 2 - - - - 1 - 1 - 21
% 39,8 17,1 1,7 0,6 3,4 1,15 1,1 0,55 1,1 - - - - 0,6 - 0,6 - 12,0

Таблица 4

АЛГОРИТМ

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ МУКОВИСЦИДОЗА

I. ДЕТЕКЦИЯ МУТАЦИИ F508del

100% ИНФОРМАТИВНОСТЬ 50% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

0% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

II. ДЕТЕКЦИЯ ДИАГНОСТИЧЕСКИ-ЗНАЧИМЫХ МУТАЦИЙ

CFTRdele2,3(21kb) 3849+10kbCT _ 2183AAG_

100% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

50% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

0% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

III. ДЕТЕКЦИЯ РЕДКИХ ДИАГНОСТИЧЕСКИ-ЗНАЧИМЫХ МУТАЦИЙ

L138ins 2184insA 2143delT W1282X N1303K

100% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

50% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

0% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

IV. ДЕТЕКЦИЯ РЕДКИХ МУТАЦИЙ

G85E R117H R117C E92K R347P G542X 4006-19del3

100% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

50% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

0% ИНФОРМАТИВНОСТЬ

V. ПОИСК ДРУГИХ РЕДКИХ МУТАЦИЙ

ВЫВОДЫ

  1. Дана оценка частота муковисцидоза среди новорождённых детей в Краснодарском крае за период 1994-2005г.г., которая составила 1:10888 (54:587946). Полученные результаты сопоставимы с аналогичными исследованиями в российских популяциях.
  2. По результатам исследования ДНК больных МВ идентифицировано 16 мутаций: F508del – 39,8%, CFTRdele2,3(21kb) – 5,1%, 3849+10kbCT – 4,5%, 2183AAG – 3,4%, 2184insA – 1,7%, N1303K – 1,7%, L138ins – 1,1%, 2143delT – 1,1% и W1282X – 1,1%; частота мутаций G85E, R117H, R117C, E92K, R347P, G542X и 4006-19del3 менее 1,0%.
  3. Впервые зарегистрированы шесть мутаций, которых ранее не диагностировали у больных МВ на территории Российской Федерации: G85E (3 экзон), R117H, R117C и E92K (4 экзон), 2183AAG (13 экзон), 4006-19del3 (19 интрон).
  4. Установлены различия в характере распределения полиморфных аллелей и генотипов внутригенных маркеров гена CFTR (IVS6aGATT, M470V, TUB18, TUB20) и внегенных маркеров (XV.2C, KM.19, J3.11, Met H) в выборках нормальных и мутантных хромосом.
  5. Основной клинической формой МВ у больных в Краснодарском крае является смешанная форма (65,0%), лёгочная составила – 19,0%, а кишечная – 16,0%. По тяжести течения основной являлась средняя степень – 54,0%, тяжёлая отмечена в 31,0%, лёгкая – 15,0%. Установлена корреляция между мутациями в гене CFTR и клиническими формами МВ: у больных, имеющих две "тяжёлые" мутации преобладает смешанная форма (78,0%), а кишечный синдром отмечен у 93,0% пациентов; для больных, имеющих одну "мягкую" мутацию характерна высокая доля лёгочной формы (44,0%).
  6. Доля полностью информативных семей при анализе гена CFTR и по всем изученным маркерным системам составила 55,0%, что позволяет осуществлять пренатальную диагностику МВ и выявлять гетерозиготных носителей мутаций гена CFTR в семьях высокого риска МВ.
  7. Создан краевой регистр семей отягощённых муковисцидозом и банк данных мутаций гена CFTR зарегистрированных на территории края. Разработан и внедрён в практику медико-генетической службы края алгоритм молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза.

РЕКОМЕНДАЦИИ

по использованию

“Алгоритма молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза”

по результатам исследования в Краснодарском крае

Алгоритм молекулярно-генетической диагностики муковисцидоза включает 7 этапов:

1 этап – осуществляется поиск частой мутации F508del гена CFTR методом HА в 10,0%-м ПААГ.

2 этап – проводиться поиск частых диагностически значимых мутаций – CFTRdele2,3(21kb), 3849+10kbCT и 2183AAG методами HА и ПДРФ и с последующим секвенированием образцов при вероятном обнаружении мутации 2183AAG, которые в Краснодарском крае зарегистрированы с частотой 3,4-5,1%.

3 этап – поиск менее диагностически значимых мутаций, встречающихся с частотой от 1,1% до 1,7% – L138ins, 2143delT, 2184insA, W1282X и N1303K, методами HА и ПДРФ с последующим уточнением нуклеотидной последовательности.

4 этап – проводится диагностика 6 редких мутаций, встречающихся с относительной частотой 0,6%, 5 из них (G85E, R117H, R117C, R347P и G542X) которые диагностируются по потере сайтов рестрикции, а мутация 4006-19del3 – методом HА. Верификация всех 6 мутаций выполняется методом секвенирования.

На 5 этапе проводится поиск других редких мутаций, не определённых данным исследованием на этапах 1–4, с применением более информативного метода анализа однонитевых конформационных изменений (SSCP) и последующим уточнением методом секвенирования.

6 и 7 этапы диагностики включают поиск внутригенных (IVS6aGATT, M470V, TUB18, TUB20) и внегенных (XV.2C, KM.19, J3.11, MetH) маркерных систем, информативных для пренатальной диагностики плода МВ в конкретной семье.

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

МВ – муковисцидоз

ПААГ – полиакриламидный гель

ПДРФ – полиморфизм длины рестрикционных фрагментов

ПЦР – полимеразная цепная реакция

цАМФ – циклический аденозинмонофосфат

ЭДТА – этилендиаминтетрауксусная кислота

CF – cystic fibrosis – кистозный фиброз

CFTR – cystic fibrosis transmembrane conductance regulator – ген трансмембранного регуляторного белка муковисцидоза

SSCP – single strand conformation polymorphism – метод анализа конформационного полиморфизма однонитевой ДНК

HA – heteroduplex analysis – гетеродуплексный анализ

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

  1. Рукавичкин Д.В. Анализ вариантов молекулярно-генетического полиморфизма гена CFTR в Краснодарском крае. // III Всероссийская университетская научно-практическая конференция молодых учёных и студентов по медицине: сборник материалов.- Тула, 2004- С. 209-210.
  2. Голубцов В.И., Рукавичкин Д.В., Шадрин С.А. Варианты молекулярно-генетического полиморфизма муковисцидоза у больных в Краснодарском крае. // Фундаментальные исследования: академия естествознания.- Москва, 2004- №1.- С. 46-47.
  3. Рукавичкин Д.В. Анализ генетического полиморфизма у больных муковисцидозом в Краснодарском крае. // XXXI научная конференция студентов и молодых учёных ВУЗов Южного федерального округа, посвящённая 35-летию Кубанского государственного университета физической культуры, спорта и туризма.- Краснодар, 2004- Ч.1.- С. 180-181.
  4. Голубцов В.И., Лазарев К.Ю., Рукавичкин Д.В. О молекулярно-генетической диагностике гена муковисцидоза в Краснодарском крае. // Сборник материалов Всероссийской научно-практической конференции “Здоровье матери и ребёнка”.- Краснодар, 2004- С. 94-96.
  5. Голубцов В.И., Рукавичкин Д.В. Гено-фенотипические варианты муковисцидоза в Краснодарском крае. // Медицинская генетика: материалы V съезда Российского общества медицинских генетиков.- Москва, 2005- Т.4, №4.- С. 174.
  6. Голубцов В.И., Рукавичкин Д.В., Шадрин С.А., Брисин В.Ю. Изучение мутаций гена муковисцидоза у больных в Краснодарском крае. // Кубанский научный медицинский вестник.- Краснодар, 2005- №3-4 (76-77).- С. 75-77.
  7. Рукавичкин Д.В., Голубцов В.И. Генотипический полиморфизм муковисцидоза в Краснодарском крае. // III международный постоянно действующий конгресс “Экология и дети – Медико-экологические и социально-экономические проблемы, пути их решения”: сборник материалов.- Анапа, 2006- С. 150-151.
  8. Голубцов В.И., Рукавичкин Д.В., Морданов С.В., Куцев С.И. Варианты полиморфизмов 4-го экзона гена CFTR у больных муковисцидозом в Краснодарском крае. // Кубанский научный медицинский вестник.- Краснодар, 2006- №12 (93).- С. 6-9.
  9. Голубцов В.И., Рукавичкин Д.В., Морданов С.В., Куцев С.И. Редкие мутации гена CFTR у больных муковисцидозом в Краснодарском крае. // Медицинская генетика.- Москва, 2007- Т.6, №9.- С. 15-19.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.