Интенсивность свободнорадикальных процессов и системы антиокислительной защиты молока и молочных продуктов при воздействии природно-климатических и технологических факторов

На правах рукописи

ИГНАТЬЕВА ГАЛИНА ВИТАЛЬЕВНА

ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ И

СИСТЕМЫ АНТИОКИСЛИТЕЛЬНОЙ ЗАЩИТЫ МОЛОКА И

МОЛОЧНЫХ ПРОДУКТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ПРИРОДНО-КЛИМАТИЧЕСКИХ И ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ

03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

КУРСК 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А.Столыпина»

Научный руководитель:

Заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич

Официальные оппоненты:

Ярован Наталья Ивановна, доктор биологических наук, профессор, ФГБОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет», зав. кафедрой химии Чепелев Николай Александрович, кандидат биологических наук, доцент, ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова», декан зооинженерного факультета

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Новосибирский государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится «_31_» октября 2013 г. в 13-00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.040.03 при ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова» по адресу: 305021, г. Курск, ул. Карла Маркса, 70. Тел. (4712) 53-13-30, факс (4712) 53-84-36.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Курская государственная сельскохозяйственная академия имени профессора И.И. Иванова».

Автореферат разослан « 26 » сентября 2013 года

Ученый секретарь диссертационного совета

Г.Ф. Рыжкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Укрепление естественных антиоксидантных систем организма человека обеспечивается за счет употребления в пищу продуктов, содержащих антиоксиданты, которые гарантируют безопасность пищевых продуктов и обеспечивают сохранность их качества [В. В. Соколовский, 1993; Halliwell et al., 1997-1999; Е. Б. Меньшикова и др., 2008]. При употреблении продуктов с начавшимся процессом окисления в организме человека происходит усиленное накопление продуктов окислительных реакций, что может привести к развитию различных заболеваний [В. П. Скулачев, 2007; А. Я. Яшин и др., 2009].

Для освоения и внедрения новых технологических процессов специалисты молочной промышленности должны владеть современными представлениями о химических и физических свойствах компонентов молока, знать сущность биохимических и микробиологических процессов, протекающих при получении, производстве, хранении молока и молочных продуктов.

Развитие пищевой технологии диктует необходимость все более тесного сочетания исследовательских работ с изучением различных медицинских аспектов питания человека. В целом, это означает, что наряду с совершенствованием традиционных способов переработки молока все большее развитие приобретают наукоемкие технологии, при одновременном усилении внимания к качеству и безопасности выпускаемой продукции [А. Н. Австриевских, 2005].

Молоко и молочные продукты, являясь продуктами повседневного потребления всех возрастных групп населения, занимают одно из ведущих мест в пищевом рационе. Пищевая ценность молока отражает полноту полезных его качеств, в том числе проявление антиоксидантных свойств. Исследование интенсивности свободнорадикальных процессов и антиокислительных свойств молока, получило развитие в научных трудах отечественных и зарубежных ученых К. К. Горбатовой, И. А. Радаевой, В. П. Шидловской, З. С. Зобковой, В. Е. Высокогорского, S. Calligaris, E. Albera и др.

В настоящее время в молочной промышленности произошли значительные изменения в технологии и технике производства, внедрены принципиально новые способы обработки молока, расширился ассортимент молочных продуктов. Разработанные направления переработки молока позволяют повысить пищевую ценность молочных продуктов.

Степень разработанности темы исследования. В работе Веселова П. В. (2010) выявлено воздействие различных экологических факторов на интенсивность перекисного окисления липидов молока разных хозяйств лесостепной природной зоны Омской области. Однако отсутствуют данные об уровне первичных, вторичных и конечных продуктов липопероксидации заготовляемого молока в степной и лесной зонах Омской области.

В литературе имеются данные об антиокислительной активности молока и кисломолочных продуктов [П. В. Веселов, 2009-2010; О. Н. Лазарева, 2008; К. К. Полянский и др., 2004], изучено влияние тепловой обработки на компоненты антиокидантной системы [Ю. В. Балакирева и др., 2010; Calligaris et al., 2004; Stojanovic et al., 1996], дана оценка антиокислительной способности йодобогащенных молочных продуктов [А. Н. Мамцев, 2007].

Отличие результатов настоящей работы состоит в том, что на основании биохимических исследований, получены новые сведения о роли различных методов переработки молока в способности продуктов, подвергаться свободнорадикальному окислению (СРО) или препятствовать этим процессам. Изучена интенсивность свободнорадикальных процессов и система антиокислительной защиты молочных продуктов в течение срока годности.

Учитывая многообразие и полифункциональный характер антиоксидантов молока, можно предположить, что сохранение качества и биологической ценности продуктов, содержащих молочный жир, предотвращение их гидролитической и окислительной порчи может определяться факторами получения молока и выбором технологических процессов и режимов его переработки. Возникает необходимость в определении воздействия природно-климатических факторов на интенсивность пероксидации липидов заготовляемого молока-сырья и изучении свободнорадикального окисления и антиокислительной активности (АОА) молока в ходе его технологической переработки.

Цель исследования: Охарактеризовать интенсивность процессов свободнорадикального окисления и антиокислительной защиты молочных продуктов для биохимического обоснования совершенствования технологических параметров производства и улучшения качества молочных продуктов.

Задачи исследования:

1. Определить воздействие природно-климатических факторов Омской области на интенсивность процессов липопероксидации заготовляемого молока.
2. Сравнить влияние использования микрофильтрации и традиционного способа производства пастеризованного молока на интенсивность свободнорадикального окисления и антиокислительные свойства продукта.
3. Исследовать влияние заквасок и технологических особенностей производства кисломолочных продуктов на антиокислительную активность.
4. Изучить показатели свободнорадикального окисления и антиокислительной защиты творога при различных способах производства.

Научная новизна работы. Выявлен различный уровень продуктов липопероксидации молока, полученного в лесной, лесостепной и степной природно-климатических зонах Омской области. Установлено, что использование мембранного метода в производстве пастеризованного молока позволяет получать продукт с меньшим уровнем свободнорадикального окисления и большей антиокислительной активностью. Большая АОА микрофильтрованного молока, способствует меньшему накоплению токсичных веществ при хранении продукта. Показано, что применяемые при производстве кисломолочных продуктов заквасочные культуры способны повышать антиокислительные свойства продуктов. Обнаружено, что в процессе ферментации увеличивается число доступных сульфгидрильных групп белков. В твороге, полученном методом ультрафильтрации (УФ), выявлено увеличение содержания доступных SH-групп, по сравнению с продуктом, приготовленным традиционным способом, что способствует увеличению его антиокислительной активности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют имеющиеся представления о биохимических механизмах антиоксидантной защиты и факторах, влияющих на интенсивность свободнорадикальных процессов при производстве основных молочных продуктов. Определение продуктов пероксидации липидов позволяет совершенствовать контроль качества и сохранить важные компоненты антиоксидантной системы молока. Изучение процессов окисления компонентов молока в течение срока годности дает возможность оценить уровень сохранности продукта в пределах срока годности.

Полученные результаты исследования послужили основой для разработки рекомендаций по повышению антиоксидантной активности молочных продуктов. Рекомендации учитываются специалистами отдела «Управление по инновациям» при разработке и внедрении новых технологий и продуктов в компании «Вимм-Билль-Данн». Определение биохимических параметров, позволяет выявить влияние особенностей технологий для их совершенствования и разработки новых видов продукции.

Основные положения работы используются в учебном процессе при чтении лекций и проведении практических занятий по курсу «Биохимия» в ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А.Столыпина.

Положения, выносимые на защиту:

1. Интенсивность процессов липопероксидации молока имеет отличительные особенности в различных природно-климатических зонах Омской области.
2. Определение показателей СРО и антиокислительной защиты в молочных продуктах позволяет оценить воздействие технологических процессов на качество и биохимические свойства молока.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на IV Международной научно-практической конференции «Перспективы производства продуктов питания нового поколения», посвященной 80-летию факультета технологии молочных продуктов ОмГАУ (Омск, 2011); на IV международной научно-практической конференции «Технология и продукты здорового питания» (Саратов, 2010); на I Международной научно-практической конференции «Современная наука: теория и практика» (Ставрополь, 2010); в сборнике научных трудов «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока» (Барнаул, 2011); на международной научно-практической конференции «Современные достижения биотехнологии» (Ставрополь, 2010); на VII Специализированном конгрессе «Молочная промышленность Сибири» (Барнаул, 2012).

Публикации. Результаты исследования опубликованы в 10 печатных работах, в том числе 4 в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ для публикации основных положений диссертаций на соискание ученой степени.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 147 страницах, содержит 37 таблиц, 16 рисунков. Диссертация включает: введение, обзор литературы, объекты и методы исследования, результаты исследований, заключение, библиографический список, который включает 190 источников литературы, в том числе 153 отечественных и 37 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследования проводились в лаборатории кафедры биохимии ФГБОУ ВПО ОмГАУ им. П.А.Столыпина, а также в лицензированной испытательной лаборатории молокоперерабатывающего предприятия «Манрос-М» филиала ОАО «Вимм-Билль-Данн» (г. Омск). Схема исследования приведена на рисунке 1.

Рисунок 1 - Схема исследования

В качестве объектов исследования в работе использованы: молоко-сырье полученное от коров трех природно-климатических зон Омской области: степная зона (Русско-Полянский район), лесостепная зона (Омский район), лесная зона (Седельниковский район), в летний (июнь-июль) и зимний (январь-февраль) период, а также полуфабрикаты и готовые молочные продукты первых и последних суток хранения, произведенные на Омском молокоперерабатывающем предприятии «Манрос М» филиале ОАО «Вимм-Билль-Данн»: нормализованное молоко; питьевое пастеризованное молоко, приготовленное различными способами; ферментируемые продукты; топленое молоко; смесь для йогурта; кефир; бифидок; ряженка; йогурт; творог, приготовленный различными способами; сыворотка творожная, пермеат.

Методы исследований. В качестве метода оценки состояния свободнорадикального окисления компонентов был применен хемилюминесцентный (ХЛ) метод анализа. Свечение индуцировали добавлением раствора сернокислого железа. Анализировали следующие параметры ХЛ: светосумму; спонтанную светимость; амплитуду быстрой вспышки; амплитуду медленной вспышки. Регистрацию свечения проводили на хемилюминомере ХЛ-003 [Ю. А. Владимиров, 1999; Р. Р. Фархутдинов, 2005;].

Антиокислительную активность молока и молочных продуктов определяли по угнетению хемилюминесценции модельной системы, генерирующей активные формы кислорода. Антиокислительную активность выражали в % угнетения светосуммы хемилюминесценции по отношению к интенсивности хемилюминесценции модельной системы [Г. И. Клебанов, 2006].

Определение первичных и вторичных продуктов липопероксидации проводили с помощью экстракционно-спектрофотометрического метода с раздельной регистрацией липопероксидов в гептановой и изопропанольной фазах экстракта молока. Использованы методические подходы, рекомендованные И. А. Волчегорским и др., (1989, 2000). Спектрофотомерию каждой фазы липидного экстракта проводили на спектрофотометре UNICO UV-2800, при трех длинах волн – 220, 232, 278 нм в кварцевых кюветах толщиной 1 см против соответствующего оптического контроля, что позволило установить уровень первичных продуктов (липопероксидов и диеновых конъюгатов), вторичных продуктов (триеновых коньюгатов) липопероксидации. В гептановой фазе определяли продукты пероксидации нейтральных липидов, а в изопропанольной фазе – фосфолипидов.

Содержание конечных продуктов липопероксидации (оснований Шиффа) определяли по величине оптической плотности гептановых и изопропанольных фаз липидных экстрактов при 400 нм по методическим рекомендациям Е.И. Львовской (1991).

Содержание продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-РП), определяли по методу Н.О. Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977).

Количество доступных сульфгидрильных групп в молочных продуктах оценивали спектрофотометрически с помощью 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислоты по методу J. D.Hayes et al. (1999).

Окислительную модификацию белков (ОМБ) изучали методом, основанным на реакции взаимодействия окисленных аминокислотных остатков с 2,4-динитрофенилгидразонами (метод A. Z. Reznick & L. Parker в модификации Е. Е. Дубининой (1995).

Статистическая обработка экспериментальных данных была выполнена с использованием пакета программ «Biostat» и «Microsoft Office Exel».

Для сравнения числовых данных двух независимых групп применяли t-критерий Стьюдента. Для сравнения двух зависимых выборок применяли парный критерий Стьюдента. Нулевая гипотеза отвергалась при уровне значимости, соответствующей р < 0,05 [А. Е. Платонов, 2000].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнение интенсивности процессов липопероксидации молока разных природно-климатических зон Омской области

С целью выяснения степени подверженности липидов натурального молока-сырья свободнорадикальному окислению в зависимости от природно-климатической зоны области, нами проведено спектрофотометрическое определение продуктов липопероксидации в липидных экстрактах молока, полученного в хозяйствах трех природно-климатических зон Омской области: степной, лесостепной, лесной в зимний (таблица 1) и летний периоды (таблица 2).

Таблица 1

Содержание продуктов липопероксидации в молоке-сырье зимнего периода разных природно-климатических зон Омской области

Фаза экстрагирования	Продукты окисления липидов	Лесная зона (n=8)	Лесостепная зона (n=8)	Степная зона (n=8)
Гептан	Первичные	1,04±0,007*	1,06±0,004	1,05±0,008
	Вторичные	0,11±0,009*	0,08±0,005	0,09±0,009
	Конечные	0,005±0,003	0,004±0,001	0,018±0,006*
Изопропанол	Первичные	0,63±0,037	0,69±0,015	0,59±0,037*
	Вторичные	0,42±0,031*	0,54±0,020	0,42±0,049*
	Конечные	0,02±0,014	0,03±0,016	0,01±0,003

Примечание - *Р0,05 по сравнению с лесостепной зоной.

Полученные результаты свидетельствуют, что содержание продуктов липопероксидации в молоке зимнего периода имеет некоторые отличия в разных природно-климатических зонах. Уровень конечных продуктов липопероксидации нейтральных липидов (оснований Шиффа) в молоке степной зоны в 4,5 раза (р=0,047) больше уровня гептанрастворимых конечных продуктов других исследуемых зон. Накопление оснований Шиффа (ОШ) определяет большую интенсивность перекисного окисления нейтральных липидов молока в степной зоне. В то же время в молоке степной зоны существенно меньше первичных и вторичных продуктов пероксидации фосфолипидов по сравнению с молоком лесостепной зоны.

Таблица 2

Содержание продуктов липопероксидации в молоке-сырье летнего периода разных природно-климатических зон Омской области

Фаза экстрагирования	Продукты окисления липидов	Лесная зона (n=8)	Лесостепная зона (n=8)	Степная зона (n=8)
Гептан	Первичные	1,11±0,004**	1,11±0,019**	1,11±0,008**
	Вторичные	0,12±0,006*	0,08±0,004	0,11±0,005*
	Конечные	0,001±0,003*	0,009±0,003	0,010±0,006
Изопропанол	Первичные	0,64±0,040	0,59±0,056	0,58±0,030
	Вторичные	0,32±0,037	0,42±0,067**	0,31±0,049
	Конечные	0,008±0,005	0,014±0,008	0,005±0,003

Примечание - *Р0,05 по сравнению с лесостепной зоной;**Р0,05 по сравнению с зимним периодом.

Содержание конечных гептанрастворимых продуктов в летний период в молоке лесной зоны ниже в 10 раз (р=0,020) по сравнению с молоком лесостепной и степной зон.

При сравнении содержания продуктов липопероксидации в зависимости от сезона, нами установлено некоторое повышение содержания диеновых коньюгатов в гептановой фракции молока-сырья всех климатических зон Омской области по сравнению с зимним периодом. Больший уровень накопления первичных продуктов в летний период, вероятнее всего, объясняется различным жирнокислотным составом молочного жира, так, согласно литературным данным [К.К. Горбатова, 2003], содержание ненасыщенных кислот в молочном жире летом на 8-9% выше по сравнению с зимним периодом. Однако отсутствие существенных различий в содержании триеновых коньюгатов и оснований Шиффа в молоке всех зон летнего периода и снижение концентрации ТБК-РП в летнем молоке лесной и степной зоны на 20% (р=0,003) и 8% (р=0,014) соответственно, можно расценивать как результат антиоксидантного воздействия пастбищного рациона, богатого витаминами, позволяющего снизить уровень окисления жира.

Сравнивая уровень конечных продуктов липопероксидации гептановой и изопропанолной фракции, удалось обнаружить, что количество конечных продуктов фосфолипидов всегда превышает данный показатель в нейтральных липидах молока всех исследуемых зон как в зимний, так и в летний период. Это служит доказательством того, что двойные связи ненасыщенных жирных кислот фосфолипидов расщепляются в большей степени, чем нейтральных жиров.

Определение уровня липопероксидации в молоке-сырье в разных природно-климатических зонах Омской области позволило выявить зону с меньшей интенсивностью протекания процессов липопероксидации – лесная и зону с более выраженной активацией процессов окисления липидов - степная.

Проведя анализ полученных данных, необходимо отметить, что молочное скотоводство развито во всех зонах Омской области благодаря достаточному количеству пастбищных территорий и благоприятным климатическим условиям. Однако лесная зона характеризуется большим количеством осадков и более богатой растительностью, что, по всей вероятности, способствует большему накоплению биологически активных веществ, входящих в состав кормовых рационов животных данной зоны. Вероятно, что многие функции биологически активных веществ реализуются механизмами антиоксидантной защиты.

Характеристика показателей свободнорадикального окисления

микрофильтрованного молока

Для выяснения влияния мембранного процесса переработки исследованы антиоксидантные свойства и интенсивность процессов СРО микрофильтрованного молока, проведено сравнение этих показателей с продуктом, изготовленным традиционным способом с применением режима высокотемпературной пастеризации.

Изучали молоко с массовой долей жира 2,5% после завершения технологического процесса, проведенного различными способами. Первый способ предусматривал применение высокотемпературной пастеризации, режим: 95°С, выдержка 300 сек. (традиционный способ), технология второго способа отличалась дополнительными операциями, в том числе процессом микрофильтрации обезжиренного молока с последующим применением низкотемпературной пастеризации нормализованной смеси, режим: 75°С, выдержка 15 сек.

Для определения степени СРО в течение заявленного срока годности определенного изготовителем в соответствии с установленными требованиями законодательства РФ исследованию также были подвергнуты продукты в последний день хранения. Показатели ХЛ молока приведены на рисунке 2.

а	б

Рисунок 2 - Показатели ХЛ пастеризованного молока а) первые сутки хранения; б) последние сутки хранения: способ МФ; традиционный способ

Параметры ХЛ свежеприготовленного микрофильтрованного молока отличны в сравнении с пастеризованным молоком, приготовленным традиционным способом: светосумма ниже в 2 раза (р<0,001); амплитуда быстрой вспышки ниже на 44,2% (р=0,001); амплитуда медленной вспышки ниже на 36,5% (р=0,001). Уровень содержания свободных радикалов без добавления инициирующих веществ (спонтанная светимость) в первые сутки хранения в микрофильтрованном молоке оказался выше на 54% (р<0,001) по сравнению со свежеприготовленным пастеризованным молоком, произведенным традиционным способом. Это может быть связано с дестабилизацией жира, образующейся в результате наибольших механических нагрузок на продукт при проведении мембранного процесса переработки молока.

Светосумма ХЛ молока, изготовленного методом микрофильтрации, в последние сутки хранения ниже на 34,1% в сравнении с данным показателем молока, приготовленного традиционным способом (р=0,01), а амплитуда медленной вспышки на 36,2% (р=0,001) ниже значения соответствующего показателя молока, приготовленного традиционным способом. Другие показатели хемилюминесценции молока в последний день хранения значимо не отличаются (р=0,705, р=0,547). Полученные результаты ХЛ анализа позволяют отметить больший уровень окислительных реакций в молоке, произведенным традиционным способом, по сравнению с микрофильтрованным пастеризованным молоком.

Оценивая уровень продуктов липопероксидации в молоке, приготовленном различными способами, выявили увеличение содержания триеновых коньюгатов в гептановой фракции на 38% (р=0,009), а шиффовых оснований - в 7 раз (р=0,007) в свежем, молоке, приготовленном традиционным способом.

Различия проявлялись и при изучении влияния длительности хранения продукта. В конце срока хранения индекс окисления конечных продуктов в гептановой фракции молока, приготовленного традиционным способом, был больше на 20% (р=0,008), по сравнению с соответствующем показателем молока, приготовленного с применением мембранного процесса.

За период хранения пастеризованного молока, приготовленного традиционным способом, существенное увеличение триеновых коньюгатов и шиффовых оснований на 27% (р=0,005) и 37% (р=0,009), соответственно, зарегистрировано в гептановой фракции.

Изменение продуктов липопероксидации наблюдается и в пробах молока, приготовленного методом микрофильтрации. За период хранения в гептановой фракции возросло: первичных продуктов на 5% (р=0,001), триеновых конъюгатов в 1,5 раза (р=0,014), а шиффовых оснований в 8 раз (р=0,011). Существенных изменений в содержании продуктов окисления в изопропанольной фракции, так же как и в молоке, приготовленном традиционным способом, отмечено не было.

Уровень пероксидации фосфолипидов во время хранения пастеризованного молока при высоких исходных показателях (ОШ = 0,023±0,008 – традиционный способ, ОШ = 0,013±0,001 – способ МФ) изменился незначительно, что может свидетельствовать о достижении максимально возможного уровня окисления фосфолипидов еще на этапе получения молока и доставки его на молокоперерабатывающее предприятие.

При исследовании антиокислительной активности пастеризованного молока нами установлено, что свежеприготовленное микрофильтрованное пастеризованное молоко способно угнетать светосумму ХЛ модельной системы на 10,9% (р<0,001) выше, чем молоко, приготовленное традиционным способом. В последние сутки хранения антиокислительная активность микрофильтрованного молока оказалась выше на 7,9% (р=0,005).

Таким образом, полученные результаты хемилюминесцентного анализа и уровня продуктов липопероксидации свидетельствуют о том, что молоко, приготовленное методом МФ, содержит меньше компонентов, способных подвергаться свободнорадикальным процессам, механизм образования которых определяется более выраженной антиоксидантной активностью.

Важным компонентом антиоксидантной защиты являются доступные SH-группы, содержание которых зависит от режима тепловой обработки. Наибольшее количество доступных сульфгидрильных групп удалось обнаружить в молоке после завершения технологического процесса, проведенного традиционным способом. Содержание доступных SH-групп в микрофильтрованном молоке, подвергнутом щадящему режиму пастеризации, было меньше на 9% (р=0,025). Данный факт может быть связан с меньшим температурным воздействием и как следствие, не полным раскрытием глобул белка. Процесс хранения молока способствует образованию дисульфидных связей, что уменьшает содержание доступных сульфгидрильных групп, снижая антиокислительные свойства продукта.

Влияние ферментации молока на процессы

свободнорадикального окисления

Исследования кисломолочных продуктов были разделены на два этапа. Первый этап предусматривал определение непосредственного влияния микроорганизмов заквасочных культур на антиокислительную способность и интенсивность СРО ферментированных продуктов, исключая воздействие технологических особенностей производства кисломолочных продуктов. Второй этап предусматривал совместное действие вышеозначенных факторов производства на антиокислительные свойства продукта и их изменение в течение заявленного производителем периода хранения кисломолочных продуктов.

Для исследования выбраны композиции биопрепаратов, применяющиеся при производстве основных кисломолочных продуктов: кефира, бифидока, ря-женки, йогурта, содержащие ассоциации культур.

Исследовалось молоко до заквашивания. Остальные пробы представлены ферментированными продуктами, приготовленными с использованием различных комбинаций заквасочных культур: «Проба №1» – комбинация культур, применяющаяся для производства кефира; «Проба №2» – комбинация культур, применяющаяся для производства бифидока; «Проба №3» – комбинация культур, применяющаяся для производства ряженки; «Проба №4» – комбинация культур, применяющаяся для производства йогурта. Значения показателей ХЛ исследуемых образцов представлены на рисунке 3.

Рисунок 3 - Показатели хемилюминесценции исследуемых образцов

В результате процесса ферментации наблюдали уменьшение светосуммы Fe2+-индуцированной хемилюминесценции компонентов системы. О снижении возможности ферментируемых продуктов подвергаться СРО свидетельствует также уменьшение значения амплитуды медленной вспышки. Максимальное снижение амплитуды медленной вспышки на 41,6% и 45,3% (р<0,001) отмечалось при совместном использовании молочнокислых бактерий и дрожжей (Проба №1, Проба №2). Такие изменения показателей могут быть обусловлены повышением антиоксидантов в пробах после заквашивания.

Тем не менее зарегистрировано увеличение спонтанной светимости, характеризующей уровень содержания свободных радикалов в пробе в исследуемых ферментируемых образцах: Проба №1 - в 2,4 раза, Проба №2 - в 2,7 раза, в Пробах №3 №4 - в 2,8 и в 2,6 раз (р<0,001) соответственно, по сравнению с молоком перед заквашиванием. Это обусловлено, вероятно, образованием в процессе ферментации активных форм кислорода, таких, как супероксидный радикал, перекисид водорода и гидроксильный радикал.

При определении антиокислительной активности (% угнетения светосуммы ХЛ модельной системы) образцов установлено, что во всех исследованных ферментированных продуктах способность угнетать светосумму хемилюминесценции модельной системы выше, чем в молоке до ферментации.

Полученные данные свидетельствуют, что наибольшая способность тормозить интенсивность свободнорадикальных процессов в модельной системе проявляется в продукте, ферментированном закваской для йогурта (Streptococcus thermophilus и Lactobacterium delbrueckii subsp. Bulgaricum). В нем способность угнетать свободнорадикальное окисление модельной системы на 25% больше, чем в молоке до заквашивания (таблица 3).

Таблица 3

Антиокислительная активность (% угнетения светосуммы модельной системы) молока до и после процесса ферментации

Объект исследования	n	X±m	*Р
Молоко	8	78,79±2,19	Р10,001
Проба №1 (кефир)	8	63,92±1,56	Р10,001 ; Р20,001
Проба №2 (бифидок)	8	58,82±0,74	Р10,001; Р20,001
Проба №3 (ряженка)	8	60,90±0,59	Р10,001; Р20,001
Проба №4 (йогурт)	8	53,80±1,92	Р10,001; Р20,001

Примечание - значения Р1 в сравнении с модельной средой; значения Р2 в сравнении с молоком перед заквашиванием.

Исследования, проведенные с помощью хемилюминесцентного анализа, позволяют сделать вывод о том, что культуры использованных биообъектов способны обогащать продукты веществами, обладающими антиоксидантной активностью. Симбиоз культур Streptococcus thermophilus и Lactobacterium delbrueckii subsp. Bulgaricum, используемый в процессе ферментации, по-видимому, вызывает уменьшение концентрации веществ, способных подвергаться свободнорадикльному окислению, и способствует накоплению антиокислительных веществ, причем необходимо отметить, что антиокислительная способность данных микрорганизмов, вероятнее всего, реализуется за счет продуцируемых витаминов и ферментов [П. П. Степаненко, 2003; А. И. Тамим, 2003].

Технология производства ряженки и йогурта предусматривает отличительные особенности. Так, производство ряженки включает процесс томления при температуре 97±2°С, в течение 3,0-3,5 часов. Режимы термической обработки йогурта и кефира идентичны, однако, рецептурный состав йогурта, обеспечивает внесение в смесь сухих компонентов: сахара и сухого молока.

Высокая интенсивность окислительных процессов на этапе томления молока подтверждается значениями всех показателей ХЛ (Рисунок 4).

Светосумма ХЛ топленого молока в 6,4 раза больше (р<0,001) значения светосуммы ХЛ пастеризованного молока, предназначенного для выработки кефира и бифидока. Значения спонтанной светимости ХЛ в топленом молоке выше в 10,2 раза (р<0,001), в смеси для йогурта – в 2,2 раза (р<0,001) по сравнению с молоком для кефира и бифидока.

а	б
в	г

Рисунок 4. Показатели хемилюминесценции кисломолочных продуктов а) светосумма; б) спонтанная светимость; в) амплитуда быстрой вспышки; г) амплитуда медленной вспышки: смесь до заквашивания; готовый продукт - 1-е сутки хранения; готовый продукт - 14-е сутки хранения.

Помимо СРО липидов окислительной модификации могут подвергаться и белки. При определении уровня окислительной модификации белков в полуфабрикатах до заквашивания, а также в готовых кисломолочных продуктах удалось установить, что уровень ОМБ в топленом молоке на 85% (р<0,001) превышает данный показатель во всех остальных смесях перед заквашиванием.

Имеет место интенсификация процессов окислительной модификации белков и в процессе сквашивания кисломолочных продуктов: уровень ОМБ в кефире увеличился на 32,6% (р=0,003), бифидоке – на 54,3% (р<0,001), йогурте – на 16,3 % (р=0,050). Результаты можно объяснить высокой протеолитической способностью дрожжей, применяющихся при изготовлении кефира и бифидока.

В процессе хранения продуктов установлено увеличение уровня ОМБ в кефире и бифидоке на 25,7 % (р=0,004) и 29,1% (р<0,001) соответственно, однако, уровень ОМБ при хранении йогурта существенно не изменен (р=0,407), а при хранении ряженки зафиксировано его снижение на 43,6% (р<0,001) по сравнению со свежеприготовленным продуктом. Данный факт, возможно, связан с последующим механизмом деградации карбонилированных белков.

Процесс ферментации, увеличивает количество доступных SH-групп во всех исследуемых кисломолочных продуктах: в свежеприготовленном кефире, бифидоке и йогурте на 27% (р<0,001; р<0,001; р=0,014 соответственно), ряженке – на 21% (р<0,001) по сравнению с продуктом перед заквашиванием.

В результате реструктурирования белков происходит увеличение числа и повышения доступности, как сульфгидрильных групп, так и других боковых групп аминокислот, которые могут играть роль ловушек для активных форм кислорода.

Процесс ферментации DVS культурами способен снизить светосумму ХЛ модельной системы, однако, мезофильные культуры молочнокислых микроорганизмов и дрожжей, применяющиеся при производстве кефира и бифидока, вызывают угнетение светосуммы хемилюминесценции модельной системы в меньшей степени по сравнению с термофильными культурами (кефир – на 14,9% (р<0,001); бифидок - на 20% (р<0,001), ряженка – на 28,5% (р<0,001); йогурт – на 30,5% (р<0,001)).

В процессе хранения, вероятно, происходит окисление SH групп, в результате чего количество свободных сульфгидрильных групп в кефире уменьшается на 27,5% (р=0,048), бифидоке – на 12,6% (р=0,045), ряженке – на 48,8% (р<0,001), а в йогурте – на 32% (р=0,006) по сравнению со свежеприготовленными продуктами. Заметно снизилась в процессе хранения и антиокислительная способность: в кефире на 14,8% (р<0,001), бифидоке - на 29,3% (р<0,001), ряженке – на 31,5% (р<0,001), йогурте – на 34,5% (р<0,001) за счет взаимодействия антиоксидантных веществ со свободными радикалами, образующимися при хранении продуктов.

Применение в технологическом процессе томления молока негативным образом влияет на биологическую ценность продукта, активируя процессы свободнорадикального окисления. Такое молоко не меняет светосумму ХЛ модельной системы, то есть не обладает антиокислительными свойствами. В то время как остальные смеси перед заквашиванием обладают антиокислительными свойствами с одинаковым уровнем активности (77-78%).

Процесс ферментации кисломолочных продуктов ингибирует протекание свободнорадикального окисления и способствует накоплению антиокислительных веществ, однако, степень данного влияния будет во многом определяться видом заквасочных культур и технологическими особенностями производства.

На рисунке 5 приведено сравнение значений антиокислительной активности продуктов без учета и с учетом особенностей технологии производства.

Ряженка	Йогурт

Рисунок 5 – Влияние особенностей производства ряженки и йогурта на

антиокислительную способность

Антиокислительная активность молока, которое не подвергалось процессу томления, но ферментировалось закваской для ряженки, больше на 11,1%.

Симбиоз культур закваски для йогурта: Streptococcus thermophilus и Lactobacterium delbrueckii subsp. Bulgaricum способствуют наибольшему накоплению антиоксидантных веществ, причем повышение сухих веществ в йогурте за счет добавления сахара и сухого молока реализует дополнительное питание микроорганизмов, что на 7% увеличивает способность свежеприготовленного продукта угнетать светосумму ХЛ модельной системы, однако, в процессе хранения больший уровень количественного состава компонентов способен изменить условия для реакций перекисного окисления, уменьшая антиокислительную активность йогурта на 22%.

Исследование процессов свободнорадикального окисления творога, полученного методом ультрафильтрации

Для характеристики свободнорадикальных процессов проведены исследования гомогенатов свежеприготовленного творога и побочных продуктов его производства, полученных традиционным методом с использованием кислотной коагуляции и с применением ультрафильтрации.

Параметры хемилюминесценции творога, полученного методом УФ, ниже по сравнению с творогом, приготовленным по традиционной технологии. Так, светосумма ХЛ, характеризующая способность компонентов системы подвергаться процессам окисления, в традиционном твороге больше на 6,4% (р=0,05). На 76,9% (р<0,001) увеличена амплитуда быстрой вспышки, отражающая концентрацию гидроперекисей в пробе. В традиционном твороге максимально возможная интенсивность перекисного окисления выше на 49,4% (р<0,001) по сравнению с соответствующим показателем ХЛ (амплитуда медленной вспышки) творога, полученного с помощью УФ. Уровень содержания свободных радикалов без добавления инициирующих веществ определяется значением спонтанной светимости, которое в традиционном твороге больше в 2,3 раза (р<0,001).

При определении антиокислительной активности образцов установлено, что творог, полученный методом УФ, обладает большей антиокислительной активностью, так как способен угнетать светосумму хемилюминесценции модельной системы до 32,64%, в то время как творог, полученный традиционным методом, - до 37,42% (р<0,001).

Нами не обнаружено значимых отличий в содержании ТБК-РП в исследуемых гомогенатах творога, однако, установлены различия в содержании доступных SH-групп. В твороге, полученным методом УФ, выявлено увеличение содержания SH-групп на 41% (р=0,003), что способствует увеличению его антиокислительной активности.

Между содержанием в продукте доступных сульфгидрильных групп и антиокислительной активностью кисломолочного продукта наблюдается высокая степень корреляции, которая представлена на рисунке 6.

Рисунок 6 – Взаимосвязь между антиокислительной активностью кисломолочного продукта и содержанием в нем доступных сульфгидрильных групп

Показатель окислительной модификации белков творога, полученного методом УФ, ниже на 13%, чем белков традиционного творога (р=0,049).

При определении антиокислительной активности побочных продуктов выявлено, что сыворотка (традиционный метод) обладает некоторой антиоксидантной активностью, снижает светосумму модельной системы на 4,33% (р<0,001), в то время как светосумма модельной системы при добавлении пермеата (метод УФ) не отличается от исходного уровня. Пермеат не обладает антиокислительными свойствами, вероятно, ввиду того, что многие антиоксиданты остались в твороге, полученном методом ультрафильтрации.

Таким образом, анализ полученных результатов свидетельствует, что определение продуктов липопероксидации позволяет выявить различия в интенсивности свободнорадикальных процессов липидов в разных природно-климатических зонах: меньше конечных продуктов липопероксидации в лесной зоне и больше в степной зоне Омской области.

Применение в молочной промышленности мембранных методов переработки позволяет в большей степени сохранить антиоксидантные свойства молока, а используемые в производстве кисломолочных продуктов заквасочные культуры способны увеличить антиоксидантную активность, что делает обогащенные ими молочные продукты еще более полезными для здоровья человека.

ВЫВОДЫ

1. Интенсивность пероксидации липидов в молоке-сырье степной зоны больше, чем в лесной и лесостепной зонах Омской области. Уровень конечных продуктов липопероксидаци нейтральных липидов в молоке зимнего периода степной зоны в 4,5 раза (р=0,047) больше уровня этих же продуктов других исследуемых зон. Уровень оснований Шиффа в летний период в молоке лесной зоны ниже в 10 раз (р=0,020) по сравнению с молоком лесостепной и степной зоны.

2. Применение процесса микрофильтрации при производстве пастеризованного молока способствует большему сохранению антиокислительных свойств и приводит к снижению показателей железоиндуцированной хемилюминесценции и продуктов липопероксидации. Антиокислительная активность микрофильтрованного пастеризованного молока выше на 10,9% - первые сутки хранения, и на 7,9% - последние сутки хранения в сравнении с молоком, произведенным с применением высокотемпературной пастеризации.

3. Культуры исследованных заквасок способны обогащать продукты веществами, обладающими антиоксидантной активностью, наибольшая возможность образования которых реализовалась при приготовлении йогурта.

4. В процессе ферментации кисломолочных продуктов увеличивается число и доступность сульфгидрильных групп, что повышает антиокислительную активность кисломолочных продуктов.

5. Применение метода ультрафильтрации при производстве творога дает возможность получить продукт с меньшим уровнем свободнорадикального окисления - спонтанная светимость ниже в 2,3 раза (р<0,001), максимально возможная интенсивность перекисного окисления ниже на 49,4% (р<0,001) - и большей антиокислительной активностью. Творог, полученный методом УФ, способен угнетать светосумму хемилюминесценции модельной системы до 32,64%, в то время как творог, полученный традиционным методом, - до 37,42% (р<0,001).

Практические рекомендации

1. На основании проведенных исследований предпочтительнее использование технологического процесса микрофильтрации не только при производстве пастеризованного молока, а также в технологической цепочке производства других молочных продуктов.
2. Производство творога методом ультрафильтрации позволяет получить продукт с меньшим уровнем радикального окисления и наибольшей антиокислительной активностью по сравнению с творогом, полученным традиционным методом.
3. При определении сырьевой базы для производства молочных продуктов необходимо учитывать воздействие природно-климатических факторов, что дает возможность получать продукты с меньшим уровнем свободнорадикального окисления. Это в свою очередь, способствует лучшей сохранности производимых продуктов.
4. Хемилюминесцентный метод анализа и спектрофотометрическое определение продуктов перекисного окисления позволяют улучшить контроль качества производимых продуктов и могут быть использованы при выборе технологических методов обработки, а также при определении продолжительности хранения молочных продуктов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Игнатьева Г.В. Параметры хемилюминесценции молочных продуктов на различных технологических этапах / Г.В. Игнатьева, В.Е. Высокогорский // Материалы IV международной научно-практической конференции «Технология и продукты здорового питания». – Саратов. – 2010. – С. 55-58.
2. Игнатьева Г.В. Показатели хемилюминесценции молочных продуктов при различных способах производства творога / Г.В. Игнатьева, В.Е. Высокогорский // Материалы I Международной научно-практической конференции «Современная наука: теория и практика». – Ставрополь. – 2010. – С. 432-434.
3. Высокогорский В.Е. / Влияние заквасок на антиокислительные свойства молока // В.Е. Высокогорский, Н.В. Стрельчик, Г.В. Игнатьева // Молочная промышленность. – 2011. - №4. – С. 28-29.
4. Игнатьева Г.В. Антиокислительные свойства пастеризованного молока категории ESL / Г.В. Игнатьева // Сборник материалов IV международной научно-практической конференции «Перспективы производства продуктов питания нового поколения», посвященной 80-летию факультета Технологии молочных продуктов ОмГАУ. – Омск. – 2011. – С. 125-127.
5. Игнатьева Г.В. Изменение параметров хемилюминесценции молочных продуктов в ходе технологической обработки / Г.В. Игнатьева, В.Е. Высокогорский // Сборник научных трудов «Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока». – Барнаул. – 2011. – С. 18-21.
6. Игнатьева Г.В. Антиокислительные свойства творога в зависимости от способа его производства / Г.В. Игнатьева // Сборник материалов международной научно-практической конференции «Современные достижения биотехнологии». – Ставрополь. – 2011. – С. 250-252.
7. Высокогорский В.Е. / Антиоксидантные свойства творога // В.Е. Высокогорский, Г.В. Игнатьева // Молочная промышленность. – 2012. - №1. – С. 74-75.
8. Высокогорский В.Е. / Хемилюминесцентный анализ пастеризованного молока // В.Е. Высокогорский, Г.В. Игнатьева // Пищевая промышленность. – 2012. - №10. – С. 34-36.
9. Игнатьева Г.В. Содержание липопероксидов натурального молока-сырья различных природно-климатических зон Омской области / Г.В. Игнатьева // Сборник тезисов «Молочная промышленность Сибири. VII Специализированный конгресс». – Барнаул. – 2012. – С. 77-79.
10. Игнатьева Г.В. / Характеристика антиокислительных свойств микрофильтрованного молока // Г.В. Игнатьева, В.Е. Высокогорский // Молочная промышленность. – 2012. - №12. – С. 53-54.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОА - антиоксидантная активность

МФ – микрофильтрация

ОМБ – окисленная модификация белков

ОШ – основания Шиффа

СРО – свободнорадикальное окисление

ТБК-РП – продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой

УФ - ультрафильтрация

ХЛ - хемилюминесценция