WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Действие биферментного конъюгата супероксиддисмутаза-хондроитинсульфат-каталаза в условиях модельного окислительного стресса in vitro и in vivo

На правах рукописи

ВАВАЕВ
Александр Владимирович

ДЕЙСТВИЕ БИФЕРМЕНТНОГО КОНЪЮГАТА СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗА-ХОНДРОИТИНСУЛЬФАТ-КАТАЛАЗА
В УСЛОВИЯХ МОДЕЛЬНОГО ОКИСЛИТЕЛЬНОГО СТРЕССА
IN VITRO И IN VIVO

Специальность 03.01.04 – биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук

Москва - 2011

Работа выполнена в лаборатории биохимической инженерии Института Экспериментальной Кардиологии ФГБУ «Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс» Минздравсоцразвития РФ

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Максименко Александр Васильевич

Официальные оппоненты: академик РАМН,
доктор биологических наук, профессор

Егоров Алексей Михайлович

доктор биологических наук, профессор

Ланкин Вадим Зиновьевич

Ведущая организация: ГУРАН Институт физиологически активных веществ РАН

Защита состоится «____» ____________ 20___ г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в ФГБУ «Российский Кардиологический Научно-Производственный Комплекс» Минздравсоцразвития РФ по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская ул., д. 15А.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
ФГБУ «РКНПК» Минздравсоцразвития РФ.

Автореферат разослан _______________ 2011 года

Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор В.Е. Синицин

Общая характеристика работы

Актуальность темы диссертационной работы обусловлена клинической необходимостью поиска и разработки новых антиоксидантных препаратов, позволяющих эффективно предотвращать окислительный стресс. Хорошо известно, что окислительный стресс сопровождает развитие многих патологий, в том числе сердечно-сосудистых, таких как инфаркт миокарда, атеросклероз и др. [Ланкин В.З. и др., 2004]. Перспективным представляется использование средств на основе нативных ферментных антиоксидантов, ограниченно представленных в плазме крови человека и действующих на 4-5 порядков быстрее витаминных антиоксидантов [Scibior D., Czeczot H., 2004].

Ковалентное связывание супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (КАТ) с хондроитинсульфатом (ХС), гликозаминогликаном присутствующим в сосудистой стенке, позволило получить биферментный конъюгат (СОД-ХС-КАТ), представляющий инновационную надмолекулярную структуру двух антиоксидантных ферментов сочетанного действия. В проведенных ранее исследованиях на модели артериального тромбоза у крыс СОД-ХС-КАТ показал выраженную антитромботическую активность, уменьшая массу образующегося тромба и увеличивая время наступления окклюзии сосуда, вероятно за счет изменения структуры и проницаемости образующего тромба. Отмеченные эффекты были наилучшими по сравнению с нативными СОД, КАТ, ХС и их различными сочетаниями [Maksimenko A.V. et al., 2004]. Обнаружение новых эффектов потребовало проведения дополнительных исследований для выяснения свойств и особенностей действия препарата, вероятно связанных с его надмолекулярной структурой.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы было исследование свойств биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ в условиях развития в организме окислительного стресса, моделируемого введением H2O2. Были поставлены следующие задачи:

• исследовать антиоксидантную и антиагрегантную активность СОД-ХС-КАТ на тромбоцитах в контроле, на фоне индуцированной агрегации и в условиях окислительного стресса;

• выяснить действие биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ на тонус кольцевого фрагмента аорты крысы при окислительном стрессе;

• изучить влияние биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ на показатели гемодинамики кроликов и крыс при модельном окислительном стрессе in vivo;

• оценить переносимость, токсичность и мутагенность биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ.

Научная новизна. В работе подтвердилось исходное предположение, что сложная структура может проявлять новые качества, которые не сводятся к сумме свойств составляющих ее компонентов. Нами впервые показано, что СОД-ХС-КАТ эффективнее, чем нативная КАТ снимает действие H2O2 на агрегацию тромбоцитов. Обнаружено, что биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ существенно ингибирует спонтанную и индуцированную агрегацию тромбоцитов, вызванную классическими индукторами агрегации (АДФ, серотонин, TRAP), в отличие от нативной КАТ.

Показано, что на кольцевом фрагменте брюшной аорты крысы биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ имеет сходную с нативной КАТ и СОД эффективность антиоксидантного действия.

Впервые показано наличие профилактического и острого защитного действия биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ при существенных нарушениях системной гемодинамики крыс и кроликов in vivo, вызванных внутривенным введением H2O2.

Практическая значимость. Выявлена низкая острая токсичность и хорошая переносимость биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ, определенные в тестах на животных. Показано отсутствие у СОД-ХС-КАТ мутагенных свойств в тесте Эймса. Совокупность полученных результатов является надежной основой для дальнейшей биомедицинской разработки биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ как потенциального терапевтического средства и указывает универсальный подход для разработки ферментных коньюгатов различного медицинского назначения.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены на нескольких научных конференциях: Всероссийская конференция «Тромбозы, геморрагии, ДВС-синдром. Современные достижения», 12-14 октября 2005 года, г. Ярославль; Четвертый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007 года, г. Москва; Московская международная конференция «Биотехнология и Медицина», март 2006 и 2009 годов, г. Москва; 4-я, 5-я, 6-я и 7-я Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека», сентябрь 2005, 2007, 2009 и 2011 годов, соответственно, г. Смоленск, на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Минздравсоцразвития РФ 23 июня 2011 г.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 15 печатных работ (7 статей и 8 тезисов конференций), 6 из которых в изданиях, рекомендованных ВАК.

Структура и объем работы. Диссертационная работа имеет стандартную структуру и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, цель и задачи исследования, материалы и методы работы, результаты и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 179 ссылок. Работа изложена на 130 страницах машинописного текста, проиллюстрирована 25 рисунками и 6 таблицами.

ОСНОВНОЕ содержание работы

Объект и методы исследования. Объектом исследования был биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ, синтез которого проводили по ранее разработанной методике [Максименко А.В., Тищенко Е.Г., 1997]. Весовое содержание белка в препарате СОД-ХС-КАТ составляло 4-6%, удельная (специфическая) активность СОД – 60 Е/мг препарата, КАТ – 140 Е/мг препарата. Содержание белка в препаратах определяли по методу Бредфорд. Ферментативную активность СОД измеряли спектрофотометрически по ингибированию восстановления нитротетразолия синего в системе ксантин-ксантиоксидаза, pH 7,8, а КАТ – спектрофотометрически по уменьшению светопоглощения раствора H2O2 и КАТ при длине волны 240 нм (pH 7,0, комнатная температура) [Максименко А.В., Тищенко Е.Г., 1997].

Приготовление конъюгата СОД-ХС-КАТ с необратимо инактивированными ферментами осуществляли по ранее разработанной методике [Максименко А.В., Тищенко Е.Г., 1997]. СОД и КАТ предварительно инактивировали инкубацией с 0,3 М раствором H2O2 (pH 7,0, 0,02 М фосфатный буфер, комнатная температура, 3 часа) и при pH 11,8 - 12,0 (0,05 М NaOH, комнатная температура, 2 часа), соответственно.

В работе были использованы следующие основные методы: агрегатометрия, сканирующая электронная микроскопия (СЭМ), измерение изометрического сокращения изолированного кольцевого фрагмента сосуда, измерение показателей гемодинамики (артериальное давление /АД/, частота сердечных сокращений /ЧСС/, электрокардиограмма /ЭКГ/) in vivo, токсикологические методы определения острой токсичности и мутагенности.

В исследованиях агрегации и адгезии тромбоцитов использовали кровь здоровых добровольцев, взятую натощак самотеком из кубитальной вены в пластиковую пробирку с 0,13 М цитратом натрия (pH 7,3). Обогащенную тромбоцитами плазму (ОТП) получали центрифугированием крови при 180g в течение 15 минут. Агрегацию тромбоцитов регистрировали используя лазерный двухканальный анализатор агрегации «БИОЛА», позволяющий в разных режимах регистрировать образование как малых (от 3 до 100 тромбоцитов), так и крупных (свыше 100 тромбоцитов) агрегатов. Исследование проводили не позднее 2 часов после взятия крови.

Адгезию тромбоцитов к стеклу и влияние на нее ферментных препаратов оценивали с помощью СЭМ. В ОТП (15 мкл) добавляли H2O2, КАТ или СОД-ХС-КАТ, наносили ее на стекло, инкубировали 15 минут при комнатной температуре в закрытом бюксе, осторожно отмывали в физиологическом растворе, и фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде 1,5 часа. По окончании фиксации образец обезвоживали и готовили для СЭМ. Подсчет тромбоцитов различной формы осуществляли на 25 полях сканирования при увеличении х2500 в сканирующем электронном микроскопе «PHILLIPS PSEM 550х» и выражали в процентах к общему количеству клеток.

Исследования тонуса сосудистого фрагмента проводили на кольцевых фрагментах (длиной 3 мм) брюшной аорты крысы линии Wistar. Кольцевой фрагмент надевали на иголки, одна из которых была соединена с тензодатчиком, и погружали в раствор Кребса-Хэнсиляйта, продуваемый карбогеном при 37 С и pH 7,4. Окислительный стресс моделировали введением в инкубационный раствор H2O2 на фоне преконстрикции, вызванной 0,1 мкМ норадреналина (NA). Изменение тонуса сосуда оценивалось относительно величины сокращения в ответ на NA. Производные антиоксидантных ферментов вводились за 10 минут до введения H2O2.

В экспериментах in vivo защитное действие производного СОД-ХС-КАТ против окислительного стресса, вызванного внутривенным введением H2O2, было изучено при регистрации ЧСС, АД и ЭКГ самцов кроликов (n=29) весом 3,65±0,10 кг и самцов крыс линии Wistar (n=13) весом 427±7 г. Все эксперименты проводились на животных анестезированных кетамином.

Кроликам катетеризировали центральную артерию одного уха и краевые вены левого и правого уха. В одну из вен болюсно вводили физиологический раствор или раствор СОД-ХС-КАТ, а также 0,8% раствор H2O2, инфузией со скоростью 0,4 мл/мин в течение 3-х минут 2 раза с перерывом в 20 минут. Суммарное количество H2O2, полученное кроликами за весь период эксперимента, составляло 0,15 мкмоль/кг. В вену другого уха по необходимости проводилась инфузия кетамина. В центральную артерию вводился катетер регистрации АД с помощью дачика Statham pb23 (США). Регистрация ЭКГ во втором отведении и ЧСС проводилась на приборе BIOGRAF-4 с компьютеризированной записью данных и их последующей обработкой программой анализа физиологических сигналов (Е.В. Лукошкова).

Крысы линии Wistar были наркотизированы внутрибрюшинным введением кетамина. Катетер для регистрации АД вживляли в сонную артерию, в яремную вену вводили H2O2 и СОД-ХС-КАТ. H2O2 вводили в течение 5 минут (на 2 минуты дольше, чем в экспериментах на кроликах), чтобы получить сходные эффекты на параметры гемодинамики. Суммарная доза H2O2, полученная крысами за весь период эксперимента, составила 2,2 мкмоль/кг.

Изучение острой токсичности СОД-ХС-КАТ при однократном внутрибрюшинном введении разных доз (в диапазоне 120-10700 мг/кг) было проведено на 80 мышах линии BALB/c (самцы, самки, масса тела 18-20 г) и 40 мышах-гибридах F1(CBAxC57Bl6) (самцы, самки, масса тела 18-20 г). Длительность наблюдения за подопытными животными после введения препарата составляла 14 дней. Мутагенность определяли по тесту Эймса. В качестве индикаторных микроорганизмов использовали ауксотрофные по гистидину штаммы Salmonella typhimurium TA98, ТА100, ТА1537. Переносимость СОД-ХС-КАТ оценивали по влиянию увеличивающихся доз препарата на АД, ЧСС и ЭКГ крыс и кроликов.

Статистическую обработку полученных результатов, представленных как среднее значение±ошибка среднего (M±m), n – количество экспериментов, вели при сравнении данных двух групп с применением двухстороннего критерия Стьюдента (статистическая значимость различий при p<0,01). Если групп сравнения было более двух, статистическую обработку вели методом ANOVA (p<0,01).

Результаты и их обсуждение

Исследование тромбоцитов. При исследовании дозозависимости действия H2O2 в диапазоне 15 – 2000 мкМ на агрегацию тромбоцитов было установлено, что H2O2 начинает индуцировать агрегацию в концентрации около 50 мкМ. Дозы выше 2 мМ H2O2 не использовались, поскольку в ОТП наблюдалось образование пузырьков кислорода, препятствующих регистрации агрегации. После анализа дозозависимости для дальнейших экспериментов была выбрана концентрация 300 мкМ H2O2, вызывающая субмаксимальный эффект (рис. 1). В исследованиях других авторов по влиянию H2O2 на агрегацию тромбоцитов использовались схожие концентрации [Ikeda H. et al., 1994; Лойко Е.Н. и др., 2004].

Вызванная H2O2 агрегация характеризуется увеличением среднего размера агрегатов, достигающего пика к 1 минуте процесса с последующей частичной дезагрегацией, выражающейся в уменьшении среднего размера агрегатов. Методами СЭМ показано, что на максимуме агрегационного ответа, вызванного H2O2, центральная часть образующихся агрегатов состоит из плотно связанных тромбоцитов, а периферическая имеют рыхлую структуру (рис. 1-Б). К пятой минуте процесса размер агрегатов уменьшался, их структура становилась настолько плотной, что не удавалось различить отдельные клетки (рис. 1-В). Уменьшение размеров агрегатов происходило как за счет диссоциации слабо связанных с агрегационным центром периферических тромбоцитов, так и благодаря уплотнению центрального «ядра» агрегатов.

Добавленная за 2 минуты нативная КАТ в дозе 3000 Е практически полностью снимает агрегационный эффект H2O2 (табл. 1). Конъюгат СОД-ХС-КАТ вызывает схожий эффект уже в дозе 400 Е КАТ активности.

Рисунок 1. Типичная кривая агрегации тромбоцитов, индуцированная 300 мкМ H2O2, и структура тромбоцитарных агрегатов на разных стадиях их образования.

Таблица 1. Средние значения агрегации, вызванной разными индукторами без и в присутствии КАТ (3000 Е) или биферментного коньюгата СОД-ХС-КАТ (400 Е). Данные получены с помощью метода оценки среднего размера агрегатов в относительных единицах (о.е.) на первой минуте измерения, когда наблюдается пик агрегации и достигается ее максимальный уровень.

Основной стимул + 300 мкМ H2O2
контроль КАТ СОД-ХС-КАТ контроль КАТ СОД-ХС-КАТ
без СПА 1,1±0,03 - - 1,8±0,1 1,4±0,1 1,6±0,1
СПА 1,6±0,2 1,5±0,1 1,4±0,1 1,8±0,2 1,5±0,1 1,6±0,1
0,5 мкМ АДФ 2,2±0,1 2,1±0,2 1,7±0,1 3,3±0,3 2,1±0,3 2,1±0,2
0,5 мкМ серотонин 2,3±0,1 3,0±0,5 1,6±0,2 3,2±0,4 2,9±0,9 2,4±0,7
1 мкМ TRAP 2,3±0,3 2,3±0,4 1,9±0,1 3,0±0,4 3,0±0,8 2,4±0,3

Среднее значение ± стандартная ошибка среднего.

Было показано, что H2O2 усиливает активацию тромбоцитов, вызванную разными по механизму действия индукторами агрегации – АДФ, серотонином и TRAP (рис. 2). СОД-ХС-КАТ и в этом случае был на порядок более эффективен, чем нативная КАТ (кривые 5 и 4 на рис. 2-А, Б, В, соответственно). Таким образом, СОД-ХС-КАТ значительно эффективнее, чем нативная КАТ снижал агрегацию, вызванную H2O2 или классическими индукторами совместно с H2O2.

Также было обнаружено, что СОД-ХС-КАТ имеет выраженный ингибирующий эффект на спонтанную и вызванную классическими индукторами агрегацию тромбоцитов (табл. 1, рис. 3), тогда как нативная КАТ в используемом нами концентрационном диапазоне не оказывала такого действия. Подобный эффект СОД-ХС-КАТ возможно обусловлен перехватом активных форм кислорода, которые генерируются активированными тромбоцитами и влияют на процесс агрегации [Krotz F. et al., 2004]. Можно также предположить, что влияние СОД-ХС-КАТ на агрегацию не сводится исключительно к его антиоксидантной активности. Для выяснения особенностей влияния надмолекулярной структуры СОД-ХС-КАТ на процесс агрегации были синтезированы ферментные производные разной формы инактивации (рис. 4). Инактивация одного из ферментов в составе СОД-ХС-КАТ полностью не устраняла ингибирующий эффект СОД-ХС-КАТ, а снижала его примерно на половину (кривые 4 и 5 в сравнении с кривыми 1 и 2 на рис. 4). Ингибирующий эффект СОД-ХС-КАТ полностью не снимался инактивацией обоих антиоксидантных ферментов. Таким образом, эффект СОД-ХС-КАТ не может быть объяснен только суммой его антиоксидантных активностей, а связан и с его приобретенной надмолекулярной структурой. Вклад структуры СОД-ХС-КАТ в этот эффект подчеркивался отсутствием влияния сходной с конъюгатом по молекулярной массе -галактозидазы, использованной в эквимолярных по белку концентрациях.

Рисунок 2. Влияние Н2О2, КАТ и СОД-ХС-КАТ на агрегацию тромбоцитов, вызванную индукторами 0,5 мкМ АДФ (А), 0,5 мкМ серотонина (Б) и 1 мкМ TRAP (В). 1 - агрегация тромбоцитов в присутствии индуктора, 2 – в присутствии 300 мкМ Н2О2, 3 – в присутствии индуктора и 300 мкМ Н2О2, 4 – в присутствии индуктора и 300 мкМ Н2О2 на фоне превентивно введенной 3000 Е КАТ, 5 - в присутствии индуктора и 300 мкМ Н2О2 на фоне превентивно введенных 400 Е КАТ активности СОД-ХС-КАТ. Представлены типичные кривые агрегатограмм. По оси абсцисс указано время (мин), по оси ординат средний размер агрегатов (в отн. ед.).

Рисунок 3. Влияние биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ (400 Е КАТ активности, кривая 2) на агрегацию тромбоцитов, индуцированную (кривая 1): 0,5 мкМ (А) и 5,0 мкМ (Г) АДФ; 0,5 мкМ (Б) и 5,0 мкМ (Д) серотонина; 1 мкМ (В) и 6 мкМ (Е) TRAP.
Представлены типичные кривые агрегатограмм, по оси абсцисс указано время (мин), по оси ординат средний размер агрегатов (в отн. ед., А-В, Д) или степень светопропускания (в %, Г и Е).

Рисунок 4. Влияние биферментных производных разной формы инактивации на агрегацию тромбоцитов, индуцированную 0,5 мкМ АДФ. Кривые агрегации в ответ на 0,5 мкМ АДФ (1), и превентивно введенных в эквимолярных концентрациях по белку, соответствующих 400 Е КАТ активности конъюгата СОД-ХС-КАТ: СОД-ХС-КАТ (2), СОДинакт-ХС-КАТинакт (3), СОД-ХС-КАТинакт (4), СОДинакт-ХС-КАТ (5). Представлены типичные кривые агрегации, по оси абсцисс указано время (мин), по оси ординат средний размер агрегатов (в отн. ед.).

Распластывание тромбоцитов на адгезивной поверхности является одной из важных стадий гемостаза, индуцирующих каскад реакций, ведущих к формированию тромба. Адгезионные свойства тромбоцитов оценивали по способности к распластыванию на стекле (рис. 5). В присутствии H2O2 в ОТП количество распластанных тромбоцитов возрастало (фото 2 на рис. 5), но при предварительном добавлении конъюгата СОД-ХС-КАТ на стекло (фото 3 на рис. 5) или в ОТП (фото 4 на рис. 5) распластанные тромбоциты в образце полностью отсутствовали. Сходная картина наблюдалась при нанесении ОТП с СОД-ХС-КАТ на стекло, с предварительно нанесенным H2O2 (фото 5 на рис. 5). При добавлении ОТП с КАТ количество распластанных тромбоцитов значительно сокращалось, которые все же иногда встречались (фото 6 на рис. 5). Вероятно, такой эффект СОД-ХС-КАТ связан с его адгезивными и антиоксидантными свойствами, позволяющими ему, с одной стороны, снижать адгезионные свойства поверхностей, а с другой активно нейтрализовывать H2O2, который усиливает адгезию и распластывание тромбоцитов на стекле.

Полученные результаты указывают на выраженное антиоксидантное и антиагрегантное действие биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ по сравнению с КАТ. Антиагрегационная активность конъюгата СОД-ХС-КАТ достоверно выше таковой для составляющих его нативных ферментов. Также наши данные свидетельствуют, что совокупность свойств СОД-ХС-КАТ обусловлена не только антиоксидантными свойствами входящих в его состав ферментов, а связана с его надмолекулярной структурой.

Рисунок 5. Электрономикроскопическая картина адгезии тромбоцитов на стекле (СЭМ PHILLIPS PSEM 550х, увеличение х2500). Адгезия тромбоцитов на стекле с добавлением к ОТП: физиологического раствора (1), Н2О2 (2), СОД-ХС-КАТ (4). Адгезия тромбоцитов на стекле, предварительно обработанным: СОД-ХС-КАТ, а затем нанесение ОТП с Н2О2 (3); Н2О2, затем нанесение ОТП с СОД-ХС-КАТ (5) или ОТП с КАТ (6).

Исследования на изолированном кольцевом фрагменте брюшной аорты крысы. Пероксид водорода в диапазоне концентраций 10 мкМ – 1 мМ вызывал дозозависимое сокращение фрагмента сосуда (рис. 6). При концентрации 10 мкМ H2O2 наблюдалось небольшое (10-12%) и длительное увеличение тонуса, при 100 мкМ H2O2 оно возрастало (48-50%) с последующим возвращением к исходному уровню (расслабление 0-3%). При концентрации 1 мМ H2O2 отмечалось быстрое сокращение артериального фрагмента (88-90%), которое сменялось фазой расслабления (на 68-70%) (рис. 6-А).

После трехкратной отмывки и 15-минутного периода покоя фрагмент сосуда повторно сокращали добавлением NA, и снова добавляли H2O2 в тех же концентрациях, что и в первом случае. Апмлитуда повторного сокращения на NA зависела от добавленной ранее концентрации H2O2 (рис. 6-А). При высоких концентрациях (1 мМ) амплитуда повторного ответа уменьшалась до 24-26% от исходного значения (рис. 6-В). Повторное сокращение на H2O2 при всех используемых концентрациях было всегда меньше по сравнению с первым ответом (рис. 6-Б). Величина повторного ответа на NA и H2O2 использовалась для оценки сохранности функционального состояния сосуда.

Мы использовали 100 мкМ H2O2 для оценки сравнительной эффективности защитного действия КАТ и конъюгата СОД-ХС-КАТ (рис. 7). Производные КАТ использовались в одинаковых концентрациях по каталазной активности (Е/мл). Нативная КАТ и конъюгат СОД-ХС-КАТ в равной степени влияли на сохранность функционального состояния при повторном введении NA (рис. 7-В). В концентрационном интервале 25-100 Е/мл КАТ активности нативная КАТ и СОД-ХС-КАТ проявляли сходный по величине защитный эффект против действия 100 мкМ H2O2 (рис. 7-Б, Г). При концентрации 500 Е/мл конъюгат СОД-ХС-КАТ более эффективно, чем КАТ снижал амплитуду ответа на H2O2 (рис. 7-Б, Г). Более выраженное защитное действие СОД-ХС-КАТ, по сравнению с КАТ может быть связано с его сродством к сосудистой стенке (благодаря ХС в его составе [Maksimenko A.V., 2005]) или присутствием СОД в составе биферментного конъюгата.

Достаточно выраженным оказалось действие СОД-ХС-КАТ на тонус фрагмента сосуда на фоне NA преконстрикции (рис. 8). В концентрации 10 Е/мл СОД-ХС-КАТ вызывал заметное (20%) расслабление сосуда (рис. 8-Б), которое не наблюдалось при добавлении КАТ. Добавление СОД в эквимолярном количестве вызывало сходное с СОД-ХС-КАТ расслабление (рис. 8А). Очевидно, что вазодилатационный эффект СОД-ХС-КАТ связан с наличием в его составе СОД, которая увеличивает биодоступность эндогенного NO.

Экспериментальным подтверждением этому послужило введение на фоне NA преконстрикции ингибитора NO-синтазы – L-NNA, вызывающее увеличение тонуса сосуда (рис. 8-В), обусловленное снижением синтеза эндогенного NO. Отсутствие выраженного ответа на ацетилхолин (активатор эндотелиальной NO-синтазы) свидетельствует о блокировании NO-синтазы. СОД на фоне L-NNA не вызывала расслабления, подчеркивая роль эндогенного NO в наблюдаемом ранее расслаблении. Введение донора NO – SNP вызывало

 Первичный и повторный ответы на H2O2 и NA. А: оригинальные треки-5

Рисунок 6. Первичный и повторный ответы на H2O2 и NA. А: оригинальные треки первого и повторного ответа. Б: величина первого (закрашенные столбцы) и повторного (незакрашенные столбцы) сокращения, вызванного разными концентрациями H2O2. В: величина повторного ответа на норадреналин (за 100% принята величина первого сокращения на NA).

 Сравнительные эффекты защитного действия КАТ и СОД-ХС-КАТ против-6

Рисунок 7. Сравнительные эффекты защитного действия КАТ и СОД-ХС-КАТ против 100 мкM H2O2. А: оригинальные треки. Б: сокращения фрагмента аорты при первом ответе на 100 мкM H2O2 в присутствии указанных концентраций КАТ (оранжевые столбцы) и СОД-ХС-КАТ (синие столбцы) по КАТ активности (Е/мл) В: величина повторного ответа на NA после добавления разных концентраций КАТ (оранжевые столбцы) и СОД-ХС-КАТ (синие столбцы), одинаковых (в паре) по КАТ активности. Г: сокращения фрагмента аорты при повторном ответе на 100 мкM H2O2 в присутствии указанных концентраций КАТ (оранжевые столбцы) и СОД-ХС-КАТ (синие столбцы) по КАТ активности (Е/мл) при первом добавлении H2O2.

дилятацию артериального фрагмента, показывая, что сосуд не потерял способность расслабляться под действием NO. Наличие в биферментном конъюгате СОД способствует увеличению биодоступности NO, что может повышать эффективность вазопротекторного действия биферментного конъюгата.

Таким образом, биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ достоверно проявляет свои вазопротекторные свойства, благодаря активности его обоих ферментных компонентов и не уступает по эффективности действия использованию нативных форм СОД и КАТ, а в ряде случаев (при 500 Е/мл КАТ активности) более эффективно снимает действие H2O2, чем нативная КАТ.

Вазопротекторные свойства конъюгата СОД-ХС-КАТ in vivo. Введение H2O2 интактным кроликам (рис. 9-А, кривая 1) вызывало резкое снижение АД (до 60% от первоначального уровня), которое в течение десяти минут восстанавливалось в контрольной и опытной группе до 90% (рис. 9-А, кривая 2).

ЭКГ у кроликов после первого введения H2O2 существенно не изменялась, хотя в контрольной группе наблюдалось некоторое снижение ST сегмента. При повторном введении H2O2 отмечались наибольшие подъемы ST интервала, особенно при затрудненном дыхании. На 5-8 мин наблюдалась желудочковая экстрасистолия с одиночными или групповыми экстрасистолами. Если одышка отмечалась уже после первого введения H2O2, то при повторном введении наблюдалось затрудненное дыхание, бронхоспазмы, более выраженные в контрольной группе.

Болюсное введение СОД-ХС-КАТ не изменяло показатели центральной гемодинамики у кроликов. Повторное введение H2O2 на фоне СОД-ХС-КАТ приводило к гораздо меньшим нарушениям параметров гемодинамики (АД, ЧСС), по сравнению с контролем.

Профилактическое введение СОД-ХС-КАТ за трое суток до эксперимента с H2O2 достоверно предупреждало падение АД и ЧСС уже при первом


 Влияние СОД активности на тонус артериального фрагмента.-7

Рисунок 8. Влияние СОД активности на тонус артериального фрагмента. Оригинальные кривые введения 10 Е/мл нативной СОД (А) или СОД-ХС-КАТ (Б) на фоне NA преконстрикции. В: изменение сосудистого тонуса при введении NA, L-NNA, ацетилхолина, нативной СОД и SNP.

добавлении H2O2, и значительно снижало их при повторном введении H2O2 (рис. 9-А, Б кривая 3). В профилактической группе происходило полное восстановление параметров гемодинамики к 80 минуте эксперимента, чего не проиходило в двух других группах.

У крыс первое введение H2O2 вызывало первоначальное кратковременное (не более 1 минуты) повышение АД на 3-5% с его последующим снижением на 15% и полным восстановлением в течение 10 минут (рис. 10-А). В этих условиях ЧСС снижалась на 3-5% и в течение 10 минут восстанавливалась до уровня 96-98% (рис. 10-Б, кривые 1 и 2). ЭКГ у крыс в период эксперимента существенно не менялась, хотя количество отдельных желудочковых экстрасистол возрастало в обеих группах животных, особенно при повторном введении H2O2.

Введение СОД-ХС-КАТ не изменяло параметров гемодинамики и ЭКГ у крыс. После болюсного введения СОД-ХС-КАТ и его распределения в течение 10 минут в организме крыс им повторно вводили H2O2, что вызывало более значительные (по сравнению с первой инфузией) изменения АД и ЧСС. Снижение АД доходило до 52% уровня в контрольной группе и до 73% уровня в опытной группе (рис. 10-А, кривые 1 и 2, соответственно, p<0,05). В опытной группе восстановление АД к 50 минуте было практически полным, тогда как в контроле и к 80 минуте не наблюдалось полного восстановления. Статистически значимое различие в восстановлении АД в опытной и контрольной группах наблюдались уже с первых минут эксперимента.

Рисунок 9. Изменение АД (А) и ЧСС (Б, оба в % от исходного) у анестезированных кроликов при окислительном стрессе (инфузия 0,8% H2O2) в контрольной (n=12, болюсное введению физиологического раствора, кривая 1) и опытной (n=9, болюсное введение конъгата СОД-ХС-КАТ, кривая 2) группах. Кривая 3 относится к опытной профилактической группе (n=6) кроликов, получавших конъюгат СОД-ХС-КАТ за трое суток до проведения этого эксперимента и после первого введения H2O2. Стрелками показаны моменты начала и окончания инфузии H2O2 и болюсного введения физиологического раствора или конъюгата СОД-ХС-КАТ (1,5 мг/кг).

Таким образом, биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ обладал достоверной способностью нормализовывать нарушения гемодинамики, вызываемые H2O2 на двух видах животных, использованных в исследовании. Конъюгат СОД-ХС-КАТ успешно противодействовал прямому влиянию H2O2 на гладкомышечные и сердечные клетки [Капелько В.И., 2004], вероятно, за счет нейтрализации как супероксид-радикала, так и H2O2. Действие СОД-ХС-КАТ достоверно проявлялось при повторном введении H2O2, когда антиоксидантная защита организма, вероятно, была уже ослаблена первым введением H2O2.

Профилактическое введение высоких доз конъюгата СОД-ХС-КАТ за 3 дня до острого опыта значительно эффективнее предотвращало вызванные H2O2 нарушения гемодинамики по сравнению с другими группами и способствовало полному восстановлению АД и ЧСС, не наблюдавшемуся в других группах.

Высокая эффективность СОД-ХС-КАТ может быть связана с несколькими причинами. Участки раннего атеросклеротического поражения сосудов накапливают на своей поверхности гликозамингликан эндотелиального гликокаликса – ХС [Wight T.N., Merriless M.J., 2004]. Он содержится в синтезированном нами конъюгате СОД-ХС-КАТ и может способствовать его накоплению на таких участках благодаря свойствам распределения гликозамингликанов по внутрисосудистой поверхности. Эндотелиальный гликокаликс, как известно, может адгезировать и удерживать на клеточной

Рисунок 10. Изменение АД (А) и ЧСС (Б, оба в % от исходного) у анестезированных крыс. Стрелками показаны моменты начала и окончания внутривенной инфузии 0,8% H2O2 (окислительный стресс) и болюсного введения физиологического раствора (n=6, контрольная группа, кривая 1) или конъюгата СОД-ХС-КАТ (n=7, опытная группа, кривая 2).

поверхности гликопротеины [Bohm T. et al., 1996]. Структура СОД-ХС-КАТ оказывается по составу сходной с внеклеточной СОД, которая является гликопротеином. Наличие гепаринсвязывающего домена у внеклеточной СОД позволяет ей связываться с гликозаминогликаном гепарансульфатом на поверхности эндотелия и проникать в интиму, создавая антиоксидантную защиту внутри сосудистой стенки [Onry T. et al., 1996]. Возможно, что СОД-ХС-КАТ может схожим образом адгезировать к эндотелиальной поверхности и проникать внутрь сосудистой стенки. Реализация такого процесса, предположительно, развивается во времени и более эффективна при профилактическом введении, когда имеется достаточный интервал времени для распределения и проникновения СОД-ХС-КАТ в интиму сосуда. Все это способствует более длительному удержанию СОД-ХС-КАТ в организме и сохранению его антиоксидантной активности. Однако для проверки значимости этого процесса необходимо провести целый ряд дополнительных исследований, в частности оценить фармакокинетику СОД-ХС-КАТ.

Токсикологические исследования. Внутривенное болюсное введение кроликам разных доз (1,5-15 мг белка/кг) конъюгата СОД-ХС-КАТ не вызывало существенных изменений параметров гемодинамики (АД, ЧСС). Отклонения не превышали 4% от средних значений у интактных наркотизированных животных. На ЭКГ кроликов не обнаружено изменений ST-интервала, нарушений ритма, проводимости и других показателей даже при максимальной дозе. В дозе СОД-ХС-КАТ 1,3-1,6 мг белка/кг массы крыс линии Wistar не обнаружено изменений параметров гемодинамики и ЭКГ. Это свидетельствует о хорошей переносимости конъюгата СОД-ХС-КАТ организмом животных.

Определение острой токсичности при однократном внутрибрюшном введении СОД-ХС-КАТ мышам линии BALB/c и мышам-гибридам F1(CBAxC57B16) обнаружило низкую острую токсичность конъюгата (табл. 2). При исследовании мутагенности в тесте Эймса СОД-ХС-КАТ не проявил мутагенных свойств.

Отсутствие отрицательных эффектов СОД-ХС-КАТ в токсикологических исследования позволяет проводить дальнейшую биомедицинскую разработку данного препарата как потенциального фармакологического средства.

Таблица 2. - Показатели токсичности биферкона при внутрибрюшинном введении мышам линии BALB/c и мышам-гибридам F1(CBAxC57Bl6).

Вид и пол мышей Показатели токсичности, мг/кг
ЛД 16 ЛД 50±m ЛД 84
BALB/c самцы 3395 4100±143 4840
BALB/c самки 3260 3965±176 4705
F1(CBAxC57Bl6) самцы 2680 3050±160* 3640
F1(CBAxC57Bl6) самки 2560 2930±146* 3520

Заключение

Действие биферментного конъюгата СОД-ХС-КАТ было исследовано в нескольких системах in vitro и in vivo. На всех уровнях СОД-ХС-КАТ оказывал положительный эффект при моделировании окислительного стресса.

СОД-ХС-КАТ на порядок более эффективно, чем нативная КАТ снижал агрегацию, вызванную H2O2 или классическими индукторами совместно с H2O2.

Кроме того СОД-ХС-КАТ имел выраженный ингибирующий эффект на спонтанную и вызванную классическими индукторами разного механизма действия агрегацию тромбоцитов, тогда как нативная КАТ в используемом нами концентрационном интервале не оказывала такого действия.

Полученные на тромбоцитах данные свидетельствуют, что эффект СОД-ХС-КАТ не связан только с антиоксидантной активностью, а обусловлен его сложной надмолекулярной структурой.

На фрагменте сосуда СОД-ХС-КАТ проявлял защитное антиоксидантное действие при моделировании окислительного стресса, не уступающее по эффективности нативным формам СОД и КАТ и при высоких концентрациях превосходил КАТ по эффективности.

СОД-ХС-КАТ предотвращал существенные нарушения параметров гемодинамики у крыс и кроликов in vivo, вызванные внутривенным введением H2O2, что было особенно выраженно при его предварительном введении.

Полученные положительные и выраженные на разных уровнях эффекты СОД-ХС-КАТ наряду с отсутствием отрицательных результатов при токсикологических исследованиях дают основания для дальнейшей биомедицинской разработки и продвижения СОД-ХС-КАТ как потенциального средства антиоксидантной терапии.

В литературе отмечены положительные эффекты перорального [Suzuki Y. et al., 2008] и ингаляционного [Tanaka K.I. et al., 2010] применения модифицированной формы СОД в снижении окислительного стресса при различных патологиях. Это позволяет считать целесообразным разработку пероральных форм СОД-ХС-КАТ конъюгата для нужд клинической антиоксидантной терапии.

Выводы

  1. Биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ снимает индуцирующее действие H2O2 на агрегацию тромбоцитов в концентрациях на порядок меньше, чем нативная КАТ.

Биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ также достоверно ингибирует агрегацию тромбоцитов, индуцированную совместным действием H2O2 и традиционных индукторов.

  1. Биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ ингибирует спонтанную и вызванную классическими индукторами агрегацию тромбоцитов. Этот антиагрегационный эффект не сводятся исключительно к антиоксидантной активности СОД-ХС-КАТ и обусловлен надмолекулярной структурой.
  2. Биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ не уступает по эффективности защитного действия СОД и КАТ и в дозе 500 ед. кат. акт. вызывает более выраженный эффект в условиях модельного окислительного стресса на кольцевых фрагментах брюшной аорты крысы.
  3. Биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ в дозах 1,5 - 2,0 мг/кг предупреждает и нормализует существенные нарушения гемодинамики (АД и ЧСС), вызванные H2O2 in vivo у крыс и кроликов.
  4. Биферментный конъюгат СОД-ХС-КАТ обладает низкой острой токсичностью и хорошей переносимостью, определенной в тестах на мышах, крысах и кроликах, и не проявляет мутагенных свойств в тесте Эймса.

РЕКОМЕНДАЦИИ

Полученные положительные и выраженные на разных уровнях эффекты СОД-ХС-КАТ наряду с отсутствием отрицательных результатов при токсикологических исследованиях дают основания рекомендовать СОД-ХС-КАТ для дальнейшей биомедицинской разработки и продвижения его как потенциального средства антиоксидантной терапии, а также указывают универсальный подход для разработки ферментных коньюгатов различного медицинского назначения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

  1. Vavaev A.V., Bouryachkovskaya L.I., Tischenko E.G., Uchitel I.A., Maksimenko A.V. The antioxidant and antiaggregant effects of the covalent bienzyme superoxide dismutase – chondroitin sulfate – catalase conjugate on platelets // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry, 2011, vol.5, №2, pp.163-170.
  2. Maksimenko A.V., Vavaev A.V., Tischenko E.G. Enzymatic antioxidants: next phase of pharmacological effort to fight oxidative stress? // The Open Conference Proceedings Journal, 2010, vol.1, №1, pp.219-223.
  3. Максименко А.В., Ваваев А.В., Бурячковская Л.И., Мох В.П., Учитель И.А., Лакомкин В.Л., Капелько В.И., Тищенко Е.Г. Биофармакология ферментных конъюгатов: вазопротекторная активность супрамолекулярного производного супероксиддисмутаза-хондроитинсульфат-каталаза // Acta Naturae, 2010, том 2 № 4 (7), С.90-103.
  4. Ваваев А.В., Тищенко Е.Г., Бурячковская Л.И., Голубых В.Л., Максименко А.В. Сосудистая стенка: оксидативное поражение и внеклеточная защита антиоксидантными ферментами // Кардиологический Вестник, 2007, том II (XIV), №1, С.41-45.
  5. Ваваев А.В., Лакомкин В.Л., Тищенко Е.Г., Капелько В.И., Максименко А.В. Вазопротекторное действие конъюгата супероксиддисмутаза-хондроитинсульфат-каталаза при профилактическом и остром применении на вызванные пероксидом водорода изменения гемодинамики // Технологии живых систем, 2010, том 7, №7, С.15-21.
  6. Ваваев А.В., Максименко А. В. Ферментные антиоксиданты на пути к практической медицине // Кардиологический Вестник, 2009, том IV (XVI), №2, С.66-70.
  7. Ваваев А.В., Тищенко Е.Г., Мох В.П., Максименко А.В. Влияние перекиси водорода на тонус артериального фрагмента сосуда крысы и его антиоксидантная защита производными каталазы и супероксиддисмутазы // Технологии живых систем, 2009, том 6, №3, С.26-32.
  8. Ваваев А. В., Тищенко Е. Г., Бурячковская Л. И., Мох В. П., Учитель И. А., Лакомкин В. Л., Капелько В. И., Максименко А. В. Вазопротекторные эффекты биферментного конъюгата супероксиддисмутаза-хондроитинсульфат-каталаза // 7-я Национальная научно-практическая конференция с международным участием «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека»
    14-18 сентября 2011 г., Смоленск, «Материалы конференции», С.41-42.
  9. Vavaev A.V., Moch V.P., Tischenko E.G. and Maksimenko A.V. The research of oxidation reaction regulation on arterial fragment tonus with bienzyme conjugate // 6-th National Scientific practical conference with international participation «Reactive oxygen species, nitric oxide, antioxidants and human health». September 14-18, 2009, Smolensk, Conference book, pp. 77-78.
  10. Maksimenko A.V. Vavaev A.V., Tischenko E.G. Extracellular protection of vascular wall with the covalently connected antioxidant enzymes against oxidative damage // J. Biotechnol., 2008, 136S, p.87 [Abstract of the Thirteenth International Biotechnology Symposium and Exhibition, October 12-17, 2008, Dalian, China, I3-P-034].
  11. Максименко А.В., Тищенко Е.Г., Ваваев А.В., Лакомкин В.Л., Капелько В.И. Белковый конъюгат сопряженного ферментного действия для антитромботической защиты сосудистой стенки // IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. 11-15 мая 2008 года. Новосибирск, С. 308 (537).
  12. Максименко А.В., Ваваев А.В., Тищенко Е.Г., Турашев А.Д., Сергиенко В.Б. Фармакологическая регуляция состояния сосудистой стенки модифицированными ферментными производными // Первый Российский регулярный научно-практический семинар «Новые технологии – инновационному бизнесу», 1-16 февраля 2007 года, Москва, С. е-88.
  13. Ваваев А.В. Влияние перекиси водорода и производных каталазы на тонус фрагмента артерии крысы in vitro // Четвертый московский международный конгресс «Биотехнология: состояние и перспективы развития», 12-16 марта 2007г., Москва – Материалы конгресса, часть 1, С. 151-152.
  14. Maksimenko A.V. Tischenko E.G., Vavaev A.V. Biotechnology of supramolecular protein structure: bienzyme covalent superoxide dismutase-chondroitin sulfate-catalase conjugate for antithrombotic protection of vascular wall // Proceedings. International conference «Chemistry, chemical engineering and biotechnology», 11-16 september 2006, Tomsk, Russia, Vol.2, P. 397-399.
  15. Vavaev A.V., Tischenko E.G., Maksimenko A.V. Supramolecular protein structure for extracellular antithrombotic protection of vascular wall // Abstracts. 3-rd annual symposium of the American heart association council on basic cardiovasculas sciences – Translation of basic insights into clinical practice. July 31 – August 3, 2006, Keystone, Colorado, USA, P. 59.

Сокращения

АД артериальное давление

АДФ аденозиндифосфат

КАТ каталаза

ОТП обогащенная тромбоцитами плазма

СОД супероксиддисмутаза

СОД-ХС-КАТ биферментный конъюгат супероксиддисмутаза-хондроитинсульфат-каталаза

СПА спонтанная агрегация тромбоцитов

СЭМ сканирующая электронная микроскопия

ХС хондроитинсульфат

ЧСС частота сердечных сокращений

L-NNA N-нитро-L-аргинин (ингибитор NO-синтазы)

NA норадреналин

SNP нитропруссид натрия (донор NO)

TRAP пептидный агонист тромбинового рецептора



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.