Лазерно-флюоресцентный метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам
На правах рукописи
ЗАЙЦЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА
ЛАЗЕРНО-ФЛЮОРЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИМИКРОБНЫМ ПРЕПАРАТАМ
03.00.07 – микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
Диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2006
Работа выполнена в Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ: Доктор медицинских наук,
профессор
Пашков Евгений Петрович
Доктор медицинских наук,
профессор
Александров Михаил Тимофеевич
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
Доктор медицинских наук, профессор
Воропаева Светлана Дмитриевна
Доктор медицинских наук, профессор
Меньшиков Дмитрий Дмитриевич
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Защита диссертации состоится «_19_»__декабря__2006 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.08 в НИЦ ММА
им. И.М. Сеченова, по адресу: 119992 г. Москва, ул. М.Трубецкая,
д. 8.,стр.1.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.
Автореферат разослан «____»________________2006г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д.208.040.08.
Доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов
Общая характеристика работы
Актуальность темы
Антибиотикорезистентность коснулась всех видов микроорганизмов и является основной причиной снижения эффективности антибиотикотерапии.
С появлением в медицинской практике антибиотиков и последующим формированием устойчивых к ним микроорганизмов возникала необходимость оценки антибиотикочувствительности возбудителей как ориентира для выбора препаратов [Лебедева М.Н., 1960, Навашин С.М., 1982].
Наиболее значимо проведение определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в отношении группы микробов, среди которых выделяется большое число антибиотикоустойчивых штаммов [Богданов М.Б., 2004]. Широкое их распространение, в свою очередь, сопровождается снижением эффективности антимикробной терапии.
В клинической практике наиболее часто врач вынужден назначать антибактериальный препарат эмпирически, до уточнения этиологии заболевания. Однако данные литературы указывают на значительные трудности при эмпирическом выборе адекватной антибактериальной терапии при инфекциях, вызванных, например, полирезистентными штаммами Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli или Klebsiella pneumoniae [Сидоренко С.В., 1998,Стецюк О.У., 2000].
Существующие современные методы определения чувствительности, несмотря на свои несомненные достоинства, не позволяют быстро и качественно проводить исследования на антибиотикочувствительность микроорганизмов в силу некоторых недостатков, основным из которых является, в первых, их длительность в среднем от 3 до 10 дней, что не позволяет своевременно начать и проводить адекватную индивидуальную специфическую терапию.
Во вторых, - невозможность оценить роль многих не культивируемых микроорганизмов в этиологии заболевания [Жемчугов В.Е., 2004], а так же тех, которые погибают на этапах доставки материала в лабораторию.
В третьих, трудоемкость и малая пропускная способность, громоздкость и/или дороговизна существующих экспресс методов.
В связи с этим врачи часто отказываются от проведения бактериологического исследования или начинают лечение антибиотиками до получения результатов чувствительности микроорганизмов к ним, что так же приводит к неудовлетворительным результатам лечения и развитию антибиотикорезистентности.
Для решения указанных проблем коллективом авторов кафедры микробиологии и госпитальной хирургической стоматологии разработан клинический оптический экспресс-метод лазерной флюоресцентной диагностики (ЛФД), позволяющий в экспресс режиме выявлять заболевания и процессы микробной природы на основе явления флюоресценции эндо- и экзогенных порфиринов бактерий. Разрабатываемые в настоящее время оптические методы диагностики отличаются высокой точностью, информативностью, имеют легко интерпретируемые результаты, позволяют их получать в короткие сроки. Среди таких методов следует назвать лазерную флюоресцентную диагностику.
Способность различных микроорганизмов флюоресцировать с различной интенсивностью при воздействии на них лазерного излучения – в зависимости от особенностей активности физиологических процессов – мы используем для оценки антибиотикочувствительности. Известно, что интенсивность флюоресценции зависит от ряда факторов, таких как длина волны возбуждающего излучения, квантовые и энергетические выходы, так же и от концентрации флюоресцирующего вещества, поэтому флюоресценция может быть применена для количественного анализа (Левшин Л.Б., 1994).
На основе регистрации динамики флюоресцентных показателей представляется возможным разработать метод определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.
Ранее в исследованиях Александрова М.Т., Пашкова Е.П., Морозовой О.А., Нестеровой М.В. был экспериментально обоснован экспресс-метод лазерной флюоресценции, позволяющий проводить индикацию микроорганизмов и диагностику патологических процессов микробной природы; были выявлены спектрально-энергетические характеристики 50 видов облигатно-анаэробных, факультативно-анаэробных и аэробных микроорганизмов и их ассоциаций.
Исходя из изложенного, мы поставили перед собой задачу обосновать возможность применения метода лазерной флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам
Целью исследования является экспериментально-теоретическое и клинико-бактериологическое обоснование возможности использования метода лазерной флюоресценции для ускоренного определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
- экспериментально обосновать применение лазерной флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам;
- провести сравнительную оценку метода лазерной флюоресценции и традиционных методов определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам;
- разработать алгоритм определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам методом лазерной флюоресценции;
- определить возможность и перспективы применения метода лазерной флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам в медицине;
Положения выносимые на защиту:
- На основании экспериментальных, микробиологических и спектрофотометрических исследований обосновано применение метода лазерной флюоресценции для ускоренного определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам.
- Метод лазерной флюоресцентной диагностики позволяет объективно проводить скрининг чувствительности различных бактерий и грибов рода Candida к антимикробным препаратам.
Научная новизна
Впервые обоснован экспресс-метод лазерной флюоресценции для ускоренного определения чувствительности микроорганизмов и их ассоциаций к антимикробным препаратам.
Впервые на основании выявленных закономерностей флюоресценции микроорганизмов разработаны критерии оценки подавления их роста антимикробными препаратами при помощи лазерной флюоресценции.
Практическая ценность работы
Полученные результаты работы привели к разработке ускоренного способа определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам, что в свою очередь позволит проводить современные исследования для ранней диагностики и рациональной антибиотикотерапии патологических процессов микробной этиологии.
Использование разработанного метода в практическом здравоохранении позволит так же проводить микробиологический мониторинг устойчивости возбудителей в рамках системы эпидемиологического надзора и предупреждения распространения устойчивых форм микроорганизмов.
Апробация работы и публикации
Основные положения работы доложены на:
1. 4-ой международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке», 23-25 мая 2003 года;
2. научной конференции отделения профилактической медицины РАМН «Современные проблемы химиопрофилактики и химиотерапии инфекций», г. Смоленск, 30 января 2004 год;
3. 6-ой международной конференции «Экология человека и природа», Москва-Плес, 5-11 июля 2004 года;
4. VII международном научном конгрессе «Современный олимпийский спорт и спорт для всех». Москва, 2004;
5. 2-ом съезде общества биотехнологов России, Москва, 13-15 октября 2004г;
6. I международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», Москва, 26-28 октября 2004;
7. апробация диссертации состоялась на заседании научно-методической конференции кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ММА им. И.М. Сеченова 14 июня 2006г. (протокол № 29).
По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ.
Внедрение в практику
Результаты исследования внедрены в лабораторную и клиническую практику, учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии и кафедры госпитальной хирургической стоматологии ММА им. И.М.Сеченова.
Структура и объем диссертации:
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», 4-х глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 183 страницах машинописного текста, иллюстрирована 40 рисунками и 34 таблицами. Список литературы содержит 144 источника, из которых 92 отечественных и 52 зарубежных авторов.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
Работа основана на лабораторных исследованиях флюоресценции микроорганизмов, определении их чувствительности к антимикробным препаратам, а так же апробации полученных результатов на клиническом материале: гнойное отделяемое раны.
В ходе исследования были изучены факультативно-анаэробные и аэробные микроорганизмы, грибы рода Сandida. Были использованы как тест-культуры референтных штаммов (E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, S. aureus ATCC 25923, S. aureus ATCC 29213, P.aeruginosa АТСС 27853, B. cereus ATCC 14893), так и штаммы, выделенные из клинического материала (табл. 1).
Питательной средой для накопления микробной массы служили: для факультативных анаэробов и аэробов – Muller-Hinton (Hi Media) агар, для грибов – агар Сабуро, АТВ F2 (производство bioMerieux). Для приготовления микробной взвеси использовали культуры в стационарной фазе их роста. Чувствительность грамотрицательных бактерий (семейство Enterobacteriaceae) к антибиотикам определяли при помощи микротестсистемы «ТПКтестГр-», позволяющей определять чувствительность исследуемых микроорганизмов к 11 антибиотикам: ампициллину, нетилмицину, цефоперазону, цефазолину, цефотаксиму, цефтазидиму, цефтриаксону, гентамицину, амикацину, ципрофлоксацину, доксициклину.
Чувствительность бактерий рода Staphylococcus определяли при помощи микротестсистемы «ТПКтестСтаф» (производство ВНИИА РАМН), позволяющей определить чувствительность исследуемых микроорганизмов к 8 антибиотикам: оксациллину, гентамицину, эритромицину, рифампицину, ципрофлоксацину, линкомицину, ванкомицину, фузидиевой кислоте. Чувствительность грибов определяли при помощи набора ATB FUNGUS 2, предназначенного для определения чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам (итраконазол, амфотерицинВ, флюцитозин, флюконазол) в полужидкой среде (производтво bioMerieux).
В качестве оборудования для проведения флюоресцентно-спектроскопических исследований использовали установку для флюоресцентной диагностики типа ЛЭСА-6 (лазерный спектральный анализатор для флюоресцентной диагностики производства Института Общей Физики РАН РФ «БиоСпек») и «Спектролюкс-МБ».
Главный принцип работы ЛЭСА заключается в одновременной регистрации спектров отражения и флюоресценции исследуемых объектов при возбуждении их излучением длиной волны 633 нм (He-Ne лазер). Спектры исследуемого объекта несут информацию о нем.
При анализе спектров исследуемых бактериальных объектов учитывали: S1 - мощность обратно отраженного зондирующего лазерного излучения, S2 - мощность флюоресцентного сигнала, S2/S1 - нормированную мощность флюоресценции (рис. 1)
Для воспроизводимости результатов, в качестве контрольных объектов, для исключения их влияния на мощность флюоресценции значимых исследуемых образцов, измеряли мощность флюоресценции:
- фторопластового эталона – не флюоресцирующего объекта сравнения (объект с нулевым содержанием фотосенса); указанные показатели (S1, S2/S1) для эталона были одинаковы на всех этапах проведения измерений, что обеспечивало высокую воспроизводимость и достоверность результатов исследования);
- растворов антимикробных препаратов или контроль антибиотика;
- материалов, в которых проводились исследования (пластик планшет, стекло стандартных пробирок, пластик пробирки типа «эппендорф»).
Рис. 1. Типичный спектр флюоресценции (S1 - мощность обратно отраженного зондирующего лазерного излучения; S2 - мощность флюоресцентного сигнала, S2/S1 - нормированная мощность флюоресценции).
Исследования были проведены в 4 этапа. Этапы и объем проведенного исследования отражены в таблице 1.
Таблица 1
Этапы и объекты исследования
| № п/п | Объект исследования | Количество образцов |
| этап I | Обоснование применения лазерной флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам | 30 образцов штаммов бактерий (S.aureus, E. сoli, P. aeruginosa, B. cereus); 3 антибиотика (ампициллин, гентамицин, ципрофлоксацин); около 8400 спектрофлюорограмм |
| Этап II | Сравнительное исследование чувствительности бактерий к антибиотикам методом лазерной флюоресценции и стандартным методом пороговых концентраций | 30 образцов штаммов бактерий S. aureus, E. coli, K.pneumoniae; 17 антимикробных препаратов; около 16200 спектрофлюорограмм |
| Этап III | Сравнительное исследование чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам методом серийных разведений и методом лазерной флюоресценции. | Гибы рода Candida – 12 образцов;4 антимикотика (итраконазол, амфотерицинВ, флюцитозин, флюконазол); 2500 спектрофлюорограмм |
| Этап IV | Разработка экспресс метода определения чувствительности ассоциаций бактерий гнойного отделяемого к антимикробным препаратам. | Гнойное отделяемое раны – 32 образца (около2000 спектрограмм) |
| Итого: | 104 микробных образца; 22 антимикробных препарата; 29100 спектрофлюорограмм | |
Статистическую обработку полученных данных производили по общепринятому методу вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), среднего квадратического отклонения (), ошибки средней арифметической (m). Сравнение параметрических вариантов после предварительной оценки правильности распределения выборок (соответствия его нормальному распределению) проводилось на основе критерия Стьюдента (t) с вычислением вероятности ошибки (p).
Для оценки достоверности результатов определения чувствительности изученных микробов методом ЛФД их сравнивали с данными, полученными стандартным методом разведений.
Расхождение результатов квалифицировали как ошибки трех категорий: «малые» ошибки, «грубые» ошибки, «очень грубые» ошибки.
К «малым» ошибкам относили расхождение результатов следующих типов: I - R и I - S, где S – чувствительный штамм, I – умеренно устойчивый, R - устойчивый штамм. «Грубыми» ошибками считали расхождения результатов, при которых штаммы, определенные референтным методом как чувствительные, квалифицировались другим методом как устойчивые. При «очень грубых» ошибках штаммы, определенные референтным методом как устойчивые, квалифицировались методом ЛФД как чувствительные. Максимально допустимая суммарная доля ошибок при использовании метода, сравниваемого с референтным, не должна превышать 10%, при 3% для «грубых» и 1,5% для «очень грубых» ошибок (NCCLS, 1994)
Для статистической обработки результатов исследования использовали программу «Microsoft Excel».
Полученные результаты и их обсуждение
На основании экспериментальных исследований ранее было отмечено, что увеличение концентрации микроорганизмов приводит к усилению мощности флюоресценции, а уменьшение – к снижению показателя флюоресценции. В качестве экспериментальной модели для установления зависимости флюоресценции от концентрации микроорганизмов нами были исследованы B. cereus, S. aureus. Различные концентрации B. cereus получали путем последовательного разведения в изотоническом растворе хлорида натрия исходной суспензии, содержащей 108 КОЕ/мл. Исходную суспензию S. aureus с концентрацией 109 КОЕ/мл пятикратно разводили до концентрации 8*106 КОЕ/мл. Для характеристики спектра мы использовали величину S2/S1 – нормированная мощности флюоресценции.
Измерения параметров обратно рассеянного излучения осуществляли через стенку пробирки. Всего было проведено 10 измерений для каждого разведения. Результаты измерений усреднялись и рассчитывались погрешности измерений. На рис. 2 представлена зависимость показателя S2/S1 от концентрации микробов S.aureus при измерении через стенку пробирки. Показана зависимость интенсивности флюоресценции бактерий от концентрации, свидетельствующая о том, что рассматриваемый параметр (S2/S1) прямо отражает концентрацию флюоресцирующих частиц, то есть увеличение мощности флюоресценции адекватно увеличению концентрации бактерий и наоборот.
А)
Б)
Рис. 2 Спектры флюоресценции (А) и значимые параметры (Б) флюоресценции (S2/S1) суспензии S. aureus в различных концентрациях
В связи с тем, что метод ЛФД позволяет отслеживать концентрацию бактерий в субстрате, мы предположили, что возможно использовать данный метод для изучения действия различных антибактериальных веществ на микроорганизмы. Было установлено, что снижение мощности флюоресценции бактериальной взвеси под действием антибактериальных препаратов может служить одним из критериев оценки их действия. Эту концепцию использовали для разработки алгоритма методики определения чувствительности микробов к антимикробным препаратам с помощью метода лазерной флюоресценции.
Таким образом, выявленные в эксперименте критерии изменения концентрации микроорганизмов нуждались в дальнейшем подтверждении их информативности и обосновании применения для определения чувствительности к антимикробным препаратам. Была исследована чувствительность 30 бактериальных объектов (S.aureus, E.coli, P.aeruginosa) к гентамицину, ампициллину и ципрофлоксацину методом двукратных серийных разведений, проанализированы около 8400 спектрофлюорограмм (табл. 1).
Изучали чувствительность бактерий к антибиотикам посредством метода ЛФД, сравнивая результаты опытов с данными, полученными при применении стандартного метода серийных разведений в бульоне. Для этой цели был разработан алгоритм определения чувствительности бактерий к антибактериальным препаратам.
Исследование по определению антибиотикочувствительности включало следующие этапы:
- Приготовление суспензии исследуемых микроорганизмов (инокулята).
- Приготовление двукратных разведений антибиотика в бульоне.
- Инокуляция.
- Инкубация.
- Учет результатов спектрофотометрически методом ЛФД (сразу после инокуляции, через 1 час, 2 и 24 часа) и методом визуальной регистрации (через 24 часа).
Параллельно исследовались контрольные пробирки с бульоном без антибиотика и с культурой (контроль культуры) для каждого испытуемого штамма. Также исследовались показатели флюоресценции бульона с раствором антибиотика без культуры (контроль антибиотика) для исключения влияния этих растворов на изменения показателей флюоресценции.
Наличие роста микроорганизма в бульоне регистрировали визуально, по помутнению бульона, свидетельствующем о том, что данная концентрация антибиотика недостаточна, чтобы подавить его жизнеспособность, и при помощи метода ЛФД, регистрируя изменения показателей нормированной мощности флюоресценции.
Были разработаны критерии оценки подавления роста микроорганизмов антимикробным препаратом, полученные при помощи лазерной флюоресценции. В случае если нормированная мощность флюоресценции образца исследуемого материала с антибактериальным препаратом выше или равна контрольным показателям бактериального инокулюма, препарат считают неэффективным по отношению к микрофлоре исследуемого объекта. Когда показатели мощности флюоресценции существенно уменьшились (до показателей флюоресценции образца раствора антибиотика без исследуемой культуры в том же объеме), констатировали, что эта концентрация антимикробного препарата обладает подавляющим действием. Первую наименьшую концентрацию антибиотика (из серии последовательных разведений), где визуально не определяется бактериальный рост, и показатели мощности флюоресценции уменьшились до показателей флюоресценции образца раствора антибиотика без исследуемой культуры, считали минимальной подавляющей концентрацией (МПК). Далее интерпретировали полученные результаты МПК с целью установления степени чувствительности микроба: чувствителен (S), умеренно устойчив (I) и устойчив (R) по рекомендациям NCCLS.
В качестве иллюстрации представляем пример определения чувствительности S. aureus к гентамицину (рис.3 ).
Рис. 3. Значимые параметры флюоресценции S. aureus с гентамицином в различных концентрациях (1мкг/мл, 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,125 мкг/мл), регистрируемые через 2 часа инкубации) (различия достоверны при
p < 0,05).
Через 2 часа инкубации показатели мощности флюоресценции бактериальной культуры с гентамицином в концентрации 0,5 мкг/мл, 0,25 мкг/мл, 0,125 мкг/мл были незначительно ниже показателя мощности флюоресценции контроля культуры. Показатель мощности флюоресценции бактериального инокулюма с гентамицином в концентрации 1 мкг/мл значительно уменьшился и составил 2,98 отн.ед., что меньше показателя мощности флюоресценции контроля антибиотика (3,9 отн.ед.). Такое снижение мощности флюоресценции бактериального инокулюма с гентамицином в концентрации 1 мкг/мл по отношению к бактериальному контролю трактовали как значительное угнетение роста культуры антибиотиком. При визуальной оценке исследуемых объектов с антибиотиком установили, что раствор культуры с гентамицином в концентрации 1 мкг/мл был прозрачный, в остальных исследуемых растворах наблюдался рост бактерий.
На основании данных лазерно-флюоресцентного исследования и визуальной оценки сделали заключение: МПК гентамицина в отношении S.aureus – 1 мкг/мл.
Было установлено, что результаты изучения чувствительности S.aureus, E.coli, P.aeruginosa к гентамицину, ампициллину и ципрофлоксацину, полученные методом ЛФД через 1, 2 и 24 часа инкубации, совпадали с визуальной оценкой роста культуры через 24 часа.
Сравнительное исследование чувствительности бактерий к антибиотикам методом лазерной флюоресценции и стандартным методом пороговых концентраций.
В исследовании изучили чувствительность бактерий к антибиотикам посредством экспресс метода ЛФД и сравнили результаты опытов с данными, полученными стандартным методом пороговых концентраций с визуальной регистрацией роста исследуемых микробов.
В исследовании определяли чувствительность клинических изолятов S. aureus, E. coli, K.pneumoniae, полученных от больных, и эталонных штаммов (стандартные штаммы АТСС) E. coli ATCC 25922, E. coli ATCC 35218, S. aureus ATCC 25923 и S. aureus ATCC 29213 методом лазерной флюоресценции. Каждый бактериальный объект исследовался троекратно. Всего была исследована чувствительность 30 образцов грамотрицательных и грамположительных бактерий к 17 антимикробным препаратам, получено и анализировано около 16200 спектрофлюорограмм (табл. 1)
Исследования проводили в микротестсистемах «ТПКтестГр-», «ТПКтестСтаф», комбинирующих метод пороговых концентраций и метод микроразведений.
Воспроизводимость исследуемых спектров подтверждали путем регистрации 5-10 спектров, записываемых последовательно с интервалами в 5 секунд. Ошибка измерений интегральной мощности флюоресценции не превышала ±1.5%. Интерпретацию данных, полученных методом ЛФД, осуществляли в соответствии с алгоритмом, описанном выше.
Данные по чувствительности, полученные при помощи метода ЛФД на разных сроках инкубации, анализировали, сравнивали с результатами стандартного метода определения чувствительности по наличию или отсутствию роста испытуемых микроорганизмов, после чего определяли проценты совпадений и ошибок. Полученные результаты представлены в таблицах.
Сопоставление результатов тестирования антибиотикочувствительности S.aureus методом ЛФД с результатами определения чувствительности, полученными методами минимальных ингибирующих концентраций с визуальной оценкой роста бактерий, показали существование значительных различий (41%) в интерпретации результатов, полученных методом ЛФД сразу после инокуляции культуры. Результаты, полученные через 2, 24 часа инкубации методом ЛФД, совпадают с результатами визуальной регистрации через 24 часа соответственно на 84% и 90%. Тестирование чувствительности к лекарственным препаратам, выполненное методом ЛФД, не позволило классифицировать резистентность у 3 из 12 образцов, резистентных к оксациллину, сразу после инокуляции и через 2 часа инкубации. Однако результаты, полученные двумя способами через 24 часа, совпали на 75%, так как 3 образца были определены методом ЛФД как «средне чувствительные». Возможно, это связано с тем, что устойчивость экспрессируется в определенных условиях, а именно: длительная инкубация в течение 24 часов при 37°С, среда с добавлением 4% NaCl [Сидоренко С.В., 1998].
Результаты антибиотикочувствительности E. coli, полученные методом ЛФД через 2 и 24 часа инкубации, являются удовлетворительными по качеству, так как совпадают с данными, полученными стандартным методом на 89% и 93% соответственно, тогда как результаты, полученные сразу после инокуляции, совпадали на 73%.
Значительное количество некорректных результатов чувствительности K.pneumoniae (28%), полученных методом ЛФД сразу после инокуляции, а именно: определение штаммов как «устойчивые» к аминогликозидам при использовании метода ЛФД, тогда как при использовании стандартного метода они оказались «чувствительными», не позволяют применять метод ЛФД для определения чувствительности сразу после инокуляции культуры. Однако результаты, полученные через 2 часа инкубации, признаются удовлетворительными, так как совпадают со стандартным методом на 91%.
Результаты исследования наглядно демонстрируют, что оптимальным, и в то же время, наиболее ранним сроком получения корректных результатов методом ЛФД является 2 часа от момента постановки исследования антибиотикочувствительности.
Недостаточное количество корректных результатов (68%), полученных методом ЛФД сразу после инокуляции, затрудняет применение метода для определения чувствительности в этот период. Однако степень достоверности результатов, полученных через 2 и 24 часа инкубации, составляет 89% и 93% соответственно, что по стандартам NCCLS считается допустимым уровнем (рис. 4)
Рис. 4. Сравнение результатов тестирования чувствительности бактерий, полученные стандартным методом визуальной регистрации результатов и методом лазерной флюоресценции на различных сроках инкубации
Результаты определения чувствительности 30 различных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий к антибактериальным препаратам при использовании экспресс-метода лазерной флюоресценции через 2 часа инкубации показали, что процент совпадений результатов с данными референтного метода для разных антибактериальных препаратов колебался в пределах от 80% до 100%, а суммарная доля ошибок – в пределах от 0% до 20%.
Таблица 2.
Активность исследуемых антибиотиков в отношении исследуемых штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов
(n = 30)
| антибиотики | n | Кол-во штаммов, определенных как резистентные (R), средне чувствительные (I) и чувствительные (S) абс. (%) | |||||
| визуальная оценка роста культуры (24 ч инкубации) | метод ЛФД (2 часа инкубации) | ||||||
| R | I | S | R | I | S | ||
| ампициллин | 18 | 12 (68) | 3 (16) | 3 (16) | 12 (68) | 3 (16) | 3 (16) |
| оксациллин | 12 | 12(100) | 0 | 0 | 6 (50) | 3 (25) | 3 (25) |
| цефазолин | 18 | 15 (84) | 3 (16) | 0 | 12(68) | 3 (16) | 3 (16) |
| цефперазон | 18 | 12 (68) | 3 (16) | 3 (16) | 12 (68) | 3 (16) | 3 (16) |
| цефотаксим | 18 | 9 (50) | 3 (17) | 6 (33) | 12 (68) | 3 (16) | 3 (16) |
| цефтазидим | 18 | 9 (50) | 6 (33) | 3 (17) | 12 (68) | 6 (32) | 0 |
| цефтриаксон | 18 | 12 (68) | 0 | 6 (32) | 12 (68) | 3 (16) | 3 (16) |
| нетилмицин | 18 | 3 (16) | 3 (16) | 12(68) | 9 (50) | 3 (17) | 6 (33) |
| гентамицин | 30 | 18 (60) | 0 | 12(40) | 21 (70) | 0 | 9 (30) |
| амикацин | 18 | 3 (16) | 3 (16) | 12(68) | 3 (16) | 3 (16) | 12(68) |
| ципрофлоксацин | 30 | 24 (80) | 0 | 6 (20) | 24 (80) | 0 | 6 (20) |
| доксициклин | 18 | 12 (68) | 6 (32) | 0 | 12 (68) | 6 (32) | 0 |
| эритромицин | 12 | 12(100) | 0 | 0 | 6 (50) | 3 (25) | 3 (25) |
| рифампицин | 12 | 9 (75) | 0 | 3 (25) | 12(100) | 0 | 0 |
| линкомицин | 12 | 12(100) | 0 | 0 | 12(100) | 0 | 0 |
| ванкомицин | 12 | 0 | 3 (25) | 9 (75) | 0 | 6 (50) | 6 (50) |
| фузидиевая к-та | 12 | 9 (75) | 3 (25) | 0 | 9 (75) | 3 (25) | 0 |
| Всего: абс. % | 294 | 183 | 36 | 75 | 189 | 45 | 60 |
| 100 | 62.3 | 12.3 | 25.5 | 64.3 | 15.3 | 20.4 | |
Данные по количеству антибиотикорезистентных микробов, полученные методом ЛФД через 2 часа от момента постановки исследования, различаются с данными стандартного метода на 2%, по количеству штаммов со средней чувствительностью – на 3%, чувствительных – на 5% (рис. 5).
Рис. 5. Активность исследуемых антибиотиков в отношении штаммов грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, изученная стандартным методом и методом лазерной флюоресценции
Определение чувствительности грибов рода Candida к антимикотикам при помощи метода лазерной флюоресценции
Для исследования мы использовали набор ATB FUNGUS 2, представляющий собой микропанель, в которой методом разведений исследуется чувствительность грибов рода Candida к антифунгальным препаратам: амфотерицину В, итраконазолу, флюконазолу и флюцитозину в различных концентрациях, что позволило определить минимальные ингибирующие концентрации.
Данные по чувствительности грибов, полученные при помощи метода ЛФД, сравнивали с результатами стандартного метода – определения МПК серийными разведениями, после чего определяли проценты совпадений и ошибок. Полученные результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3.
Результаты оценки данных определения чувствительности грибов рода Candida к противогрибковым препаратам методом ЛФД
| Противогрибковый препарат | Совпадения результатов, (%) | Ошибки, (%) | ||
| малые | грубые | очень грубые | ||
| Флюцитозин | 90 | 10 | 0 | 0 |
| Амфотерицин В | 100 | 0 | 0 | 0 |
| Флюконазол | 90 | 10 | 0 | 0 |
| Итраконазол | 80 | 10 | 10 | 0 |
| Общая воспроизводимость | 90 | 7,5 | 2,5 | 0 |
Наилучший показатель соответствия между результатами определения чувствительности с использованием метода ЛФД и стандартным методом серийных разведений получен для амфотерицина В – 100% совпадений. К противогрибковым препаратам, по отношению к которым достоверность результатов определения чувствительности методом ЛФД составила 90%, отнесли флюцитозин и флюконазол; 10% ошибок относились к категории «малых». Для итраконазола получена степень достоверности результатов 80%, при суммарном проценте ошибок 20%, что в соответствии со стандартами NCCLS превышает допустимый уровень ошибок.
Общая воспроизводимость результатов составила 90%, что является достаточно высоким совпадением результатов определения чувствительности ЛФД методом с данными стандартного метода разведений, суммарная доля ошибок составила 10%, что в соответствии со стандартами NCCLS считается допустимым уровнем.
Разработка экспресс метода определения чувствительности ассоциаций бактерий гнойного отделяемого к антимикробным препаратам
Мы провели ряд поисковых исследований по определению чувствительности микроорганизмов непосредственно в гнойном отделяемом с последующей клинической оценкой результатов антибиотикотерапии, выбранной на основе метода лазерной флюоресценции. В качестве объекта исследования использовали гнойный раневой экссудат.
Исследование антибиотикочувствительности микроорганизмов непосредственно в гнойном отделяемом бактериологическим методом весьма затруднительно. Так как существует ряд факторов, оказывающих влияние на рост и развитие микроорганизмов в течение длительного времени (18 часов), помимо исследуемых антибиотиков, а именно: антагонизм бактерий, ферменты и биологически активные вещества и др. Последствия комбинированного влияния этих факторов и приводят к не воспроизводимым результатам.
В предлагаемом нами методе действие указанных факторов сохраняется, но в меньшей степени, так как время постановки опыта и, следовательно, воздействия перечисленных факторов сокращается до 30-60 минут.
На основании применения для лечения гнойных ран антисептика 0.1% р-ра мирамистина и антибиотика, выбранного методом ЛФД, как средство контроля антибактериальной терапии получены клинические результаты, свидетельствующие об эффективности разработанной методики. Антибактериальная терапия оценивалась как эффективная при отсутствии клинических признаков (лихорадка, боли дискомфорт в области поражения, купирования отека, инфильтрат, гноетечение, наложения вторичных швов) и изменения лабораторных (снижение лейкоцитоза, увеличение абсолютного содержания лимфоцитов, появление эозинофилов) и биохимических показателей. Клиническая неэффективность терапии определялась при сохранении персистирующей лихорадки и симптомов заболевания через 3-4 суток после начала антибактериальной терапии. При этом учитывали, что определение чувствительности микробов к антибиотикам считается завершенным только после клинически подтвержденной эффективности, выбранного лабораторным методом, антимикробного препарата.
Параллельно, бактериологическим методом определялась чувствительность выделенных из гнойного отделяемого ведущих возбудителей.
В основной группе больных с флегмонами челюстно-лицевой области (ЧЛО), где выбор антибактериального препарата осуществлялся при помощи метода лазерной флюоресценции, сроки нормализации температуры, прекращения гнойного отделяемого, купирования отека, «рассасывания» инфильтрата, появление грануляций, койко-день были на 3-5 дней меньше, чем в группе сравнения (табл. 4)
Таблица 4
Клинические показатели течения флегмоны челюстно-лицевой области у больных с легкой степенью тяжести течения заболевания (основная и контрольная группы)
| День купирова-ния отека | Количество дней гноетечения | День рассасыва-ния инфильтра-та | День появления грануляции | Дни нетрудоспо-собности | |
| Группа сравнения (n=50) | |||||
| Легкая степень заболевания* | 5,4 | 6,6 | 6,7 | 7,9 | 13,7 |
| Основная группа (n = 32) | |||||
| Легкая степень заболевания* | 4,2 | 4,1 | 5,3 | 3,2 | 8,5 |
П р и м е ч а н и е: * межгрупповые различия достоверны при p < 0,05
Метод ЛФД является более чувствительным, так как критерии оценки (отн. единицы флюоресценции) роста микробов более объективны, чем степень мутности.
Преимущество предложенного метода – ЛФД заключается в более высокой чувствительности и объективности оценки действия препарата – по мощности и спектру флюоресценции, времени учета результатов – всего 2-3 часа после экспозиции с антимикробными препаратами.
Возможность автоматизации учета, обработки и хранения информации при использовании ЛФД метода делает его предпочтительным.
Выводы
- Впервые экспериментально обоснована, бактериологически и клинически подтверждена возможность использования метода лазерной флюоресценции для экспресс оценки чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам.
- Объективным критерием подавления микроорганизмов антибиотиками является изменение интегральной мощности флюоресценции относительно бактериального контроля до показателей контроля антибиотика, что и является основой определения антибиотикочувствительности микроорганизмов при помощи метода лазерной флюоресценции.
- Метод лазерной флюоресценции позволяет ускорить процесс определения чувствительности грамположительных, грамотрицательных факультативно-анаэробных и аэробных бактерий к антимикробным препаратам (2 часа после посева).
- Показано, что метод лазерной флюоресцентной диагностики позволяет ускоренно определять чувствительность грибов рода Candida к антимикотикам через 2 часа после посева.
- Возможно ускоренное определение антибиотикочувствительности ассоциаций микроорганизмов, находящихся непосредственно в исследуемом материале (гнойное отделяемое и др.).
- Включение разработанной методики определения чувствительности ассоциаций микроорганизмов в схему лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области позволило сократить сроки лечения в среднем на 3-5 дней.
- Метод лазерной флюоресценции высокоинформативен, прост и удобен в применении, что позволит считать его доступным и перспективным в клинической микробиологической лаборатории и непосредственно в условиях клиники. Метод позволит проводить анализ по месту лечения.
Практические рекомендации.
1. Согласно полученным экспериментальным данным разработанный метод лазерной флюоресценции можно применять для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам. Разработанный метод можно рекомендовать в качестве экспресс-метода определения антибиотикочувствительности.
2. В качестве объективных критериев чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам рекомендовано использовать изменения нормированной мощности флюоресценции (показатель S2/S1) исследуемых образцов микроорганизмов с антимикробными препаратами относительно показателей контрольных объектов.
Для воспроизводимости метода необходимо использовать калибровочные тесты и нормировку регистрируемых показателей – S1, S2/S1 по эталонному нефлюоресцирующему образцу
Список работ, опубликованных по теме диссертации.
1. Александров М.Т., Воробьев А.А., Зайцева Т.А., Красенков Я.Н., Родионов А.Д., Воробьев А.А., Пашков Е.П., Филатов М.В. Экспресс метод определения эффективности антимикробных препаратов на основе использования явления флюоресценции// материалы 4-ой международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке». – М., 2003 г. – С. 35-36.
2. Александров М.Т., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Родионов А.Д., Красенков Я.Н., Воробьев А.А. Лазерная флюоресцентная диагностика заболеваний полости рта// материалы 4-ой международной научно-практической конференции «Здоровье и Образование в XXI веке».- М., 2003 г. – С 34 - 35.
3. Александров М.Т., Зайцева Т.А., Пашков Е.П., Воробьев А.А., Брагина М.Н., Смирнова В.В. Метод лазерной флюоресцентной диагностики определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам // материалы 6-ой международной конференции «Экология человека и природа», Москва-Плес, 2004, - С. 261-262.
4. Зайцева Т.А., Александров М.Т., Пашков Е.П., Воробьев А.А., Брагина М.Н., Баграмов Р.И., Баграмова Г. Обоснование применения метода лазерной флюоресцентной диагностики для определения чувствительности микробных ассоциаций к антимикробным препаратам // материалы VII международного научного конгресса «Современный олимпийский спорт и спорт для всех», - М., 2004. - С. 68-70.
5. Александров М.Т., Зайцева Т.А., Лабазанов А.А., Морозова О.А., Бажанов Н.Н., Пашков Е.П., Воробьев А.А., Хоменко В.А., Брагина М.Н. Обоснование применения метода лазерной флюоресцентной диагностики для определения чувствительности микробных ассоциаций к антимикробным препаратам // материалы VII московского международного салона промышленной собственности «Архимед – 2004».
6. Александров М.Т., Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Воробьев А.А., Брагина М.Н., Лабазанов А.А. Применение метода лазерной флюоресцентной диагностики для оценки эффективности современных антисептиков// Клиническая лабораторная диагностика. - 2004, - №9. - с.28.
7. Александров М.Т. Пашков Е.П., Зайцева Т.А., Воробьев А.А., Брагина М.Н., Лабазанов А.А. Опыт применения лазерно-флюоресцентной диагностики для лечения больных с гнойно-воспалительными заболеваниями челюстно-лицевой области (клинико-микробиологическое обоснование выбора антибиотикотерапии)// Клиническая лабораторная диагностика. - 2004, - №9. - с.32.
8. Александров М.Т., Лабазанов А.А., Бажанов Н.Н., Зайцева Т.А., Поляков К.А., Пашков Е.П., Морозова О.А., Гапоненко О.Г., Хоменко В.А. Применение метода лазерной флюоресцентной диагностики для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам в хирургической стоматологической практике: Тез. докл. II всероссийской научно-практической конференции «Образование, наука и практика в стоматологии». – М., 2005. – С.19-21.
9. Александров М.Т., Зайцева Т.А., Воробьев А.А., Пашков Е.П., Бажанов Н.Н., Брагина М.Н., Морозова О.А., Поляков К.А., Уголькова И.В., Хоменко В.А. Возможности метода лазерной флюоресценции для определения чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам в спортивной практике// Олимпийский бюллетень – 2005, - №7. – С.182-194.
10. Александров М.Т., Зайцева Т.А., Пашков Е.П., Воробьев А.А., Бажанов Н.Н., Зотова М.В., Голованова Е.А., Пронина Е.А. Антимикробная активность оксида азота при воздействии на Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans// Клиническая лабораторная диагностика №9, 2005. – C. 30-31.
11. Александров М.Т., Зайцева Т.А., Пашков Е.П., Воробьев А.А., Бажанов Н.Н., Голованова Е.А., Пронина Е.А. Сравнительная оценка эффективности антимикробных препаратов методом лазерной флюоресценции// Клиническая лабораторная диагностика, №9, 2005. – с. 30.
