Выделение гордецина из зерна ячменя и исследование его биологического действия и взаимосвязи с морфофизиологическими признаками

На правах рукописи

КОСТРОМИЧЕВА ЕКАТЕРИНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

ВЫДЕЛЕНИЕ ГОРДЕЦИНА ИЗ ЗЕРНА ЯЧМЕНЯ

И ИССЛЕДОВАНИЕ ЕГО БИОЛОГИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

И ВЗАИМОСВЯЗИ С МОРФОФИЗИОЛОГИЧЕСКИМИ ПРИЗНАКАМИ

Специальность 03.01.05 – физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Воронеж – 2013 г.

Работа выполнена в ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур»

Научный руководитель:	доктор биологических наук, профессор Павловская Нинэль Ефимовна
Официальные оппоненты:	Грабович Маргарита Юрьевна доктор биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет», профессор кафедры биохимии и физиологии клетки
	Корнеева Ольга Сергеевна доктор биологических наук, профессор ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет инженерных технологий», заведующая кафедрой микробиологии и биохимии
Ведущая организация:	ГНУ «Всероссийский научно-исследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова», Санкт-Петербург

Защита состоится «19» апреля 2013 года в 16.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.038.02 при Воронежском государственном университете по адресу: 394006, Воронеж, Университетская пл., 1.

С диссертацией можно ознакомиться в зональной научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Воронежский государственный университет».

Автореферат разослан «_____» марта 2013 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Брехова Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Ячмень (Hordeum vulgare L.) выделяется среди других злаковых культур большим набором биологически активных компонентов, в том числе и антибактериальных, свойственным только этой культуре. Они являются фактором естественного иммунитета растений и защищают его от микробов. В зерне ячменя содержится гордецин - вещество, обладающее антибактериальными свойствами (Ежов И.С., 1968), сосредоточенное в алейроновом слое и оболочке зерен ячменя. Ежов И.С.и Новотельнов Н.В. впервые выделили его из воды, оставшейся после замачивания ячменя. Установлена эмпирическая формула гордецина– C25H39O7N и вычислена его молекулярная масса - 465,33. Гордецин представляет собой непредельное азотистое соединение кислотной природы. (Ежов И.С., 1968). В дальнейшем было показано, что гордецинсодержащие вещества обладают фунгицидным и бактериостатическим действием, и могут быть альтернативой синтетических антибиотиков в медицине, пищевой промышленности, ветеринарии, защите растений. Гордецин отличается широким спектром действия и низкой токсичностью. Возможность его использования в пищевой промышленности определена, способностью останавливать рост спороносных бактерий. Гордецин эффективен в борьбе с картофельной болезнью пшеничного хлеба. Его применение увеличивает срок хранения яиц. Лучшие результаты гордецин показал при лечении кандидамикозов. Терапевтический эффект проявлялся при лечении эпидермофии стоп, рубофитии кожи, микробной экземы (Аравийский А.Н., 1967; Новотельнов Н.В., 1967; Ежов И.С., 1968; Заруцкий Л.Я., 2009).

Известно, что антибиотики природного происхождения представляют собой альтернативное средство защиты растений от болезней. В тканях растений их биологическая активность, проявляется значительно сильнее, чем в животных тканях. Антибиотики обладают избирательным действием, снижая тем самым уровень вредного воздействия на растение. (Павловская Н.Е., 2012).

Реакция растений на обработку гордецином остается слабо изученной. В связи с этим, исследование физиологического действия гордецина по отношению к растительным объектам, не содержащим антибактериальные вещества, является актуальным и своевременным.

Представляет интерес накопление гордецина в различных сортах ячменя, изменение его содержания в зависимости от сорта. Выявление источников с высоким содержанием гордецина позволит проанализировать его роль в формировании устойчивости ячменя к различным заболеваниям. Изучение взаимосвязи содержания гордецина с морфофизиологическими признаками и с определенными спектрами запасных белков (гордеинов) позволит выявить наиболее перспективные генотипы.

Цели и задачи исследований. Цель данной работы – получить гордецин из ячменя и исследовать физиолого-биохимические аспекты его действия.

Для достижения цели решались следующие задачи:

1. Провести количественное выделение гордецина из различных сортообразцов ячменя, методом экстракционного извлечения.
2. Исследовать морфофизиологические особенности яровых и озимых сортообразцов ячменя.
3. Исследовать действие экзогенного гордецина на интенсивность ростовых процессов проростков гороха.
4. Выяснить влияние обработки экзогенным гордецином проростков гороха на изменение супероксиддисмутазной активности.
5. Провести идентификацию сортообразцов ячменя используя, запасные полиморфные белки гордеины.
6. Установить корреляционную взаимосвязь морфофизиологических особенностей в сортообразцах ячменя с количеством гордецина.

Научная новизна работы. Впервые проведен анализ генотипов ячменя на содержание гордецина и выявлены образцы с наибольшим выходом этого антибактериального вещества. Определены оптимальные параметры растворителей для максимального извлечения гордецина из малых проб зерна ячменя. Получены результаты влияния гордецина на рост и развитие здоровых и инфицированных Fusarium oxysporum растений гороха. Установлены ростостимулирующие свойства гордецина, при заражении проростков гороха Fusarium oxysporum. Подтверждены бактериостатические свойства гордецина. Выявлена взаимосвязь содержания гордецина с морфофизиологическими показателями ячменя.

Практическая значимость работы. Расширены и углублены знания о действие гордецина на физиологические процессы в растительных объектах. Данные, свидетельствующие о бактерицидных свойствах гордецина, а также о стимулирующем влиянии на физиологические процессы растений, зараженные Fusarium oxysporum, открывают перспективы его использования в растениеводстве. Установлены генетические формулы локусов гордеинов в сортообразцах ячменя, которые могут быть использованы для выведения сортов с высоким содержанием гордецина.

Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе на кафедре биотехнологии Орловского государственного аграрного университета при чтении лекций по физиологии, биохимии, микробиологии, а также при проведении практикумов и выполнения курсовых и дипломных работ.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на региональных конференциях. Они были представлены на международной конференции молодых ученых «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии " (Брянск, 2008), региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства» (Орел, 2009), региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященный 35-летию Орловского государственного аграрного университета «Инновационный потенциал молодых ученых – АПК Орловской области» (Орел, 2010), Всероссийской научно-практической конференции «Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства» (Орел, 2010), Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2010), международной конференции «Биология наука XXI века» (Москва, 2012), на втором молодежном региональном конкурсе инновационных проектов «Молодежь и наука 21 века».

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, в том числе 3 статьи в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 144 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, изложения результатов исследований и их обсуждения, выводов, заключения, приложения, списка литературы, включающего 200 источников. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 54 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. Экспериментальная работа проводилась в лаборатории физиологии и биохимии растений ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт зернобобовых и крупяных культур Российской академии сельскохозяйственных наук и в испытательной лаборатории института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН. Материалом для исследований послужили 19 сортообразцов ярового и озимого ячменя, в том числе сорта, допущенные к использованию в регионе, и сорта, созданные во ВНИИЗБК. Озимые сортообразцы: Волгодон, Мастер, Фрегат, Ураган, Жигули, Фараон, Садко, №1681, №546, №1629. Яровые сортообразцы: Атаман, Инермис Б-9, В-5, А-14, Эректум-1, Медикум-1577, Нудум-1, Т-277, Ассоль.

Методы исследования. Для определения активности супероксиддисмутазы использовали модифицированную методику с использованием прибора - фотореактора (Giannopolities, C.N., 1977). Электрофорез гордеина проводили по методу, описанному А.А. Созиновым и Ф.А. Поперели (1978) с модификациями А.А. Поморцева (1985). Содержание белка в зерне определяли методом Къельдаля (Ермаков А.И., 1972). Методом взвешивания определяли сухую массу растения и семян, предварительно высушивая их при температуре 800 С в течение 2-х суток. Оценка устойчивости к болезням осуществлялась по степени поражения растений в процентах к общему числу растений в пробе (Пересыпкин В. Ф, 1991). Получение гордецина проводили по методу, предложенному Новотельновым Н.В. и Ежовым И.С. с разработанными в нашей лаборатории модификациями.

Статистические методы обработки данных. Лабораторные опыты проводили в 3 кратной биологической повторности, аналитическое определение для каждой пробы – в трех повторностях. Достоверность экспериментальных данных оценивали методами математической статистики с привлечением современных программных средств. Расчеты, построение графиков и их описание осуществляли с помощью приложений Microsoft Office Word 7 и Excel 7 для Windows ХР, GrTest.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Морфофизиологические особенности сортообразцов ячменя

Для создания сортов ячменя с повышенным содержанием гордецина необходимо изучить взаимосвязь данного признака с другими морфофизиологическими признаками. В связи с этим нами были проанализированы следующие показатели: содержание белка в зерне, устойчивость к заболеваниям, высота растения, сухая масса растения, продуктивная кустистость, масса главного колоса, число зерен главного колоса, масса зерен главного колоса, масса зерне с одного растения, масса 1000 семян за период 2009…2011 гг. Установлена значительная изменчивость морфофизиологических показателей озимых и яровых генотипов ячменя. На основании полученных данных выделены высокоурожайные сорта: Волгодон, №1681, Атаман, Медикум-1577.

Важную роль в оценке биохимических показателей зерна ячменя играет содержание белка. Результаты экспериментального изучения исходного материала выявили преобладание данного показателя у яровых форм над озимыми. Содержание белка в озимых сортообразцах колеблется от 10,3% до 14,9%, в яровых от 10,2% до 16,8%. В среднем количество белка в зернах ячменя в 2009 году составило 12% в озимых формах и 14,6% в яровых; в 2010 году 12,2% в озимых и 12,4% в яровых; в 2011 12,6% и 14,6% соответственно. На протяжении трех лет исследований относительно высокое количество белка было отмечено в озимых сортообразцах: Жигули, № 546, Фрегат, в яровых сортообразцах: Т- 277, А-14. Наименьшим содержанием белка отличились озимые сортообразцы ячменя: №1629, Мастер и яровой сорта Атаман.

Содержание белка у сортообразцов характеризуется постоянством и небольшим варьированием от различных факторов окружающей среды. Максимальные различия по содержанию белка между сортообразцами ячменя в 2009…2011 гг. составили среди озимых форм - 3,1%, 4,9%, 2,2%, соответственно, а среди яровых форм - 3,7%, 3,9%, 4,7% соответственно.

В ходе изучения сортообразцов ячменя нами была проанализирована их устойчивость к наиболее распространенным на территории Орловской области заболеваниям, таким как ржавчина, мучнистая роса, гельминтоспориоз, пыльная головня. Было установлено, что наибольший вред посевам наносит мучнистая роса (20% – 80%). Самыми устойчивыми оказались яровые формы Атаман и Эректум-1, процент зараженности составил по 20%. Максимальная зараженность этим грибом – 80 % отмечена у сорта Фараон.

Менее устойчивы к заболеванию ржавчиной оказались озимые формы ячменя по сравнению с яровыми. Процент зараженности озимых сортов от 20% до 60%. Практически во всех яровых сортообразцах процент зараженности либо не превышает 20% (В-5, Эректум-1, Т-277, Нудум-1), либо встречаются единичные случаи заражения ржавчиной (А-14, Медикум 1577, Атаман).

Гельминтоспориоз повреждал от 28% до 68% изучаемых озимых и яровых сортообразцов ячменя. Самым не устойчивым оказался сорт Фараон. Наименее пораженным – сортообразец №1629.

Установлено, что практически все сортообразцы оказались устойчивыми к заболеванию пыльной головни. Признаки заболевания или отсутствовали или встречались у единичных растений.

Таким образом, можно выделить наиболее устойчивые формы ячменей: А-14, Медикум - 1577, Атаман, №1629, Эректум-1. Установлено, что озимые формы ячменей более подвержены различным возбудителям заболеваний, чем яровые.

2. Выделение и очистка антибиотика гордецина

Получение гордецина проводили методом, предложенным Новотельновым Н.В. и Ежовым И.С. Однако в ходе проведения эксперимента были внесены некоторые корректирующие методические операции, обусловленные необходимостью получать гордецин из малых проб зерна ячменя. Проведя некоторые изменения в ходе выделения, мы получали гордецин по следующей схеме (рис.1).

Выделение гордецина осуществляли двухступенчатой экстракцией различными растворителями. В отличие от оригинальной методики нами была исключена трехкратная водная обработка измельченных семян ячменя и заменена экстракцией диэтиловым эфиром в присутствие 3% соляной кислоты. В результате исключения гидрокарбоната натрия как одного из растворителей количество фракций гордецина сократилось с пяти, выделенных Ежовым И.С. до двух: карбонатной и нейтральной. Было выявлено, что нейтральная фракция гордецина превышает карбонатную в соотношении - 13:5. В среднем выход карбонатной фракции из озимых сортообразцов ячменя составляет 0,2%, из яровых 0,3%. Выход нейтральной фракции из озимых форм – 0,4%, из яровых 0,9%.

Для подтверждения принадлежности полученного препарата к гордецину была осуществлена идентификация его хроматографическим методом на бумаге в специальной системе элюции: н-бутанол : ацетон : вода в соотношении 5:1:2. Полученные пятна карбонатной и нейтральной фракций соответствуют по цвету и относительной электрофоретической подвижности Rf (0,81; 0,87; 0,99). Именно такое описание было составлено Ежовым И.С. для выделенного из ячменя гордецина. Нами были обработаны полученные результаты хроматографирования гордецина в программе GrTest, разработанной И.А. Гринблатом (2006 г.). Данные объединены и преобразованы с помощью Microsoft Excel в графическое изображение (рис.2). Сравнительный анализ площади пиков свидетельствует о преобладании нейтральной фракции над карбонатной.

Рис.1 - Схема выделения гордецина из семян ячменя.

Рис. 2 - Хроматограмма нейтральной и карбонатной фракций гордецина. 1 и 1/ - rf=0,99; 2 и 2/ rf=0,87; 3 и 3/ rf=0,81. (ряд 1 – нейтральная, ряд 2 – карбонатная).

Следовательно, на основании анализа хроматограмм разделенного гордецина можно утверждать, что выделенная фракция является гордецином.

3. Действие экзогенного гордецина на физиолого-биохимические процессы в растениях гороха (Pisum sativum L.)

Биологическая активность гордецина и его фракций проявляется в действии на различные регуляторные процессы, показатели посевных качеств семян, в том числе на рост и развитие растений. Наиболее чувствительной к действию природных и химических сенсибилизаторов является антиоксидантная система клеток. Разработанный рядом ученых Орловского аграрного государственного университета (Павловская Н.Е., Гринблат А.И., Гагарина А.Ю., 2006-2011 г.г. и др) тест  для оценки влияния активных веществ и прогнозирования реактивности их воздействия на состояние клеточного метаболизма открывает возможности изучения механизма действия и физиологического эффекта на основные процессы гордецина.

В естественных условиях процесс свободнорадикального окисления находится под строгим контролем различных систем клетки (Владимиров Ю.В., 1998). Проведенные исследования показали, что в норме активность фермента супероксиддисмутазы у прорастающего гороха в течение 10 дней имеет тенденцию к постепенному увеличению почти в 2 раза. В ходе проведения эксперимента растения гороха подвергались обработке раствором гордецина в различных концентрациях.

Динамика активности супероксиддисмутазы в проростках гороха под действием гордецина в концентрации 210-6 М резко увеличивается на вторые и седьмые сутки, и снижается на пятые, что свидетельствует о сильном стрессовом воздействии (рис. 3). После этого растение увядает и гибнет.

Рис. 3 - Динамика активности СОД в проростках гороха, обработанных гордецином.

Такая ответная реакция показывает губительность экзогенного гордецина в высоких концентрациях на проростки гороха, в связи, с чем нами были проведены исследования по влиянию низких концентраций гордецина на динамику активности СОД.

При снижении концентрации гордецина до 210-10М … 210-12М пики активности выражены слабее, а к 10 суткам показатели активности фермента приближаются к контролю или незначительно превышают его. Таким образом, обработка гордецином в концентрации 210-12М, а в некоторых случаях и 2*10-11М позволяет снизить вредное воздействие и повысить показатели активности супероксиддисмутазы к десятым суткам (рис.3).

При инфицировании Fusarium oxysporum проростков гороха активность СОД уже к 5 суткам увеличивается в 2,5 раза, что свидетельствует об усилении выработки свободных радикалов, направленных на борьбу с чужеродными объектами, однако их количество губительно сказывается в дальнейшем на активности супероксиддисмутазы (рис. 4). Как видно из полученных данных, активность супероксиддисмутазы в проростках гороха к седьмым суткам падает ниже первоначального значения на 20%. Интересно отметить, что активность данного показателя снижается на пятые сутки почти на 80%.

При совместном действии Fusarium oxysporum и гордецина в концентрации 210-6М имеет место выраженная стрессовая реакция проростков гороха. Так, активность СОД резко увеличивается (почти в 10 раз) к 7 суткам экспозиции. В то же время наблюдается сильное падение этого показателя на десятый день (активность СОД приближается к нулю). Снижение количества экзогенного гордецина (210-10М – 210-12М) позволяет уменьшить негативное воздействие антибактериальных веществ. Наблюдается появление активности СОД в растении на 7-е сутки (600 – 700 E/г сырой массы).

Рис. 4 - Активность СОД в инфицированных Fusarium oxysporum проростках гороха, обработанных гордецином.

Проведенные исследования позволяет считать возможным использование гордецина как иммуностимулятора в растениях.

Аналогичная по значению величина активности фермента наблюдается в не инфицированных образцах. На десятые сутки активность СОД снижается, при этом уровень активности фермента достигает контрольных значений.

4. Влияние гордецина на ростовые процессы гороха (Pisum sativum L.)

Для выявления влияния гордецина на рост и развитие проростков гороха в течение 10 суток проводились исследования изменения скорости роста корней и побегов. Показателем этих изменений служили значения прироста длины исследуемого растения. Наблюдалась вариабельная изменчивость длины проростков в зависимости от концентрации гордецина. Обработка гордецином растений в концентрации 210-6М приводила к полному ингибированию ростовых процессов. Выявлено, что длина корней здоровых проростков гороха, обработанных гордецином, снижается по сравнению с контролем в 2,5 раза. Обратная ситуация наблюдалась в случае зараженных Fusarium oxysporum проростков. Длина корней проростков гороха, обработанных гордецином, по-сравнению с контролем, выше в 2,3 – 2,7 раза (рис. 5 - 6).

Рис. 5 - Изменение длины корней гороха, обработанного гордецином.

Рис. 6 - Изменение длины корней гороха, инфицированного Fusarium oxysporum и обработанного гордецином.

Таким образом, у здоровых проростков гороха экзогенный гордецин в определенных концентрациях (210-10М – 210-12М) угнетает рост корней, а у инфицированных Fusarium oxysporum способствует резкому увеличению ростовой активности корня, что видимо, связано с избирательным действием гордецина на патоген.

На рост здоровых проростков гороха гордецин на начальных стадиях также оказывает ингибирующее влияние, независимо от его концентрации. Снижение показателей роста проростков гороха под действием гордецина проявляется на четвертые сутки. Длина проростков гороха, инфицированного Fusarium oxysporum и обработанного гордецином, превышает высоту здоровых растений в течение четырех суток в 2 – 2,7 раза и высоту инфицированных организмов 3,2 – 3,5 раза. Как видно из полученных данных, к восьмым суткам рост проростков замедляется как по сравнению с здоровыми образцами, так и по сравнению с инфицированными (рис. 7 - 8).

Рис. 7 - Изменение длины проростков гороха, обработанного гордецином.

Рис. 8 - Изменение длины проростков гороха, инфицированного Fusarium oxysporum и обработанного гордецином.

Механизм стимулирующего действия антибиотиков на растения до конца не выяснен. Действие гордецина наблюдается только при совместном действии с Fusarium oxysporum, что проявляется в ускорении процесса накопления биомассы корней. Возможно, на инфицированном фоне гордецин способствует усилению иммунобиологических свойств опытного растения. В отсутствие патогена взаимодействие гордецина с тканями растения приводит к замедлению роста корней и проростков гороха.

5. Бактерицидные свойства гордецина

Для исследования бактерицидной способности гордецина его выделенные фракции были апробированы на разных микроорганизмах: E. Coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus. Эти исследования проводились в лаборатории инфекционных болезней больницы им. С.П. Боткина (г. Орел). Установлено, что более выраженным антимикробным действием обладает карбонатная фракция этого антибиотика. Вероятно, концентрация действующего вещества в ней выше, чем в нейтральной (рис. 9 – 10).

Рис. 9 - Бактерицидная способность нейтральной фракции гордецина.

Были выявлены очаги подавления грамотрицательных палочковидных бактерий E.Coli в диаметре от 2 до 8 мм и шаровидных грамположительных бактерий в диаметре более 12 мм, что позволяет судить о перспективности создания новых типов растительных антибиотиков и ветеринарных препаратов с использованием гордецина

Рис. 10 - Бактерицидная способность карбонатной фракции гордецина

Результаты эксперимента подтвердили бактерицидную способность гордецина по отношению к исследованной патогенной микрофлоре.

6. Поиск и отбор сортообразцов ячменя как источников гордецина

Для того чтобы оценить выход готового продукта, была определена масса полученных веществ в выделенных фракциях (табл. 1 -2).

Таблица 1.

Выход гордецина из зерен озимого ячменя, %

озимые сортообразцы	Волгодон	№546	Жигули	Фараон	Ураган	Мастер	№1681	№1629	Садко	Фрегат	Среднее
Количество гордецина, %	0,99	0,45	1,4	0,48	0,49	0,50	0,48	0,48	0,43	0,51	0,62

Таблица 2.

Выход гордецина из зерен ярового ячменя, %

Яровые сортообразцы	Инермис Б-9	В-5	А-14	Эрэктум-1	Медикум-1577	Т-277	Нудум-1	Атаман	Среднее
Количество гордецина, %	1,07	1,18	1,05	0,59	0,72	1,32	1,60	1,88	1,18

Установлено, что в яровых формах ячменя содержание гордецина выше, чем в озимых. Так, в среднем выход гордецина из озимых сортообразцов ячменя составляет 0,62 %, из яровых - 1,18 %.(табл.1,2)

По суммарному количеству гордецина среди озимых образцов лидирует сорт ячменя Жигули (1,43%). Высокое содержание этого вещества отмечено в сортах Волгодон и Фрегат, количество гордецина в них составило 0,97% и 0,51% соответственно. Сравнительно низкое количество (от 0,48% до 0,49%) гордецина обнаружено в сортообразцах Фараон, Ураган, Мастер, №1681, №1629. В семенах озимых ячменей Садко (0,43%) и №546 (0,45%) выявлено самое низкое количество гордецина. Высокий выход этого компонента в яровых сортообразцах Атаман (1,88%) и Нудум – 1 (1,6%). Наименьшее количество гордецина в сортообразцах Эректум – 1 (0,69%) и Медикум – 1577 (0,72%).

По результатам анализа соотношения фракций выявлено, что содержание карбонатной фракции гордецина в исследуемых озимых сортообразцах ячменя составляет примерно 0,23%. Установлено, что наибольшее количество данной фракции содержится в семенах сорта ячменя Фараон (0,26%). В семенах яровых сортообразцов ячменя содержание карбонатной фракции гордецина равняется 0,38%. Наибольшее значение данного показателя отмечено у сортообразца Инермис Б-9 (0,5%).

Исследования семян озимых ячменей на содержание нейтральной фракции гордецина установили, что наибольшее количество данной фракции характерно для сорта Жигули (1,40%). В изученных яровых сортообразцах ячменя максимальное количество нейтральной фракции гордецина обнаружено в сорте Атаман (1,7%).

В большинстве озимых форм ячменя содержание нейтральной фракции гордецина в 2,4 раз больше, чем карбонатной фракции. Тогда как в яровом ячмене, количество нейтральной фракции гордецина в 3,4 раз больше, чем карбонатной.

Таким образом, наиболее перспективными сортообразцами для выделения гордецина являются Атаман и Нудум-1.

7. Исследование взаимосвязи содержания гордецина с морфофизиологическими признаками

В ходе исследования взаимосвязи морфофизиологических признаков ячменя установлена сильная корреляционная зависимость (r=0,99) между продуктивностью ячменя и такими показателями как: масса главного колоса, масса зерна с растения (табл.3).

Урожайность коррелирует также с числом зерен с главного колоса (r=0,82), массой зерна с главного колоса (r=0,81). Более слабая взаимосвязь (r=0,64) выявлена между урожайностью и сухой массой растения. Масса зерна с растения коррелирует с массой и числом зерен главного колоса (r=0,99). Существенная положительная взаимосвязь (r=0,88) отмечена между массой зерна одного растения и его продуктивной кустистостью, а также между массой сухого растения и массой зерна с растения. Коэффициент корреляции 0,7 установлен для следующих элементов структуры урожая: число зерен с главного колоса и масса сухого растения; масса зерна с главного колоса и масса сухого растения. Отрицательной корреляции между данными элементами не выявлено. Более слабая взаимосвязь обнаружена между урожайностью и сухой массой растения.

Содержание гордецина связано обратной зависимостью с изученными морфофизиологическими показателями. Практически отсутствует связь с продуктивной кустистостью (r= - 0,08). Количество гордецина связано слабой обратной зависимостью с высотой растения (r= - 0,31), сухой массой растения (r= - 0,45), урожайностью (r= - 0,47), более значительной зависимостью с массой главного колоса (r= - 0,62), числом зерен с главного колоса (r= - 0,63), массой зерна с растения (r= - 0,64), массой зерна с главного колоса (r= - 0,61), массой тысячи зерен (r= - 0,83). Это указывает на то, что синтез веществ вторичного обмена находится в обратной зависимости от накопления биомассы ячменя. Расход пластических веществ, накапливаемых при фотосинтезе, направлен, прежде всего, на формирование запасных компонентов клетки.

Таблица 3.

Взаимосвязь морфофизиологических признаков (коэффициент корреляции).

Морфофизиологические признаки	Высота растения	Продуктивная кустистость	Масса главного колоса	Число зерен главного колоса	Масса 1000 зерен	Масса зерна с одного растения	Масса зерна главного колоса	Сухая масса растения	Урожайность
Продуктивная кустистость	0,51
Масса главного колоса	0,04	0,54
Число зерен главного колоса	0,28	0,02	0,99
Масса 1000 семян	0,28	0,55	0,34	0,26
Масса зерна с одного растения	0,57	0,88	0,94	0,92	0,55
Масса зерна главного колоса	0,21	0,12	0,99	0,99	0,41	0,99
Сухая масса растения	0,64	0,51	0,62	0,74	0,41	0,81	0,72
Урожайность	0,14	0,41	0,92	0,82	0,56	0,90	0,81	0,64
Содержание гордецина	-0,31	-0,08	-0,62	-0,63	-0,83	-0,64	-0,61	-0,45	-0,47

Полученные данные содержания гордецина в ячмене разных генотипов и количества белка, позволяют провести анализ их взаимосвязи. В результате корреляционного анализа установлена слабая взаимосвязь между этими показателями (r=0.33).

Анализ соотношения количества гордецина в озимых сортообразцах ячменя с зараженностью мучнистой росой обнаруживает наличие отрицательной корреляции, что говорит о снижении процента зараженности в образцах с повышенным содержанием гордецина (рис.11).

Рис. 11 - Соотношение содержания гордецина в озимых сортообразцах ячменя со степенью зараженности их мучнистой росой.

Коэффициент корреляции между количеством гордецина в зерне и процентом зараженности гельминтоспориозом и ржавчиной низкий. Связь между этими показателями практически отсутствует.

В озимых сортообразцах снижение зараженности гельминтоспориозом на фоне увеличения содержания гордецина наблюдается только в сорте ячменя Жигули. В случае с заражением ржавчиной похожая картина прослеживается в сорте ячменя Садко. Снижение зараженности мучнистой росой с увеличением количества гордецина происходит в яровых сортообразцах Атаман, А-14, Медикум-1577, Инермис Б-9. При зараженности гельминтоспориозом в сортообразцах Инермис Б-9, Эректум – 1 и Атаман высокое содержание гордецина совпадает со снижением степени инфицирования.

8. Идентификация генотипов ячменя методом электрофореза белков в крахмальном геле

В последние годы в изучении важных морфофизиологических показателей широкое распространение получили методы, связанные с использованием систем генетических маркеров (Собко А.А., 1993). Распределение белковых компонентов обладает преимуществом перед другими биохимическими составляющими, так как позволяет идентифицировать локусы и их сочетания, определяющие конкретную функциональную значимость их продуктов для растительного организма. Для культуры ячменя наиболее подходящими маркерами являются запасные белки гордеины (Поморцев А.А., 2011). В настоящее время определены группы сцепления и локусы, контролирующие эти блоки. Локусы, HrdF, Hrd A и Hrd B – полиморфны. Нами были проанализированы электрофореграммы локусов гордеинов изучаемых сортообразцов ячменя, с целью выявления сочетания локусов, характерных для генотипов с высоким содержанием гордецина.

На основании полученных электрофореграмм, представленных на рисунках 12 – 13, были установлены преобладающие локусы, отличающиеся для озимых и яровых сортов.

№1681 №1629 №546 Фрегат Волгодон Садко Жигули

Рис. 12 - Электрофореграммы гордеинов озимых сортообразцов ячменя.

Анализ спектров компонентов гордеина позволил выявить три варианта по локусу Hrd A, четыре варианта по локусу Hrd B и два варианта по локусу Hrd F для озимых форм. Исследованные яровые сортообразцы ячменя отличаются наличием семи аллелей блока Hrd А, семи аллелей Hrd В, и тремя аллелями Hrd F. У исследованных озимых ячменей преобладающими локусами являются Hrd А3 и Hrd А21. По локусу Hrd В озимые сортообразцы оказались более разнообразны, чем по локусу Hrd А. Среди данных сортообразцов преобладает аллель Hrd В17. У яровых форм ячменя наиболее часто встречается локус Hrd A2, по локусу Hrd B преобладают аллели 8, 19.

А-14 Т-277 Медикум-1577 Эректум-1

В-5 Ассоль Нудум-1 Инермис Б-9

Рис. 13 – Электрофореграммы гордеинов яровых сортообразцов ячменя.

Анализ локусов гордеинов в наиболее перспективных сортообразцах

На основании сопоставления полученных данных и электрофореграмм сортообразцов озимого и ярового ячменя можно выделить перспективные генотипы. Так, наиболее продуктивными оказались генотипы: Hrd A2B3F2 › Hrd A21B3F2 › Hrd A3B17F3 › Hrd A3B5F1 › Hrd A21B19F1 › Hrd A3B17F3 › Hrd A3B17F3 среди озимых ячменей. К ним относятся сортообразцы ячменя Волгодон, №1681, Жигули, Фрегат, №1629, Ураган, Садко. Hrd A23B8F2 › Hrd A2B19F3 › Hrd A2B11F1 › Hrd A18B19F3 › Hrd A28B31F3 – Hrd A40B8F2 › Hrd A12B13F2 › Hrd A24B111F1 среди яровых ячменей, т.е. сортообразцы Атаман, Медикум – 1577, В-5, Инермис Б-9, А-14, Эректум-1, Нудум – 1, Т-277 соответственно.

По содержанию белка генотипы расположены следующим образом: Hrd A3B17F1 › Hrd A21B3F2 › Hrd A3B5F1 › Hrd A3B17F3 › Hrd A2B3F2 › Hrd A21B3F2 › Hrd A3B17F3 › Hrd A21B19F1 среди озимых ячменей, которым соответствуют сортообразцы Жигули, №546, Фрегат, Ураган, Волгодон, №1681, Садко, №1629. Среди яровых сортов наблюдается такой ряд: Hrd A24B111F1 › Hrd A40B8F2 › Hrd A28B31F3 › Hrd A2B19F3 › Hrd A18B19F3 › Hrd A2B11F1 › Hrd A23B8F2, которые соответствуют сортообразцам Т-277, Эректум-1, А-14, Медикум-1577, Инермис Б-9, В-5, Атаман.

По количественному содержанию гордецина генотипы озимых сортообразцов ячменей распределялись следующим образом: Hrd A3B17F3 (Жигули) › Hrd A2B3F2 (Волгодон) › Hrd A3B5F1(Фрегат) › Hrd A3B17F3 (Ураган)› Hrd A21B3F2 (№1681) – Hrd A21B19F1 (№1629) › Hrd A21B3F2 (№546) › Hrd A3B17F3 (Садко). Для яровых ячменей этот ряд показателей выглядел так: Hrd A23B8F2 (Атаман) › Hrd A12B13F2 (Нудум-1)› Hrd A24B111F1 (Т-277)› Hrd A2B11F1 (В-5)› Hrd A18B19F3 (Инермис Б-9) › Hrd A28B31F3 (А-14) › Hrd A2B19F3 (Медикум -1577) › Hrd A40B8F2 (Эректум 1).

Таким образом, для оптимального соотношения высокой продуктивности и значительного содержания антибактериальных фракций в изучаемых сортообразцах характерно сочетание локусов гордеинов Hrd А23В8F2, Hrd А2В3F2.

Заключение

В ходе проведения исследований был выделен гордецин из 19 сортообразцов озимого и ярового ячменя и выявлены растения с наибольшим содержанием этого антибактериального вещества. Выделение гордецина осуществляли двухступенчатой экстракцией разными растворителями.

Были определены соотношения массы зерна ячменя и количество растворителя. Так, оптимальными являются следующие пропорции: ячменная мука, серный эфир, соляная кислота – 10; 25; 1,7. В результате проведенного исследования было выявлено, что содержание гордецина в зерне ячменя колеблется от 0,43 % до 1,4 % в озимых формах и от 0,59% до 1,88% в яровых.

Исследование влияния на физиологические процессы в растительных организмах экзогенного гордецина показало его биологическую активность. Установлено идентичность действия выделенных веществ из различных сортообразцов ячменя, а также схожесть нейтральной и карбонатной фракций гордецина. В ходе изучения физиологического действия гордецина рассматривали его влияние на рост проростков гороха. Показано, что обработка экзогенным гордецином в низких концентрациях действует угнетающе на развитие растений на начальных стадиях, замедляя рост корней и проростков. Высокие концентрации данного вещества (выше 210-6М) приводят к нарушению процесса прорастания семян.

Обработка гордецином инфицированных Fusarium oxysporum проростков гороха приводит к усилению ростовой активности корней и замедлению роста проростков. Механизм стимулирующего действия антибиотиков на растения до конца не выяснен. Действие гордецина наблюдается только при совместном действии с Fusarium oxysporum. Возможно, на инфицированном фоне гордецин способствует усилению иммунобиологических свойств опытного растения.

Испытания биологической активности гордецина на активность супероксиддисмутазы в проростках гороха выявили существенную разницу активности фермента в зависимости от концентрации гордецина. Проведенные исследования показали целесообразность его применения в низких концентрациях для увеличения иммунных свойств растений зараженных Fusarium oxysporum.

В результате анализа устойчивости к заболеваниям изучаемых сортообразцов ячменя установлено отсутствие взаимосвязи между количеством гордецина и процентом зараженности ржавчиной и гельминтоспориозом. Следовательно, гордецин не влияет на устойчивость к этим заболеваниям. Коэффициент корреляции содержания гордецина с мучнистой росой равен -0,5.

Установлено, что содержание гордецина в ячмене находится в обратной зависимости от накопления его биомассы, так как со всеми рассмотренными морфофизиологическими показателями количество гордецина коррелирует отрицательно.

Для более полного изучения особенностей выделенных источников высокого содержания гордецина был проведен электрофоретический анализ запасных белков зерна ячменя – гордеинов, полиморфным по локусам Hrd A, Hrd B, Hrd F. Изучение электрофоретических спектров показало внутрисортовую однородность и межсортовой полиморфизм исследуемых сортообразцов.

Выявлено, что наибольшим содержанием гордецина отличались сортообразцы со следующими сочетаниями блоков локусов гордеинов: Hrd A3B17F3, Hrd A2B3F2, Hrd A3B5F1 (озимые), Hrd A23B8F2, Hrd A12B13F2, A24B111F1 (яровые). Низкая белковость зерна в 2009 – 2011 гг. была отмечена у сортообразцов ячменя с генотипами Hrd A21B3F2, Hrd A3B17F3, Hrd A21B19F среди озимых и Hrd A18B19F3, Hrd A2B11F1 среди яровых форм ячменя. Наиболее продуктивными оказались сортообразцы имеющие локусы Hrd A2B3F2, Hrd A21B3F2, Hrd A3B17F3 среди озимых ячменей и локусы Hrd A23B8F2, Hrd A2B19F3, Hrd A2B11F1 среди яровых.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что содержание гордецина в яровых формах ячменя выше, чем в озимых в два раза. Его накопление связано с условиями выращивания. Количество гордецина в семенах озимого ячменя составляет от 0,43 % до 1,4 % в семенах ярового от 0,59 % до 1,88 %. Максимальное содержание гордецина отмечено в сорте Атаман – 1,18%
2. Биологическое действие экзогенного гордецина на проростки гороха не одинаково и зависит от его дозы. Так, обработка семян гордецином в концентрации 210-6 М ингибирует процесс прорастания семян, снижение количества гордецина до 210-10 М замедляет рост корней и проростков гороха, а до 210-12 М стимулирует образование боковых корешков.
3. Действие гордецина на проростки гороха зависит от их физиологического состояния. Гордецин способен стимулировать рост корней гороха на инфицированном Fusarium oxysporum фоне, тогда как на рост корней здоровых проростков он оказывает ингибирующее действие.
4. Установлено, что экзогенный гордецин оказывает регулирующее влияние на активность супероксиддисмутазы в проростках гороха инфицированных Fusarium oxysporum. Активность супероксиддисмутазы имеет пик на пятые сутки у зараженных растений, а у обработанных гордецином, на седьмые сутки, что обусловлено ответной реакцией растения на увеличение количества активных форм кислорода.
5. Установлена высокая изменчивость морфофизиологических показателей среди озимых и яровых сортообразцов ячменя. Наибольшая вариабельность характерна для показателей: сухая масса растений (+50% от среднего значения), продуктивная кустистость (+65,0% для озимых культур; + 40% для яровых).
6. Выявлена отрицательная корреляционная взаимосвязь содержания гордецина с продуктивностью и морфофизиологическими показателями ячменя (r= -0,31….. -0,83). Установлено, что синтез гордецина находится в обратной зависимости от накопления биомассы ячменя. Выявлена положительная взаимосвязь морфофизиологических показателей с продуктивностью ячменя (r=0,14…0,90). Показана положительная зависимость содержания гордецина с устойчивостью ячменя к мучнистой росе и отсутствие взаимосвязи с устойчивостью к гельминтоспориозу и ржавчине.
7. Установлено, что более выраженным антимикромным действием против патогенных микроорганизмов E. Coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus обладает карбонатная фракция гордецина.
8. Показано, что исследованные сортообразцы ячменя различаются по генетическим формулам гордеин-кодирующих локусов, сохраняя при этом внутрисортовую однородность и стабильность. Сочетание локусов гордеинов Hrd А23В8F2, Hrd А2В3F2 характерно для изучаемых сортообразцов с оптимальным соотношением продуктивности и высокого содержания гордецина.

Основные результаты диссертации опубликованы в следующих работах:

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Павловская, Н.Е. Супероксиддисмутазная активность как тест-система для выявления физиологического действия гордецина / Н.Е. Павловская, В.С. Сидоренко, Е.В. Костромичёва // Вестник Орел ГАУ. - №2. – 2011. С. 12 – 14.
2. Павловская, Н.Е. Характеристика генотипов ячменя по хозяйственно-ценным признакам и электрофоретическим спектрам проламинов семян / Н.Е. Павловская, В.С. Сидоренко, Е.В. Костромичёва // Вестник Орел ГАУ. - №4. – 2011. С. 2 – 3.
3. Павловская, Н.Е. Ячмень – источник антибиотиков / Н.Е. Павловская, Е.В. Костромичева, Е.С. Кулешова, И.В. Горькова, И.Н. Гагарина // Вестник Орел ГАУ. - №4. – 2012. С. 70 – 72.

Статьи и материалы конференций:Павловская, Н.Е. Перспективы использования ячменя для биотехнологического производства лизина / Н.Е. Павловская, В.С. Сидоренко, Е.В. Костромичева // Фундаментальные и прикладные аспекты современной биотехнологии. Материалы международной конференции молодых ученых 10 – 11 августа Брянск, 2008 С.109-110.

4. Костромичева, Е.В. Создание биологически активных добавок на основе гордецина для пищевой промышленности / Е.В. Костромичева, Н.Е. Павловская, И.В. Горькова, И.Н Гагарина // Роль молодых ученых и специалистов в повышении эффективности растениеводства сборник // Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспиратнов и студентов. – Орел, 2009. – 252 с.
5. Павловская, Н.Е. Исследование растительных объектов на возможность создания ветеринарных препаратов/ Н.Е. Павловская, Е.В. Костромичева // Развитие инновационного потенциала агропромышленного производства: Материалы всероссийской научно-практической конференции 24 ноября 2010 года. – Орел, 2010. – С.143-145.
6. Павловская, Н.Е. Антибиотики растительного происхождения/ Н.Е. Павловская,  И.Ю. Акулова, Е.В. Костромичева [и др.]  // Биотехнология: состояние и перспективы развития: матер. Московского международного конгресса:  секц. 5. Биотехнол. переработка отходов. Экологические и инженерные проблемы ( 15-17 марта 2010 г. Москва). –М., 2010.  – С.191-192.
7. Павловская, Н.Е. Выделение гордецина из ячменя и его влияние на супероксиддисмутазную активность/ Н.Е. Павловская, Е.В. Костромичева // Инновационный потенциал молодых ученых – АПК Орловской области : Материалы региональной научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященный 35-летию Орловского государственного аграрного университета. – Орел, 2010. – С.141-143.
8. Павловская, Н. Е. Действие природных активных веществ с антибиотическими свойствами на активность супероксиддисмутазы проростков гороха / Н. Е. Павловская, Е.В. Костромичева, И.Н. Гагарина, И.В. Горькова, А.Ю. Гагарина // Организация и регуляция физиолого- биохимических процессов: межрегиональный сборник научных работ. Вып. 14 Воронеж, 2012. – с. 145 – 148.
9. Павловская, Н.Е. Индуцирование устойчивости гороха биотехнологическими препаратами на основе растительных экстрактов / Н.Е. Павловская, И.В. Горькова, И.Н. Гагарина, А.А. Горьков, С.А. Полехин, Е.В. Костромичева, А.Ю. Гагарина // Материалы международной конференции. 24 мая 2012 г., г. Москва. Российский экономический университет им. Г.В. Плеханова. С.668-669.
10. Павловская, Н.Е. Формирование состава иммунокорректирующих биопрепаратов / Н.Е. Павловская, И.В. Горькова, И.Н. Гагарина, А.А. Горьков, С.А. Полехин, Е.В. Костромичева, А.Ю. Гагарина // Биология наука XXI века. Материалы международной конференции. 24 мая 2012 г., г. Москва. Российский экономический университет им. Г.В. Плеханова. С.669-671.

Подписано в печать 13.03.2013 г. Формат 60х90/16. Бумага офсетная. Гарнитура Таймс. Усл. печ. л. 1,0. Заказ 33. Тираж 100 экз. Отпечатано в издательстве Орел ГАУ, 2013, Орел, бульвар Победы, 19