WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Биохимический анализ гиалуронидазного взаимодействия с эндотелиальным гликокаликсом при нарушениях микроциркуляции

На правах рукописи

ТУРАШЕВ АСКАР ДАМИРОВИЧ

БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГИАЛУРОНИДАЗНОГО

ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ С ЭНДОТЕЛИАЛЬНЫМ ГЛИКОКАЛИКСОМ

ПРИ НАРУШЕНИЯХ МИКРОЦИРКУЛЯЦИИ

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва – 2011 год

Работа выполнена в лаборатории биохимической инженерии НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Максименко Александр Васильевич

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН

доктор биологических наук, профессор,

Тоневицкий Александр Григорьевич

доктор биологических наук

Писаренко Олег Иванович

Ведущая организация:

ГУРАН Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится _________________________ на заседании диссертационного совета Д 208.073.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ и СР РФ (121552 Москва, ул. 3-я Черепковская, д. 15а)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РКНПК» МЗиСР РФ.

Автореферат разослан ___________________________20____ года

Ученый секретарь диссертационного

совета, д.м.н., профессор В.Е. Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Сердечно-сосудистые заболевания являются одной из ведущих причин инвалидности и смертности населения развитых стран мира. Необходимость совершенствования существующих и разработки новых средств их лечения требует изучения факторов риска, развития стратегий диагностики и профилактики, фармакологических и хирургических методов. Целью подобных разработок является, в частности, устранение последствий острого коронарного синдрома, представленного нестабильной стенокардией, острым инфарктом миокарда, внезапной сердечной смертью.

Острое критическое состояние может быть вызвано закупоркой коронарной артерии в результате ряда причин, что приводит к нарушению метаболизма миокарда, его сократимости, развитию некроза. Восстановление коронарного кровотока – реперфузия – за кратчайшие сроки с момента возникновения поражения позволяет сократить зону инфаркта, восстановить сократительную способность миокарда, снизить возможность появления осложнений и наступления летального исхода. Современная реперфузионная терапия способна ограничивать размер инфаркта примерно на 50% у половины пациентов. В ряде случаев терапия не обеспечивает восстановления функции поврежденного миокарда из-за развития сопутствующих осложнений. При этом функциональное восстановление миокарда наблюдается только при достаточной реканализации инфаркт-связанной артерии и адекватном восстановлении системы микроциркуляции и тканевой перфузии зоны инфаркта.

Микроциркуляция представляет собой значительную долю системы кровообращения, реализующую доставку циркулирующей крови и обмен кислородом, нутриентами и метаболитами жизнедеятельности к клеткам органов и тканей организма. Нарушения функций этой системы могут быть вызваны рядом патологических процессов, в том числе и распространенным при остром коронарном синдроме явлением отсутствующего кровотока (no-reflow). Вклад в развитие no-reflow вносят функциональные и структурные изменения на уровне тканевой микроциркуляции, агрегация клеток крови, развитие воспалительных процессов, гиперпродукция активных форм кислорода, активация системы врожденного иммунитета при ишемии/реперфузии и микроэмболизация [Rezkalla S.H. and Kloner R.A., 2002]. Существующие на сегодняшний день представления о молекулярных и клеточных механизмах no-reflow, как и других нарушениях микроциркуляции, игнорируют роль одного из возможных участников этого процесса, люминального покрытия сосудистого эндотелия – эндотелиального гликокаликса (ЭГК). Эта комплексная и многокомпонентная структура принимает участие в ряде функций, поддерживающих метаболизм системы кровообращения [Pries A.R. et al., 2000]. В условиях патологии происходит полная или частичная потеря гликокаликса, что приводит к нарушению целостности сосудистой стенки и изменению ее функций. Роль ЭГК при нарушениях микроциркуляции исследована мало и весьма неполно.

Группа гликозидазных ферментов (гиалуронидазы и гепарин/гепараназы) принимает участие в катаболизме компонентов ЭГК гликозаминогликанов (ГАГ), благодаря чему такие биокатализаторы становятся эффективным инструментом исследования функции гликокаликса в норме и патологии. Функционирование гликозидаз происходит в условиях сахаридного микроокружения (низкомолекулярные сахара кровотока; ГАГ гликокаликса и их фрагменты), регулирующего структуру и специфические активности ферментов. Поэтому исследование поведения гликозидазных ферментов в естественном микроокружении и разработка подходов к стабилизации их активностей являются обоснованными как для изучения функционирования гликокаликса в условиях модельной патологии, так и для разработки новых подходов лечения заболеваний, связанных с нарушением функционирования системы микроциркуляции.

Цели и задачи исследования. Целью нашего исследования стало доказательство участия эндотелиального гликокаликса и его структурных компонентов в развитии нарушений микроциркуляторного русла, что в ряде случаев определяет тяжесть развития сердечно-сосудистых поражений и усложняет проводимую терапию.

В соответствии с целью диссертационной работы были поставлены следующие задачи:

1. Изучить инактивирующее гликирование нативной (ГУ) и модифицированной хондроитинсульфатом (ГУ-ХС) гиалуронидазы сахаридными маркерами нарушения углеводного обмена (моно- и дисахариды кровотока) и модельными сахаридами продуктов деградации ЭГК (N-ацетилгексозамины);

2. Определить инактивирующее действие фрагментов гиалуронана общей формулы GlcA–(–GlcNHAc–GlcA–)n–GlcNHAc (где n варьируется от 0 до 4) и их смеси на эндогликозидазную активность ГУ и ГУ-ХС;

3. Изучить действие производных ГУ на процесс восстановления микроциркуляции кожи на модели ишемии/реперфузии задней конечности крысы методом лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) при введении препаратов до ишемии и перед реперфузией;

4. Сравнить на модели ишемии/реперфузии задней конечности крысы действие белковых и гликозаминогликановых производных на восстановление микроциркуляции после ишемии/реперфузии при введении исследуемых соединений до ишемии и перед реперфузией.

Научная новизна. В работе впервые исследовано гликирующее действие углеводных производных различной природы (низкомолекулярных нейтральных моно- и дисахаридов кровотока, N-ацетилгексозаминов как модельных компонентов продуктов деградации ЭГК и олигомеров ГАГ гиалуронана различной длины) на эндогликозидазную активность нативной ГУ и ее производного, оригинального ковалентного конъюгата ГУ-ХС. На основании полученных данных разработан специфичный ферментный тест для выявления присутствия продуктов деградации ЭГК, возникающих при ишемии/реперфузии.

На модели ишемии задней конечности крысы изучено влияние полученных ферментных производных на характер восстановления постышемической кожной микроциркуляции с помощью метода лазерной допплеровской флоуметрии при превентивном (до ишемии) и остром (перед реперфузией) введении исследуемых препаратов. Получены экспериментальные данные об участии гликокаликса в нарушениях микроциркуляции после ишемии/реперфузии, подтверждено значение стабильной гиалуронидазной активности для скорейшего восстановления микроциркуляции и антиишемическое действие свободного хондроитинсульфата и его смеси с нативной гиалуронидазой.

Практическая значимость работы. Полученные данные демонстрируют участие поверхностной структуры сосудистого эндотелия – ЭГК – в развитии патологических нарушений микрососудистой циркуляции, в частности, при регионарном ишемическом воздействии с последующей реперфузией. Изучение подобных патологических процессов и разработка способов их коррекции представляет значимый научно-практический интерес для разработки терапевтических подходов по лечению заболеваний, связанных с нарушениями микроциркуляции.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: XII Международной научно-практической конференции «Наукоемкие химические технологии» (Россия, Волгоград, 2008); XIII International biotechnology symposium and exhibition (КНР, Далянь, 2008); Всероссийская конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению» (Россия, Москва, 2008 и 2010); IV и V Всероссийские конференции по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии с международным участием (Россия, Москва, 2009 и 2011); VII и VIII международные конференции “Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения)” (Россия, Ярославль, 2009 и 2011). Апробация диссертационной работы была проведена на межлабораторном семинаре НИИ экспериментальной кардиологии ФГБУ РКНПК МЗиСР РФ 16 июня 2011 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 работ: 9 статей и 8 тезисов докладов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы (пять глав), описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения (три главы), заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 140 страниц печатного текста, 19 рисунков, 11 таблиц и 170 ссылок.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы включает пять глав. В главе I кратко рассмотрены структура и функции сосудистого эндотелия. Глава II посвящена визуализации, биохимическому составу и структуре ЭГК. В главе III подробно рассмотрены функции эндотелиального гликокаликса как регулятора сосудистой проницаемости, механотрансдуктора напряжения сдвига кровотока, регулятора сосудистого микроокружения и взаимодействия эндотелия с циркулирующими клетками крови. Глава IV посвящена участию гликокаликса в патологических процессах сердечно-сосудистой системы. В последней, V главе приведены подходы по регуляции структуры гликокаликса, преимущественно при помощи ферментных производных.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Используемые материалы. В работе использованы тестикулярная гиалуронидаза (КФ 3.2.1.35) из семенников быка производства (ФГУП “Микроген” МЗиСР РФ, Россия) со специфической активностью нативного производного 950-970 NFU/мг белка, подвергшаяся предварительной очистке с помощью гель-хроматографии на носителе Sephadex® G-100 Medium (Sigma, США). Для синтеза ГУ-ХС использованы хондроитин-4-сульфат из трахеи быка со средней молекулярной массой 30-50 кДа (Sigma, США), пара-бензохинон (Aldrich, США), тринитробензосульфокислота (Sigma, США). Для изучения кинетики гликирования ГУ и ГУ-ХС использованы: субстрат в виде лиофилизированной калиевой соли гиалуроновой кислоты (гиалуронан) средней молекулярной массы 700-800 кДа из пуповины человека, натриевая соль высокомолекулярного гепарина бычьего происхождения молекулярной массы 16-18 кДа, D-глюкоза (Glc), D-галактоза (Gal), D-лактоза (Lac), D-мальтоза (Mal), D-целлобиоза (Cel), N-ацетилглюкозамин (N-AcGlcNH2), N-ацетилгалактозамин (N-AcGalNH2) фирмы Sigma-Aldrich, США. Индивидуальные фрагменты (олигомеры) гиалуроновой кислоты общей формулы GlcA–[–GlcNHAc–GlcA–]n–GlcNHAc, где n равно 0 (димер), 1 (тетрамер), 2 (гексамер), 3 (октамер), 4 (декамер гиалуронана), были любезно предоставлены профессором Keiichi Takagaki, Department of Biochemistry, Hirosaki University School of Medicine, Hirosaki, Japan. Все остальные реактивы отечественного или зарубежного производства (фирма Sigma-Aldrich, США) были аналитический степени чистоты.

Для оценки влияния препаратов нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы на состояние перфузии конечности крысы после ишемического воздействия методом ЛДФ-метрии были использованы крысы-самцы линии Вистар средней массы 320-400 граммов в возрасте 1-1,3 года, полученные от зоопитомника филиал “Столбовая” ГУ НЦБМТ РАМН.

Методы исследования. 1) Ферментативную активность препаратов нативной и модифицированной гиалуронидазы определяли, используя метод вискозиметрии, согласно установленным рекомендациям [Vercruysse K.P. et al., 1995].

2) Активацию ГАГ хондроитинсульфата (ХС) п-бензохиноном проводили по оригинальной методике путем смешивания растворов исходных соединений в весовом соотношении 1 : 1 и инкубацией в течении 1,5 часов с последующей хроматографической очисткой активированного ХС. Количество гидрохиноновых центров присоединения на гликановой цепи хондроитинсульфата (10-20% от общего количества) определялось йодометрически [Maksimenko A.V. et al., 2001].

3) Ковалентное конъюгирование ГУ с активированным ХС проводили по оригинальной методике путем инкубации растворов предварительно очищенной хроматографически ГУ и активированного ХС (соотношения компонентов в реакционной смеси: 20 мкМ ГУ – 10-15 мкМ ХС, 18-22 часов, рН 8,2-8,7). После инкубации реакционная смесь проходила стадию очистки (хроматографической или ультрафильтрационной) с последующей лиофилизацией. Эндогликозидазная активность полученного производного составляла 76-78% от активности ГУ, степень экспонирования поверхностных аминогрупп ГУ-ХС (степень модификации фермента) – 84-86%. Содержание белка в модифицированном препарате - 3-6%.

4) Содержание белка в препаратах ГУ и ГУ-ХС определяли по методу Брэдфорд [Bradford M.M., 1976].

5) Степень модификации ГУ измеряли путем титрования поверхностных аминогрупп гиалуронидазных производных тринитробензосульфокислотой по методу Spadaro A.C. et al. (1979), принимая содержание аминогрупп нативного фермента за 100%.

6) Гликирование производных ГУ осуществляли при их инкубации с сахаридными формами: моно- (Glc, Gal), дисахаридами (Lac, Mal, Cel), N-ацетилгексозаминами (N-AcGlcNH2 и N-AcGalNH2) и олигомерами гиалуроновой кислоты общей формулы GlcA–[–GlcNHAc–GlcA–]n–GlcNHAc, где n равно 0 (димер), 1 (тетрамер), 2 (гексамер), 3 (октамер), 4 (декамер гиалуронана). Инкубацию ферментных производных проводили в 0,05 М фосфатном буфере pH 5,5 или pH 7,5 (в присутствии 0,15 или 0,75 М NaCl) при 37оС в течение 8 суток. В случае инкубации с олигосахаридами гиалуроновой кислоты в течение трех часов из инкубационного раствора отбирались пробы по 0,1 мл и определялась ее эндогликозидазная активность по вышеописанной методике через 10, 30 мин, 1, 2, 3 часа после начала инкубации. В остальных случаях забор пробы происходил 1 раз в сутки.

7) Влияние ионной силы раствора на активность производных ГУ оценивалось путем вышеописанного измерения активности термостатированного при температуре 37оС буферного раствора ГУ и ГУ-ХС с заданными аналитическими концентрациями хлорида натрия при значениях рН раствора 5,5 и 7,5.

8) Резистентность производных ГУ к ингибированию гепарином оценивали по величине их остаточной эндогликозидазной активности в присутствии избытка гепарина (соотношение весовых концентраций фермент/гепарин 1:100).

9) Спектрофлюориметрическое исследование изменения степени экспонирования поверхностных аминогрупп при инкубировании производных ГУ с нейтральными сахаридами проводили на спектрофлюориметре Hitachi F-4010 (Япония) при длине волны возбуждения 280 нм, испускания 348 нм с одинаковой концентрацией белка (0,2 мг/мл).

10) Эксперименты in vivo по оценке действия препаратов ГУ на состояние системы микроциркуляции после ишемии/реперфузии были выполнены на анестезированных хлороформом крысах, задняя конечность которых подвергалась 3-х часовой ишемии с последующей реперфузией. Характер восстановления перфузии микроциркуляции задней конечности при внутривенном болюсном введении исследуемых препаратов оценивали методом ЛДФ с использованием одноканального лазерного анализатора кожного кровотока ЛАКК-02 (НПП «ЛАЗМА», Россия). В зависимости от используемого препарата и вида его введения (превентивного или острого) животные были сформированы в группы по 6 голов. Описания групп приведены в Таблице 1.

11) Вейвлет-анализ экспериментальных данных опытов in vivo выполнен с помощью программного обеспечения LDF 2.2.0.507 для оценки влияния механизмов локальной и системной регуляции микроциркуляции на ее функционирование в условиях ишемии/реперфузии и воздействия исследуемых соединений.

12) Статистическая обработка результатов опытов in vivo выполнена с использованием программного пакета Statistica 6.0 (StatSoft Inc., США) согласно рекомендациям [Реброва О.Ю., М.: МедиаСфера, 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Получение модифицированной гиалуронидазы. Обработка ХС (и других ГАГ) бензохиноном делает этот полимер пригодным для ковалентного связывания с ферментами. Ковалентное присоединение биокатализатора к активированному бензохиноном ГАГ обеспечивается за счет поверхностных аминогрупп фермента и подтверждается данными денатурирующего электрофореза с додецилсульфатом натрия. Ранее в работах нашей лаборатории было экспериментально продемонстрировано влияние ГАГ-микроокружения ГУ на эндогликозидазную активность и резистентность к гепариновому ингибированию, при этом упомянутое микроокружение моделировалось ковалентным присоединением ГАГ к гиалуронидазе [Максименко А.В., 2003]. Полимерные ГАГ (гиалуронан, ХС) стабилизировали эндогликозидазную активность фермента, а сополимерные (гепарин/ гепарансульфат, дерматансульфат) дестабилизировали ее. Инактивирующее влияние сополимерных ГАГ было связано с присутствием в микроокружении ГУ остатков идуроновой кислоты и (1-3)-, (1-4)-гликозидных связей. Наибольшим стабилизирующим эндогликозидазную активность фермента эффектом обладало ХС-микроокружение биокатализатора. По оригинальной методике было наработано препаративное количество препарата ГУ-ХС для выполнения дальнейших сравнительных исследований.

Исследование действия гликирующих агентов на активность ГУ и ГУ-ХС.

Гликирование моно- и ди- сахаридами. Для выяснения закономерностей структурно-функциональных изменений ГУ и ГУ-ХС была выполнена оценка влияния нейтральных сахаридов (как простых гликирующих агентов в виде моносахаридов, так и структурных аналогов полимерных звеньев ГАГ – дисахаридов) на эндогликозидазную активность ферментных производных.

Гликирование ГУ моно- (Glc и Gal, их смесью) и дисахаридами (Lac, Mal, Cel, их смесью) влияло на активности ферментов сходным образом, вызывая снижение активности как при pH 5,5, так и при pH 7,5. При этом сильным инактивирующим действием в отношении ГУ обладали Gal (при pH 5,5) и Lac (при pH 5,5 и 7,5). Смесь моно- и дисахаридов наиболее значимо инактивировали ГУ. Присутствие в растворе субстрата гепарина вызывало снижение активности ГУ во всех случаях. Инкубация с моносахаридами Glc и Gal по отдельности, а также с дисахаридами Mal и Cel приводила к постепенному снижению степени экспонирования поверхностных аминогрупп ГУ. Характер изменения степени экспонирования аминогрупп существенно варьировался при инкубации ГУ с Lac и смесью моно- и дисахаридов (Табл. 2 и 3).

Напротив, инкубация ГУ-ХС с моно- и дисахаридами не приводила к существенным потерям эндогликозидазной активности, вне зависимости от значения pH инкубационной среды (Табл. 2 и 3). В отличие от нативного фермента, Gal и Lac не оказывали ингибирующего воздействия на ГУ-ХС и только смесь моно- и дисахаридов приводила к ее заметной инактивации. Кроме того, ГУ-ХС обладала резистентностью к ингибированию гепарином. Параметр степени экспонирования поверхностных аминогрупп обладал значительной вариабельностью с тенденцией к росту.

Спектрофлуориметрическое исследование не выявило существенных изменений в зависимости Iф от времени инкубационного процесса, демонстрирующей изменение конформации фермента с изменением положения групп-флуорофоров на белковой поверхности в процессе гликирования, при его проведении с ГУ в отсутствии моно- и дисахаридов. В присутствии моносахаридов происходит почти одинаковое, монотонно возрастающее со временем инкубации тушение флуоресценции для всех случаев. Для ГУ-ХС значение Iф при инкубации с моно- и дисахаридами монотонно снижалось во всех случаях.

Гликирование N-ацетилгексозаминами. Помимо нейтральных гликирующих агентов в условиях сосудистого поражения могут появляться также заряженные сахаридные производные, способные возникать в результате деградации ЭГК. Модельными гликирующими агентами, представляющими эти сахаридные производные, выступают N-ацетилгексозамины.

Гликирование ГУ N-ацетилгексозаминами не вызывает существенных потерь активности (Табл. 4). Наблюдалось некоторое падение активности гиалуронидазы при pH 5,5 от действия смеси N-ацетилгексозаминов. В сравнении с контрольными показателями не наблюдалось выраженных изменений гепаринового ингибирования ГУ при гликировании N-ацетилгексозаминами.

К достоверному снижению эндогликозидазной активности модифицированного фермента приводило его гликирование N-ацетилгексозаминами (Табл. 4). Меньшее инактивирующее действие вызвал N-AcGalNH2, большее – N-AcGlcNH2, а наибольшую инактивацию активности вызывало действие их смеси. Ингибирующий эффект гепарина был сходен по глубине с эффектами для случаев ГУ, и был больше в сравнении с инкубацией ГУ-ХС без N-ацетилгексозаминов.

Эффекты гликирования N-ацетилгексозаминами оказались противоположными гликирующему действию нейтральных моно- и дисахаридов, когда ХС-микроокружение стабилизировало ГУ. Мы предполагаем, что указанное различие может быть обусловлено развитием кулоновских взаимодействий после модификации фермента ХС. Для выяснения этого было выполнено исследование влияния ионной силы на эндогликозидазную активность ферментных производных. Оказалось, что эндогликозидазная активность ГУ и ГУ-ХС зависит от величины ионной силы среды сходным образом (Рис. 1). Таким образом, электростатические взаимодействия не имеют решающего влияния на активность ферментных производных. При этом обнаруженная зависимость была более выражена при pH 5,5 и менее значительна при pH 7,5. В последнем случае лимитирующее влияние электростатических взаимодействий на процесс гликирования может выявляться заметней при его проведении с повышенной величиной ионной силы инкубационной среды (0,75 М NaCl) со смесью N-ацетилгексозаминов.

Было выполнено тестирование влияния величины ионной силы инкубационных растворов на процесс гликирования ферментов N-ацетилгексозаминами. Показано, что величина ионной силы практически не сказывается на гликировании ГУ и заметно влияет на гликирование ГУ-ХС (Рис. 2). Увеличение ионной силы уменьшало развитие кулоновских взаимодействий на больших сроках инкубации, что приводило к снижению гликирующей инактивации модифицированного фермента.

Гликирование фрагментами гиалуронана. Взаимодействие производных ГУ с фрагментами гиалуронана общей формулы GlcA–[–GlcNHAc–GlcA–]n–GlcNHAc, где n от 0 до 4, продемонстрировало, что ГУ-ХС существеннее инактивируется в сравнении с ГУ (Рис. 3). С увеличением длины сахаридной цепи (рост молекулярного размера) гиалуронановых фрагментов инактивация уменьшалась для ГУ и ГУ-ХС. С увеличением времени инкубации (pH 5,5, 37оС) заметнее усиливалась инактивация ГУ-ХС, особенно смесью фрагментов гиалуронана. За три часа инкубации снижалось количество титруемых поверхностных аминогрупп ГУ на 50%, а ГУ-ХС на 34%. Наблюдаемые эффекты наглядно подтверждали инактивирующее действие N-ацетилгексозаминов (расположенных у восстанавливающего конца фрагментов гиалуронана) на ГУ-ХС. Смесь гиалуронановых фрагментов моделировала действие смеси продуктов деградации ЭГК.

Модель поражения микроциркуляции крысы. Выбор модели ишемического поражения микроциркуляции нижней конечности крысы был обусловлен доступной возможностью слежения за изменением уровня подкожной микроциркуляции во времени с помощью метода ЛДФ и тем, что аналогичная модель была подробно описана при изучении комплексного регионарного болевого синдрома [Coderre T.J. et al., 2004].

Экспериментально установленная продолжительность ишемии (три часа) позволяет достигать исходного уровня микроциркуляции после снятия зажима в контрольной группе в течение периода в 2-3 мин, что было удобно для оценки эффектов исследуемых соединений.

Кроме того, выбранный период ишемии не способствовал развитию интерстициального отека и необратимого разрушения микроциркуляторного русла. Нарушения микроциркуляции могли быть связаны в этих условиях с “реперфузионным” поражением (ишемия/реперфузия), эндотелиальным набуханием, вазоспазмом, воспалительным ответом. Установленный интервал (2,3-3,5 мг белка/кг веса животного, 2200-3400 NFU/кг) белковой дозы ГУ соответствовал ее оптимальному эффекту и в этих границах (с учетом содержания компонентов в ГУ-ХС) сравнивалось действие изученных веществ.

Флоуметрическое рассмотрение данных экспериментов in vivo.

Схема 1. Время достижения исходного уровня микроциркуляции после ишемии было различным для рассматриваемых групп (Рис. 4). При проведении парного сравнения групп животных по тесту Манна-Уитни, сопоставляемого в ANOVA Краскела-Уоллиса, было найдено, что действие ГУ и ГУ-ХС достоверно отличаются между собой и от показателей других групп, тогда как показатели контрольной группы достоверно не отличались от показателей свободного ХС и его смеси с ГУ (Табл. 5-6, Рис. 5). ГУ ускоряет восстановление микроциркуляции, а ГУ-ХС замедляет этот процесс, указывая на возможную роль ингибирующего действия продуктов деградации ЭГК.

Воздействие ишемии/реперфузии и воспалительных процессов разрушает ЭГК в венулах и капиллярах системы микроциркуляции. Вероятно, гликокаликс в этом случае выступает в качестве фактора резистентности кровотоку, создавая дополнительные препятствия при локальных нарушениях целостности микрососудистого эндотелия,

способствуя агрегации циркулирующих белковых компонентов и клеток крови. Деструкция одного из компонентов ЭГК, гиалуронана, может определять функционирование капилляров (Cabrales P. et al., 2007). Системно введенное в кровоток производное ГУ (в нашем исследовании) способно воздействовать на гиалуронан ЭГК и может подвергаться действию метаболитов карбогидратного окружения. В условиях продолжительной ишемии в их роли могут выступать продукты деградации ЭГК. Свидетельством первого направления

взаимодействия выступает снижение резистентности кровотоку микрососудов, а второму – ингибирование ферментативной активности. При этом нейтральные сахариды инактивируют ГУ, а олигомерные формы продуктов ГАГ-деградации ЭГК – ГУ-ХС.

Вейвлет-преобразование полученных результатов демонстрирует уменьшение микрососудистой резистентности кровотоку в случае ГУ, поддерживаемое действием свободного ХС (достоверный рост амплитуды в нейрогенном и миогенном интервале – снижение резистентности кровотоку). Данные ЛДФ демонстрируют достоверный эффект ускорения (относительно контроля) восстановления уровня микроциркуляции после ишемии только с ГУ (Рис. 5). Можно полагать, что наблюдаемый эффект обусловлен ее эндогликозидазной активностью, поскольку использование другого белка (бычьего сывороточного альбумина, БСА), заведомо лишенного такой активности, не оказывает отмеченного действия. Более того, ГУ-ХС проявляет “тормозящий” эффект (относительно контроля) на скорость восстановления уровня микроциркуляции после ишемии. Это свидетельствует об ингибировании ферментативной активности, по-видимому, в результате действия именно продуктов деградации ЭГК и, возможно, об организации дополнительных барьеров микрокровотоку после ишемии.

Полученные данные демонстрируют участие ЭГК в микроциркуляторных нарушениях, устранение которых ускоряется при активном ферментативном воздействии на его компоненты. Вероятно, такое воздействие будет более затруднительным при остром введении производных (перед окончанием ишемии и реперфузией), когда накоплены продукты деградации ЭГК (в зоне продолжительной ишемии) для проявления их “ударного” действия, а гиперемия сокращает дозу активного фермента в очаге поражения (нет системного распределения производного) и исключается возможность функционирования введенных соединений в период ишемии. Для подтверждения этого предположения были выполнены эксперименты по схеме 2.

Схема 2. Флоуметрическое исследование демонстрирует решающий вклад в достижение исходного уровня микроциркуляции после трехчасовой ишемии самого потока

 крови (Рис. 6). Статистическая обработка этих данных показывает достоверность-17

крови (Рис. 6). Статистическая обработка этих данных показывает достоверность-18крови (Рис. 6). Статистическая обработка этих данных показывает достоверность сходства результатов контрольного эксперимента и эффекта ГУ, от которых достоверно отличаются сходные между собой “тормозящие” восстановление кровотока эффекты ГУ-ХС, ХС и его смеси с ГУ (Табл. 5-6, Рис. 7). Действие БСА подчеркивает значимость гиалуронидазной активности, которая, по-видимому, направлена на измененную ишемией структуру ЭГК и

снижается при функционировании ГУ в ишемизированной зоне микроциркуляции. Это влияние сказывается на действии смеси ГУ с ХС, обнаруживая, возможно, присутствие увеличенного количества нейтральных сахаридных производных (в сравнении с эффектами схемы 1). Доминирующее накопление продуктов деградации ЭГК инактивирует ГУ-ХС и ее электростатический комплекс ГУ с ХС (Рис. 7), подтверждая участие гликокаликса в развитии микроциркуляторных нарушений. Данные вейвлет-преобразования результатов флоуметрии предполагают возможное удержание гликокаликсом ХС и его ковалентных и электростатических комплексов с ГУ, что достоверно замедляет восстановление микроциркуляции (Рис. 7), вероятно, благодаря возникновению гидродинамических препятствий кровотоку. Сравнение данных разных экспериментальных схем (Рис. 5 и 7) подтверждает вероятность такой ситуации, указывая на антиишемическую защиту поверхности микрососудов свободным ХС и его смесью с ГУ. Полученные результаты поддерживают рассмотрение ЭГК как важной терапевтической мишени.

ВЫВОДЫ:

1. Модификация бычьей тестикулярной гиалуронидазы хондроитинсульфатом стабилизирует ее эндогликозидазную активность по отношению к инактивирующему гликированию моно- (глюкоза и галактоза) и ди- (целлобиоза, мальтоза, лактоза) сахаридами.

2. Гликирование нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы N-ацетилгексозаминами (как в виде индивидуальных соединений, так и в составе структуры фрагментов гиалуронана) значительно инактивирует эндогликозидазную активность модифицированной гиалуронидазы и незначительно влияет на нативный фермент.

3. Противоположное влияние на эндогликозидазную активность нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы моно- и дисахаридов, с одной стороны, и N-ацетилгексозаминов (расположенных у восстанавливающего конца продуктов деградации эндотелиального гликокаликса), с другой, предполагает использование этих ферментных производных для выяснения участия продуктов деградации эндотелиального гликокаликса в развитии нарушений микроциркуляции, вызванных процессом ишемии с последующей реперфузией.

4. На модели ишемии/реперфузии мышц задней конечности крысы превентивное (предышемическое) внутривенное болюсное введение нативной гиалуронидазы быстрее вызывает восстановление исходного уровня микроциркуляции, чем действие модифицированного фермента. Эти результаты свидетельствуют о преобладании в ишемизированной микрососудистой сети продуктов деградации эндотелиального гликокаликса, вносящих вклад в развитие микрососудитых обструкций в ишемизированных тканях и ингибирующих модифицированную хондроитинсульфатом гиалуронидазу.

5. Ингибирующее действие продуктов деградации эндотелиального гликокаликса на модифицированную хондроитинсульфатом гиалуронидазу более выражено после постишемического внутривенного болюсного введения исследуемых агентов.

6. По данным биохимического тестирования с использованием нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы на модели ишемии/ реперфузии мышц задней конечности крысы эндотелиальный гликокаликс участвует в развитии нарушений микроциркуляции.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования могут быть использованы в исследовательских целях для разработки ферментных препаратов, предназначенных для регуляции структуры эндотелиального гликокаликса при патологиях системы микроциркуляции, а также для возможного клинического использования в качестве вспомогательной терапии в случае возникновения микрососудистых осложнений. Данные работы могут использоваться для дальнейшего развития в ФГБУ РКНПК МЗиСР РФ, ГУ Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН, ФГБУ ЦВКГ им. А.А. Вишневского МО РФ, химическом и биологическом факультетах МГУ им. М.В. Ломоносова, ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, ГУ НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН, ФГБУ Гематологический Научный Центр РАМН и в ряде других мест, связанных с разработкой белковых препаратов медицинского назначения.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Состояние, деструкция и реконструкция околоклеточной углеводной оболочки люминальной сосудистой поверхности в атерогенезе. Кардиологический вестник. 2007: Том II (XIV), №2, стр. 64-68.

2. Максименко А.В., Турашев А.Д., Тищенко Е.Г. Подходы к регуляции углеводного покрытия люминальной поверхности сосудистой стенки для коррекции патофизиологических процессов. Молекулярная медицина. 2008, №2, стр. 12-17.

3. Турашев А.Д., Максименко А.В. Эндотелиальный гликокаликс в функционировании микроциркуляторного русла. Кардиологический вестник. 2009: Том IV (XVI), №2, стр. 59-65.

4. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Гликирование нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы моносахаридами. Молекулярная медицина. 2009, №3, С. 51-56.

5. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Неферментативное гликозилирование нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы дисахарами. Молекулярная медицина. 2009, №6, С. 50-55.

6. Максименко А.В., Турашев А.Д. Гликокаликс и его фрагменты в функционировании микроциркуляции. Регионар. кровообращ. микроциркул., 2009, Т. 8, №3, С. 4-13.

7. Максименко А.В., Турашев А.Д. Визуализация, состав и структура эндотелиального гликокаликса. Атеросклероз и дислипидемии, 2011, №1, 26-38.

8. Максименко А.В., Турашев А.Д. Функции и состояние эндотелиального гликокаликса в норме и патологии. Атеросклероз и дислипидемии, 2011, №2, 4-17.

9. Максименко А.В., Турашев А.Д., Федорович А.А., Тищенко Е.Г., Рогоза А.Н. Эндотелиальный гликокаликс крыс участвует в нарушениях микроциркуляторного русла. Атеросклероз и дислипидемии, 2011, №3, 13-29.

10. Турашев А.Д., Бут А.С., Тищенко Е.Г., Лихацкая Г.Н., Максименко А.В.. Влияние гликирования дисахаридами нативной и модифицированной хондроитинсульфатом гиалуронидазы на структурно-функциональные соотношения фермента. Поиск подходов к регуляции плотности углеводной выстилки сосудистой стенки. XII Международная научно-техническая конференция «Наукоемкие химические технологии - 2008». 9-11 сентября 2008 года. Волгоград. Стр 169.

11. Maksimenko A. V., Turashev A. D., But A. S., Tischenko E. G., Trifonov E. V., Nurminski E. A., Likhatskaya G. N. Glycation of hyaluronidase by mono- and di-saccharides. Protective effect of chondroitin sulfate microenvironment in vitro and in silico: abstrs of the Thirteenth intern. biotechnology symp. and exhibition, Oct. 12-17, 2008, Dalian, China // Journal of Biotechnology. – 2008. – Vol. 136, Suppl. 1. – P. S202.

12. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Стабилизация гиалуронидазной активности для регуляции плотности углеводного покрытия сосудистой стенки. Тезисы Всероссийская конференция с международным участием «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению». 16-18 октября 2008 года. Москва. Стр 134-135.

13. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Регуляция активности гиалуронидазы разных форм гликированием низкомолекулярными сахаридными производными для коррекции микроциркуляторных нарушений. Тезисы. IV Всероссийская конференция по клинической гемостазиологии и гемореологии в сердечно-сосудистой хирургии (Москва, 4-6 февраля 2009 г.) Стр. 532-533.

14. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Производные гиалуронидазы для исследования эндотелиального гликокаликса системы микроциркуляции. Тезисы. VII Международная конференция «Гемореология и микроциркуляция (от функциональных механизмов в клинику)» (Ярославль, 15-15 июня 2009 г.), стр. 40.

15. Турашев А.Д., Тищенко Е.Г., Максименко А.В. Флоуметрическое исследование с гиалуронидазными производными участия эндотелиального гликокаликса в микроциркуляторных нарушениях. Тезисы всероссийской конференции «Тромбозы, кровоточивость, ДВС-синдром: современные подходы к диагностике и лечению», г. Москва, 9-10 декабря 2010 г. Приложение №8, 83-84.

16. Турашев А.Д., Федорович А.А., Тищенко Е.Г., Рогоза А.Н., Максименко А.В. Ферментативное тестирование участия эндотелиального гликокаликса в ишемическом повреждении микроциркуляторного русла. Материалы конференции «V всероссийская конференция “Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии (с международным участием)”», Москва, НЦ Сердечно-сосудистой хирургии им. А.Н. Бакулева РАМН, 3-5 февраля 2011 г., 522-524.

17. Максименко А.В., Турашев А.Д., Федорович А.А., Рогоза А.Н., Тищенко Е.Г. Флоуметрическое исследование участия эндотелиального гликокаликса в нарушениях микроциркуляции посредством гиалуронидазного тестирования. Сборник материалов конференции «VIII международная конференция (со школой для молодых ученых) “Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиогенеза до центрального кровообращения”», Ярославль, 10-14 июня 2011 г., 136.

Список используемых в работе сокращений.

ЭГК эндотелиальный гликокаликс Mal мальтоза
ГАГ гликозаминогликаны Cel целлобиоза
ГУ нативная гиалуронидаза N-AcGlcNH2 N-ацетилглюкозамин
ХС хондроитинсульфат N-AcGalNH2 N-ацетилгалактозамин
ГУ-ХС модифицированная хондроитинсульфатом гиалуронидаза интенсивность флуоресценции
ГУ + ХС –– смесь нативной гиалуронидазы со свободным хондроитин-сульфатом БСА бычий сывороточный альбумин
Glc глюкоза ЛДФ лазерная доплеровская флоуметрия
Gal галактоза МЦР микроциркуляторное русло
Lac лактоза


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.