WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Штаммы vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности

На правах рукописи

ЗАДНОВА Светлана Петровна

ШТАММЫ VIBRIO CHOLERAE С ИЗМЕНЕННОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ

ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ

03.00.07 - микробиология

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

САРАТОВ - 2009

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные консультанты:

Член-корреспондент Российской Академии

медицинских наук,

доктор медицинских наук, профессор Кутырев Владимир Викторович

Доктор биологических наук, профессор Смирнова Нина Ивановна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Швиденко Инна Григорьевна

Доктор медицинских наук, профессор Замараев Валерий Семенович

Доктор биологических наук, профессор Тараненко Татьяна Михайловна

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии медицинских наук «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н.Ф.Гамалеи РАМН»

Защита состоится «_____» ______________2009 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.078.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (410005,

г. Саратов, ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб».

Автореферат разослан «____»_____________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник А.А. Слудский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Распространение холеры в странах Азии, Африки и Латинской Америки свидетельствует о том, что эта инфекция по-прежнему остается угрозой для многих стран, включая и Российскую Федерацию (Онищенко с соавт., 2005; Кутырев, 2008; Ломов с соавт., 2008). Важным и перспективным направлением в решении проблемы холеры является изучение генетических основ изменчивости вирулентных свойств возбудителя. О большой вариабельности генома этого патогена свидетельствует тот факт, что в процессе эволюции сформировано три эпидемически опасных варианта Vibrio cholerae: О1 серогруппы классического биовара, О1 серогруппы эльтор биовара и О139 серогруппы (Бароян, 1971; Ломов, 2004; Смирнова, Кутырев, 2004; Finkelstein, 1973; Kaper et al., 1995; Matson et al., 2007).

Очевидная необходимость проведения исследований по проблеме изменчивости V. cholerae определяется и тем, что в связи с изменяющимися экологическими условиями постоянно растет частота выделения природных атипичных штаммов возбудителя холеры. Особый интерес вызывает процесс образования природных штаммов с повышенной вирулентностью (Смирнова с соавт., 2008; Albert et al., 1993; Sharma et al., 1997; Davis et al., 1999; Nair et al., 2002, 2006; Faruque et al., 2003, 2007; Safa et al., 2005, 2008; Raychoudhuri et al., 2009). Структурно-функциональный анализ таких изолятов может обеспечить получение фундаментальных знаний о новых механизмах формирования штаммов с ранее неизвестными свойствами. Более того, на их основе возможен поиск новых способов генодиагностики природных штаммов с измененной вирулентностью для осуществления адекватного мониторинга внешней среды с целью прогнозирования эпидемических ситуаций.

Поскольку возбудитель холеры может существовать как в инфицированном макроорганизме (человек), так и в природных экосистемах, то другая важная проблема состоит в изучении взаимосвязи между синтезом факторов вирулентности и персистенции V. cholerae, так как этот вопрос остается малоизученным. Так, в последние годы интенсивно изучается механизм обратимых фазовых вариаций, которые выражаются в переключении биосинтеза экзополисахарида или EPS (от англ. – exopolysaccharide), обеспечивающего выживаемость клеток во внешней среде в составе биопленки (Yildiz et al., 2001; Ali et al., 2002). При этом у клонов, продуцирующих экзополисахарид, снижается уровень биосинтеза ряда факторов патогенности (Yildiz et al., 2004). Вместе с тем единичные сообщения на эту тему не дают полного представления об изменении экспрессии генов вирулентности при адаптации возбудителя холеры к меняющимся условиям окружающей среды. Отсутствуют данные о сигналах внешней среды, приводящие к репрессии факторов патогенности при росте клеток в неблагоприятных условиях. Остается неясным, при каких условиях окружающей среды осуществляется переключение экспрессии генов патогенности V. cholerae, определяющее появление у возбудителя вирулентных свойств. Между тем выявление факторов внешней среды, обеспечивающих индукцию экспрессии факторов вирулентности в природных популяциях, может внести существенный вклад в повышение эффективности мониторинга внешней среды.

Еще одной не менее важной является проблема экспрессии резидентных генов патогенности в бактериальных клетках, получивших дополнительный генетический материал (различные плазмиды, транспозоны, бактериофаги). До недавнего времени считалось, что рекомбинантные плазмиды с клонированными генами различных факторов патогенности при введении их в клетки реципиентных штаммов определяют повышенный уровень продукции белков, биосинтез которых кодируется этим дополнительным генетическим материалом. Проведение интенсивных исследований в этом направлении привело к созданию штаммов-продуцентов холерного токсина и его В-субъединицы (Янишевский, 1986; Ильина с соавт., 1987; Филькова с соавт., 1988; Смирнова, 1989; Чеховская, Смирнова, 1994; Захарова, 1997; Ерошенко, 2004; Faruque et al., 2000). В тоже время сведения об изменении экспрессии хромосомных генов, определяющих продукцию других факторов патогенности в клетках, содержащих плазмидный геном, практически отсутствуют. Геномный и протеомный анализ таких штаммов будет основой для понимания ранее неизвестных путей регуляции экспрессии важнейших генов патогенности в новом генетическом окружении. Полученные фундаментальные знания открывают новые подходы для создания штаммов с повышенной продукцией одновременно нескольких протективных антигенов. Такие штаммы могут быть использованы для изготовления современных диагностических и профилактических препаратов.

Цель работы – молекулярно-генетический и биохимический анализ природных и генетически модифицированных штаммов V. cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности и создание на их основе штаммов-продуцентов основных протективных антигенов.

Задачи исследования:

  1. Изучить популяционный состав природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров для выявления фенотипических вариантов с координировано измененным уровнем продукции факторов патогенности и персистенции. Создать коллекцию изогенных штаммов с разным уровнем экспрессии ключевых генов вирулентности.
  2. Провести сравнительный анализ фено- и генотипических свойств двух типов изогенных вариантов природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров, различающихся по продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар) и подвижности (Mot). Выделить, очисть и изучить моносахаридный состав экзополисахарида модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара.
  3. Провести сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов (EPS++Тох+Нар++Mot++ и EPS+Тох++Нар+Mot+) модельного штамма V. cholerae Дакка 35. Выяснить роль отдельных белков и экзополисахарида в адаптации клеток к неблагоприятным условиям окружающей среды.
  4. Выявить факторы внешней среды, вызывающие координированное переключение экспрессии различных генов вирулентности и персистенции в клетках V. cholerae классического биовара.
  5. Изучить влияние рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 на экспрессию хромосомных генов V. cholerae классического биовара, включая ключевые гены вирулентности и иммуногенности.
  6. Сравнить протеомные профили исходного и содержащего рекомбинантную плазмиду рСТ105::mini-kan модельного штамма V. cholerae классического биовара с целью выявления различий в содержании белков, являющихся факторами патогенности или определяющими жизнеспособность клеток.
  7. Сконструировать содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией одновременно трех основных антигенов, обладающих протективными свойствами – холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена. Определить оптимальные условия их глубинного культивирования для получения этих антигенов.
  8. Создать экспериментальную многокомпонентную иммуноферментную диагностическую тест-систему для выяснения антигенного состава химических вакцин и оценки экспрессии основных генов патогенности у природных штаммов V. cholerae О1 серогруппы. Определить ее специфичность, эффективность и диагностическую ценность.

Научная новизна исследования:

Впервые при изучении популяционного состава природных штаммов холерного вибриона эльтор и классического биоваров выявлены штаммы, имеющие в популяции два типа клонов, различающихся одновременно несколькими фенотипическими свойствами: морфологией колоний, продукцией холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижностью. Впервые установлено, что экспрессия генов, определяющих разные фенотипы клеток, имеет координированный характер. Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаружен экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и содержащий рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток при действии осмотического и оксидативного стрессов.

При проведении сравнительного протеомного анализа двух фенотипически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 впервые выявлено изменение содержания в клетках ферментов и белков внешней мембраны, играющих важную роль в их метаболизме и выполняющих защитную функцию. Показано, что смена популяционного состава штамма по фенотипу либо повышает его устойчивость к воздействиям повреждающих факторов внешней среды, либо усиливает вирулентность.

Впервые выявлено, что одним из главных факторов, стимулирующих координированное переключение экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности в штаммах холерного вибриона классического биовара, является щелочная (рН 9,0) реакция среды.

На основании сравнительного анализа протеомов впервые обнаружено, что введение в клетки штаммов V. cholerae классического биовара рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности CTX и RS1, приводит к изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих белки, участвующие в патогенезе, транспорте, энергетическом и метаболическом обменах, входящих в состав внешней мембраны. В результате проведенных исследований впервые выявлена панель белков, кодируемых хромосомными генами (ctxAB, tcpA-F, ompU, hapA), повышение содержания которых характерно для штаммов, содержащих рекомбинантную плазмиду. Впервые установлено, что в присутствии указанной плазмиды в клетках токсигенных штаммов классических вибрионов увеличение экспрессии хромосомных генов tcpA-F и ompU происходит за счет усиления активности глобального регуляторного гена toxR.

Впервые получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара сероваров Инаба (2415 и КМ207) и Огава (2414 и КМ206), отличающиеся от штаммов, используемых в производстве таблетированной холерной химической вакцины «холероген-анатоксин+О-антиген» (569В Инаба и М41 Огава), повышенной продукцией одновременно трех протективных антигенов – холерного токсина или СТ (от англ. – cholera toxin), токсин-корегулируемых пилей адгезии или ТСР (от англ. – toxin-coregulated pilus) и О1 антигена. Приоритетность работы в данном направлении подтверждена получением 4-х патентов РФ на изобретения: № 2169187 (приоритет от 26.04.2000 г.) «Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава – продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2193598 (приоритет от 26.07.2001 г.) «Штамм бактерий Vibrio сholerae KM200-продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии»; № 2222595 (приоритет от 15.07.2002 г.) «Штамм бактерий Vibrio сholerae KM206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов»; № 2222594 (приоритет от 15.07.2002 г.) «Штамм бактерий Vibrio сholerae KM207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов».

Выявлены особенности экспрессии генов, кодирующих указанные протективные антигены, при глубинном культивировании штаммов-продуцентов. Определены оптимальные условия продукции ими протективных антигенов и экспериментально доказана целесообразность использования сконструированных штаммов для получения указанных белков и липополисахаридов в условиях производства. Приоритетность работы по получению очищенных протективных антигенов подтверждена патентом РФ № 2324740 (приоритет от 11.07.2006 г.) на способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара.

Впервые создана эффективная и специфичная экспериментальная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система, включающая четыре очищенных протективных антигена (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, О1 антиген Инаба, О1 антиген Огава) и четыре поликлональные антисыворотки к ним, позволяющая оценивать экспрессию основных генов патогенности в природных штаммах V. cholerae О1 серогруппы для уточнения их эпидемической значимости.

Практическая ценность и формы внедрения:

В Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» депонировано 16 штаммов V. cholerae классического биовара сероваров Огава и Инаба, из которых 6 - продуценты холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии; 8 штаммов характеризуются координированным переключением экспрессии трех генов (mot, hap, vps), связанных с вирулентностью; 2 штамма - инсерционные мутанты, утратившие способность продуцировать холерный токсин при внедрении транспозона TnphoA (Kmr) в бактериальный геном.

Результаты исследований использованы в следующих документах:

- Практическое руководство «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней». Под ред. академика РАМН, профессора Г.Г. Онищенко, чл-корр. РАМН, профессора В.В. Кутырева. – М: ОАО Издательство «Медицина», Издательство «Шико», 2009.

- Методические указания МУК 4.2.2218—07 «Лабораторная диагностика холеры», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 31 мая 2007 г. и введенные в действие с 1 августа 2007 г. взамен методических указаний «Лабораторная диагностика холеры» МУ 4.2.1097—02.

- Методические рекомендации «Создание штаммов холерного вибриона классического биовара – продуцентов протективных антигенов», одобренные Ученым Советом (протокол № 4 от 13.04.2004 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (14.04.2004 г.).

- Методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенности и персистенции», одобренные Ученым Советом (протокол № 7 от 27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

- Методические рекомендации «Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU холерного вибриона классического биовара», одобренные Ученым Советом (протокол № 7 от 27.06.2006 г.) и утвержденные директором РосНИПЧИ «Микроб» (29.06.2006 г.).

Сконструированные содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы-продуценты одновременно трех основных протективных антигенов холерного вибриона (В-субъединицы в составе холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, О1 антигена серовара Огава или О1 антигена серовара Инаба) используются в научных и производственных лабораториях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» при проведении молекулярно-генетических исследований по изучению механизмов регуляции экспрессии генов вирулентности и иммуногенности холерного вибриона и при получении очищенных ключевых протективных антигенов.

Материалы диссертации включены в курс лекций по современной микробиологии холеры на курсах первичной специализации врачей по особо опасным инфекциям при ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб».

Положения, выносимые на защиту:

1. Популяция ряда природных штаммов V. cholerae эльтор и классического биоваров содержит два типа клонов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные и мутные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Изменение морфологии колоний изогенных вариантов V. cholerae обоих биоваров связано с продукцией клетками экзополисахаридного слоя. Продуцирующие экзополисахарид холерные вибрионы эльтор биовара (EPS++) отличаются от изогенных (EPS+) вариантов меньшей подвижностью, повышенным уровнем биосинтеза холерного токсина, но сниженной продукцией растворимой гемагглютинин/протеазы. Для классических холерных вибрионов характерна обратная связь между экспрессией названных факторов вирулентности.

2. Присутствующий на поверхности клеток модельного штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара экзополисахаридный слой содержит рамнозу, глюкозу, галактозу и гексозамин. Экзополисахарид повышает устойчивость клеток к действию осмотического и оксидативного стресса.

3. Два фенотипически разных варианта модельного штамма V. cholerae Дакка 35 имеют разные протеомы. Среди 841 выявленного белка идентифицировано 57 белков с повышенным или пониженным содержанием в клетках. В клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Тох++Нар+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

4. Щелочная (рН 9,0) реакция среды является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности. Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её резистентности к действию неблагоприятных факторов окружающей среды.

5. Геном рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности CTX и RS1, при введении его в клетки V. cholerae cholerae, согласно данным сравнительного протеомного анализа, изменяет экспрессию различных хромосомных генов, включая гены, кодирующие белки, являющиеся важными факторами патогенности и иммуногенности (ТСР и OmpU), и участвующими в энергетическом обмене, процессах метаболизма, цитокинезиса, транспорта, входящих в состав внешней мембраны.

6. Получены содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов – холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена. Определены оптимальные параметры их выращивания для получения протективных антигенов в полупроизводственных условиях.

7. Создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, состоящая из 4-х очищенных протективных антигенов холерного вибриона (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, О1 антиген Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Указанная тест-система перспективна при оценки экспрессии основных генов патогенности у природных штаммов V. cholerae О1 серогруппы.

Апробация работы.

Материалы диссертации представлены на интернациональном симпозиуме «Биомедицинская оптика» (Сан-Хосе, США, 1999), ХIХ Российской конференции по электронной микроскопии «ЭМ2002» (Черноголовка, 2002), 8 Российской научно-практической конференции по проблеме «Холера» (Ростов-на-Дону, 2003), III съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров России «Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), III конференции молодых ученых России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), I Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2004), ХIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005), III Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), VII Межгосударственной научно-практической конференции «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств – участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), пятом съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009), а также на совещаниях проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы» Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (Ростов-на-Дону, 2005-2007) и ежегодных научных конференциях ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб» (Саратов, 1999-2009).

Публикации по теме исследования.

По теме диссертации опубликовано 47 научных работ, из них 22 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК, 4 статьи в зарубежных изданиях, 5 патентов на изобретения, 10 тезисов в сборниках международных и Российских конференций.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 239 листах компьютерного текста, состоит из введения, обзора литературы, семи глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, включающего 514 ссылок, из них 413 зарубежных и 101 отечественных авторов. Работа иллюстрирована 21 таблицей и 45 рисунками.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы и методы. В работе использовали 146 штаммов V. cholerae О1 серогруппы (эльтор и классического биоваров), 4 штамма О139 серогруппы и 13 штаммов других бактерий, полученных из Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб», а также рекомбинантные плазмиды с клонированными генами патогенности V. cholerae. Применяли традиционные и современные микробиологические, биохимические, генетические, молекулярно-биологические и электронно-микроскопические методы исследования. Культивирование бактерий и изучение их фенотипических свойств проводили общепринятыми методами. Наличие ТСР выявляли визуально при постановке реакции самоагглютинации бактерий (Chiang et al., 1995) и методом иммуноблоттинга (Towbin et al., 1979). Продукцию секретируемого СТ определяли с помощью радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде (Шагинян, Маракуша, 1983; Bramucci, Holmes, 1978) и иммуноферментным методом GM1 ELISA (Svennerholm, Wiklund, 1983). Коньюгационные скрещивания проводили по методу D. E. Bradley et al. (1980). Плазмидный состав штаммов определяли по (Kado, Liu, 1981). Электрофоретическое разделение белков проводили по методу U. K. Laemmli et al. (1970). Присутствие полисахаридов выявляли окрашиванием полиакриламидных гелей после проведения электрофореза ионами серебра. Выделение экзополисахаридного материала с поверхности клеток осуществляли по методике, описанной L. R. Evans и A. Linker (1973). Количественное содержание полисахаридов определяли с помощью антронового реактива (Захарова, Косенко, 1982). Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили по стандартной методике (Захарова, Косенко, 1982). Изучение поверхностных структур клеток проводили методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии (Mudd, Anderson, 1942). При постановке двумерного фореза руководствовались методикой, описанной у P. H. O’Farrell (1975), идентификацию белков по наборам значений масс пептидов после трипсинолиза проводили с использованием программы «Mascot» (США), поиск идентичных последовательностей осуществляли по базе данных NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), работа проводилась совместно с сотрудниками протеомного центра при ГУ Научно-исследовательском институте Биомедицинской химии им. В. Н. Ореховича РАМН (г. Москва). Выделение геномной ДНК, рестрикцию нуклеазами, ДНК-ДНК гибридизацию осуществляли в соответствии с описанными рекомендациями (Маниатис с соавт., 1984). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических праймеров осуществляли по К. Hoshino et al. (1998). Секвенирование ДНК проводили по методу F. Sanger et al. (1977) с использованием прямых и обратных праймеров на соответствующие гены. Статистическую обработку проводили по рекомендациям Н. А. Плохинского (1970).

Результаты исследований

1. Выявление и фенотипический анализ природных штаммов V. cholerae, содержащих в популяции клоны с координировано измененной экспрессией факторов патогенности и персистенции.

В гетерогенной популяции холерных вибрионов большой интерес представляют варианты, отличающиеся от типичных форм одновременно по нескольким свойствам. Появление таких клонов может быть связано с согласованным изменением экспрессии ряда генов, что является одним из важных механизмов адаптации этого патогена к меняющимся условиям среды обитания. Для выявления штаммов, имеющих в популяции варианты с одновременным изменением продукции ряда факторов патогенности и персистенции, был изучен популяционный состав 41 штамма V. cholerae биовара эльтор, выделенных в разное время и на различных территориях от больных людей и из внешней среды. В первую очередь проводилось изучение морфологии колоний, поскольку морфологические изменения могут сопровождаться изменением других признаков, включая свойства, определяющие вирулентность популяции (van der Woude, Bumler, 2004). В результате фенотипического анализа популяций было выявлено две группы штаммов. В первую входило 28 (70 %) штаммов, характеризующихся однородным популяционным составом относительно морфологии колоний и состоящих из клеток, формирующих типичные прозрачные колонии. Вторая группа была представлена 12 штаммами (30 %), в популяции которых были обнаружены опалесцирующие (мутные) колонии, находящиеся в S форме. В отличие от раннее описанных гладких (S) и шероховатых (R) форм холерного вибриона прозрачные колонии, согласно данным литературы, были обозначены как T (от англ. - translucent), а мутные как O (от англ. - opaque). Затем у T и O вариантов была изучена продукция СТ, растворимой гемагглютинин/протеазы (Hap), гемолизина (Hly), а также подвижность (Mot). В результате было выявлено 7 штаммов, у которых вариабельность морфологии колоний сопровождалась изменением продукции 2-4-х факторов патогенности. Наибольший интерес представляли популяции штаммов М-1085, С-418 и М-1326, содержащие колонии двух типов, которые одновременно отличались по четырем признакам: уровню продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности (таблица 1). O варианты синтезировали большее количество СТ, но меньше гемолизина, растворимой гемагглютинин/протеазы и были менее подвижны, чем Т варианты, поэтому их фенотип был обозначен как O Тох++Hly+Hap+Mot+. В то же время для Т вариантов был характерен координированный альтернативный уровень экспрессии указанных факторов патогенности – сниженная продукция СТ, увеличенный синтез Hly, Нар, а также повышенная подвижность. В этой связи фенотип данных вариантов был обозначен как Т Тох+Hly++Hap++Mot++ (таблица 1). Полученные нами экспериментальные результаты относительно синтеза СТ и гемолизина у Т и О вариантов эльтор вибрионов согласуется с данными литературы (Finkelstein et al., 1992; 1997). В тоже время сведения о разном уровне продукции Нар и подвижности у Т и О вариантов получены нами впервые.

На следующем этапе был изучен популяционный состав 105 природных штаммов холерного вибриона классического биовара. Среди них было выявлено также две группы штаммов. В первую группу входило 80 штаммов (76,2 %), содержащих только Т варианты, вторая включала 25 штаммов (23,8 %), в популяции которых наряду с Т вариантами присутствовали и О. Среди штаммов второй группы было выявлено 12 изолятов, морфология колоний которых коррелировала с изменением уровня продукции 2-4-х факторов патогенности. Особое внимание привлекли штаммы V. cholerae Дакка 35, 9361, B-1307, 49520, два типа колонии которых отличались по четырем фенотипическим свойствам – морфологии колоний, продукции СТ, Нар, а также подвижности (таблица 1).

Таблица 1 - Фенотипические свойства двух морфологически различных вариантов V. cholerae эльтор и классического биоваров.

Штамм V. cholerae ФЕНОТИП
Синтез СТ (по данным GM1 ELISA), мкг/мл Продукция гемолизина, мм* Подвижность, мм** Продукция Hap, мм*** Морфология колоний
Холерные вибрионы биовара эльтор
М-1085 0,01±0,006 3,0±0,4 5,0±0,5 5,0±0,5 Т
0,17±0,005 1,0±0,4 2,0±0,3 3,0±0,5 О
С-418 0,02±0,005 3,0±0,2 10,0±0,4 3,0±0,3 Т
0,06±0,02 1,0±0,5 1,0±0,3 2,0±0,4 О
М-1326 0,02±0,005 4,0±0,5 10,0±0,5 3,0±0,2 Т
1,1±0,05 2,0±0,5 1,0±0,3 2,0±0,6 О
Холерные вибрионы классического биовара
Дакка 35 13,0±1,0 0,0 2,0±0,2 2,0±0,5 T
0,3±0,1 0,0 8,0±0,5 6,0±0,5 O
9361 2,8±0,5 0,0 5,0±0,3 1,0±0,6 T
0,01±0,01 0,0 15,0±0,5 5,0±0,7 O
B-1307 3,0±0,5 0,0 3,0±0,2 3,0±0,5 T
0,02±0,01 0,0 10,0±0,5 6,0±0,4 O
49520 8,0±0,5 0,0 0,0 2,0±0,5 Т
0,02±0,004 0,0 1,0±0,2 3,0±0,5 О
Примечания: * - в мм дана ширина зоны гемолиза; ** - радиус распространения макроколонии в полужидком агаре; *** - в мм дана зона просветления на агаре с 10 % молоком; T - прозрачные, O - мутные колонии.

T клоны указанных штаммов были более токсигенны (по данным РПИГ), продуцировали незначительное количество Нар и были малоподвижными (таблица 1, рисунок 1), поэтому их фенотип был обозначен как Т Тох++Нар+Mot+. Как известно классические вибрионы не продуцируют гемолизин, поэтому изменений по данному признаку обнаружено не было. Вместе с тем для О вариантов был характерен координированный альтернативный уровень продукции указанных факторов патогенности – сниженный синтез СТ, высокий уровень биосинтеза Нар и значительная подвижность (таблица 1, рисунок 1). Фенотип данных вариантов был обозначен как О Тох+Нар++Mot++. Использование иммуноферментного метода GM1 ELISA полностью подтвердило выявленные методом РПИГ различия в продукции СТ между О и Т клонами (таблица 1).

A - продукция холерного токсина (РПИГ); Б – подвижность; В - продукция растворимой гемагглютинин/протеазы. Штамм V.  cholerae 569В взят в качестве положительного контроля.

Рисунок 1 - Фенотипические свойства Т Тох++Нар+Mot+ и О Тох+Нар++Mot++ клонов штамма V. cholerae Дакка 35.

Обнаруженная обратная связь между морфологией колоний классических и эльтор вибрионов и продукцией ими изученных факторов патогенности (СТ, Нар и подвижности), возможно, является следствием различной регуляции генов, кодирующих указанные факторы патогенности у холерных вибрионов разных биоваров (DiRita et al., 1996; Kovacikova, Skorupski, 2000; Lee et al., 2001; Beyhan et al., 2006a; Silva et al., 2008; Tamayo et al., 2008).

Поскольку различия между колониями по четырем свойствам были наиболее выражены у штамма V. cholerae Дакка 35 классического биовара (таблица 1, рисунок 1), то именно этот штамм был выбран в качестве модельного для последующих экспериментов.

Вследствие большого значения CT в вирулентности холерных вибрионов, большой интерес представляло изучение механизма, определяющего различный уровень продукции этого белка у модельного штамма. В результате установлено, что сравниваемые Т Тох++Нар+Mot+ и О Тох+Нар++Mot++ варианты не отличались друг от друга по набору и числу копий структурных и регуляторных генов, кодирующих и регулирующих синтез CT. Однако при анализе секвенированного промотора гена ctxA были получены новые и важные сведения о числе тандемных повторов (TTTTGAT). Поскольку активация транскрипции оперона ctxAB происходит в результате связывания регуляторного белка ToxR или ToxT (Miller, Mekalanos, 1988; Prouty et al., 2005) с данными повторами, то уровень транскрипции указанных генов находится в прямой зависимости от их копийности. Оказалось, что в отличие от многих природных штаммов, имеющих 1-3 копии последовательности TTTTGAT, в промоторной области ctxAB штамма Дакка 35, независимо от фенотипа, содержалось шесть таких повторов (рисунок 2). Эти данные представляют значительный интерес, поскольку могут объяснить необычайно высокую экспрессию генов ctxAB у токсигенных клонов штамма Дакка 35, сопоставимую с таковой у известного штамма 569B, содержащего в промоторной области оперона ctxAB восемь копий названной последовательности (Miller, Mekalanos, 1984).

Обозначения: 1 - Т Тох++Нар+Mot+ вариант V. cholerae Дакка 35; 2 - О Тох+Нар++Mot++ вариант V. cholerae Дакка 35; 3 - V. cholerae 569В; 4 - V. cholerae N16961 (положительный контроль). Отсчет ведется от предполагаемой точки начала транскрипции.

Рисунок 2 - Секвенированная последовательность промоторной области гена ctxA штаммов холерного вибриона.

Таким образом, в результате анализа популяционного состава природных штаммов V. cholerae О1 серогруппы обнаружено три штамма классического и три штамма эльтор биовара, особенность которых заключалась в формировании двух морфологически разных вариантов, отличающихся друг от друга измененной экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции.

2. Выявление у V. cholerae классического биовара экзополисахаридного слоя и его биохимический анализ.

Для установления причины изменения морфологии колоний в штаммах холерного вибриона было проведено электронно-микроскопическое изучение поверхности двух вариантов V. cholerae Дакка 35. В результате было выявлено, что О Тох+Нар++Mot++ клетки окружены рыхлым слоем, который отсутствует у Т Тох++Нар+Mot+ клонов. Одной из причин появления дополнительного слоя на поверхности клеток холерного вибриона может быть продукция белков внешней мембраны и/или экзополисахарида (Swanson, 1978; Simpson et al., 1987; Wright et al., 1990; Finkelstein et al., 1992; Johnson et al., 1992; Comstock et al., 1995; Yildiz, Schoolnik, 1999). Однако при использовании электрофореза в полиакриламидном геле было выяснено, что вклад белков внешней мембраны в изменение морфологии колоний либо незначителен, либо эти поверхностные структуры не участвуют в указанном событии. В тоже время было обнаружено, что прозрачные и мутные клоны четко отличались друг от друга по содержанию полисахаридов. У О колоний классических и эльтор вибрионов регистрировалась нижняя зона полисахаридов, которая у Т колоний была значительно меньше или отсутствовала (рисунок 3).

1 2 3 4 5 6 7 8

Обозначения: 1 - Т Тох++Нар+Mot+ вариант Дакка 35; 2 - О Тох+Нар++Mot++ вариант Дакка 35; 3 - Т Тох++Нар+Mot+ вариант 9361; 4 - О Тох+Нар++Mot++ вариант 9361; 5 - Т Тох++Нар+Mot+ вариант B-1307; 6 - О Тох+Нар++Mot++ клон B-1307; 7 - Т Тох++Нар+Mot- вариант 49520; 8 - О Тох+Нар++Mot+ клон штамма 49520.

Рисунок 3 - Выявление полисахаридов в штаммах V. cholerae классического биовара (окраска азотнокислым серебром).

Полученные данные позволили предположить, что изменение морфологии колоний у О вариантов связано с синтезом дополнительного экзополисахаридного слоя. Для подтверждения данной гипотезы бактерии V. cholerae Дакка 35 были исследованы методом электронной микроскопии после их обработки красителем рутением красным, применяемым для обнаружения экзополисахарида у грамотрицательных бактерий (Johnson et al., 1992; Yildiz et al., 2001). Действительно О Тох+Нар++Mot++ варианты Дакка 35 окружены электронноплотным слоем окрашенных экзополисахаридов, тогда как у Т Тох++Нар+Mot+ вариантов такой слой почти отсутствовал (рисунок 4).

Обозначения: А - макроколония Т Тох++Нар+Mot+ варианта; Б – макроколония О Тох+Нар++Mot++ варианта. Стрелкой отмечен экзополисахаридный слой. Увеличение x30 000.

Рисунок 4 - Электронно-микроскопическая фотография двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35, окрашенных рутением красным.

Далее, экзополисахаридный слой был выделен с поверхности двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35. В препарате, полученным из О Тох+Нар++Mot++ вариантов, содержание полисахаридов составило 70 мкг/мл, а из Т Тох++Нар+Mot+ – 40 мкг/мл. Присутствие полисахаридов в препарате, выделенным из О Тох+Нар++Mot++ варианта, было подтверждено методом ВЭЖХ. Проведение сравнительного анализа моносахаридного состава экзополисахарида О Тох+Нар++Mot++ вариантов методом ТСХ при сравнении со стандартными углеводными метчиками показало присутствие в нем рамнозы, глюкозы, галактозы, гексозамина. В то же время в препарате, полученном из Т Тох++Нар+Mot+ вариантов, указанные моносахара присутствовали в следовых количествах. Согласно данным F. H. Yildiz и G. K. Schoolnik (1999) в составе EPS ругозных колоний V. cholerae биовара эльтор, помимо глюкозы и галактозы входят глюкозамин и манноза, отсутствующие в EPS классических вибрионов.

На основе полученных данных о выраженной продукции экзополисахарида O-клонами классических и эльтор вибрионов их фенотип был обозначен как EPS++, а T клонов - как EPS+.

Для выяснения функциональной роли экзополисахарида был проведен сравнительный анализ резистентности EPS++Тох+Нар++Mot++ и EPS+Тох++Нар+Mot+ клонов модельного штамма к действию неблагоприятных факторов внешней среды. В качестве стрессовых факторов использовались высокие концентрации NaCl (2,5 М), а также перекись водорода (20 мМ). В результате было обнаружено, что EPS++Тох+Нар++Mot++ варианты V. cholerae Дакка 35 более устойчивы к действию высоких концентраций соли и перекиси водорода по сравнению с EPS+Тох++Нар+Mot+. Эти сведения указывают на то, что продукция экзополисахарида холерными вибрионами классического биовара происходит, видимо, в результате их адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

3. Сравнительный анализ протеомов фенотипически разных вариантов V. cholerae классического биовара и выявление сигналов внешней среды, определяющих координированное изменение экспрессии генов вирулентности и персистентности.

Поскольку у холерных вибрионов координированная экспрессия факторов вирулентности и персистенции контролируется несколькими глобальными регуляторными системами, то изменение активности генов вирулентности может сопровождаться изменением уровня экспрессии генов, кодирующих белки с другими функциями. В этой был проведен двумерный гель-электрофорез белковых экстрактов клеток двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35. При компьютерном анализе протеомных карт был выявлен 841 белок. При сопоставлении протеомных профилей двух фенотипически разных вариантов были обнаружены 57 белков, экспрессия которых у EPS+Тох++Нар+Mot+ клонов была либо значительно выше, либо существенно ниже, чем у EPS++Тох+Нар++Mot++ вариантов. Оказалось, что в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ вариантов репрессировался синтез 26 белков и индуцировался синтез 31, тогда как в клетках EPS+Тох++Нар+Mot+ наблюдалась обратная картина. Для идентификации было выбрано 19 белков, экспрессия которых между двумя вариантами отличалась в 3,0 и более раз. Среди белков, содержание которых было повышено в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ вариантов, большой интерес представляли мембранные (OmpU, TolC) и цитоплазматические (с нитроредуктазной и антиоксидантной функцией) белки, которые обеспечивают защиту клеток от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды (рисунок 5, таблица 2). Более того, повышение в EPS++Тох+Нар++Mot+ вариантах более чем в 13 раз концентрации белка OmpU, но снижение почти в 5 раз содержания белка OmpT, биосинтез которых непосредственно контролируется глобальным регуляторным геном toxR, служит в пользу предположения о возможном участии этого гена не только в координированном изменении уровня экспрессии различных генов патогенности, но и других генов, обеспечивающих жизнеспособность клеток.

Обозначения: 62,63,65 – NADH-оксидаза; 125,127,130 – фосфоенолпируват карбоксикиназа; 273 – белок внешней мембраны TolC; 280,288 – аланиндегидрогеназа; 500,541,566 – OmpU; 513, 517 – иммуногенный белок; 518 – белок внешней мембраны OmpT; 658 – кислород-нечувствительная NAD(P)H нитроредуктаза; 709 – антиоксидант, семейства AhpC/Tsa; 709 – метилтрансфераза;791 – фрагмент OmpU; 841 – не идентифицированный белок.

Рисунок 5 - Протеинограмма EPS+Тох++Нар+Mot+ (А) и EPS++Тох+Нар++Mot++ (Б) вариантов V. cholerae Дакка 35 с идентифицированными белками.

Таблица 2 - Идентифицированные белки в штамме V. cholerae Дакка 35.

№ белка на геле Название белка Моле-кулярный вес, Да Функция Изменение уровня экспрессии белка у EPS++ вариантов в сравнении с EPS+
62,63, 65 NADH-оксидаза 61874 Энергетический обмен + 5,7; + 8,9; + 32,6
125, 127, 130 Фосфоенолпируват карбоксикиназа 59806 Энергетический обмен: гликолиз - 7,5; - 9,8; - 14,8
273 Белок TolC 47722 Метаболизм белков: секреция и транспорт + 2,2
280, 288 Аланин-дегидрогеназа 39814 Метаболизм - 11,4; - 5,6
500, 541, 566 OmpU 36624 Белок внешней мембраны, защитная + 13,2; + 6,6; + 2,8
513, 517 Иммуногенный белок 35233 Белок внешней мембраны: другие - 11,1; отсутствует у EPS++
518 OmpT 37145 Белок-порин внешней мембраны - 4,8
658 Кислород-нечувствительная NAD(P)H нитроредуктаза 24063 Клеточные процессы: детоксикация + 6,4
709 Антиоксидант, семейства AhpC/Tsa 22847 Клеточные процессы: детоксикация отсутствует у EPS+
709 Метилтрансфераза 23322 Белковый синтез отсутствует у EPS+
791 Фрагмент OmpU 36624 Белок внешней мембраны, защитная +3,4
841 Не идентифицированный белок 13127 Не установлена + 4,1

Примечание: «+» - повышение уровня экспрессии белка в обозначенное количество раз, «-» - уменьшение.

Таким образом, данные, полученные с помощью протеомного анализа, свидетельствуют о том, что смена фенотипа изучаемых клонов V. cholerae сопровождается значительным изменением клеточного метаболизма.

Следующий этап работы был посвящен выявлению сигналов внешней среды, вызывающих комплексные изменения в экспрессии факторов вирулентности и персистенции в штаммах холерного вибриона классического биовара. В результате установлено, что только при культивировании на средах с щелочной реакцией среды (pH 9,0) в популяции EPS+Тох++Нар+Mot+ вариантов V. cholerae Дакка 35, 9361, B-1307 и 49520 с частотой 80-85 % происходило появление вариантов с координированным альтернативным изменением уровня экспрессии генов, определяющих продукцию холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, экзополисахарида, а также подвижности, что приводило к смене их фенотипа.

Смена популяционного состава штамма должна, видимо, привести к изменению уровня его вирулентности. Действительно, при изучении вирулентности двух изогенных клонов V. cholerae Дакка 35 на модельных лабораторных животных было установлено, что EPS+Тох++Нар+Mot+ клоны были вирулентны, а EPS++Тох+Нар++Mot++ - авирулентны. Тем не менее, среди изолированных колоний EPS++Тох+Нар++Mot++ варианта, полученных после рассева содержимого кишечника на плотные среды, фенотип 6,0 % (от общего числа проверенных колоний) был очень сходен с таковым клонов EPS+Тох++Нар+Mot+, что свидетельствует о возможности реверсии нетоксигенного клона в токсигенный in vivo.

Таким образом, важным итогом проведенных исследований является получение новых данных о популяционной гетерогенности V. cholerae. В пределах популяции обнаружено два морфологически разных варианта, отличающихся друг от друга экспрессией нескольких факторов вирулентности и персистенции, что расширяет имеющиеся представления о диапазоне изменчивости возбудителя холеры. Учитывая процесс координированного переключения активности генов, можно сделать предположение, что у V. cholerae О1 серогруппы существует еще неизвестный регуляторный механизм, который контролирует дифференциальную экспрессию соответствующих генов, который может лежать в основе формирования клонов с новым патогенным потенциалом.

4. Фенотипический и молекулярно-генетический анализ генетически модифицированных штаммов V. cholerae классического биовара с измененной продукцией факторов патогенности.

В 1999 г. были получены данные о том, что мутации в промоторе структурных генов tcpA-F, контролирующих биосинтез пилей ТCP, изменяют активность регуляторного гена toxT, что приводит почти к 10-кратному понижению уровня продукции СТ (Yu, DiRita, 1999). Выявленный новый механизм координированного изменения экспрессии ключевых генов патогенности и иммуногенности послужил основанием для предположения о том, что при повышении продукции СТ за счет введения в клетки холерного вибриона в составе рекомбинантной плазмиды дополнительных копий структурных генов ctxAB и гена антирепрессора rstC может произойти увеличение биосинтеза ТСР и других факторов вирулентности.

В качестве модельных было отобрано две группы штаммов – с высокой (V. cholerae 569В, Дакка 35, КМ200) и умеренной продукцией СТ (V. cholerae М-9, В-1307, J-89) (таблица 3).

Таблица 3 - Продукция факторов патогенности природными и сконструированными штаммами V. сholerae классического биовара.

Штамм V. cholerae СТ (по данным GM1 ELISA), мкг/мл ТСР** Белки внешней мембраны
OmpU OmpT
Дакка 35 13,0±1,0 - следы +
2414* [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох++ТСР++ 42,0±2,5 ++++ + следы
КМ206 (бесплазмидный производный 2414) KmsTcs Тох++ТСР++ 40,0±0,2 ++++ + следы
569В 9,0±1,8 + следы +
2415 [569В (pCT105::mini-kan)] TcrKmr Тох++ТСР++ 38,4±1,6 ++++ + -
КМ207 (бесплазмидный производный 2415) KmsTcs Тох++ТСР++ 34,0±0,2 ++++ + -
КM200 14,0±1,6 +++ + +
КМ220 [КM200 (рСТ105::mini-kan)] TcrKmr Тох++ТСР++ 42,0±2,1 ++++ + +
J-89 2,0±0,5 - + +
J-89 (pCT105::mini-kan) TcrKmr Тох+ТСР- 6,2±1,2 - + +
M-19 4,2±2,0 - - +
M-19 (pCT105::mini-kan) TcrKmr Тох+ТСР- 12,5±2,3 - - +
В-1307 3,0±0,5 - + +
В-1307 (рСТ105::mini-kan) TcrKmr Тох+ТСР- 8,0±1,0 - + +
Дакка 35 (рСТ27) Tcr 48,0± 3,0 - следы +
569В(рСТ27) Tcr 45,0±2,0 - следы +
Примечание: * - штамм V. cholerae 2414 депонирован в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» под номером КМ197; ** - ТСР определяли методом самоагглютинации, «-» - отсутствие признака; «+» - наличие признака, а количество + - степень выраженности признака: «+» - мутный бульон, осадок незначительного числа клеток; «+++» - полупрозрачный бульон, значительное число клеток в осадке; «++++» - прозрачный бульон, осадок практически всех клеток.

Методом конъюгации в клетки выбранных штаммов была введена рекомбинантная коинтегратная плазмида pCO107-2 (TcrKmr), включающая плазмиду pOX38 (производная F-фактора, утратившего все известные IS-элементы), и pCT105::mini-kan (TcrKmr), производную pBR322, содержащую ген устойчивости к тетрациклину, транспозон mini-kan и вставку ДНК штамма V. cholerae RV79 биовара эльтор размером 7,0 т.п.н. с клонированными генами профагов СТХ и RS1 (Гинцбург с соавт., 1984). В состав клонированного фрагмента СТХ входят часть гена orfU и гены ace, zot, ctxAB, кодирующие биосинтез 3-х различных токсинов. Профаг RS1, помимо генов rstA, rstB и rstR, содержит ген-антирепрессор rstC, который индуцирует транскрипцию фагового генома, включая гены ctxAB (Гинцбург с соавт., 1984, Смирнова с соавт., 2001, Davis et al., 2002), что приводит к повышению продукции СТ. Частота переноса плазмиды рСО107-2 в клетки V. cholerae классического биовара составила 5x10-7. При введении плазмиды рСО107-2 происходило разъединение коинтеграта и сохранение лишь плазмиды рСT105::mini-kan (TcrKmr). Данные блот-гибридизации тотальной ДНК штаммов V. cholerae, обработанной рестриктазой PstI, с СТ-зондом подтвердили присутствие в созданных штаммах 3-х копий генов холерного токсина, две из которых входили в состав двух хромосом, а одна (размером 7,0 т.п.н.) была локализована на плазмидном репликоне (рисунок 6, дорожки 3 и 5).

Обозначения: 1 - V. cholerae Дакка 35 (исходный); 2 - V. cholerae КМ206 KmsTcs; 3 - V. cholerae 2414 [Дакка 35 (рСT105::mini-kan)]; 4 - V. сholerae 569В (исходный); 5 - V. сholerae 2415 [569В (рСT105::mini-kan)]; 6 - V. сholerae КМ207 KmsTcs. Стрелками отмечены хромосомные(5,6 и 9,0 т.п.н.) и плазмидные (7,0 т.п.н.) копии структурных генов холерного токсина.

Рисунок 6 - Блот-гибридизация тотальной ДНК штаммов V. cholerae, обработанной рестриктазой PstI, с СТ-зондом.

Значительное повышение уровня биосинтеза холерного токсина обусловлено присутствием в штаммах дополнительной копии структурных генов ctxAB, которые находятся на плазмиде и эффективно экспрессируются. Более того, не исключено, что в присутствии гена rstC, которого лишены природные штаммы классических холерных вибрионов, происходит повышение транскрипции их резидентных генов ctxAB, что полностью согласуется с недавно полученными сведениями (Davis et al., 2002).

Последующий анализ трансконьюгантов показал, что только у производных высокотоксигенных штаммов V. cholerae 2414 [Дакка 35 (рСT105::mini-kan)], 2415 [569В (рСT105::mini-kan)] и КМ220 [КM200 (рСТ105::mini-kan)] увеличилась и продукция ТСР (таблица 3), что была подтверждено методами иммуноблоттинга и электронной микроскопии.

Таким образом, основной итог экспериментальной работы - обнаружение ранее не известного влияния рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan, содержащей клонированные гены ctxAB и rstC, на биосинтез ТСР у изученных штаммов V. cholerae классического биовара. Из этого следует, что нами выявлен достаточно простой способ создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции основных факторов вирулентности и иммуногенности – СТ и ТСР, состоящий во введении в клетки этого возбудителя указанной плазмиды.

Получение штаммов с повышенным биосинтезом одновременно двух белков, выполняющих ряд важнейших функций в клетке холерного вибриона, ставит вопрос, за счет какого механизма рекомбинантная плазмида, не имеющая клонированных генов tcpA-F, изменяет продукцию ТСР? Поскольку экспрессия генов ctxAB и tсpA-F контролируется одним и тем же регуляторным геном toxR, мы предположили, что наблюдаемое увеличение продукции ТСР у штаммов, содержащих плазмиду, могло быть связано с увеличением активности данного белка-регулятора. В этом случае содержащие плазмиду штаммы должны отличаться от исходных и измененной продукцией белков внешней мембраны OmpU и OmpT, экспрессия которых непосредственно контролируется ТoxR. При анализе полученных изогенных штаммов с помощью электрофореза в полиакриламидном геле было показано, что продукция белков OmpU и OmpT в присутствии плазмиды существенно изменяется только в штаммах V. cholerae 2414 TcrKmr и 2415 TcrKmr. Исходные штаммы Дакка 35 и 569В синтезируют белок OmpT, экспрессия генов которого негативно регулируется белком ТoxR, и лишь следы OmpU, позитивно контролируемого этим белком. В то же время их содержащие плазмиду штаммы продуцируют значительное количество белка OmpU (таблица 3). Появление у содержащих плазмиду штаммов белка OmpU указывает на то, что в их клетках экспрессия регуляторного гена toxR действительно повысилась. Это обстоятельство, в свою очередь, обусловило, по-видимому, повышение продукции ТохТ, который на завершающей стадии каскадной регуляции увеличил активность генов tcpA-F, что привело к увеличению уровня биосинтеза ТСР. Участие ТoxR в повышении экспрессии ctxAB и tcpA-F в экспериментальных штаммах было подтверждено при их культивировании в непермиссивных для продукции ТoxR условиях.

Далее, для дальнейшего подтверждения участия гена toxR в изменении уровня биосинтеза ТСР в плазмидных штаммах в эксперименты был взят штамм V. cholerae RV31, имеющий делецию в гене toxR. Введение в клетки этого штамма плазмиды рСТ105::mini-kan и последующее определение у полученных трансконьюгантов продукции ТСР и OmpU показало отсутствие у них указанных белков. Эти данные указывают на справедливость нашего утверждения относительно усиления транскрипции гена toxR в штаммах, содержащих рекомбинантную плазмиду и имеющих полноценный ген toxR.

Таким образом, у возбудителя холеры классического биовара обнаружен новый механизм регуляции генной активности, основанный на влиянии плазмидного генома, содержащего клонированные гены двух профагов вирулентности на экспрессию хромосомных генов. Показано, что в присутствии рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan в токсигенных штаммах V. cholerae классического биовара повышается экспрессия хромосомных генов tcpA-F и ompU, кодирующих соответственно биосинтез ТСР и ОmpU, в результате усиления активности регуляторного гена toxR.

Возникает вопрос о том, какие гены клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды могут изменять экспрессию хромосомного гена toxR? Одно из возможных предположений состояло в том, что в таких событиях может играть большую роль второй профаг - RS1, входящий в состав клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды. Внесение в клетки классических вибрионов ДНК профага RS1 в составе рекомбинантной плазмиды могло привести к индукции в чужом хозяине экспрессии гетерологичного гена toxR. Данные, позволившие подтвердить это предположение, были получены в экспериментах при использовании другой рекомбинантной плазмиды рСТ27 (Тсr), являющейся также производной pBR322, но лишенной в отличие от плазмиды рСТ105 умеренного фага RS1, и несущей делецию протяженностью 250 п.н. в гене ctxA. Оказалось, что введение указанной плазмиды в клетки штаммов V. cholerae 569В и Дакка 35 не приводит к изменению у трансконьюгантов продукции ТСР. Более того, у полученных штаммов V. cholerae Дакка 35 (рСТ27) и 569В (рСТ27) было выявлено отсутствие по сравнению с исходными штаммами каких-либо изменений в биосинтезе белков OmpU и OmpT. Повысилась лишь в 2-3 раза продукция В-субъединицы СТ за счет наличия в клетках дополнительных структурных генов ctxB (таблица 3). Таким образом, эти эксперименты, во-первых, подтвердили данные других авторов (Fando et al., 1997; Provenzano et al., 2001; Wibbenmeyer et al., 2002) об отсутствии влияния плазмиды pBR322 на активность гена toxR, во-вторых, свидетельствуют о том, что отсутствие описанных выше различий в продукции ТСР и белков внешней мембраны (OmpU и OmpТ) между исходными и содержащими плазмиду штаммами V. cholerae Дакка 35 (рСТ27) и 569В (рСТ27) может быть обусловлена тем, что рекомбинантная плазмида рСТ27 лишена профага RS1. Из этих данных следует, что этот профаг, возможно, несет ответственность за повышение экспрессии гена toxR. В качестве одного из первых претендентов на участие в этом событии следует рассматривать ген rstC, локализованный в составе RS1. Однако для окончательного заключения о роли гена-антирепрессора rstC в изменении экспрессии хромосомных генов, необходимы дальнейшие исследования.

Итак, нами обнаружено, что введение в клетки возбудителя холеры классического биовара плазмидного генома с клонированными генами двух профагов может включаться дополнительный механизм регуляции хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуногенности. Перспективность продолжения работы в этом направлении определяется не только получением новых фундаментальных знаний о регуляции экспрессии различных генов патогенности возбудителя холеры, но и ее непосредственной практической ценностью. Во-первых, на основании полученных данных показана возможность использования принципиально нового подхода для создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции одновременно трех важнейших белков – СТ, ТСР и белка OmpU. Во-вторых, созданные штаммы с гиперпродукцией протективных антигенов могут быть использованы для совершенствования выпускаемой в России химической холерной вакцины «холероген–анатоксин+О антиген», а также для выделения очищенных антигенов, необходимых для конструирования диагностических тест – систем.

5. Сравнительный протеомный анализ исходного и содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan штаммов V. cholerae классического биовара.

Вполне очевидно, что при введении плазмиды рСТ105::mini-kan, наряду с повышенной активностью регуляторного гена toxR, может происходить изменение экспрессии и других хромосомных генов, кодирующих белки с различной функцией. Так, в 2003 г J. Bina et al. показали, что белок ToxR оказывает значительное влияние на метаболизм клетки. При мутации в toxR происходит изменение экспрессии 154 генов, из которых 60 индуцируется, а 94 репрессируется. Обнаружено изменение экспрессии генов, кодирующих белки внешней мембраны, участвующие в транспортных и энергетических процессах, метаболизме железа, подвижности, а также с неустановленной функцией. Эти данные позволяют полагать, что в клетках сконструированных нами штаммах, содержащих плазмиду рСТ105::mini-kan, также может изменяться экспрессия ряда хромосомных генов. В этой связи был проведен сравнительный анализ протеомов исходного штамма V. cholerae 569В и его производного V. cholerae 2415 (рСТ105::mini-kan) TcrKmr. При сопоставлении протеомных профилей сравниваемых штаммов было выявлено 783 белка и обнаружено изменение содержания 61 белка (рисунок 7). Большинство из них, так или иначе, связано с метаболизмом клетки (триптофаназа), ее энергетическим обменом (ацетат киназа), а также транспортными (С4-дикарбоксилат-связывающий белок) и секреторными (MshL, OmpT) функциями (таблица 4).

Наибольший интерес вызывает существенное повышение (в 11,9-19,8 раз) в клетках штамма V. cholerae 2415 TcrKmr белка патогенности – А субъединицы холерного токсина (таблица 4). По данным иммуноферментного анализа уровень продукции секретируемого СТ, в состав которого входит А субъединица, в штамме V. cholerae 2415 TcrKmr увеличился лишь 4,3 раза (таблица 3). Одно из возможных объяснений различий между секретируемой и связанной с клеткой А субъединицей может состоять в отсутствии перестройки в работе системы секреции II типа, через которую происходит транспорт СТ из клетки, при введении плазмиды рСТ105::mini-kan.

Обозначения: 209 – белок MshL; 444 - белок OmpT; 495 - белок цитоплазматической мембраны FtsZ; 583 и 585 – С4-дикарбоксилат связывающий периплазматический белок; 369 – триптофаназа; 401 – ацетаткиназа; 650 и 694 – А субъединица холерного токсина.

Рисунок 7 - Протеинограмма исходного штамма V. cholerae 569В (А) и его производного V. cholerae 2415 TcrKmr, содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan, (Б) с идентифицированными белками.

Таблица 4 - Идентифицированные белки в изогенных штаммах V. cholerae 569B и 2415 (рСТ105::mini-kan).

белка на геле Название белка Молекулярный вес, Да Функция Изменение уровня экспрессии белка в штамме 2415 по сравнению с 569В
209 MshL 60098 Белок внешней мембраны: секреция + 8,0
369 Триптофаназа 52887 Метаболизм - 5,6
401 Ацетат киназа 42816 Энергетический обмен: ферментация + 8,0
444 OmpT 37145 Белок внешней мембраны: порин - 12,0
495 FtsZ 41502 Цитокинезис + 5,6
583, 585 C4-дикарбоксилат-связывающий белок 37072 Транспорт белков, кислот, углеводов - 10,0 - 15,0
650, 694 А субъединица СТ 29317 Патогенез + 11,9; + 19,8

Примечания: «+» - повышение уровня экспрессии белка в обозначенное число раз, «-» - уменьшение.

Полученные нами при протеомном анализе результаты согласуются с данными J. Bina et al. (2003), относительно изменения продукции ацетаткиназы, транспортных и белков внешней мембраны при изменении активности toxR, и подтверждают выявленную нами роль глобального регуляторного белка ToxR в изменении экспрессии хромосомных генов в штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, присутствие плазмиды рСТ105::mini-kan, содержащей клонированные гены профагов CTX и RS1, в высокотоксигенном штамме V. cholerae 569В в результате повышения активности toxR привело не только к увеличению продукции факторов патогенности СТ и ТСР, но и значительно изменило метаболизм клетки, что выразилось в изменении содержания более 60 белков, участвующих в энергетическом обмене, делении клеток, транспорте, а также входящих в состав внешней мембраны.

5. Создание экспериментальной многокомпонентной иммуноферментной диагностической тест-системы.

Сконструированные штаммы V. cholerae 2414 [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] и 2415 [569В (pCT105::mini-kan)] с высоким уровнем продукции одновременно трех протективных антигенов холерного вибриона – СТ, ТСР и OmpU могут быть использованы в производстве диагностических и вакцинных препаратов. Однако, в условиях производства необходима селекция клонов, сохранивших рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan, что требует добавление антибиотиков в среду выращивания. Такие условия культивирования нежелательны при изготовлении вакцинных препаратов. В этой связи, на первом этапе работы были получены бесплазмидные штаммы V. cholerae продуценты протективных антигенов. При выращивании штаммов V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) и 2415 (pCT105::mini-kan) при температуре 4 оС (благоприятные условия для элиминации плазмиды) с частотой 14-16 % были получены KmsTcs клоны. Утрата плазмиды в 98 % сопровождалась потерей гиперпродукции СТ и ТСР. Вместе с тем среди изученных бесплазмидных клонов было обнаружено по два клона (или 2 %), у которых потеря автономной плазмиды не сопровождалась понижением продукции ТСР и СТ (фенотип KmsTcs Тох++ТСР++). Более того, бесплазмидные Тох++ТСР++ клоны не отличались от содержащих плазмиду штаммов по уровню биосинтеза белка OmpU, что указывает на сохранение эффективной экспрессии в них регуляторного гена toxR. Для дальнейшего изучения этого явления было отобрано по одному KmsTcs Тох++ТСР++ клону, обозначенными как V. cholerae КМ206 (производный штамма 2414 (pCT105::mini-kan) Тох++ТСР++) и V. cholerae КМ207 (производный штамма 2415 (pCT105::mini-kan) Тох++ТСР++) (таблица 3). Такой фенотип штаммов, лишенных указанной плазмиды, дает основание предполагать, что усиление транскрипции гена toxR могло произойти в результате внедрения профага RS1 или утратившей все маркеры резистентности плазмиды рСТ105 с клонированным опероном ctxAB в хромосому. Однако опыты по блот-гибридизации хромосомной ДНК бесплазмидных штаммов с СТ- и RS1-зондами показали отсутствие в их бактериальном геноме профага RS1 и дополнительных копий оперона ctxAB (рисунок 6, дорожки 2 и 6). Мы пока не располагаем сведениями, объясняющими повышенный уровень экспрессии глобального гена toxR, который сохранился после утраты плазмиды. Тем не менее, полученные бесплазмидные штаммы, с высоким уровнем продукции трех протективных антигенов, являются весьма перспективными для применения их в производстве. Кроме того, при сравнительном анализе продукции ряда протективных антигенов сконструированными штаммами в сравнении с производственными штаммами V. cholerae 569В серовара Инаба и М-41 серовара Огава, используемыми для изготовления вакцины «холероген-анатоксин+О-антиген» (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов), было обнаружено что полученные нами штаммы сероваров Инаба и Огава отличаются от производственных штаммов повышенной продукцией не только СТ, ТСР, белка OmpU, но и ферментов протеазы и фосфолипазы, а также О1 антигена указанных сероваров, которые также участвуют в образовании защитных антител при холере (таблица 5).

Таблица 5 - Сравнительный анализ продукции протективных антигенов сконструированными и производственными штаммами V. cholerae 569В и М-41.

Штамм V. cholerae Продукция СТ (по данным GM1 ELISA), мкг/мл Присутствие ТСР* Синтез Нар, мм** Продукция фосфолипазы, мм*** Титр реакции агглютинации с антисыворотками
О Огава Инаба
569В 9,0±2,0 - 2,0±0,1 2,0±0,2 1 : 1600 - 1 : 400
М-41 2,8±0,7 - 1,5±0,5 2,5±0,5 1 : 3200 1 : 800 -
2414 (pCT105::mini-kan) TcrKmr 42,0±2,5 ++++ 4,0±0,2 6,0±0,5 1 : 6400 1 : 800 -
КМ206 TcsKms 40,0±0,4 ++++ 3,0±0,2 3,0±0,5 1 : 6400 1 : 800 -
2415 (pCT105::mini-kan) TcrKmr 38,4±1,6 ++++ 6,0±0,5 6,0±0,2 1 : 1600 - 1 : 800
КМ207 TcsKms 34,0±0,2 ++++ 6,0±0,5 6,0±0,2 1 : 1600 - 1 : 800
Примечания: *- ТСР определяли методом самоагглютинации, «-» - отсутствие признака; «+» - наличие признака, а количество + - степень выраженности признака: «++++» - прозрачный бульон, осадок практически всех клеток; ** - величина зоны просветления на агаре, содержащем 10 % молока; *** - величина зоны просветления на агаре с 2 % эмульсией яичного желтка.

Эти данные позволяют считать, что сконструированные штаммы, имеющие высокий уровень продукции 6-ти протективных антигенов по сравнению с производственными штаммами, могут найти применение для приготовления более эффективной химической холерной вакцины.

Далее в условиях малообъемного культивирования было установлено, что для получения значительного количества СТ, ТСР и О1 антигена сероваров Инаба и Огава культивирование сконструированных штаммов-продуцентов необходимо проводить не более 12 ч в бульоне Хоттингера (рН 8,0) и казеиновом бульоне (рН 7,6) без добавления пептона и глюкозы.

На следующем этапе была разработана модифицированная методика выделения препарата, содержащего токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона, и получены антисыворотки. Для выделения ТСР использовали трис-HCl-буфер (рН 7,0), описанный у D. Sun et al. (1990). Модификации касались способа отделения ТСР от поверхности клеток. Для этих целей использовали не шприц с толстой иглой (Sun et al., 1990), а обработку культуры в течение 2 мин на вортексе «Bio Vortex V1» (Россия) при орбитальном движении центрифужных пробирок с максимальной скоростью (2500 об/мин). Содержание белка в полученных белковых препаратах (БП) составляло 240-300 мкг/мл. По данным белкового электрофореза в БП, кроме ТСР, содержался белок внешней мембраны OmpU. Присутствие ТСР в полученных препаратах было подтверждено электронно-микроскопически и методом иммуноблоттинга с анти-ТСР сывороткой, предоставленной R. K. Taylor (США).

Поликлональные антисыворотки получали иммунизацией животных (кролики) бактериями штамма V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) TcrKmr и БП, выделенным из штамма V. cholerae КМ206 TcsKms. В результате отработанной методики иммунизации животных получены поликлональные кроличьи антисыворотки, содержащие в высоком титре специфические антитела к ТСР, которые могут быть использованы для выяснения экспрессии генов tcp в природных штаммах холерного вибриона с помощью иммуноблоттинга и электронно-микроскопически (рисунок 8).

Наличие антисывороток, содержащих антитела к ТСР холерного вибриона, позволило приступить к созданию многокомпонентной экспериментальной иммуноферментной диагностической тест-системы, необходимой для изучения экспрессии основных генов вирулентности в штаммах V. cholerae, выделяемых из различных объектов внешней среды при выяснении их эпидзначимости.

Примечания: Стрелками отмечены пучки токсин-корегулируемых пилей адгезии. Инструментальное увеличение 17 000.

Рисунок 8 - Иммуноэлектронная микрофотография бактерий исходного штамма V. cholerae Дакка 35 (А) и его производного V. cholerae 2414 TcrKmr, содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan, (Б) при использовании коньюгата иммуноглобулинов, приготовленных из антисыворотки к ТСР, и коллоидного золота.

В настоящее время разработан ряд отечественных иммуноферментных тест-систем на основе использования поли- и моноклональных антител для контроля синтеза лишь отдельных антигенов (О антигена или В-субъединицы СТ) (Федорова с соавт, 2000; Алексеева с соавт., 2002; Сырова с соавт., 2003; Чемисова с соавт., 2003; Шеклакова с соавт., 2005). Однако при проведении мониторинговых исследованиях предпочтительны многокомпонентные тест-системы, позволяющие определять экспрессию диагностически значимых генов и генов вирулентности.

Для решения поставленной задачи использовали четыре очищенных ключевых антигена холерного вибриона (ТСР, СТ, О1 антиген Огава и Инаба) и четыре поликлональные антисыворотки к ним. В качестве метода анализа был выбран дот-иммуноанализ (ДИА), позволяющий проводить исследования значительного количества образцов (Beutin et al., 1984). Тест-система обладала высокой чувствительностью, так как определяла ТСР при концентрации бактерий 3,0х106 м.кл./мл., экспрессируемые СТ и О1 антиген соответственно в концентрации 0,3 и 0,14-0,16 мкг/мл, и специфичностью, поскольку выявляла антигены только в штаммах V. cholerae соответствующей серогруппы и серовара.

На следующем этапе был проведен анализ 18 штаммов V. cholerae, выделенных на территории России и других стран от больных и из внешней среды, и эпидемическая значимость которых подтверждена ранее при использовании ПЦР. Все клинические штаммы, содержащие структурные гены О1 антигена серовара Инаба или Огава, ТСР и СТ, продуцировали контролируемые ими факторы вирулентности и иммуногенности (таблица 6).

Таблица 6 - Определение серовара, продукции токсин-корегулируемых пилей адгезии, холерного токсина в природных штаммах V. cholerae с помощью многокомпонентной диагностической тест-системы.

Штамм V. cholerae* Продукция штаммами поверхностных антигенов Продукция СТ
О1 антигена Инаба О1 антигена Огава ТСР
мкг/мл ДИА
Вирулентные штаммы (ctxA+, tcpA+)
569В (контроль) + - + 9,0±2,0 +
Р-3644 + - + 0,23±0,1 +
34 Филип. - + + 0,45±0,25 +
М-1260 - + + 0,25±0,1 +
Р-16064 - - + 0,5±0,14 +
М-1429 + - - 0,0 -
М-1430 - + + 0,0 -
М-964 + - + 0,0 -
МО-45 - - + 0,0 -
Нетоксигенные штаммы (ctxA-, tcpA+), содержащие гены, кодирующие ТСР
18797 - + + 0,0 -
18796 - + + 0,0 -
Авирулентные штаммы (ctxA-, tcpA-)
М-1420 + - - 0,0 -
1132 - + - 0,0 -
Р-18751 - + - 0,0 -
М-885 - + - 0,0 -
М-998 - + + 0,0 -
М-999 - + + 0,0 -
С-197 - - + 0,0 -
230 - - - 0,0 -
КМ115 - - - 0,0 -
Примечание: *- по данным ПЦР и реакции агглютинации с диагностическими холерными О-сыворотками тестируемые штаммы относятся к следующим серогруппам и сероварам: 569В, Р-3644, М-1429, М-964, М-1420 – О1 серогруппа серовар Инаба; 34 Филип., М-1260, М-1430, 18797, 18796, 1132, Р-18751, М-885, М-998, М-999 – О1 серогруппа серовар Огава; Р-16064, МО-45, 230, КМ115 – О139 серогруппа; С-197 – неО1/неО139 серогруппа.

Вместе с тем было выявлено три штамма (М-999, М-998, С-197), у которых отсутствовал ген tcpA, но результаты ДИА были положительными (таблица 6). Согласно литературным данным у tcpA- холерных вибрионов могут присутствовать пили, подобные ТСР (Fullner, Mekalanos, 1999). Можно полагать, что данные штаммы синтезируют новый тип пилей, имеющих сходную с ТСР последовательность белка. Эти данные расширяют наши представления о дополнительных факторах патогенности холерного вибриона и указывают на возможность использования созданной тест-системы при анализе атипичных штаммов V. cholerae, все чаще вызывающих вспышки или спорадические случаи холеры.

На следующем этапе сконструированную тест-систему использовали для анализа двух производственных серий холерной химической бивалентной вакцины «холероген-анатоксин+О антиген». Ранее было установлено, что эта вакцина содержит О1 антиген сероваров Инаба и Огава, а также В-субъединицу в составе инактивированного СТ (Джапаридзе с соавт., 1991). Присутствие указанных антигенов в вакцине обеспечивает формирование антибактериального и антитоксического иммунитета. В тоже время из-за отсутствия антисыворотки к ТСР не было сведений о наличии этого антигена в указанной вакцине. Полученные нами данные подтвердили присутствие в составе вакцины О1 антигена сероваров Инаба и Огава, а также В-субъединицы СТ. Однако проверяемая вакцина не содержала ТСР.

Итак, диагностическая ценность предлагаемой тест-системы заключается в следующем. Во-первых, обнаружение продукции О антигена позволяет судить о выделении штамма холерного вибриона О1 серогруппы. Во-вторых, на основе изучения экспрессии СТ и ТСР возможна оценка вирулентности выделенных штаммов. В-третьих, созданная тест-система может быть использована при анализе атипичных штаммов V. cholerae, способных вызывать вспышки и спорадические случаи холеры.

В заключении подведены итоги работы и определены перспективы дальнейших исследований. Отмечено, что новые сведения, о существовании в популяции ряда штаммов возбудителя холеры двух типов клонов, различающихся уровнем экспрессии одновременно нескольких генов вирулентности и персистенции, а также выяснение роли отдельных факторов внешней среды в переключении активности этих генов, может внести существенный вклад в понимание природы адаптационной изменчивости V. cholerae, поскольку является одним из перспективных направлений дальнейших исследований по проблеме холера и позволит прогнозировать развитие эпидемической ситуации.

Не менее важны приоритетные данные о влиянии рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности СТХ и RS1, на экспрессию хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы патогенности и иммуногенности, а также контролирующих процессы метаболизма, энергетического обмена, транспорта, цитокинезиса и продукцию белков внешней мембраны, путем изменения активности глобального регуляторного гена toxR. Полученные результаты свидетельствуют о существовании ранее неизвестного механизма координированного изменения активности различных генов и указывают на перспективы продолжения исследований, направленных на получение новых фундаментальных знаний о роли чужеродного генетического материала в изменении экспрессии резидентных генов возбудителя холеры.

Наряду с фундаментальным аспектом, работа имеет и важное практическое значение. Сконструированные бесплазмидные и содержащие плазмиду рСТ105::mini-kan штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией ряда факторов патогенности и иммуногенности холерного вибриона (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, белок внешней мембраны, ферменты патогенности, О1 антиген) могут быть использованы в производстве более эффективных холерных профилактических и диагностических препаратов. Созданная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система будет востребована при проведении мониторинговых исследований и уточнения эпидемической значимости штаммов холерного вибриона.

ВЫВОДЫ

1. При комплексном фенотипическом анализе 146 клинических штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров обнаружены штаммы, гетерогенность популяции которых определяется присутствием двух типов клонов, различающихся по морфологии колоний (мутные и прозрачные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Впервые установлено, что экспрессия генов, контролирующих указанные фенотипические свойства, имеет координированный характер.

2. Морфология колоний штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров определяется биосинтезом экзополисахарида. Впервые обнаружено, что классические и эльтор вибрионы, продуцирующие экзополисахарид, различаются по характеру координированной экспрессии генов холерного токсина (сtxAB), растворимой гемагглютинин/протеазы (hapА) и подвижности (mot). У эльтор вибрионов повышение экспрессии генов экзополисахарида (vps) сопровождается увеличением активности генов сtxAB, но снижением экспрессии генов hapА и mot. У классических вибрионов существует обратная связь между экспрессией указанных генов.

3. Впервые показано, что в состав экзополисахарида V. cholerae классического биовара входят рамноза, глюкоза, галактоза и гексозамин. Выявлена адаптивная функция экзополисахарида, заключающаяся в повышении устойчивости клеток к действию осмотического и оксидативного стрессов.

4. Проведенный сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35 классического биовара выявил присутствие 841 белка. В клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Тох++Нар+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

5. Сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности является щелочная реакция среды (рН 9,0). Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Введение рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 в клетки высокотоксигенных штаммов V. cholerae классического биовара приводит к выраженному изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы патогенности и иммуногенности, – токсин-корегулируемые пили адгезии и белок OmpU. Изменение экспрессии хромосомных генов обусловлено повышенной активностью глобального регуляторного гена toxR.

7. При сравнительном анализе протеомов исходного и содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan штаммов V. cholerae впервые выявлены различия в их белковых профилях. В штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду, обнаружено 33 гена с пониженной и 28 генов с повышенной экспрессией, кодирующих белки, являющиеся важными факторами вирулентности и иммуногенности, а также участвующими в энергетическом обмене, процессах метаболизма, транспорте, цитокинезисе и входящих в состав внешней мембраны.

8. Сконструированы содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов – холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена, ответственных за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Определены оптимальные условия их культивирования (фаза роста, температура, состав и рН среды, время выращивания) для получения протективных антигенов при малообъемном культивировании в производственных условиях.

9. На основе сконструированных штаммов создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, включающая набор из 4-х очищенных протективных антигенов (холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, О1 антигена сероваров Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Экспериментально доказана специфичность, эффективность и диагностическая ценность тест-системы при определении экспрессии основных генов патогенности и иммуногенности у природных штаммов V. cholerae с различной эпидемической значимостью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ

ДИССЕРТАЦИИ

  1. Заднова С. П. Сравнительный анализ факторов патогенности у токсигенных и нетоксигенных клонов штаммов Vibrio cholerae Дакка35 Огава / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 1999. – Вып. 79. – С. 153–159.
  2. Чеховская Г. В. Новый высокотоксигенный штамм Vibrio cholerae Дакка35: морфология, продукция холерного токсина и белковый спектр / Г. В. Чеховская, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, Ю. В. Лазовский, Н. И. Смирнова // Centre for Control and Research of natural infectious diseases. Scientific Journal. – Ulaanbaatar, 1999. – N 7. – P. 282–283.
  3. Konnov N. P. Comparative microscopy study of Vibrio cholera flagella / N. P. Konnov, V. B. Baibyrin, S. P. Zadnova, Y. P. Volkov // International Symposium. Biomedical Optic, Spie Proceedings. – San Jose, USA, 1999. – Vol. 3607. – P - 25. – S. 30–31.
  4. Топорков А. В. Штаммы холерного вибриона с повышенной продукцией токсин-корегулируемых пилей адгезии: выявление и фенотипический анализ / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2000. – Вып. 80. – С.88–93.
  5. Топорков А. В. ToxR-регулируемые гены и их экспрессия в штаммах Vibrio cholerae О1 (рСТ105::mini-kan) / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Г. А. Ерошенко, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Информация проблемной комиссии (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (46.00). – Ростов-на-Дону, 2000. – Вып. 13. – С. 59–61.
  6. Смирнова Н. И. Молекулярно- генетические особенности штаммов Vibrio cholerae>
  7. Заднова С. П. Получение и фенотипический анализ штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией основных протективных антигенов / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2001. – № 2. – C. 3–6.
  8. Заднова С. П. Получение и изучение антител против токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона О1 серогруппы / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2001. – Вып. 1(81). – С. 131–136.
  9. Заднова С. П. Изучение продукции токсин-корегулируемых пилей адгезии у штаммов холерного вибриона классического биовара / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Сб. тез. Международной научно-практической конференции. – Алматы, 2001. – Вып. 3. – С. 143–147.
  10. Заднова С. П. Продукция токсин-корегулируемых пилей адгезии природными штаммами холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Б. Челдышова, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Ростов-на-Дону, 2001. – Вып. 14. – С. 36–38.
  11. Заднова С. П. Конструирование штаммов-суперпродуцентов токсин-корегулируемых пилей адгезии – основного фактора колонизации холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Б. Челдышова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Биотехнология. – 2002. – № 2. – С. 3–11.
  12. Коннов Н. П. Изучение токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона методом иммуноэлектронной микроскопии / Н. П. Коннов, С. П. Заднова, О. В. Новикова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // ЭМ’2002. Тез. докл. ХIХ Российской конференции по электронной микроскопии. – Черноголовка, 2002. – C. 229.
  13. Заднова С. П. Получение и использование антител на токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. И. Смирнова // Биотехнология. – 2003. – № 1. – C. 79–84.
  14. Топорков А. В. Генетический контроль регуляции экспрессии основных генов патогенности у возбудителя холеры / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2003. – Вып. 85. – С. 113–121.
  15. Заднова С. П. Изучение роста штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение белка токсин-корегулируемых пилей адгезии / С. П. Заднова, С. А. Еремин, Н. Г. Авдеева, О. А. Волох // Холера. Материалы Российской научно-практической конференции. – Ростов-на-Дону, 2003. – С. 236–238.
  16. Заднова С. П. И. Колониальные вариации штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Огава / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Т. Л. Захарова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Холера. Материалы Российской научно-практической конференции. – Ростов-на-Дону, 2003. – С. 140–143.
  17. Smirnova N. I. Molecular-genetic peculiarities of>
  18. Заднова С. П. Изучение динамики роста штаммов Vibrio cholerae-продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии / С. П. Заднова, С. А. Еремин, Н. Г. Авдеева, О. А. Волох // Биотехнология. – 2004. – № 3. – С. 43–48.
  19. Заднова С. П. Фенотипический анализ штамма Vibrio сholerae Дакка 35 Огава, имеющего гетерогенную популяцию / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Д. Исаев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2004. – № 3. – С. 86–88.
  20. Заднова С. П. Функциональная роль ToxR-регулируемых белков Vibrio cholerae / С. П. Заднова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2004. – Вып. 1(87). – С. 9–13.
  21. Заднова С. П. Биохимический анализ двух фенотипически различных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 О1 / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. П. Коннов, Т. Л. Захарова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2004. – Вып. 1(87). – С. 42–45.
  22. Заднова С. П. Сравнительное изучение белкового состава у токсигенных и нетоксигенных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка35 / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова // Молекулярная медицина и биобезопасность. Сб. тез. I Международной конференции. – М., 2004. – С. 80–81.
  23. Заднова С. П. Вариабельность биохимических и генетических свойств штамма Vibrio cholerae Дакка 35 / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова // Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития. Сб. тез. III съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров России. – М., 2004. – Т.1. – С. 381.
  24. Топорков А. В. Повышение продукции основных протективных антигенов Vibrio cholerae О1 с помощью рекомбинантной плазмиды с клонированными генами холерного токсина / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Сб. тез. III конференции молодых ученых с международным участием. – М., 2004. – С. 160–161.
  25. Смирнова Н. И. Влияние рекомбинантной плазмиды, несущей клонированные гены холерных профагов СТХ и RS1, на экспрессию генов вирулентности и иммуногенности у возбудителя холеры / Н. И. Смирнова, С. П. Заднова, А. В. Топорков // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. – 2005. – № 3. – С. 3–8.
  26. Топорков А. В. Сравнительный анализ продукции протективных антигенов у рекомбинантных и производственных штаммов Vibrio cholerae классического биовара / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2005. – № 1. – С. 53–57.
  27. Исаев Н. Д. Популяционная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара: координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств / Н. Д. Исаев, Ю. В. Лозовский, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2005. – Вып. 1(89). – С. 43–46.
  28. Заднова С. П. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий / С. П. Заднова, Ю. В. Лозовский // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2005. – Вып. 2(90). – С. 11–16.
  29. Смирнова Н. И. Конструирование штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона с помощью изменения экспрессии глобального регуляторного гена toxR / Н. И. Смирнова, С. П. Заднова, А. В. Топорков, В. В. Кутырев // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы III Международного конгресса. – М., 2005. – Ч.1. – С. 82.
  30. Кузнецов О. С. Изучение морфологии колоний Vibrio cholerae Дакка 35 методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии / О. С. Кузнецов, С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова, Н. П. Коннов // ХIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. Тез. докл. – Черноголовка, 2005. – C. 261.
  31. Заднова С. П. Экзополисахаридный слой холерных вибрионов классического биовара: обнаружение, биохимический анализ и функциональная значимость / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Ростов-на-Дону, 2005. – Вып. 18. – С. 92–94.
  32. Smirnova N. I. Construction of strains producing the main protective antigens of Vibrio cholerae based on altered expression of the global regulatory gene toxR / N. I. Smirnova, S. P. Zadnova, A. V. Toporkov, V. V. Kutyrev // New Research on Biotechnology and Medicine / Edit. A.M. Egorov, G.E. Zaikov. New York, 2006. – P. 177–188.
  33. Заднова С. П. Протеомный анализ двух изогенных вариантов Vibrio cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, К. Б. Кутейкин-Тепляков, О. В. Тихонова, И. Ю. Торопыгин, А. И. Арчаков, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. – 2006. - № 3. – С. 11–16.
  34. Исаев Н. Д. Влияние условий среды на координированное переключение генов патогенности и персистенции у холерного вибриона / Н. Д. Исаев, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Ростов-на-Дону, 2006. – Вып. 19. – С. 69–71.
  35. Заднова С. П. Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU из штамма холерного вибриона классического биовара / С. П. Заднова, С. А. Еремин, О. А. Волох, Н. И. Смирнова // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств – участников Содружества Независимых Государств. Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции. – Оболенск, 2006. – С. 105–106.
  36. Заднова С. П. Изучение продукции основных факторов патогенности и иммуногенности различными штаммами Vibrio cholerae при их культивировании в производственных условиях / С. П. Заднова, О. А. Волох, И. М. Крепостнова, Е. Ю. Щелканова, Л. Ф. Ливанова, Т. Л. Захарова, И. А. Шепелев, С. А. Еремин, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2007. – Вып. 1(95) – С. 51–55.
  37. Zadnova S. P. Studying Vibrio cholerae isogenic variants of>
  38. Заднова С. П. Изменение свойств штаммов холерного вибриона классического биовара под действием факторов внешней среды и мобильных генетических элементов / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Ю. В. Лозовский, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. – Ростов-на-Дону, 2007. – Вып. 20. – С. 102–105.
  39. Захарова Т. Л. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности у холерных вибрионов / Т. Л. Захарова, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, И. М. Крепостнова, М. Н. Киреев, Н. И. Смирнова // Биотехнология. – 2008. – № 1. – С. 88–96.
  40. Волох О. А. Изучение физиологических процессов, происходящих в популяции штаммов холерного вибриона продуцентов протективных антигенов, в процессе производственного культивирования / О. А. Волох, И. А. Шепелёв, С. П. Заднова, И. М. Крепостнова, С. А. Еремин // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2008. – Вып. 1(95). – С. 52-55.
  41. Захарова Т. Л. Конструирование рекомбинантных штаммов для одновременного получения нескольких очищенных основных протективных антигенов холерного вибриона / Т. Л. Захарова, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, М. Н. Киреев, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2009. – Вып. 2(100). – C. 68-71.
  42. Заднова С. П. Выявление в природных популяциях холерного вибриона клонов с различной экспрессией факторов вирулентности и персистенции и их фенотипический анализ / С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, Ю. В. Лозовский, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. – Саратов, 2009. – Вып. 3(101). - (принята в печать).

Патенты Российской Федерации на изобретения.

  1. Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава – продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии: пат RU 2169187 C1 / Смирнова Н. И., Заднова С. П., Топорков А. В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2169187 C1; заявл. 26.04.2000; опубл. 20.06.2001, Бюл. № 17. – 6 с.
  2. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM200-продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии: пат. RU 2193598 C1 / Смирнова Н. И., Заднова С. П., Топорков А. В., Челдышова Н. Б.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2193598, заявл. 26.07.2001, опубл. 27.11.2002. Бюл. № 33. – 6 с.
  3. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов: пат. RU 2222594 C1 / Топорков А. В., Заднова С. П., Смирнова Н. И., Кутырев В. В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2222594, заявл. 15.07.2002, опубл. 27.01.2004, Бюл. № 3. – 8 с.
  4. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов: пат. RU 2222595 C1 / Заднова С. П., Топорков А. В., Смирнова Н. И., Кутырев В. В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2222595, заявл. 15.07.2002; опубл. 27.01.2004, Бюл. № 3. – 10 с.
  5. Способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара: пат. RU 2324740 C2 / Заднова С. П., Еремин С. А., Авдеева Н. Г., Волох О. А., Самохвалова Ю. И., Смирнова Н. И.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2324740; заявл. 11.07.2006; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14. – 7 с.: ил.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.