Индивидуальные морфофункциональные различия реакции иммунной системы крыс вистар при воздействии информационной нагрузки и липополисахарида

На правах рукописи

Яблонская Анна Михайловна

ИНДИВИДУАЛЬНЫЕ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ РАЗЛИЧИЯ РЕАКЦИИ ИММУННОЙ СИСТЕМЫ КРЫС ВИСТАР ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ИНФОРМАЦИОННОЙ НАГРУЗКИ И ЛИПОПОЛИСАХАРИДА

03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2009

Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научные руководители:

доктор медицинских наук,

профессор Макарова Ольга Васильевна

доктор биологических наук,

доцент Кондашевская Марина Владиславовна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Болтовская Марина Николаевна

доктор медицинских наук,

профессор Ванько Людмила Викторовна

Ведущее учреждение:

ГОУ ВПО Московская медицинская академия им И.М. Сеченова

Защита диссертации состоится «26» февраля 2009 г. в 14.00 час на заседании диссертационного совета (Д.001.004.01) ГУ НИИ морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул. Цюрупы, д. 3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ морфологии человека РАМН

Автореферат разослан « » января 2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук Л.П. Михайлова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

В механизмах развития адаптивных и дизадаптивных реакций ключевую роль играют генотипические особенности организма, а именно полиморфизм генов главного комплекса гистосовместимости, определяющих силу иммунного ответа, а также замена единичных нуклеотидов (single nucleotide polymorphism - SNP) (Бочков Н.П. и соавт., 2004, Глотов О.С., Баранов В.С., 2007). Генетический полиморфизм индивидов определяет индивидуальные различия реакции организма при воздействии стрессорных факторов и предрасположенность к развитию заболеваний, особенности их патогенетических механизмов, клинических и морфологических проявлений (Середенин С.Б., 2003; Сибиряк С.В. и соавт., 2003, Пирузян Л.А., 2004; Макарова О.В., Михайлова Л.П., 2008).

Анализ генетических основ, обуславливающих индивидуальные различия реакции организма, задача сложная, и, кроме того, генетическая предрасположенность определяет развитие заболеваний только на 20-40%, а 60-80% обусловлены фенотипическими особенностями (МакКонки Э., 2008). Индивидуальные различия реакции организма на воздействие стрессорных факторов особенно ярко проявляются при функциональных нагрузках, которые могут вызывать развитие как физиологических, так и патологических стрессорных реакций (Баевский Р.М., 1979; Казначеев В.П., 1986).

В связи с постоянным ускорением темпа жизни, компьютеризацией, увеличением коммуникативных связей все большее значение в развитии стрессорных реакций приобретает информационное воздействие. Информационный стресс вызывает изменение функционального состояния организма, развивающееся в условиях неблагоприятного сочетания факторов информационной триады: объема информации, подлежащей обработке с целью принятия решений; фактора времени (дефицит времени); высокой мотивацией принятия оптимального решения (Крыжановский Г.Н., 2002). Однако влияние информационного стресса на иммунную систему изучено недостаточно. В работе М.В. Кондашевской (2005) на основании данных морфологического исследования показано, что информационная нагрузка в условиях многоальтернативного лабиринта вызывает у крыс активацию морфофункционального состояния органов иммунной системы.

В связи с достижениями иммунологии и расширением представлений о механизмах врожденного и приобретенного иммунитета в последнее десятилетие все больший интерес исследователей привлекает изучение генетической основы индивидуальных различий иммунного ответа при инфекционно-воспалительных заболеваниях (Симбирцев А.С., 2005; Wurfel M.M. et al., 2005; Parry C.S., Brooks B.R., 2008). Наиболее продуктивными в этом плане являются исследования различий реакции иммунной системы у особей с преобладанием Тх1 или Тх2-типа иммунного ответа, который, во многом, определяет клинико-морфологические и иммунологические особенности воспалительного процесса (Spellberg B., Edwards J., 2001).

В развитии адаптивных процессов и воспалительных заболеваний важную роль играет эндотоксинемия и состояние антиэндотоксинового иммунитета (Мишнев О.Д. и соавт., 2003; Мешков М.В. и соавт., 2007; Писарев В.Б. и соавт., 2008). Одним из ключевых факторов антиэндотоксинового иммунитета является липополисахарид (ЛПС), который при гибели грамотрицательных бактерий переходит в свободное состояние, что приводит к развитию воспалительного ответа в основном за счет его наиболее токсичной составляющей – липида А (Becker S. et al., 2002). В работах последних лет показано, что выраженность иммунологических и воспалительных реакций на ЛПС генотипически обусловлена (Wang X. et al., 2002). Исследование генома лиц с высокой и низкой продукцией провоспалительных цитокинов выявило индивидуальные различия 80 генов, экспрессирующихся в присутствии ЛПС, и 21 гена, экспрессирующихся в отсутствии ЛПС (Wurfel M.M. et al., 2005).

Индивидуальные различия реакции на ЛПС могут быть обусловлены нуклеотидным полиморфизмом генов толл-подобных рецепторов (toll-like receptors TLR), нарушением экспрессии TLR, трансдукции сигнала, выработки эффекторных молекул и уровнем продукции ИЛ-17. Функциональный полиморфизм генов TLR связан с заменами единичных нуклеотидов (SNP), что приводит к снижению способности распознавания соответствующих лигандов, либо к нарушению проведения внутриклеточных сигналов, и в результате к менее выраженной активации клеток после взаимодействия с инфекционными агентами (Симбирцев А.С., 2005). В механизмах противоинфекционного иммунитета и, в частности, иммунного ответа на ЛПС, важную роль играет ИЛ-17, который продуцируется CD4(+) Т-клетками, вызывает нейтрофильную реакцию и стимулирует бактерицидную активность нейтрофилов, активирует остеокласты, повышая уровень -дефенсинов (Matsuzaki G., Umemura M., 2007). Также обсуждается роль ИЛ-17 в индукции Тх1 и Тх2-типа иммунного ответа (Matsuzaki G., Umemura M., 2007). Показано, что в результате генетически обусловленного снижения экспрессии рецепторов к ИЛ-17 на ранних стадиях инфицирования наблюдается менее выраженная активация защитных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета (Happel K.I. et al., 2003; Matsuzaki G. et al., 2007).

Основанная на использовании генетических методов оценка индивидуальных различий реакции иммунной системы при адаптивных и дизадаптивных процессах является трудной задачей. В связи с этим необходим поиск маркеров индивидуальных различий реакции иммунной системы, основанный на оценке изменения параметров эффекторной фазы иммунного ответа при стрессорных воздействиях.

Цель исследования – изучить в эксперименте индивидуальные морфофункциональные различия реакции иммунной системы при адаптации к информационной нагрузке и при дизадаптивном воспалительном ответе на введение высокой дозы липополисахарида.

Задачи исследования

1. Провести оценку структурно-функциональных изменений органов иммунной системы и цитокинового профиля крыс Вистар после обучения в многоальтернативном лабиринте.
2. Установить индивидуальные морфофункциональные различия реакции иммунной системы крыс Вистар, подвергавшихся информационной нагрузке.
3. Провести оценку структурно-функциональных изменений органов иммунной системы и цитокинового профиля крыс Вистар в ответ на введение высокой дозы липополисахарида.
4. Изучить индивидуальные морфофункциональные различия реакции иммунной системы крыс Вистар в ответ на введение высокой дозы липополисахарида.
5. Установить индивидуальные морфофункциональные различия реакции органов-мишеней крыс Вистар в ответ на введение высокой дозы липополисахарида.

Научная новизна

В работе впервые выявлены индивидуальные различия реакции иммунной системы при адаптивном процессе, обусловленном воздействием информационной нагрузки, и при дизадаптивном воспалительном, вызванном воздействием липополисахарида.

Установлено, что обучение крыс Вистар в многоальтернативном лабиринте (информационная нагрузка) вызывает активацию иммунной системы с поляризацией иммунного ответа преимущественно по Тх1-типу, что характеризуется акцидентальной инволюцией тимуса I-II стадии, гиперплазией белой пульпы селезенки с расширением светлых центров лимфоидных фолликулов и изменением цитокинового профиля с увеличением уровня продукции ИЛ-2 и ФНО-.

По сравнению с необучаемыми у обучаемых крыс Вистар активация иммунной системы в ответ на информационную нагрузку более выражена, что проявляется в расширении субкапсулярной зоны тимуса, увеличении индекса отношения объемной плотности белой пульпы селезенки к красной, повышении уровня ИЛ-12.

При воспалительном процессе, обусловленном воздействием липополисахарида, у крыс Вистар выявлены индивидуальные различия реакции иммунной системы, которые определяются выраженностью поляризации иммунного ответа по Тх1-типу. При поляризации иммунного ответа по Тх1-типу с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов (ИЛ-2, ИНФ-) выявляется выраженная активация центральных и периферических органов иммунной системы. При низкой продукции Тх1 цитокинов морфофункциональная активация органов иммунной системы менее выражена и сочетается с их альтеративными изменениями.

У крыс с низкой продукцией Тх1 цитокинов воспалительные и дистрофические изменения в органах-мишенях, легких и печени, более выражены по сравнению с группой животных с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов.

Научно-практическая значимость

Выявленные при воздействии физиологического и патологического стрессоров индивидуальные различия реакции органов иммунной системы следует учитывать при прогнозировании течения адаптивных реакций и дизадаптивных воспалительных процессов и их коррекции.

Результаты диссертационного исследования используются в лекционном курсе и при проведении практических занятий на кафедре гистологии, цитологии и клеточной биологии Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы и публикации

Основные результаты исследования доложены и обсуждены на научно-практической конференции по инфекционной патологии (Москва, 2007); научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (Москва, 2008); научной конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2008); Четвертом международном междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008); межлабораторной конференции в ГУ НИИ морфологии человека РАМН (декабрь, 2008г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, из них 1 статья в журнале, рекомендуемом ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 216 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 49 рисунками и 31 таблицей. Список литературы включает 308 источников, в том числе 219 зарубежных.

Материалы и методы исследования

В работе использованы 94 особи половозрелых крыс–самцов Вистар (питомник «Столбовая»). Масса тела экспериментальных животных составляла 200-230 гг. Все эксперименты выполнены в осенне-зимний период. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ГУ НИИ морфологии человека РАМН (протокол №5 от 12.03.2007).

Оценку морфофункциональных изменений органов иммунной системы при воздействии информационной нагрузки проводили, используя модель формирования сложного пищедобывательного поведения (обучение) в многоальтернативном лабиринте. Животных опытной группы (n=33) ежедневно в течение 15 сут помещали поодиночке на 13-15 мин в многоальтернативный лабиринт (Никольская К.А., 1978). В условиях свободного выбора крысы Вистар должны были сформировать сложный пищедобывательный навык в циклической форме. Пищевая депривация составляла 23 ч, доступ к воде был свободным.

В процессе обучения регистрировали двигательную активность (число пройденных отсеков), мотивационную активность (число заходов), число и виды ошибочных действий. Регистрацию и первичный анализ данных осуществляли с помощью программы Labyrinth (Никольская К.А. и соавт., 1995).

Используемая модель позволила разделить животных на группы обучаемых и необучаемых. Животные, самостоятельно сформировавшие трех-четырехзвенный условный рефлекс в циклической форме (переход из свободного поля в лабиринт, подкрепление в одной или двух из четырех имеющихся в лабиринте кормушек, выход в свободное поле), считались обученными.

Популяцию крыс контрольной группы (n=22) также подвергали пищевой депривации и ежедневно помещали на 1-2 ч в условия «жилой комнаты» в течение 15 сут, но не подвергали воздействию информационной нагрузки.

С целью изучения индивидуальных различий реакции иммунной системы и органов-мишеней у крыс Вистар моделировали воспалительный процесс. Животным опытной группы (n= 25) вводили ЛПС E.coli штамма O26:B6 (“Sigma”, США) в высокой дозе 20 мг/кг, которая по данным О.Д. Мишнева и соавт. (2003) является для крыс сублетальной. Крысам контрольной группы (n=14) внутрибрюшинно вводили физиологический раствор. Животных выводили из эксперимента на 1-е (n=10) и 7-е сут (n=15) после введения ЛПС. Выбор сроков забоя определялся тем, что в 1-е сут после введения ЛПС развиваются выраженные патологические изменения органов-мишеней (Писарев В.Б. и соавт., 2008), на 7-е сут острый воспалительный процесс и альтеративные изменения органов-мишеней прогрессируют или подвергаются обратному развитию (Диатроптов М.Е., 2006).

В группе животных, подвергавшихся информационной нагрузке, проводили забор тимуса и селезенки. В группе животных, подвергавшихся воздействию ЛПС, проводили забор печени, почек, тимуса и селезенки; для оценки воспалительных изменений в легких проводили цитологическое исследование бронхоальвеолярного смыва (БАС). В работе использован комплекс морфологических, культуральных, биохимических методов исследования.

Гистологические. Проводили забор печени, почки, тимуса, селезенки. Материал фиксировали в растворе Буэна в течение 24 ч, заливали в парафин, изготовляли гистологические срезы, окрашивали их гематоксилином и эозином. Гистологические срезы печени окрашивали по Маллори.

Гистохимические. Для выявления жировых включений криостатные срезы печени, фиксированной в 10% растворе забуференного формалина, окрашивали суданом III. Гистологические срезы почек окрашивали на гликопротеиды (ШИК-реакция).

Цитологические. Для получения БАС животным под эфирным наркозом через трахею вводили 5 мл 199 среды. Сразу после интратрахеального введения культуральную среду отсасывали. Объем отсасываемой жидкости («возврата») составлял 35-70% введенной. В камере Горяева подсчитывали абсолютное содержание клеточных элементов в 1 мл жидкости БАС. В мазках из жидкости БАС, окрашенных по Романовскому-Гимзе, проводили дифференцированный подсчет клеток на 200 клеточных элементов; полученные данные выражали в процентах (эндопульмональная цитограмма по А.П. Авцыну и соавт., 1982).

Морфометрические. Морфометрическое исследование тимуса и селезёнки проводили в гистологических препаратах, окрашенных гематоксилином и эозином. Объемную плотность функциональных зон тимуса и селезенки оценивали под световым микроскопом с помощью сетки Г.Г. Автандилова (1973). Ширину субкапсулярного слоя тимуса измеряли в микрометрах при ув. 640.

Легкие, тощую и подвздошную кишку животных фиксировали в 2% уксусной кислоте по методике J. Bienenstock и M.R. McDermott (2005). Через 18-24 ч с помощью сетки Г.Г. Автандилова (1973) под лупой проводили подсчет относительной доли лимфоидных фолликулов, ассоциированных с бронхами (БАЛТ), по отношению к поверхности продольно рассеченных бронхов. Площадь неинкапсулированной лимфоидной ткани (агрегированные и солитарные лимфоидные фолликулы), ассоциированной с кишечником (ЛТАК), выражали в процентах по отношению к площади поверхности кишки.

Культуральные. Для индукции синтеза и секреции цитокинов суспензию клеток селезёнки в концентрации 5х106/мл культивировали 24 ч в 1 мл полной ростовой среды с добавлением конканавалина А (5 мкг/мл) в 24-луночных культуральных планшетах при 37°С в атмосфере 5% СО2. По окончании инкубации отбирали надосадки, которые хранили в течение 1 мес при -20°С. Среда для культивирования спленоцитов состояла из RPMI 1640 (ПанЭко) с 5% инактивированной телячьей эмбриональной сыворотки, 2 мМ глутамина и 50 мкг/мл гентамицина.

Иммуноферментный анализ. В культуральной жидкости методом ИФА (тест-системы фирмы “Bio Source International”) определяли концентрацию интерлейкинов (ИЛ) -2, 10, 12, интерферона- (ИНФ-), фактора некроза опухоли- (ФНО-). Определение содержания кортикостерона, свободного и связанного (общего) тестостерона, дегидроэпиандростерон-сульфата в сыворотке крови проводили методом ИФА с использованием наборов фирмы “Bio Source International”.

Статистические методы. С целью выявления индивидуальных различий реакции иммунной системы крыс Вистар на введение высокой дозы ЛПС проводили кластерный анализ (Ward’s method) по 15 параметрам, характеризующим морфофункциональное состояние иммунной системы.

Достоверность различий между показателями определяли с помощью t-критерия Стьюдента и непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Различия считались достоверными при p < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Индивидуальные различия реакции иммунной системы крыс Вистар при воздействии информационной нагрузки

Морфофункциональные изменения иммунной системы крыс Вистар при воздействии информационной нагрузки

Информационная нагрузка формировалась при обучении животных в многоальтернативном лабиринте, который является модельным вариантом сложной интеллектуальной деятельности человека, требующей высокого уровня интеллекта – прогнозирования результата действия (Никольская К.А., 1978).

В группе животных, подвергавшихся информационной нагрузке, по сравнению с контрольной группой, не было выявлено достоверных различий показателей содержания кортикостерона, тестостерона и дегидроэпиандростерон-сульфата в сыворотке крови.

По данным морфологического и морфометрического исследования было установлено, что обучение в многоальтернативном лабиринте (информационная нагрузка) вызывает активацию иммунной системы крыс Вистар. После воздействия информационной нагрузки у крыс Вистар увеличивались индексы отношения объемной плотности коркового слоя тимуса к мозговому и белой пульпы селезенки к красной, расширялись светлые центры лимфоидных фолликулов селезенки. Показатели объемной плотности неинкапсулированной лимфоидной ткани, ассоциированной с бронхами и кишечником, достоверно не изменялись (табл. 1).

Данные об активации иммунной системы при обучении в многоальтернативном лабиринте согласуются с результатами, полученными М.В. Кондашевской (2005). Информационная нагрузка, которой подвергались обучавшиеся в многоальтернативном лабиринте крысы, приводила к реактивным изменениям тимуса, характеризовавшимся расширением субкапсулярной зоны за счет увеличения числа лимфобластов. Расширение коркового слоя тимуса и светлых центров лимфоидных фолликулов селезенки является неспецифической реакцией иммунной системы, которая развивается в ответ на стрессорные и

Таблица 1

Морфометрические показатели органов иммунной системы крыс Вистар, подвергавшихся информационной нагрузке, в зависимости от способности к обучению

Морфометрические показатели Группа наблюдений	Тимус		Селезенка				Неинкапсулированная лимфоидная ткань
	Индекс отношения коркового слоя к мозговому, усл. ед.	Ширина субкапсулярной зоны, мкм	Объемная плотность, %			Индекс отношения объемной плотности белой пульпы к красной, усл. ед.	Объемная плотность, %
			Лимфоидные фолликулы	ПАЛМ	Светлые центры		БАЛТ	ЛТАК
Контрольная	1,59±0,09 1*	27,43±0,37 5	19,30±1,03 9	34,57±1,22 13	17,57±1,63 17	1,25±0,07 21	33,22±1,91 25	7,90±0,35 29
Информационная нагрузка	2,13±0,09 2	29,06±0,39 6	23,00±1,13 10	36,17±1,21 14	32,06±1,30 18	1,66±0,11 22	32,27±1,63 26	7,67±0,48 30
Обучаемые	2,19±0,12 3	31,09±0,49 7	23,89±1,54 11	37,08±1,64 15	32,45±1,55 19	1,80±0,15 23	32,24±2,03 27	7,10±0,52 31
Необучаемые	2,01±0,14 4	24,64±0,53 8	21,46±1,54 12	34,57±1,71 16	31,37±2,37 20	1,42±0,13 24	32,32±2,79 28	8,67±0,81 32
Достоверность различий	p1-2 < 0,001 p1-3 < 0,001 p1-4 < 0,01 p3-4 > 0,05	p5-6 < 0,01 p5-7 < 0,001 p5-8 < 0,001 p7-8 < 0,001	p9-10 < 0,05 p9-11 < 0,05 p9-12 > 0,05 p11-12 > 0,05	p13-14 > 0,05 p13-15 > 0,05 p13-16 > 0,05 p15-16 > 0,05	p17-18 < 0,001 p17-19 < 0,001 p17-20 < 0,001 p19-20 > 0,05	p21-22 < 0,01 p21-23 < 0,01 p21-24 > 0,05 p23-24 < 0,05	p25-26 > 0,05 p25-27 > 0,05 p25-28 > 0,05 p27-28 > 0,05	p29-30 > 0,05 p29-31 > 0,05 p29-32 > 0,05 p31-32 < 0,05

Примечания: * - номер показателя

антигенные воздействия (Селье Г., 1972; Зайратьянц О.В., 1998; Селятицкая В.Г., Обухова Л.А., 2004; Kaiser H.E. et al., 2000).

При воздействии информационной нагрузки в цитокиновом профиле крыс Вистар впервые было выявлено увеличение уровня ИЛ-2 в 1,7 раза и ФНО- в 1,5 раза (табл. 2). Результат оценки цитокинового профиля, как и данные морфологического исследования органов иммунной системы, объективно отражают активацию иммунной системы при воздействии информационной нагрузки. Повышение уровня ИЛ-2 свидетельствует об активации иммунной системы преимущественно по Тх1 (клеточному) типу иммунного ответа (Spellberg B., Edwards J., 2001).

Морфофункциональные различия реакции иммунной системы обучаемых и необучаемых крыс Вистар

В трех социальных группах крыс Вистар (по 11 особей в каждой), подвергавшихся обучению в условиях многоальтернативного лабиринта, используя метод математического анализа, удалось устойчиво идентифицировать две подгруппы животных, различавшихся по характеру когнитивных процессов, динамике обучения, поведенческой тактике, репертуару психоэмоциональных проявлений. Из 33-х крыс, подвергавшихся обучению по методу свободного выбора, самостоятельно сформировать четырехзвенный пищедобывательный условный рефлекс в циклической форме смогли 23 особи. По данным оценки поведенческих реакций животные, сумевшие выработать в многоальтернативном лабиринте сложный пищедобывательный навык (обучаемые), по сравнению с группой, не справившейся с поставленной задачей (необучаемые), характеризовались более выраженными возбудительными (обучаемые – 13,46 ± 0,57, необучаемые – 7,28 ± 0,12; p<0,001) и менее выраженными тормозными процессами (обучаемые – 10,49 ± 0,46, необучаемые 12,25 ± 0,51; p<0,05), более выраженной двигательной (обучаемые – 625,75 ± 8,80, необучаемые – 183,41 ± 10,02; p<0,001) и мотивационной активностью (обучаемые – 28,59 ± 0,33 необучаемые – 3,25 ± 0,23; p<0,001).

В работе впервые выявлены индивидуальные различия реакции иммунной системы при воздействии информационной нагрузки. По сравнению с необучаемыми обучаемые животные характеризовались более выраженными

Таблица 2

Уровень продукции цитокинов спленоцитами крыс Вистар, подвергавшихся информационной нагрузке, в зависимости от способности к обучению

Показатель, пг/мл Группа наблюдений	ИЛ-2	ИЛ-10	ИЛ-12	ФНО-
Контрольная	86,63±11,03 1*	28,04±2,92 5	5,01±0,68 9	26,74±2,59 13
Информационная нагрузка	144,79±8,84 2	33,24±2,32 6	6,63±0,55 10	41,57±1,14 14
Обучаемые	145,01±11,53 3	31,31±2,68 7	7,24±0,49 11	41,04±1,42 15
Необучаемые	144,41±15,83 4	37,08±4,18 8	5,57±0,98 12	42,49±2,08 16
Достоверность различий	p1-2 < 0,01 p1-3 < 0,01 p1-4 < 0,05 p3-4 > 0,05	p5-6 > 0,05 p5-7 > 0,05 p5-8 > 0,05 p7-8 > 0,05	p9-10 > 0,05 p9-11 < 0,05 p9-12 > 0,05 p11-12 < 0,05	p13-14 < 0,01 p13-15 < 0,05 p13-16 < 0,05 p15-16 > 0,05

Примечания: * - номер показателя

признаками активации иммунной системы: расширением субкапсулярной зоны тимуса, увеличением индекса отношения объемной плотности белой пульпы селезенки к красной (табл. 1), повышением уровня ИЛ-12 (табл. 2). Известно, что ИЛ-12, являясь иммунорегуляторным цитокином, поляризует иммунный ответ по Тх1-типу (Spellberg B., Edwards J., 2001), поэтому повышение показателя этого интерлейкина у обучаемых животных, по-видимому, отражает более выраженную активацию клеточного иммунного ответа.

В отличие от обучаемых, у необучаемых животных было выявлено увеличение объемной плотности ЛТАК (табл. 1), что указывает на «включение» в адаптационные процессы барьерных органов. Гиперплазия ЛТАК обусловлена усилением антигенной стимуляции, в частности, это может быть вызвано изменением состава бактериальной флоры желудочно-кишечного тракта и других биотопов. По данным литературы на начальных этапах дизадаптационного процесса морфофункциональные изменения барьерных органов и тканей сопровождаются нарушением состава микрофлоры (Хромова С.С. и соавт., 2004).

Необучаемые животные еще до начала обучения в многоальтернативном лабиринте характеризовались повышенным (в пределах нормы) уровнем кортикостерона (887,10±152,72 нг/мл) по сравнению с контрольной группой (662,35 ± 58,41 нг/мл; p<0,05). Между обучаемыми (747,61 ± 58,07 нг/мл) и необучаемыми (887,10±152,72 нг/мл) группами животных выявлены достоверные различия по этому показателю (p < 0,05). В результате воздействия информационной нагрузки уровень кортикостерона в группе необучаемых животных снизился до контрольного значения, а у обучаемых животных была отмечена тенденция к повышению содержания этого гормона в ответ на воздействие информационной нагрузки.

Таким образом, в эксперименте показано, что информационная нагрузка (обучение в многоальтернативном лабиринте) вызывает активацию иммунной системы преимущественно по Тх1 (клеточному) типу. В условиях информационной нагрузки выявлены различия реакции иммунной системы: по сравнению с необучаемыми у обучаемых животных активация иммунного ответа по клеточному типу была более выраженной и сочеталась с повышением концентрации кортикостерона в сыворотке крови.

Механизмы взаимодействия нервной и иммунной системы при воздействии информационной нагрузки изучены недостаточно. Показано. что при воздействии информационной нагрузки происходит активация инсулярной коры (Pacheco-Lopez G. et al., 2005), которая способна модулировать активность гипоталамуса и симпатической нервной системы, тем самым, влияя на морфофункциональное состояние иммунной системы. По данным литературы можно выделить два основных пути, посредством которых информационная нагрузка способна активировать иммунную систему (Elenkov I.J. et al., 2000; Mignini F. et al., 2003; Rogausch H. et al., 2004). Во-первых, активация оси гипоталамус-гипофиз-эндокринные железы приводит к выработке гормонов (глюкокортикоидов, половых гормонов, гормонов щитовидной железы и др.), которые могут воздействовать на иммунную систему и модулировать иммунный ответ (Tausk F. et al., 2008). Во-вторых, информационная нагрузка приводит к активации вегетативной нервной системы, включающей симпатическую, парасимпатическую и пептидэргическую системы (Hermann G. et al., 1994; Dhabhar F.S., McEwen B.S., 1999; Wrona D., 2006), которые реципрокно взаимодействуют между собой и оказывают регуляторное влияние на морфофункциональное состояние органов иммунной системы.

Индивидуальные различия реакции органов-мишеней и иммунной системы крыс Вистар при воздействии липополисахарида

Морфологические изменения органов-мишеней и иммунной системы крыс Вистар при воздействии липополисахарида

Проведена оценка реакции на воздействие высокой дозы ЛПС печени, почек и легких, являющимися основными органами-мишенями при остром эндотоксикозе. При введении высокой дозы ЛПС у крыс Вистар наблюдались выраженные дистрофические изменения в органах-мишенях – печени и почке, и нейтрофилез жидкости БАС, что согласуется с данными В.Б. Писарева и соавт. (2008).

По данным морфофункционального исследования органов иммунной системы, на 1-е сут после введения ЛПС в них были выявлены признаки активации, характеризующиеся акцидентальной инволюцией тимуса, опустошением селезенки и ЛТАК, сочетающиеся у части животных (40%) с альтеративными изменениями, проявляющимися гибелью лимфоцитов в корковом слое тимуса и лимфоидных фолликулах селезенки. По данным литературы механизмы опустошения и гибели лимфоцитов в органах иммунной системы связаны с активацией механизмов апоптоза, обусловленными как прямым действием ЛПС, за счет связывания с рецепторами к эндотоксину на лимфоцитах (Vernooy J.H. et al., 2001), так и опосредованным – через кортикостерон (Gong S.L. et al., 2008), концентрация которого повышалась на 1-е сут после введения ЛПС (контрольная группа – 216,52±5,93, 1-е сут после введения ЛПС – 301,08±5,63; p<0,001). Выявленная у крыс Вистар на 1-е сутки после введения высокой дозы ЛПС акцидентальная инволюция тимуса I-III стадии является стереотипной, т.к. характерна для любой стрессорной реакции и антигенной стимуляции (Зайратьянц О.В., 1992).

Показатель объемной плотности БАЛТ крыс Вистар в разные сроки после введения ЛПС не изменялся по сравнению с животными контрольной группы. При воздействии ЛПС наблюдался нейтрофилез жидкости БАС. Миграция нейтрофилов в бронхоальвеолярное пространство обусловлена реакцией респираторного, а не воздухопроводящего отдела легких (Takizawa H., 2003). При внутрибрюшинном введении ЛПС реагирует, главным образом, респираторный отдел органа-мишени легких, что характеризуется миграцией нейтрофилов через стенки капилляров межальвеолярных перегородок, а воздухопроводящий отдел и БАЛТ реагируют на введение ЛПС в меньшей мере.

На 7-е сут после введения ЛПС отмечалась нормализация содержания кортикостерона, восстановление нормальной морфологической структуры тимуса и селезенки на фоне высокой продукции провоспалительных цитокинов.

Морфологические изменения органов-мишеней и иммунной системы крыс Вистар при воздействии липополисахарида в зависимости от уровня продукции Тх1 цитокинов

При кластерном анализе параметров, характеризующих морфофункциональное состояние иммунной системы крыс контрольной группы, достоверных индивидуальных различий выявлено не было.

В группе крыс, подвергавшихся воздействию высокой дозы ЛПС (патологический стрессор), нами были выделены 2 подгруппы животных, характеризующихся разным уровнем продукции цитокинов, опосредующих Тх1

Рис. 1. Продукция цитокинов спленоцитами крыс Вистар в разные сроки после воздействия ЛПС в зависимости от уровня продукции Тх1 цитокинов: а – на 1-е сут после введения ЛПС; б – на 7-е сут после введения ЛПС. Группы наблюдений: контрольная - ; с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов - ; с низким уровнем продукции Тх1 цитокинов - . Различия достоверны: * - по сравнению с контрольной группой; ^ - между подгруппами с высоким и низким уровнем продукции Тх1 цитокинов

(клеточный) тип иммунного ответа (рис. 1). В результате морфометрического исследования между подгруппами крыс с высоким и низким уровнем продукции Тх1 цитокинов в ответ на введение высокой дозы ЛПС были выявлены различия реакции иммунной системы (табл. 3) и патологических изменений в органах-мишенях – легких и печени (рис. 2, 3). Так, в подгруппе животных с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов через сутки после воздействия ЛПС выявлялась акцидентальная инволюция тимуса I-II стадии, опустошение белой пульпы селезенки, расширение светлых центров лимфоидных фолликулов, представленных лимфобластами (табл. 3), менее выраженными дистрофическими изменениями печени (рис. 3) и воспалительной реакции в легких (рис. 2). В подгруппе с низким уровнем продукции Тх1 цитокинов воздействие ЛПС приводило к гибели лимфоцитов в корковом слое тимуса и в светлых центрах лимфоидных фолликулов селезенки, к распространенному и более выраженному дистрофическому процессу в печени (рис. 3) и более выраженному воспалительному процессу в легких (рис. 2).

На 7-е сут морфофункциональные различия реакции иммунной системы в сравниваемых подгруппах животных нивелировались (табл. 3) и характеризовались только качественными особенностями светлых центров фолликулов селезенки: у крыс с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов они были представлены лимфобластами, с низким уровнем продукции – эпителиоидными клетками и лимфобластами. Появление эпителиоидноклеточных светлых центров характерно для хронических воспалительных процессов (Вылков И.Н., 1980). Объемная плотность ЛТАК в подгруппе животных с низким уровнем продукции Тх1 цитокинов на 7-е сут после воздействия ЛПС была выше (табл. 3). В органах-мишенях печени и легких, снижалась выраженность дистрофических и воспалительных изменений (рис. 2, 3). Индивидуальные различия реакции иммунной системы в ответ на воздействие ЛПС генетически детерминированы. Механизмы индукции различного иммунного ответа на введение ЛПС могут заключаться в SNP полиморфизме генов TLR (Симбирцев А.С., Громова А.Ю., 2005; Smirnova I. et al., 2000; O’Brien A. et al., 2005) и различном уровне экспрессии рецепторов к ИЛ-17 на NKT-клетках (Happel K.I. et al., 2003; Matsuzaki G., Umemura M., 2007).

Таблица 3

Морфометрические показатели органов иммунной системы крыс Вистар при воздействии ЛПС в зависимости от уровня продукции Тх1 цитокинов

Морфометрические показатели Группа наблюдений			Индекс отношения объемной плотности коркового слоя тимуса к мозговому, усл. ед.	Селезенка				Неинкапсулированная лимфоидная ткань
				Объемная плотность, %			Индекс отношения объемной плотности белой пульпы к красной, усл. ед.	Объемная плотность, %
				Лимфоидные фолликулы	ПАЛМ	Светлые центры		БАЛТ	ЛТАК
Контрольная			1,45±0,13 1*	29,11±1,06 6	31,66±0,85 11	25,02±1,57 16	1,72±0,07 21	36,48±1,45 26	10,29±0,98 31
Опытная	1-е сут	Высокий	1,35±0,18 2	21,70±1,54 7	21,57±1,60 12	38,62±3,14 17	0,84±0,08 22	34,03±5,54 27	6,52±0,45 32
Уровень продукции Тх1 цитокинов
		Низкий	0,65±0,05 3	16,50±1,80 8	24,45±2,32 13	28,50±2,02 18	0,75±0,08 23	42,06±4,70 28	6,15±0,44 33
	7-е сут	Высокий	2,01±0,15 4	20,80±1,93 9	27,10±1,26 14	24,09±1,81 19	0,97±0,07 24	35,05±2,26 29	5,44±0,19 34
		Низкий	1,99±0,42 5	17,47±1,31 10	26,80±1,26 15	25,39±2,68 20	0,81±0,05 25	33,72±1,72 30	7,64±0,78 35
Достоверность различий			p1-2 > 0,05 p1-3 < 0,001 p2-3 < 0,001 p1-4 <0,01 p1-5 > 0,05 p4-5 > 0,05	p6-7 < 0,001 p6-8 > 0,05 p7-8 < 0,05 p6-9 < 0,001 p6-10 < 0,001 p9-10 > 0,05	p11-12 < 0,01 p11-13 < 0,01 p12-13 > 0,05 p11-14 < 0,05 p11-15 < 0,05 p14-15 > 0,05	p16-17 < 0,01 p16-18 > 0,05 p17-18 < 0,05 p16-19 > 0,05 p16-20 > 0,05 p19-20 > 0,05	p21-22 < 0,001 p21-23 < 0,001 p22-23 > 0,05 p21-24 < 0,001 p21-25 < 0,001 p24-25 > 0,05	p26-27 > 0,05 p26-28 > 0,05 p27-28 > 0,05 p26-29 > 0,05 p26-30 > 0,05 p29-30 > 0,05	p31-32 < 0,001 p31-33 < 0,001 p32-33 > 0,05 p31-34 < 0,001 p31-35 < 0,01 p34-35 < 0,05

Примечания: * - номер показателя

Рис. 2. Показатели эндопульмональной цитограммы крыс Вистар на 1-е сут после введения высокой дозы ЛПС в зависимости от уровня продукции Тх1 цитокинов. Группы наблюдений: контрольная - ; с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов - ; с низким уровнем продукции Тх1 цитокинов - . Различия достоверны: * - по сравнению с контрольной группой; ^ - между подгруппами с высоким и низким уровнем продукции Тх1 цитокинов

Рис. 3. Выраженность дистрофических изменений в печени крыс Вистар в разные сроки после введения высокой дозы ЛПС. Группы наблюдений: с высоким () и низким () уровнем продукции Тх1 цитокинов. Различия достоверны: * – между подгруппами крыс с высоким и низким уровнем продукции Тх1 цитокинов.

Индивидуальные различия реакции иммунной системы выявлены нами как в ответ на воздействие информационной нагрузки, вызывающей развитие адаптивных изменений, так и при введении высоких доз ЛПС (дизадаптивная реакция). Одним их эффекторных механизмов, определяющих индивидуальные различия реакции иммунной системы при адаптации и при воспалительном процессе, является поляризация иммунного ответа по Тх1 и/или Тх2-типу. Эти данные согласуются с результатами исследований О.В. Макаровой и Л.П. Михайловой (2008), которые показали, что клинико-морфологические особенности течения воспалительного процесса при туберкулезе определяются поляризацией иммунного ответа преимущественно по Тх1 или Тх2-типу.

Полученные в работе данные позволяют рекомендовать для прогнозирования течения инфекционных воспалительных заболеваний, вызванных грамотрицательной микрофлорой, исследование реакции организма на физиологическую функциональную нагрузку с последующим определением поляризации иммунного ответа по Тх1 или Тх2-типу. При преобладании Тх1-типа иммунного ответа можно предположить, что течение заболевания будет более благоприятным.

Выявленные в зависимости от преобладания Тх1/Тх2 типа иммунного ответа различия реакции иммунной системы на адаптивную и дизадаптивную нагрузки следует учитывать при назначении широко используемых в настоящее время иммуномодулирующих препаратов.

ВЫВОДЫ

1. При воздействии информационной нагрузки (адаптивная реакция) и высокой дозы липополисахарида (дизадаптивная реакция) у экспериментальных животных выявлены индивидуальные различия реакции иммунной системы, характеризующиеся разной выраженностью активации и поляризации иммунного ответа по Тх1 (клеточному) типу.
2. Поведенческие реакции у крыс Вистар при воздействии информационной нагрузки различаются: у животных с преобладанием возбудительных процессов и исследовательских безусловных реакций (обучаемые) обучение сопровождается увеличением в 3,5 раза показателей горизонтальной и вертикальной активности по сравнению с животными с доминированием тормозных процессов и пассивно-оборонительных реакций (необучаемые).
3. Информационная нагрузка вызывает активацию иммунной системы, которая характеризуется акцидентальной инволюцией тимуса I-II стадии и гиперплазией белой пульпы селезенки с расширением светлых центров лимфоидных фолликулов. Воздействие информационной нагрузки приводит к изменению цитокинового профиля: уровень ИЛ-2 повышается в 1,7 и ФНО- в 1,5 раза, что отражает активацию иммунного ответа преимущественно по Тх1 (клеточному) типу.
4. По сравнению с необучаемыми у обучаемых животных информационная нагрузка вызывает более выраженную активацию иммунной системы. При информационной нагрузке у обучаемых животных отмечается расширение субкапсулярной зоны тимуса, увеличение индекса отношения объемной плотности белой пульпы селезенки к красной, повышение уровня ИЛ-12, поляризующего иммунный ответ по Тх1-типу. У необучаемых животных активация иммунной системы характеризуется только увеличением индекса отношения объемной плотности белой пульпы селезенки к красной.
5. Через сутки после введения высокой дозы липополисахарида в органах иммунной системы выявляются признаки активации и альтерации. Морфологическими проявлениями активации иммунной системы являются акцидентальная инволюция тимуса I-III стадии, опустошение белой пульпы селезенки и лимфоидной ткани, ассоциированной с кишечником. Альтеративные изменения иммунной системы характеризуются гибелью лимфоцитов коркового слоя тимуса и светлых центров лимфоидных фолликулов селезенки. Функциональная активация иммунной системы сопровождается увеличением продукции ИЛ-2, ИЛ-12, ИНФ-, что отражает поляризацию иммунного ответа по Тх1-типу.
6. При кластерном анализе параметров, характеризующих морфофункциональное состояние органов иммунной системы, через сутки после воздействия липополисахарида, выявлены индивидуальные различия, обусловленные выраженностью поляризации иммунного ответа по Тх1 (клеточному) типу. Показатели уровня ИЛ-2 и ИНФ- в подгруппе с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов по сравнению с подгруппой с низким уровнем были соответственно в 9,4 и в 159 раз выше.
7. В подгруппе животных с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов через сутки после воздействия липополисахарида развивается акцидентальная инволюция тимуса I-II стадии, выявляется опустошение белой пульпы селезенки, расширение светлых центров лимфоидных фолликулов, представленных лимфобластами с большим числом митозов. В подгруппе с низким уровнем продукции Тх1 цитокинов высокая доза липополисахарида вызывает акцидентальную инволюцию тимуса II-III стадии, гибель лимфоцитов в корковом слое тимуса и в светлых центрах лимфоидных фолликулов селезенки. На 7-е сут морфофункциональные различия реакции иммунной системы в сравниваемых подгруппах животных нивелируются.
8. На 1-е сут после воздействия липополисахарида в подгруппе крыс с высоким уровнем продукции Тх1 цитокинов воспалительные и дистрофические изменения в органах-мишенях – легких и печени – менее выражены по сравнению с крысами с низким уровнем Тх1 цитокинов. На 7-е сутки в сравниваемых подгруппах животных различий в выраженности патологических изменений в органах-мишенях не выявлено.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Яблонская А.М., Кондашевская М.В., Серебряков С.Н., Макарова О.В. Морфофункциональные различия иммунной системы слизистых оболочек бронхов, тонкой кишки и микробиоты у обучающихся и необучающихся крыс Вистар // Материалы XVI всероссийской конференции «Нейроиммунология. Нейроимидж». С.-Пб. – 2007. – С. 141.
2. Яблонская А.М. Индивидуальные морфофункциональные различия реакции иммунной системы крыс Вистар при информационной нагрузке // Материалы научно-практической конференции по инфекционной патологии. Москва. – 2007. – С. 109-110.
3. Яблонская А.М., Кондашевская М.В. Морфофункциональные изменения иммунной системы крыс Вистар при воздействии информационной нагрузки // В сб. Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. Москва. – 2008. – С. 179-181.
4. Яблонская А.М., Солдатов Д.И., Макарова О.В. Морфофункциональные изменения органов иммунной системы, цитокинового и гормонального статуса крыс Вистар при синдроме системного воспалительного ответа, вызванном липополисахаридом // В сб. Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины, С. –Петербург. – 2008. – С.45-47.
5. Яблонская А.М., Кондашевская М.В., Макарова О.В. Морфофункциональные различия реакции иммунной системы крыс Вистар при воздействии информационной нагрузки в зависимости от способности к обучению // В сб. Нейронаука для медицины и психологии, Судак. – 2008. – С. 340-341.
6. Яблонская А.М. Индивидуальные морфофункциональные различия реакции иммунной системы крыс Вистар при воздействии информационной нагрузки // Морфологические ведомости. – 2008. – №1-2. – С. 139-142.
7. Кондашевская М.В., Макарова О.В., Михайлова Л.П., Яблонская А.М., Диатроптов М.Е. Индивидуальные особенности нервной, иммунной и эндокринной систем у крыс Вистар при повышенной психической нагрузке // Бюллетень сибирской медицины. – 2008. – Т.7, приложение 1. – С. 134.
8. Кондашевская М.В., Макарова О.В., Михайлова Л.П., Яблонская А.М., Диатроптов М.Е. Взаимодействие нервной, иммунной и эндокринной систем при повышенной психической нагрузке, индивидуальные особенности реагирования этих систем у крыс Вистар // Бюллетень сибирской медицины. – 2008. – Т.7, приложение 1. – С. 45-50.
9. Яблонская А.М., Кондашевская М.В., Макарова О.В., Михайлова Л.П., Диатроптов М.Е., Карузин К.А., Машков Д.А. Особенности реагирования нервной, иммунной и эндокринной систем в ответ на повышенную информационную нагрузку в эксперименте // В сб. научных трудов II съезда физиологов СНГ, Кишинэу, Молдова. – 2008. – С. 157.
10. Яблонская А.М., Кондашевская М.В., Макарова О.В. Влияние информационной нагрузки на морфофункциональное состояние иммунной системы крыс Вистар с различной способностью к обучению // Морфология. – 2008. – №4. – С. 107.

Соискатель А.М. Яблонская