WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Гены центра инактивации и модификации хроматина активной и неактивной х-хромосом у сумчатых генетика –

На правах рукописи







ЗАХАРОВА ИРИНА СЕРГЕЕВНА

ГЕНЫ ЦЕНТРА ИНАКТИВАЦИИ И МОДИФИКАЦИИ ХРОМАТИНА АКТИВНОЙ И НЕАКТИВНОЙ Х-ХРОМОСОМ У СУМЧАТЫХ


Генетика 03.02.07

автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук






Новосибирск


2010


Работа выполнена в лаборатории эпигенетики развития Учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Закиян С.М. Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Беляева Е.С. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук, профессор Высоцкая Л.В. Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск


Ведущее учреждение: Томский государственный университет, г. Томск

Защита состоится «____»_______________2010 г. на утреннем заседании Диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 003.011.01 при Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН по адресу: 630090, г. Новосибирск, пр. академика Лаврентьева, 10. Факс: (383) 333-12-78; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики Сибирского отделения РАН.

Автореферат разослан «____»_______________2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета,

доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Центр инактивации – один из наиболее важных регуляторных локусов генома млекопитающих, который отвечает за контроль экспресии генов целой хромосомы, изменение структуры и свойств хроматина.

В настоящее время достоверно установлено, что у высших млекопитающих ген Xist (X inactive specific transcript) выполняет основные функции центра инактивации Х-хромосомы (XIC), который является главным локусом, управляющим процессом инактивации (Borsani et al., 1991; Brockdorff et al., 1991; Penny et al., 1996; Herzing et al., 1997). Сумчатые – самые древние млекопитающие, у которых наблюдается инактивация Х-хромосомы у самок в раннем эмбриогенезе. Инактивация у сумчатых импринтированная (Sharman, 1971), неполная и тканеспецифическая (Cooper et al., 1993). Она напоминает инактивацию в экстраэмбриональных тканях плацентарных, и, по-видимому, является отражением предкового механизма инактивации. Данная работа направлена на исследование ранних этапов эволюции системы инактивации Х-хромосомы: исследование центра инактивации и эпигенетических механизмов процесса инактивации у сумчатых.

Так как последовательности Xist эволюционно лабильны, поиск центра инактивации у сумчатых с помощью гетерологичных зондов оказался безрезультатным. Можно было ожидать, что проект по секвенированию генома опоссума Monodelphis domestica даст ответ о наличии центра инактивации у сумчатых млекопитающих. Однако даже последняя версия базы данных проекта не дает полного представления о порядке генов и последовательностях Х-хромосомы опоссума. В данном исследовании была предпринята попытка выявить Xist сумчатых среди последовательностей, сцепленных с консервативными генами Chic1 и Slc16a2, которые фланкируют центр инактивации у большинства плацентарных. Сравнение последовательностей группы сцепления Chic1 - Slc16a2 у сумчатых и плацентарных млекопитающих представляет огромный интерес, так как позволяет установить этапы эволюции процесса инактивации Х-хромосомы млекопитающих, а также имеет большое значение для понимания механизмов регуляции экспрессии генов и эволюции сложных регуляторных локусов, содержащих нетранслируемые ядерные РНК.

В качестве объекта в данной работе использованы два вида сумчатых: североамериканский вирджинский опоссум Didelphis virginiana и южноамериканского серый короткохвостый опоссум Monodelphis domestica, которые широко используются как лабораторный объект для генетических и эволюционных исследований (VandeBerg, 1990; Nesterova et al., 1997).

Цель и задачи исследования. Цель работы – поиск генов центра инактивации и исследование модификаций хроматина активной и неактивной Х-хромосом у сумчатых.

Задачи:

  1. Получить зонды Х-сцепленных генов опоссумов, ортологи которых фланкируют центр инактиваци у плацентарных (Slc16a2, Chic1) и расположены вблизи от него (Hprt, Pgk1, Sox2). Провести скрининг геномных BAC-библиотек двух видов опоссумов с использованием полученных зондов и метода прогулки по хромосоме.
  2. Провести сравнительное картирование Х-хромосом M. domestica и D. virginiana.
  3. Для поиска гена Xist исследовать у опоссумов окружение генов Chic1 и Slc16a2, тесно сцепленных и фланкирующих ген Xist у плацентарных, а также последовательности, представленные в проектах по секвенированию геномов сумчатых.
  4. Исследовать модификации хроматина на активной и неактивной Х-хромосомах M. domestica.

Научная новизна. Настоящее исследование имеет большое значение для понимания процесса инактивации Х-хромосомы сумчатых млекопитающих, который до настоящего времени считался мало изученным. В работе впервые убедительно показано, что у сумчатых, несмотря на наличие процесса инактивации Х-хромосомы, не существует прямого ортолога гена Xist, ответственного за инактивацию Х-хромосомы у плацентарных. Впервые обнаружено, что неактивное состояние хроматина инактивированной Х-хромосомы у самок сумчатых связано с триметилированием гистона H3 по лизину в 9 положении.

Положения, выносимые на защиту.

  1. Процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.
  2. Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у M. domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование H3K9, гипометилирование H3K4, триметилирование H3K27.
  3. Неактивная Х-хромосома у M. domestica обогащена триметилированным H3K9. Модификация неактивного хроматина триметилированный H3K27, в отличие от плацентарных, у M. domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.

Практическая значимость. Практическое значение могут иметь результаты сравнительного картирования геномов двух видов опоссумов; полученные микродиссекционные пробы Х-хромосом двух видов опоссумов, котоые можно использовать в дальнейшем для изучения процессов инактивации, а также в других исследованиях для маркирования Х-хромосом данных видов; установленные в ходе данной работы нуклеотидные последовательности ВАС-клонов, которые позволили существенно дополнить данные проектов по секвенированию геномов опоссумов.

Апробация работы. Результаты работы представлены на второй международной конференции по инактивации Х-хромосомы (Париж, 17 – 22 сентября 2006 г.), на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы Молекулярной и Клеточной Биологии» (Томск, 9 – 12 мая 2007 г.), международной конференции «Хромосома 2009» (Новосибирск, 2009 г.), семинарах и отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН. По теме диссертации опубликованы две работы в рецензируемых зарубежных журналах, рекомендованных ВАК.

Вклад автора. Основные результаты получены автором самостоятельно. Скрининг генмных BAC библиотек проведен совместно с к.б.н. А.И. Шевченко. Секвенирование ВАС клонов выполнено в Wellcome Trust Sanger Institute (Cambridge, UK). Анализ последовательностей ДНК проводился совместно с к.б.н. Е.А. Елисафенко.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, заключения, выводов и списка литературы (116 наименований). Работа изложена на 106 страницах, содержит 13 рисунков и 4 таблицы.


МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ


1. Скрининг геномных ВАС-библиотек опоссумов. В работе были использованы три геномные ВАС-библиотеки: VMRC-6 – M. domestica (сконструированная в Virginia Mason Research Center), LBNL3 (изготовленная в Lawrence Berkeley National Laboratory) и OM – D. virginiana. Готовые фильтры библиотек были заказаны с помощью CHORI BACPAC Resources (http://bacpac.chori.org/protocols.htm). Скрининг ВАС-библиотек M. domestica и D. virginiana проводили согласно протоколам фирмы BACPAC Resources. Зонды для скрининга геномных ВАС-библиотек получены методом ПЦР. Для генов Chic1, Slc16a2, Hprt и Pgk1 были подобраны праймеры на наиболее консервативные белок-кодирующие районы, найденные при сравнении последовательностей соответствующих генов мыши, человека и, если это было возможно, сумчатых. Для генов G6pd, Rbmx, Sox3 праймеры были выбраны на последовательности M. domestica, представленные в trace-базе данных Ensembl (http://trace.ensembl.org). Последовательности ген-специфических пар праймеров, используемых при получении зондов для скрининга геномных ВАС-библиотек опоссумов опубликованы в работе Shevchenko et al. (2007). Включение [aP32]-dATP проводили, используя стат-праймер из набора фирмы Roche, согласно протоколу производителя, или с помощью ПЦР.

2. Определение нуклеотидной последовательности ДНК проводили в Межинститутском центре секвенирования ИХБиФМ СО РАН согласно протоколу ABI PRISM BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Applied Biosystems Perkin-Elmer Corporation). Последовательности рекомбинантных BAC-клонов определяли в Международном центре секвенирования института Сенгера (Wellcome Trust Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, UK. International Sequencing Senger Center).

3. Контекстный анализ последовательности ДНК. Компьютерный анализ последовательности выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al., 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/; Altschul et al., 1997), RepeatMasker (A. Smit, http://www.genome.washington.edu/UWGC/analysistools/ repeatmask.htm), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNASTAR (DNASTAR Inc.), а также программ на серверах http://genome.ucsc.edu/, http://www.ensembl.org/. Поиск гомологичных последовательностей проводился по базам данных нуклеотидных последовательностей на BLAST-сервере NCBI. Для выравнивания двух последовательностей использовали программу LALIGN (Huang, Miller, 1991) из пакета программ FASTA, а также программу Seqman из пакета DNASTAR. Выбор олигонуклеотидов осуществлялся с помощью программы PrimerSelect из пакета DNAstar.

4. Клеточные линии. В работе использовали перевиваемые культуры фибробластов FMDL и MMDL, полученные соответственно от самки и самца M. domestica (Nesterova et al,. 1997), и перевиваемую культуру почечного эпителия OK, полученную от самки D. virginiana (Keith et al,.1984). Кроме того, в ходе данной работы были получены первичные культуры фибробластов легкого самки и самца M. domestica. Культивирование клеток проводили в условиях, описанных в работе Shevchenko et al. (2007).

5. Приготовление препаратов метафазных хромосом производили по стандартному протоколу, описанному в статье Shevchenko et al. (2007).

6. Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Флуоресцентная гибридизация in situ была выполнена на основе метода Пинкеля (Pinkel et al., 1986; Lichter et al., 1988). В качестве зондов использовали ДНК BAC-клонов, меченную биотин-16-dUTP или дигоксигенин-11-dUTP методом ник-трансляции с помощью набора фирмы Roсhe, согласно протоколу фирмы-производителя. Анализ препаратов проводили через интерференционный фильтр на флуоресцентном микроскопе NIKON X100. Обработку изображения проводили с помощью программного обеспечения фирмы Imstar и программы Adobe Photoshop 8,0 (Adobe Systems).

8. Иммунофлуоресцентное окрашивание метафазных хромосом проводили по стандартному протоколу (Chaumeil et al., 2002; Chaumeil et al., 2004) с небольшими модификациями. В работе использованы антитела: H3K4me2, 07-030, Upstate (Millipore); H3K27me3, 05-851, Upstate (Millipore); H3K9me3, ab-6001, Abcam; H3K9ac, 07-352, Upstate (Millipore); Alexa Fluor 568 anti rabbit IgG (H+L), A11011, Molecular Probe (Invitrogene); Alexa Fluor 488 anti rabbit IgG (H+L), A11008, Molecular Probe (Invitrogene). Для окрашивания хромосом использовали раствор DAPI в Vectashield Mounting Medium (Vector Laboratories). Анализ препаратов проводили на флуоресцентном микроскопе NIKON X100 с помощью программного обеспечения фирмы Imstar. Для каждой модификации хроматина было проанализировано от 30 до 50 метафазных пластинок. Построение профилей интенсивности сигнала флуоресценции антител к модификациям хроматина производилось с помощью программы ISIS MetaSystems.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ


1. Получение зондов и скрининг ВАС-библиотек. Анализ базы данных проекта по секвенированию генома опоссума M. domestica не позволил обнаружить последовательности генов-ортологов центра инактивации, не дал информации о локализации на Х-хромосоме, порядке и взаимном расположении окружающих генов: G6pd, Rbmx, Sox3, Hprt, Pgk1. Кроме того, последовательности, сцепленные с ортологами Chic1 и Slc16a2, представлены в базе данных не достаточно полно. Поэтому в данной работе был проведен скрининг трех ВАС-библиотек зондами, которые представляли собой участки Х-сцепленных генов, фланкирующих центр инактивации Chic1 и Slc16a2, и других генов Х-хромосомы: Sox3, Rbmx, Pgk1, G6pd, Hprt. Зонды для всех генов были получены с помощью ПЦР кДНК M. domestica или геномной ДНК, выделенной из культуры клеток FMDL M. domestica. Наличие соответствующих генов в выявленных в результате скрининга позитивных клонах было подтверждено частичным секвенированием. Название, длина и генетическое содержание изолированных ВАС-клонов опубликованы в работе Shevchenko et al., (2007).

2. Сравнительное картирование Х-хромосом опоссумов

2.1. Установление порядка генов. В ходе выполнения задачи по сравнительному картированию Х-хромосом M. domestica и D. virginiana впервые были установлены порядок и взаимное расположение генов Sox3, Rbmx, Chic1, Slc16a2, Pgk1, G6pd, Hprt на Х-хромосомах данных видов опоссумов. Для этого была проведена ДНК-FISH на обычных и механически растянутых хромосомах с использованием в качестве зондов отдельных ВАС-клонов, содержащих соответствующие гены (рис. 1). Небольшая акроцентричесая Х-хромосома M. domestica имеет следующий порядок генов: G6pd и Chic1 локализуются вблизи центромеры и в проксимальной области Х-хромосомы, Hprt, Rbmx, Sox3 – в центре большого плеча, Slc16a2, Pgk1 – в дистальной области. Таким образом, гены Chic1 и Slc16a2, которые являются тесно сцепленными и фланкируют ген Xist у всех изученных видов плацентарных млекопитающих, разделены на Х-хромосоме M. domestica. У D. virginiana эти гены также разделены: Chic1 локализуется на коротком плече Х-хромосомы, в то время как Slc16a2 – в теломерном районе длинного плеча (рис. 2).

2.2. Построение и анализ контигов ВАС-клонов, окружающих гены Slc16a2 и Chic1 M. domestica и D. virginiana. Для реализации задачи по поиску ортолога гена Xist у опоссумов было проведено исследование организации последовательностей, окружающих гены Slc16a2 и Chic1, ортологи которых у плацентарных тесно сцеплены с Xist. Нуклеотидные последовательности, фланкирующие встройку в рекомбинантной ДНК ВАС-клонов, дающих позитивные ответы на ген-специфические зонды Slc16a2 и Chic1, были идентифицированы с помощью секвенирования при использовании универсальных праймеров T7 и SP6. Каждый участок с определенной нуклеотидной последовательностью (“конец ВАС-клона”) был проанализирован программой RepeatMasker (Pearson and Lipman, 1988) для обнаружения и маскировки повторов. На уникальные участки последовательностей были подобраны праймеры. Последовательности праймеров, использованных для ориентироки ВАС-клонов, окружающих гены Сhic1 и Slc16a2 M. domestica и D. virginiana, опубликованы в работе Shevchenko et al., (2007). Полученные ПЦР-продукты были тестированы с помощью Саузерн-блот гибридизации с геномной ДНК опоссумов, гидролизованной рестриктазой EcoRI, для того, чтобы убедиться в уникальности паттерна гибридизации и затем использовать эти пробы для дальнейшего скрининга ВАС-библиотек.

Каждый вновь изолированный клон был проверен с помощью FISH, чтобы убедиться, что он имеет ту же самую локализацию на Х-хромосомах опоссумов, что и исходный ВАС-клон, последовательность конца которого служила в качестве зонда. Взаимное расположение BAC-клонов, полученных в результате прогулки по хромосоме, определяли c помощью блот-гибридизации, используя зонды на участки, фланкирующие встройки BAC-клонов и различные экзоны последовательностей генов Chic1 и Slc16a2.

Таким образом, были получены контиги, окружающие гены Slc16a2 и Chic1 у M. domestica и D. virginiana, которые затем по возможности дополнили последовательностями (рис. 3), полученными в результате выполнения проекта по секвенированию генома M. domestica (http://genome.ucsc.edu/ и http://www.ensembl.org/) и другими доступными последовательностями. Полное секвенирование ВАС-клонов OM 191G11, OM 158F12, OM 068C1, LBNL3 266N1 и VMRC-6 529L22 было проведено в Wellcome Trust Sanger Institute, Cambridge, UK. Последовательности доступны в EMBL под номерами: CR385029, CR387999, CR387990, CU075922 и CR753179 соответственно.

При анализе ДНК BAC-клонов обнаружено, что последовательности, окружающие ген Slc16a2, не имеют гомологии как с XIC млекопитающих, так и с предковыми последовательностями этого локуса, выявленными у курицы. Окружение Slc16a2 составляют хорошо известные X-сцепленные гены, относящиеся к консервативному району центра инактивации Х-хромосомы.

В последовательностях за 3’-границей гена Chic1 у опоссумов обнаруживается гомология к генам Fip1 и Lnx3, которые присутствуют в ортологичном локусе на хромосоме 4 курицы.

Кроме того, был проведен BLAST-поиск гомологии с последовательностями гена Xist плацентарных, а также с районами консервативных А-повторов во всех версиях базы данных проекта по секвенированию генома M. domestica: MonDom1 (октябрь 2004) (http://www.broadinstitute.org/mammals/opossum), MonDom4 (январь 2006) и MonDom5 (октябрь 2006) (http://www.ensembl.org/Monodelphis_domestica/Info/Index). В результате не было получено статистически значимых гомологий к последовательностям гена Xist и других генов центра инактивации.

3. Отсутствие прямого ортолога гена Xist у опоссумов. Таким образом, в результате проведенного картирования генов показано, что X-хромосомы опоссумов в ходе эволюции претерпели перестройки, в результате которых гены Chic1 и Slc16a2, тесно сцепленные у курицы и плацентарных млекопитающих, оказались разделены на Х-хромосомах опоссумов. При этом у D. virginiana имеется дополнительная по сравнению с M. domestica инверсия, в результате которой Cdx4 и Chic1 были перенесены на малое плечо Х-хромосомы и отдалены центромерой и блоком прицентромерного гетерохроматина от основной массы Х-сцепленных генов, таких как Sox3, Rbmx, Slc16a2, Pgk1, G6pd and Hprt, облигатно подвергающихся инактивации у плацентарных млекопитающих. Можно отметить, что у D. virginiana ген G6pd, избегающий инактивации, располагается ближе к генам Cdx4 и Brx, чем инактивирующийся ген Pgk1, тесно сцепленный с Slc16a2.

Показано, что картированные ранее на Х-хромосоме опоссумов гены Lnx3 и Rasl11c (Duret et al., 2006) непосредственно сцеплены с геном Chic1. Ген Fip1 сильно дивергировал и не является функциональным геном, тогда как ген Lnx3 продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания (Duret et al.,

 Сравнительное картирование Х-хромосом M. domestica и D.-0

 Сравнительное картирование Х-хромосом M. domestica и D. virginiana-1

Рис. 1. Сравнительное картирование Х-хромосом M. domestica и D. virginiana (по Shevchenko et al., 2007). Стрелка указывает на положение центромеры. Слева на идиограммах Х-хромосом показан G-бэндинг (по Nesterova et al., 1997, Sinha, Kakati, 1976).

 Схематическое изображение сравнительной локализации генов G6pd,-2

Рис. 2. Схематическое изображение сравнительной локализации генов G6pd, Cdx4, Chic1, Fip1, Lnx3, Hprt, Rbmx, Sox3, Slc16a2 и Pgk1 на хромосоме 4 курицы (Gallus gallus), Х-хромосомах M. domestica, D. virginiana и Homo sapiens (Shevchenko et al., 2007). На Х-хромосоме человека показано только плечо Xq. Гены-ортологи показаны одинаковым цветом. Относительное положение центромеры показано черным овалом.

 Схематическое изображение геномных контигов, окружающих гены-3

 Схематическое изображение геномных контигов, окружающих гены Chic1-4

Рис. 3. Схематическое изображение геномных контигов, окружающих гены Chic1 (A) и Slc16a2 (Б) M. domestica и D. virginiana (Shevchenko et al., 2007). Сплошные линии представляют собой ВАС-клоны, используемые в работе, и их взаимное расположение. Рядом указаны названия ВАС-клонов. АС190120 взят из базы EMBL. Звездочки на линиях ВАС-клонов показывают локализацию зондов, используемых для определения взаимного расположения ВАС-клонов. Числа над звездочками соответствуют номерам пар праймеров, используемых для ориентироки ВАС-клонов, пары праймеров для зондов 3 и 9 соответствуют специфическим праймерам Chic1 и Slc16a2, используемым при получении зондов для скрининга геномных ВАС-библиотек опоссумов. Обведенные в кружок номера пар праймеров использовали для получения зондов при «прогулке по хромосоме». Линии с ромбиками представляют собой доступные последовательности. Сплошные линии с ромбиками – последовательности, определенные в данной работе. Пунктирные линии с ромбиками – последовательности, полученные из проекта по секвенированию генома M. domestica. Жирная пунктирная линия – район, в котором нуклеотидные последовательности определены не полностью. Боксы соответствуют позициям идентифицированных генов, стрелки над ними показывают предсказанное направление транскрипции.

 Модификации хроматина H3K4me2 и H3K9me3 в перевиваемой культуре-5

 Модификации хроматина H3K4me2 и H3K9me3 в перевиваемой культуре-6

Рис. 4. Модификации хроматина H3K4me2 и H3K9me3 в перевиваемой культуре фибробластов самки и самца M. domestica. (А) Самка, H3K4me2 - зеленый. (Б) Самка, H3K9me3 - красный. (В) Самец, H3K4me2 - зеленый. (Г) Самец, H3K9me3 - красный. Окраска хромосом – DAPI. Увеличенное изображение активной и неактивной Х-хромосом самки (Д), (Е) и активной Х-хромосомы самца (Ж), профили интенсивности флуоресценции DAPI (синий), H3K4me2 (зеленый) и H3K9me3 (красный).

 Модификации хроматина H3K9me3 и H3K27me3 в первичной культуре-7

 Модификации хроматина H3K9me3 и H3K27me3 в первичной культуре-8

Рис. 5. Модификации хроматина H3K9me3 и H3K27me3 в первичной культуре фибробластов самки и самца M. domestica. (А) Самка, H3K9me3 - красный. (Б) Самка, H3K27me3 - зеленый. (В) Самец, H3K9me3 - красный. (Г) Самец, H3K27me3 - зеленый. Увеличенное изображение активной и неактивной Х-хромосом самки (Д), (Е) и активной Х-хромосомы самца (Ж), профили интенсивности флуоресценции DAPI (синий), H3K9me3 (красный) и H3K27me3 (зеленый).

2006) и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Таким образом, у сумчатых, несмотря на наличие у них процесса инактивации, предполагаемый район локализации XIC не гомологичен XIC млекопитающих, а имеет сходство с генами Fip1 и Lnx3 курицы и, очевидно, не выполняет функций центра инактивации. Следует особо подчеркнуть, что дивергировавшие фрагменты гена Fip1 и ген Lnx3 опоссумов гомологичны соответствующим генам курицы лишь на 60% и практически утратили сходство с генами Tsx и Xist плацентарных млекопитающих, которое было отмечено для генов Fip1 и Lnx3 курицы (Duret et al., 2006). Существует небольшая вероятность, что район, содержащий гены Fip1, Lnx3, Rasl11c был дуплицирован на Х-хромосомах опоссумов, и другая еще не изученная копия этого района окажется более сходной с геном Xist, чем та, которая исследована. О такой возможности свидетельствует, например, произошедшая в данном районе генома у опоссумов дупликация гена Cdx4. Тем не менее, полученные к настоящему моменту результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена. В заключение можно отметить, что мы не отрицаем полностью возможность участия какой бы то ни было РНК в процессе инактивации Х-хромосомы у сумчатых, так как этот процесс у опоссумов сопровождается модификациями хроматина, такими как ацетилирование гистонов и поздняя репликация, установление которых зачастую связано с некодирующими ядерными РНК.

4. Модификации хроматина Х-хромосом у сумчатых. Известно, что у сумчатых, в отличие от плацентарных, инактивация Х-хромосомы является неполной и тканеспецифичной. Еще одной особенностью инактивации Х-хромосом сумчатых является реактивация неактивной Х-хромосомы в перевиваемой культуре клеток. Поэтому в работе по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом M. domestica наряду с перевиваемыми культурами фибробластов легкого, полученными ранее в лаборатории, использовали первичные культуры фибробластов легкого самки и самца. Изначально все клетки в перевиваемых культурах имели диплоидный набор хромосом, однако в процессе длительного культивирования в большинстве клеток произошла полиплоидизация, и клетки приобрели тетраплоидный набор хромосом. При этом в ряде случаев в перевиваемых культурах наблюдается элиминация хромосом, в том числе половых. В экспериментах с использованием первичных культур анализировали 30 метафазных пластинок, с использованием перевиваемых культур – 50. Применяемые антитела широко используются в исследованиях модификаций хроматина у млекопитающих, кроме того, специфическая гибридизация с определенными районами модифицированных гистонов была проверена в лаборатории в культурах клеток человека, мыши и полевки.

4.1. Модификации, характерные для активного хроматина. Известно, что неактивная Х-хромосома человека, мыши и других плацентарных имеет сниженный уровень модификаций активного хроматина: диметилированного H3K4 и ацетилированного H3K9 (Heard et al., 2001; Boggs et al., 2002; Okamoto et al., 2004). Такие же модификации характерны и для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК (см. Delaval, Feil, 2004). В результате проведенного иммунофлуоресцентного окрашивания препаратов метафазных хромосом перевиваемой культуры фибробластов опоссумов антителами к модификацям активного хроматина обнаружено, что Х-хромосомы окрашиваются с различной степенью интенсивности (рис. 4, А, В, Д, Е, Ж).

Для плацентарных известно, что Х-хромосома, имеющая позитивный сигнал гибридизации с антителами к модификациям активного хроматина, является транскрипционно активной, а Х-хромосома, не имеющая такого сигнала – инактивированной (Heard et al., 2001; Boggs et al., 2002; Okamoto et al., 2004). В данной работе показано, что у самок M. domestica одна из двух Х-хромосом окрашивается антителами к маркерам транскрипционно активного хроматина и, следовательно, является транскрипционно активной, в то время как другая Х-хромосома не окрашивается антителами к данным модификациям и является транскрипционо неактивной. Так, для ацетилированного H3K9 выявляется как практически не окрашенная Х-хромосома, так и Х-хромосома, имеющая более интенсивную окраску. Т.е., как и у плацентарных, у сумчатых неактивная Х-хромосома гипоацетилирована по H3K9. При иммунофлуоресцентном окрашивании антителами к диметилированному H3K4 (рис. 4, А, В, Д, Е, Ж) также хорошо видны различия в интенсивности окраски половых хромосом. В культуре клеток самки выявляется обогащенная диметилированным H3K4 активная Х-хромосома, а также неактивная Х-хромосома, практически не окрашенная антителами к данной модификациии активного хроматина, т.е. гипометилированная по H3K4 (рис. 4, Д, Е). Единственная активная Х-хромосома самца имеет яркую окраску (рис. 4, В, Ж).

4.2. Модификации, характерные для неактивного хроматина. Известно, что неактивная Х-хромосома человека, коровы, полевки является позднореплицирующейся и обогащена модификациями неактивного хроматина, в частности, триметилированным H3K9 и триметилированным H3K27. При этом характер распределения по хромосоме данных модификаций различен, поскольку они принадлежат к двум разным системам сайленсинга (Chadwick et al., 2004; Шевченко и др., 2006; Coppola et al., 2008; Shevchenko et al, 2009). Триметилированный H3K27 выявляется на неактивной Х-хромосоме в обогащенных генами G-негативных бэндах (Chadwick et al., 2004; de Napoles et al., 2004; Smith et al., 2004; Coppola et al., 2008) и совпадает с локализацией РНК гена Xist. Триметилированным H3K9 обогащены G-позитивные бэнды неактивной Х-хромосомы. Кроме того, данная модификация неактивного хроматина выявляется в районах прицентромерного гетерохроматина на обеих Х-хромосомах и на аутосомах, а также в их теломерных районах (Chadwick et al., 2004; Coppola et al., 2008). Модификации триметилированный H3K9 и триметилированный H3K27 также характерны для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК (см. Delaval, Feil, 2004).

В данной работе с помощью 5-бромдезоксиуридина показано, что в культуре клеток самки M.domestica присутствует поздно реплицирующаяся Х-хромосома. Известно, что поздно реплицирующаяся Х-хромосома у самок сумчатых выявляется во всех тканях и эта Х-хромосома является неактивной (Cooper et al., 1993).

С помощью иммунофлуоресцентного окрашивания проанализирован характер распределения модификаций неактивного хроматина на препаратах метафазных хромосом опоссумов.

При одновременном окрашивании метафазных хромосом опоссума антителами к модификациям активного (диметилированный H3K4) и неактивного (триметилированный H3K9) хроматина показано, что неактивная Х-хромосома, не окрашенная диметилированным H3K4, обогащена маркером неактивного хроматина - триметилированным H3K9. (рис. 4, А, В, Е). Активные Х-хромосомы и самки, и самца имеют ярко окрашенный бэнд в прицентромерном районе, кроме того, при построении профилей интенсивности флуоресценции выявляются пики в прителомерном районе и в центре большого плеча (рис. 4, Б, Г, Д, Ж, 4, А, В, Д, Ж). На аутосомах M.domestica триметилированный H3K9 выявляется в виде бэндинга.

Кроме того, обнаружено, что, в отличие от плацентарных, у опоссумов в культуре клеток обе Х-хромосомы триметилированы по H3K27 (рис. 5, Б). При солокализации с триметилированным Н3К9, который позволяет различать активную и неактивную Х-хромосомы, показано, что неактивная Х-хромосома окрашивается триметилированным H3K27 более интенсивно, чем активная (рис. 5, Д, Е). Кроме того, стоит отметить, что, в отличие от плацентарных, у M.domestica триметилированный H3K27 имеет обширное распространение на аутосомах: распределяется в виде бэндов, локализуется в центромерных и теломерных районах хромосом (рис. 5, Б, Г).

4.3. Общие тенденции в распределении модификаций хроматина Х-хромосом у сумчатых. Наряду с результатами, полученными в данной работе, в 2009 году были опубликованы две работы по исследованию модификаций хроматина Х-хромосом сумчатых. В первом случае было показано, что на метафазных хромосомах в культуре фибробластов взрослых животных M. eugenii гетерохроматиновые районы коротких плеч обеих Х-хромосом обнаруживают позитивное окрашивание антителами к триметилированному Н3К9, в то время как длинные плечи, имеющие районы гомологии с Х-хромосомой человека, - позитивное окрашивание антителами к триметилированному H3K27.

Также отмечен повышенный уровень триметилированного H3K27 на одной из двух Х-хромосом, что связывали с разной степенью компактизации хроматина активной и неактивонй Х-хромосом (Koina et al., 2009). Обогащения неактивной Х-хромосомы триметилированным H3K9 не было обнаружено.

В другой работе на интерфазных ядрах первичной культуры клеток мозга и печени взрослых животных M. domestica выявлена струкура, обогащенная триметилированным H3K27, имеющая солокализацию с неактивной Х-хромосомой (Mahadevaiah et al., 2009).

В данной работе впервые проведено исследование модификаций хроматина с использованием метафазных хромосом M.domestica. Суммируя данные по распределению модификаций хроматина Х-хромосом опоссума, можно заключить, что, несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, на неактивной Х-хромосоме M.domestica присутствуют модификации хроматина, характерные для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК, - триметилирование H3K27, гипоацетилирование H3K9 и гипометилирование H3K4.

Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы Xist-независимой модификацией - триметилированным H3K9. Известно, что триметилированный H3K9 вместе с триметилированным H4K20 и гетерохроматин-специфическим белком HP1 вовлечен в систему мейотического сайленсинга и выявляется в постмейотическом половом хроматине. На человеке, мыши, полевке и крысе показано, что триметилированный H3K9 выявляется в G-позитивных бэндах и не солокализуется с районами обогащения РНК Xist. По-видимому, у сумчатых в связи с отсутствием ортолога нкРНК Xist факультативный гетерохроматин, обогащенный тирметилированым H3K9, выполняет основную функцию поддержания неактивного состояния инактивированной Х-хромсомы. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования H3K27 и триметилирования H3K9.

5. Механизмы инактивации X-хромосомы у сумчатых и плацентарных млекопитающих отличаются и, вероятно, имеют независимое происхождение. Несмотря на определенные сходства, импринтированная инактивация у плацентарных и сумчатых, очевидно, имеет разные механизмы. Совершенно определенно можно сказать, что этот процесс у сумчатых происходит без участия центра инактивации и гена Xist, а, следовательно, можно предполагать, что механизмы инактивации у Methateria и Eutheria имеют независимое происхождение. О механизме инактивации X-хромосомы у Methateria известно очень мало. Предполагают, что у сумчатых неактивное состояние генов на X-хромосоме отцовского происхождения устанавливается во время мейотической инактивации X и Y хромосом в гаметогенезе у самцов, а затем передается в зиготу (Cooper et al., 1993). Однако коровые гистоны вместе с эпигенетическими сведениями о транскрипционном статусе хроматина при упаковке хромосом в спермии замещаются на протамины, а метилирование CpG островков ДНК, использующееся для наследования неактивного статуса, у Х-сцепленных генов не обнаруживается (Hornecker et al., 2007). Таким образом, неясно, как неактивное состояние хроматина после мейотической инактивации передается в зиготу. В противовес данной гипотезе в недавней работе было показано, что у M. domestica Х-хромосомные гены, вовлеченные в мейотический сайленсинг, реактивируются после мейоза и подвергаются последующей инактивации у самки (Mahadevaiah et al., 2009). Альтернативное предположение состоит в том, что у сумчатых могла независимо эволюционировать какая-либо другая нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist (Shevchenko et al., 2007; McCarrey et al., 2009). Однако обнаружено, что нетранслируемые ядерные РНК, использующиеся для импринтированного сайленсинга аутосомных генов у мыши, не требуются для импринтинга моноаллельной экспрессии трех изученных ортологичных генов у сумчатых и попросту у них отсутствуют (Weidman et al., 2006), так же как и Xist. У плацентарных, по крайней мере, у мыши, импринтированная инактивация происходит с участием XIC и Xist, независимо от процесса мейотической инактивации у самцов. Более того, вместо импринтинга, предрасполагающего к инактивации X-хромосому отцовского происхождения, в XIC обнаружен импринтинг, предотвращающий экспрессию Xist и защищающий от инактивации X-хромосому материнского происхождения (см. Heard, Disteche, 2006). Основываясь на этих данных, очень сложно восстановить картину эволюционных преобразований механизма данного процесса от импринтироаннной инактивации у сумчатых до случайной инактивации у плацентарных. Очевидно, что в ходе эволюции контроль над процессом инактивации у Eutheria перешел к образовавшемуся у них центру инактивации и гену Xist, возникла случайная инактивация. Импринтированная инактивация у плацентарных в одних таксонах сохранилась (например, у грызунов), тогда как в других (например, у человека) стала деградировать.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

У плацентарных млекопитающих дозовая компенсация обеспечивается посредством инактивации одной из двух Х-хромосом у самок. Этот процесс регулируется работой центра инактивации и его ключевым геном Xist, экспрессия которого приводит к привлечению модификаций хроматина, обеспечивающих инактивацию транскрипции. У самок сумчатых млекопитающих также наблюдается процесс инактивации Х-хромосомы, однако обнаружить у них ортолог гена Xist с помощью молекулярной гибридизации не удавалось, а сведения о модификациях хроматина Х-хромосом были неполные и противоречивые. Известно, что у всех исследованных видов плацентарных млекопитающих ген Xist фланкируют два консервативных белок-кодирующих гена: Chic1 и Slc16a2. Сцепление этих генов выявляется также на 4-ой хромосоме у курицы, между ними располагаются два белок-кодирующих гена: Fip1 и Lnx3. Ген Lnx3 имеет частичную гомологию с РНК Xist и рассматривается как предшественник гена Xist. В данной работе показано, что гены Chic1 и Slc16a2 у двух видов американских опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana удалены друг от друга в результате хромосомных перестроек. При анализе последовательностей ДНК в окружении гена Chic1 сумчатых обнаружена гомология с белок-кодирующими генами Fip1 и Lnx3, которые являются эволюционными предшественниками генов центра инактивации. Ген Lnx3 сумчатых продуцирует мРНК, имеет нативную открытую рамку считывания, и, очевидно, функционирует как белок-кодирующий ген, а не как нетранслируемая ядерная РНК, подобная Xist. Полученные результаты свидетельствуют, что у опоссумов не существует прямого ортолога гена Xist, и инактивация Х-хромосомы у сумчатых, в отличие от плацентарных млекопитающих, происходит без участия данного гена.

Для выяснения того, как же тогда происходит инактивация Х-хромосомы у сумчатых, и какой механизм управляет этим процессом, в данной работе были исследованы модификации хроматина Х-хромосом сумчатых. У плацентарных первыми модификациями инактивируемой Х-хромосомы, появление которых напрямую зависит от экспрессии РНК гена Xist, являются: гипометилирование гистона Н3 по лизину в положении 4 (H3K4), гипоацетилирование гистона Н3 по лизину в положении 9 (H3K9), метилирование гистона H3 по лизину в положении 27 (H3K27). Кроме того, эти модификации аналогичным образом задействованы в регуляции импринтированной моноаллельной экспрессии генов, сайленсинг которых также связан с некодирующей РНК. В данной работе показано, что у сумчатых, несмотря на отсутствие некодирующей РНК Xist, для осуществления процесса инактивации привлекаются данные модификации.

Кроме того, в данной работе впервые на сумчатых показано обогащение неактивной Х-хромосомы Xist-независимой модификацией - триметилированным H3K9. Вероятно, основную функцию поддержания неактивного состояния инактивированной Х-хромсомы у сумчатых, при отсутствии ортолога нкРНК Xist, выполняет факультативный гетерохроматин, обогащенный триметилированным H3K9. Таким образом, в систему инактивации Х-хромосомы сумчатых вовлечены универсальные механизмы генетического сайленсинга с участием двух типов модификаций хроматина: триметилирования H3K27 и триметилирования H3K9.

ВЫВОДЫ


  1. Проведено сравнительное картирование Х-хромосом двух видов американских опоссумов M. domestica и D. virginiana и показано, что гены Chic1 и Slc16a2, тесно сцепленные и фланкирующие ген Xist у плацентарных, у опоссумов разделены в результате независимых инверсий, которые происходили в эволюции Х-хромосом данных видов.
  2. При анализе последовательностей ДНК в окружении генов Chic1 и Slc16a2 опоссумов и последовательностей, представленных в проектах по секвенированию генома M. domestica, не обнаружено прямого ортолога гена Xist.
  3. Показано, что на расстоянии около 20 т.п.н. после 3’-границы Chic1 у исследуемых видов имеется фрагментарная гомология с последовательностью гена Fip1 – предполагаемого эволюционного предшественника Tsx. У M. domestica обнаружен участок, идентичный двум экзонам гена Lnx3 – эволюционного предшественника гена Xist. Таким образом, можно утверждать, что процесс инактивации у сумчатых происходит без участия ортолога гена Xist.
  4. Несмотря на отсутствие прямого ортолога гена Xist, у M. domestica на неактивной Х-хромосоме присутствуют модификации хроматина, которые характерны для неактивной Х-хромосомы плацентарных, а также для инактивированных аутосомных генов с импринтированной моноаллельной экспрессией, сайленсинг которых связан с транскрипцией некодирующей РНК: гипоацетилирование H3K9, гипометилирование H3K4, триметилирование H3K27.
  5. Впервые показано, что у сумчатых неактивная Х-хромосома обогащена триметилированным H3K9.
  6. Показано, что модификация неактивного хроматина триметилированный H3K27, в отличие от плацентарных, у M. domestica выявляется как на неактивной, так и на активной Х-хромосоме.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

  1. Shevchenko A.I., Zakharova I.S., Elisaphenko E.A., Kolesnikov N.N., Whitehead S., Bird C., Ross M., Weidman J.R., Jirtle R.L., Karamysheva T.V., Rubtsov N.B., VandeBerg J.L., Mazurok N.A., Nesterova T.B., Brockdorff N. & Zakian S.M. Genes flanking Xist in mouse and human are separated on the X chromosome in American marsupials // Chromosome Research. 2007. V. 15. P. 127–136. (Перечень ВАК.)
  2. Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Zakian S.M. Monoallelic gene expression in mammals // Chromosoma. 2009. V. 118. P. 279–290. (Перечень ВАК.)
  3. Захарова И.С. Сравнение последовательностей белок-кодирующих генов сумчатых. // XLI Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. 2003. С.14.
  4. Захарова И.С. Исследование организации и инактивации Х хромосомы сумчатых. // XI Международная научная конференция для студентов, аспирантов и молодых ученых, «Ломоносов-2004». Москва. 2004. С. 51-52.
  5. Захарова И.С. Сравнительное картирование Х хромосом двух видов сумчатых опоссумов Monodelphis domestica и Didelphis virginiana. // XLII Международная научная студенческая конференция «Студент и научно-технический прогресс». Новосибирск. 2004. С. 48.
  6. Zakharova I.S., Shevchenko A.I., Elisaphenko E.A., Ross M., Weidman J., Jirtle R., Vandeberg J., Nesterova T., Karamysheva T., Rubtsov N., Zakian S, Brockdorff N. Protein-coding genes surrounding Xist in mouse and human are separated in the American marsupials Monodelphis domestica and Didelphis virginiana // 2nd Conference on X-inactivation. Paris. 2006. P.99
  7. Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А. Как происходит инактивация Х хромосомы у сумчатых. // Сборник материалов Международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии». Томск. 2007. С.74.
  8. Захарова И.С., Шевченко А.И., Елисафенко Е.А., Шилов А.Г. и Закиян С.М. Особенности организации и инактивации Х-хромосом у сумчатых опоссумов. // Материалы международной конференции «Хромосома 2009». Новосибирск. 2009. С.95.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.