Антикарнозиновая активность стафилококков
На правах рукописи
Потехина Лидия Петровна
АНТИКАРНОЗИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ СТАФИЛОКОККОВ
03.02.03 – «Микробиология»
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Оренбург – 2010
Работа выполнена в УРАН Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения Российской академии наук
Научный руководитель:
член-корреспондент РАН,
директор учреждения Российской
академии наук Институт клеточного
и внутриклеточного симбиоза
Уральского отделения РАН Бухарин Олег Валерьевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор ГОУ ВПО «Оренбургская
государственная медицинская
академия Росздрава» Усвяцов Борис Яковлевич
кандидат биологических наук,
доцент ГОУ ВПО
«Тюменская государственная
медицинская академия Росздрава» Тимохина Татьяна Харитоновна
Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Росздрава»
Защита состоится « » декабря 2010 г. в ________ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, зал заседаний диссертационного совета).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ОрГМА.
Автореферат разослан «______» октября 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор Немцева Наталия
Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Феномен выживания бактерий в организме хозяина рассматривается как одно из важных звеньев в патогенезе инфекционного процесса. Выживание бактерий в макроорганизме реализуется через их адаптацию к факторам защиты хозяина и может быть связано с инактивацией последних. В настоящее время установлено, что микроорганизмы способны подавлять факторы естественной резистентности организма хозяина, такие как лизоцим, комплемент, лактоферрин и др. [Бухарин О.В., 1999]. Одним из факторов защиты хозяина является природный дипептид карнозин (-аланил-L-гистидин), который оказывает антибактериальное действие, обладает антиоксидантной активностью [Дупин А.М. с соавт., 1984], проявляет антистрессорный [Гуляева Н.В. с соавт., 1989], иммуномодулирующий [Мальцева В.В. с соавт., 1992] и радиопротекторный [Северин С.Е. с соавт., 1990] эффекты, обнаружено также его противоаллергическое действие [Адо А.Д. с соавт., 1977]. Отмечено, что дифтерийные бактерии, нуждающиеся для своего роста в -аланине, могут получать его из L-карнозина [Mueller,1938], установлено разрушение карнозина бактериями [Gefter, 1925], а также способность бактерий, преимущественно стафилококков, его инактивировать, определенная как антикарнозиновая активность (АКрА) [Бухарин О.В. с соавт., 1999]. Карнозин является эндогенным компонентом быстрых скелетных мышц [Severin S.F., 1964], однако наибольшее количество дипептида содержится в обонятельном эпителии слизистой оболочки передних носовых ходов [Margolis F., 1974], являющимся естественным биотопом для микроорганизмов (в частности, стафилококков) при бактерионосительстве.
В связи с этим, известный интерес представляет, с одной стороны, - изучение распространенности антикарнозиновой активности у разных видов стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, у здоровых лиц, бактерионосителей S. aureus и из очагов инфекции от больных инфекционно-воспалительными заболеваниями, расшифровка биологической роли антикарнозиновой активности у стафилококков, а с другой – разработка новых подходов к диагностике и санации бактерионосителей под контролем этого признака.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось определение роли антикарнозиновой активности стафилококков в формировании бактерионосительства и разработка новых методов диагностики и санации стафилококковых бактерионосителей.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
1. Изучить распространенность и выраженность антикарнозиновой активности у стафилококков разных видов.
2. Оценить биологическую роль антикарнозиновой активности стафилококков при бактерионосительстве.
3. Разработать подходы к дифференциации резидентной и транзиторной стафилококковой микрофлоры при бактерионосительстве.
4. Изучить регуляторное действие Циклоферона на антикарнозиновую активность стафилококков in vitro и in vivo.
Научная новизна
Проведенные исследования позволили установить, что АКрА является широко распространенным признаком стафилококков и зависит от источника выделения: антикарнозиновая активность с высокими значениями признака характерна для культур, выделенных из биотопа с высокой концентрацией карнозина (обонятельный эпителий слизистой оболочки носовых ходов) в сравнении со стафилококками, выделенными из очагов от больных инфекционно-воспалительными заболеваниями. При сравнительной оценке значимости персистентных свойств стафилококков, выделенных от бактерионосителей, установлено, что ведущим свойством стафилококков, определяющим формирование бактерионосительства, является их антикарнозиновый признак.
Экспериментально в опытах in vivo показан вклад антикарнозинового признака в персистенцию золотистых стафилококков.
Обоснована возможность использования антикарнозиновой активности в дифференциации стафилококковой микрофлоры при бактерионосительстве и в прогнозировании развития стафилококковых инфекций.
В экспериментальных условиях установлена способность Циклоферона подавлять АКрА стафилококков, что позволило обосновать новый способ санации стафилококковых бактерионосителей.
Практическая ценность
Полученные данные расширяют теоретические представления о биологических свойствах стафилококков, способствующих их персистенции.
Практическая ценность исследования заключается в возможности использования антикарнозиновой активности стафилококков в качестве маркера при диагностике стафилококкового бактерионосительства, разработана математическая модель дифференциации резидентной стафилококковой микрофлоры от транзиторной. Предложен способ дифференциации ассоциативной микрофлоры, вызывающей развитие местных гнойно-воспалительных заболеваний, по уровню экспрессии антикарнозиновой активности (Патент РФ на изобретение №2318021) и способ санации резидентных стафилококковых бактерионосителей Циклофероном.
Положения, выносимые на защиту
1. Антикарнозиновая активность стафилококков – фактор их персистенции, способствующий выживанию микроорганизмов в организме хозяина и формированию бактерионосительства.
2. Антикарнозиновый признак стафилококков – маркер при диагностике бактерионосительства.
3. Способность Циклоферона снижать антикарнозиновую активность стафилококков позволяет обосновать подход к отбору препарата для санации резидентных бактерионосителей.
Апробация работы
Материалы работы были доложены и обсуждены на конференции молодых ученых и специалистов Оренбургской области (Оренбург, 2006; 2009); V и VI Всероссийской конференции по персистенции микроорганизмов (Оренбург, 2006; 2009); Всероссийской научной конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Москва, 2007); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007); I международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых (Донецк, 2009); Всероссийской научной конференции с международным участием «Физиология и генетика микроорганизмов в природных и экспериментальных системах» (Москва, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 публикации в журналах, рекомендованных ВАК, получен патент на изобретение № 2318021 от 27 февраля 2008 года.
Материалы диссертации представлены на региональном конкурсе научно-исследовательских работ для молодых учёных по медицине и отмечены Дипломом лауреата III премии Губернатора области (Оренбург, 2009).
Объем и структура диссертационной работы
Текст диссертации изложен на 117 страницах машинописи, содержит введение, 4 главы, заключение, выводы, указатель литературы, включающий 114 отечественных и 75 иностранных источников и приложение.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материалы и методы исследования
Для характеристики распространенности и выраженности АКрА клинических изолятов использовали: 134 штамма Staphylococcus aureus, 254 – Staphylococcus epidermidis, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа у здоровых лиц (17-18 лет) и часто длительно болеющих (ЧДБ) респираторными заболеваниями детей 9-14 лет, являющихся резидентными бактерионосителями. Были изучены золотистые и эпидермальные стафилококки, выделенные от 42 больных с гнойным воспалением околоносовых пазух, 27 больных с постинъекционными абсцессами мягких тканей, 10 больных с трофическими язвами нижних конечностей, 15 – с гнойными заболеваниями легких и плевры.
Выделение и идентификацию стафилококков от бактерионосителей проводили в соответствии с «Методическими рекомендациями по выделению и идентификации бактерий рода Staphylococcus» (Москва, 1990), выделение культур от больных осуществляли при помощи «Унифицированных методов лабораторной диагностики инфекционных заболеваний» (Приказ МЗ СССР №535).
Экспериментальная часть работы по созданию модели для дифференциации резидентной и транзиторной микрофлоры выполнена на штаммах S. aureus и S. epidermidis, выделенных у 50 человек, обследованных на стафилококковое бактерионосительство. Дифференциация типов носительства проводилась по Чистовичу Г.Н. (1969) и включала сопоставление видовых и типовых характеристик штаммов, выделенных трехкратно от одного лица с интервалами 10 суток.
Все культуры обладали типичными морфологическими, биохимическими и культуральными свойствами. Идентификацию выделенных штаммов проводили по биохимическим тестам фирмы «Lachema» (Чехия).
Антилизоцимную (АЛА), «антиинтерфероновую» (АИА), антикомплементарную (АКА), антикарнозиновую (АКрА) и антилактоферриновую (АЛфА) активности штаммов определяли по разработанным методикам (Бухарин О.В. и сотр., 1999). Полученные данные были обработаны посредством комплекса программ многомерных вероятностно-статистических критериев: «информативность», «корреляционный анализ», «факторный анализ» и «дискриминантный анализ».
Для определения биологической роли АКрА микроорганизмов использовали интраорбитальное заражение (Анатолий С.А. с соавт., 1971) мышей-самцов линии СВА массой 18 - 20 г отобранной парой изогенных клонов, отличающихся по уровню АКрА, штамма N 52 S. aureus, выделенного со слизистой оболочки переднего отдела носа от резидентного бактерионосителя. Анализу подвергались длительность бактериовыделения и массивность обсеменения почечной ткани животных. Для оценки биологической роли АКрА стафилококков в биотопе был использован метод интраназального заражения беспородных крыс-самцов экспериментально отобранными изогенными клонами («АКрА+» и «АКрА-»), полученными с использованием метода популяционного анализа (Lederberg J., Lederberg M., 1952). Полученный материал подвергали гистологической обработке на световом и электронно-микроскопическом уровнях с последующей статистической обработкой количественных параметров.
Экспериментальное изучение влияния Циклоферона на АКрА стафилококков проводили на 12 штаммах S. aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей по методике Кириллова Д.А. (2004).
Статистическую и математическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием критерия Стъюдента (Ашмарин И.П., Воробьев А.А., 1962).
Результаты исследования и их обсуждение
При проведении сравнительного анализа распространения антикарнозиновой активности у золотистых и эпидермальных стафилококков, выделенных от бактерионосителей, было установлено, что карнозин инактивировали 94±4,4% S. epidermidis и 86,1±6,9% S. aureus. Среди штаммов, выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями, антикарнозиновый признак определялся у 83,8±12,4% S. epidermidis и 79,8±8,4% S. aureus.
При оценке уровня выраженности способности стафилококков к инактивации карнозина в зависимости от источника выделения отмечено, что у S. epidermidis, выделенных от бактерионосителей, значение признака (2,1±0,09 мг/мл) было в 1,3 раза выше, по сравнению со штаммами, выделенными от больных гнойно-воспалительными заболеваниями, у которых среднее значение АКрА составило 1,6±0,4 мг/мл (p<0,05). Аналогичная закономерность наблюдалась и в отношении S. aureus: среднее значение АКрА стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа составило 2,7±0,03мг/мл, тогда как у изолятов от больных - 1,7±0,2 мг/мл (р<0,05).
Таким образом, при исследовании стафилококков оказалось, что АКрА является широко распространенным признаком и существенно зависит от источника выделения: признак наиболее выражен и чаще встречается у штаммов стафилококков, выделенных из биотопа с высокой концентрацией карнозина (обонятельный эпителий слизистой оболочки носовых ходов) (Margolis F., 1974), что, по-видимому, имеет значение в феномене бактерионосительства, и в меньшей степени у штаммов, выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями.
Далее была изучена выраженность АКрА у разных видов стафилококков, выделенных из носовой полости у здоровых лиц, бактерионосителей и часто длительно болеющих детей. Установлено, что при стафилококковом бактерионосительстве резидентная микрофлора отличается от вариантов, непродолжительно находящихся на слизистой оболочке носовых ходов (выделенных у здоровых лиц), уровнем экспрессии способности к инактивации карнозина. Так, АКрА у S. epidermidis, выделенных от резидентных бактерионосителей составляла 1,7±0,2 мг/мл, у S. aureus – 2,3±0,3 мг/мл, тогда как у здоровых лиц 1,3±0,2 мг/мл и 0,8±0,1 мг/мл соответственно. Высокие значения признака регистрировали у штаммов как золотистых, так и эпидермальных стафилококков (3,2±0,4 мг/мл и 2,7±0,4 мг/мл соответственно), выделенных от часто длительно болеющих детей, являющихся резидентными бактерионосителями.
Отмечено, что частота встречаемости и уровни выраженности АКрА стафилококков нарастали в ряду: здоровые лица < резидентные бактерионосители < часто длительно болеющие дети.
При сравнительной оценке распространенности АКрА у разных видов стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носовой полости резидентных и транзиторных бактерионосителей (табл. 1), было показано, что стафилококки, выделенные от резидентных бактерионосителей, обладали способностью инактивировать карнозин практически в 100% случаев (исключение составили штаммы S. warneri - 70%). Штаммы стафилококков, выделенные от транзиторных бактерионосителей, характеризовались меньшей распространенностью признака: 40% у S. cohnii и S. warneri, 80% у S. aureus, S. epidermidis и S. xylosus и 100% у остальных видов.
АКрА стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носовой полости резидентных бактерионосителей, была максимальной у S. xylosus и S. aureus (2,9±0,02 и 2,8±0,04 мг/мл). Уровень антикарнозиновой активности у других видов стафилококков, выделенных от резидентных бактерионосителей, был высок и варьировал от 2,1±0,18 мг/мл (S. haemolyticus) до 2,6±0,08 мг/мл у S. epidermidis и S. hominis.
Таким образом, оказалось, что при стафилококковом бактерионосительстве резидентная микрофлора отличалась от транзиторных вариантов уровнем экспрессии способности к инактивации карнозина.
Для определения биологической роли АКрА стафилококков при бактерионосительстве мы использовали модели экспериментальной инфекции.
Изучение длительности персистирования изогенных клонов при интраорбитальном заражении мышей показало, что стафилококк с низким уровнем АКрА выделялся из органов инфицированных мышей в течение 42 дней (в среднем – 37,5 ±2,0 дней), тогда как клон с высоким уровнем признака выделялся более длительно: до 63 дня с момента заражения (в среднем 54,2±2,8 дня) (p<0,05).
Таблица 1.
Распространенность и выраженность АКрА у разных видов
стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носовой полости
| Вид стафилококка | n | Резидентные бактерионосители | Транзиторные бактерионосители | ||
| Распространенность АКрА, % | Выраженность АКрА, мг/мл | Распространенность АКрА, % | Выраженность АКрА, мг/мл | ||
| S. aureus | 10 | 100±3,1 | 2,8±0,04 | 80±12,6 | 1,8±0,24* |
| S.epidermidis | 10 | 100±3,1 | 2,6±0,08 | 80±12,6 | 0,8±0,45* |
| S. cohnii | 10 | 100±3,1 | 2,4±0,12 | 40±15,5 | 1,2±0,36* |
| S. capitis | 10 | 100±3,1 | 2,5±0,10 | 100±3,1 | 0,9±0,42* |
| S. xylosus | 10 | 100±3,1 | 2,9±0,02 | 80±12,6 | 1,9±0,22* |
| S. hominis | 10 | 100±3,1 | 2,6±0,08 | 100±3,1 | 1,2±0,36* |
| S. haemolyticus | 10 | 100±3,1 | 2,1±0,18 | 100±3,1 | 1,1±0,38* |
| S. schleiferi | 10 | 100±3,1 | 2,3±0,14 | 100±3,1 | 0,9±0,43* |
| S. warneri | 10 | 70±14,4 | 2,3±0,14 | 40±15,5 | 1,3±0,33* |
Примечание: * - p 0,05 для сравниваемых групп
Поскольку при стафилококковой экспериментальной инфекции в почечной ткани животных наблюдаются стабильные и высокие показатели микробной обсемененности (Шеенков Н.В., 1993), этот орган был выбран для высева микроорганизмов. Бактериологическое исследование почечной ткани животных выявило более высокий уровень микробной обсемененности практически на всех сроках наблюдения мышей, инфицированных клоном золотистого стафилококка с высоким значением признака в сравнении с изогенным клоном (рис. 1). Массивность обсеменения почечной ткани мышей, зараженных клоном с низкой АКрА, в ходе течения экспериментальной инфекции снижалась. Если на 10 день она составляла 8,0±1,5 lg КОЕ/мл, на 15 – 6,0±1,5 lg КОЕ/мл, 25 – 5,5±1,5 lg КОЕ/мл, то перед прекращением бактериовыделения, на 35 день данный показатель снизился до 1,0 lg КОЕ/мл и на 42 день выделение стафилококков прекратилось. При инфицировании мышей клоном с высокой АКрА исходная массивность обсеменения почек составила 8,0±1,5 lg КОЕ/мл, затем она снизилась до 3,0±0,5 lg КОЕ/мл на 35 сутки и оставалась на этом уровне до 49 дня, предшествовавшего окончанию выделения стафилококков (63 день).
Таким образом, использование экспериментальной модели доказало участие АКрА бактерий в их персистенции. Полученные в ходе экспериментального инфекционного процесса результаты показали, что клон золотистого стафилококка, обладающий высоким уровнем антикарнозиновой активности, длительнее выделялся из организма мышей по сравнению с клоном с низкой АКрА, динамика показателя микробной обсемененности почек зависела от исходного уровня АКрА стафилококка.
- АКрА – 3,0 мг/мл - АКрА – 0,1 мг/мл
Рис.1. Динамика микробной обсемененности почек мышей в зависимости от исходного уровня АКрА.
На следующем этапе работы методами световой и электронной микроскопии изучено взаимодействие стафилококков с «АКрА+» и «АКрА–» с эукариотическими клетками, которое позволило отметить большую деструкцию ультраструктурных компонентов эукариотических клеток, а также снижение их пролиферативной активности при инфицировании штаммом с «АКрА+», который, в свою очередь, был более устойчив к действию защитных систем эукариот в сравнении со штаммами с «АКрА–». Установленные адаптивные и реактивные изменения в про- и эукариотических организмах в условиях их взаимодействий свидетельствуют, что со стороны как макро-, так и микроорганизма вырабатываются адаптационные механизмы, обеспечивающие динамическое равновесие в системе «эукариот – прокариот», что и обеспечивает их персистентное состояние.
Важная роль в формировании резидентного стафилококкового бактерионосительства принадлежит секретируемым микробным факторам, обуславливающим внутриклеточное паразитирование возбудителя: антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной, антилактоферриновой активностям. В этой связи интерес представляет сравнительная оценка информативных персистентных характеристик микроорганизмов при бактерионосительстве и возможность использования данных свойств для построения диагностических моделей.
Изучение распространенности и выраженности факторов персистенции у стафилококков, выделенных от резидентных и транзиторных бактерионосителей показало, что штаммы от резидентных бактерионосителей значительно чаще обладали факторами персистенции с более высокими значениями признаков (исключение составила «антиинтерфероновая» активность бактерий).
Степень значимости изученных персистентных характеристик с учетом их выраженности (в ед.) у S. aureus, выделенных от резидентных бактерионосителей, нарастала в ряду: АЛА (0,11), АИА (0,31), АКА (0,36), АЛфА (0,66), АКрА (0,93). Аналогичная тенденция наблюдалась при ранжировании признаков у S. epidermidis, выделенных также от резидентных бактерионосителей. Что же касается S. aureus, выделенных от транзиторных бактерионосителей, наименее значимыми признаками оказались АЛА и АКА, наиболее – АКрА. Ведущим свойством у S. epidermidis, выделенных от транзиторных бактерионосителей была АКрА, а за ней следовали в порядке убывания АЛфА, АИА, АЛА и АКА.
Для выяснения внутренних связей между данными признаками у разных видов стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного и транзиторного типа, был проведен корреляционный анализ, который позволил охарактеризовать ряд достоверных (р<0,01) корреляционных связей: АЛА и АКА (r=0,45) у золотистых стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, АКА и АИА (r=0,48), АЛА и АЛфА (r=0,47) у эпидермальных стафилококков, выделенных от бактерионосителей резидентного типа, а также АКрА и АЛфА (r=0,48) у эпидермальных стафилококков, выделенных от бактерионосителей транзиторного типа. Других корреляционных связей проведенный анализ не выявил.
В совокупности представленные данные указывали на определенное участие всех изученных факторов персистенции в формировании бактерионосительства. С целью конкретизации данного положения был проведен факторный анализ, с помощью которого были выявлены пять факторов с разной степенью удельного веса. Итоги проведенного анализа свидетельствовали о наличии тесных, функциональных взаимосвязей между изученными характеристиками стафилококков и подтверждали роль факторов персистенции в формировании бактерионосительства.
В связи с тем, что все изученные показатели вносили определенный вклад в формирование стафилококкового бактерионосительства, мы использовали их в дальнейшем для построения дискриминантной модели, позволяющей дифференцировать штаммы стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа по формуле:
Д = х1а1 + х2а2 +... хnаn + С,
где Д - дискриминантная функция, характеризующая резидентный или транзиторный тип штамма;
х - значение показателя в баллах;
а - коэффициент показателя;
С - поправочная константа.
В таблице 2 даны коэффициенты для каждого показателя и поправочные константы.
Таблица 2.
Коэффициенты показателей и поправочные константы для дифференциации резидентной и транзиторной микрофлоры
при бактерионосительстве.
1. Staphylococcus aureus
| АКрА | АЛА | АКА | АЛфА | АИА | С | |
| Резидентные | 47,62 | 56,63 | 5,14 | 0,11 | -1,26 | -265,35 |
| Транзиторные | 17,39 | -8,67 | 1,8 | 0,01 | 3,64 | -35,67 |
2. Staphylococcus epidermidis
| АКрА | АЛА | АКА | АЛфА | АИА | С | |
| Резидентные | 51,32 | 171,78 | 32,05 | 7,27 | 20,26 | -634,80 |
| Транзиторные | 28,58 | 61,23 | 7,27 | -2,38 | 6,61 | -107,55 |
Для установления принадлежности штамма к определенному типу, полученные у стафилококка количественные значения по показателям, переводят баллы и используют для расчета дискриминантной функции по приведенной формуле. Расчет проводят по всем строкам соответствующей таблицы.
Наибольшая величина дискриминантной функции из всех полученных будет в 95% случаев соответствовать обозначенному на данной строке типу бактерионосительства.
Пример 1. Исследуемый штамм золотистого стафилококка характеризовался следующими признаками: АКрА – 3 мг/мл (10 баллов), АЛА - 1 мкг/мл (1 балл), АКА - 20 усл.ед. (8 баллов), АИА - 5 усл.ед. (5 баллов), АЛфА – 10,5 нг/мл (7 баллов). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов следующий:
Д1=47,62х10 + 56,63х1 +5,14 х8 +0,11х7+ -1,26х5 + -265,35 = 303,07
Д2=17,39х10 + -8,67х1 + 1,8х8 + 0,01х7+3,64х5 + - 35,67 = 162,23
В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на первой строке (Д1), что позволило отнести данный штамм к резидентному типу.
Пример 2. Исследуемый штамм эпидермального стафилококка характеризовался следующими признаками: АКрА - 0,6 мг/мл (2 балла), АЛА - 1 мкг/мл (1 балл), АКА – 2,5 усл.ед. (1 балл), АИА - 1 усл.ед. (1 балл), АЛфА – 1,5 нг/мл (1 балл). Расчет по формуле с использованием представленных в таблице коэффициентов следующий:
Д1=51,32х2 + 171,78х1 + 32,05х1 + 7,27х1+20,26х1 -634,80= -300,80
Д2=28,58х2 + 61,23х1 + 7,27х1 + -2,38х1+ 6,61х1+ -107,55 = 22,34
В результате проведенного расчета максимальная величина дискриминантной функции установлена на второй строке (Д2), что позволило отнести данный штамм к транзиторному типу.
При ретроспективном сопоставлении прогнозируемых и реальных результатов дифференциации штаммов, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, эффективность разработанной модели отмечена в 93,6% случаев.
Нами экспериментально установлена значимость уровня выраженности антикарнозиновой активности у разных видов стафилококков, выделенных со слизистой оболочки носа для дифференциации стафилококковой микрофлоры на нормальную микрофлору и микрофлору, способную вызвать развитие местных инфекционно-воспалительных заболеваний. Показано, что высокий уровень АКрА у стафилококков, вегетирующих на слизистой переднего носа у бактерионосителей, обуславливает развитие местных инфекционно-воспалительных заболеваний.
Для проведения эффективных мероприятий по санации резидентных бактерионосителей целесообразно использование лекарственного препарата, который, с одной стороны, стимулировал бы местный иммунитет и естественную колонизационную резистентность слизистых оболочек макроорганизма, а с другой – снижал персистентные свойства патогена, в частности, его антикарнозиновую активность.
В качестве такого препарата нами был выбран иммуномодулятор Циклоферон, который к тому же снижал персистентный потенциал микроорганизмов (Кириллов Д.А., 2005). В связи с этим мы проверили его влияние на АКрА стафилококков, проведя исследования in vitro и in vivo.
В экспериментальных условиях нами была изучена способность стафилококков к инактивации карнозина под воздействием Циклоферона, полученные результаты представлены в табл. 3.
Таблица 3.
Изменение антикарнозиновой активности стафилококков под
воздействием Циклоферона
| Дни эксперимента | АКрА активность (мг/мл) | |
| Контроль | Опыт | |
| до инкубации | 2,9+0,05 | 2,9+0,05 |
| 1 | 2,8+0,03 | 2,2+0,021,2 |
| 2 | 2,7+0,02 | 2,0+0,011,2 |
| 3 | 2,6+0,03 | 1,7+0,011,2 |
| 4 | 2,7+0,01 | 1,6+0,011,2 |
| 5 | 2,8+0,01 | 1,4+0,021,2 |
| 6 | 2,7+0,01 | 1,2+0,021,2 |
Примечание: 1 - p < 0,01 в опытной группе (к исходу)
2 - p < 0,01 для сравниваемых групп (контроль – опыт)
Среднее значение АКрА у стафилококков опытной группы до инкубирования с Циклофероном и контрольной группы было сходным и составляло 2,9+0,05 мг/мл; после однократного инкубирования с Циклофероном в опытной группе обследуемых способность стафилококков к инактивации карнозина снизилась до 2,2+0,02, в контрольной до 2,8+0,03 мг/мл; на 2 день эксперимента значение АКрА стафилококков составило 2,01+0,01 мг/мл, тогда как в контроле 2,7+0,02 мг/мл. На 3 день – антикарнозиновая активность бактерий в опытной группе составляла 1,7+0,01 мг/мл, в контрольной – 2,6+0,03 мг/мл. На 4 день в опытной группе АКрА продолжала снижаться и составляла 1,5±0,03 мг/мл, тогда как в контрольной равнялась 2,7+0,01 мг/мл. На 5 день эксперимента АКрА стафилококков снизилась до 1,4+0,02 мг/мл, тогда как у стафилококков контрольной группы среднее значение АКрА составляло 2,8+0,01 мг/мл. В результате к 6 дню способность стафилококков инактивировать карнозин была равна 1,2+0,02 мг/мл в опытной группе (р<0,05) и 2,7+0,01 мг/мл в контрольной (р>0,05). Таким образом, антикарнозиновая активность в опытной группе снизилась на 1,7 мг/мл, что составило 58,3+6,5%, а в группе сравнения изучаемый признак был в пределах физиологических колебаний.
Таким образом, проведенный анализ по изучению динамики антикарнозиновой активности стафилококков под воздействием Циклоферона показал однозначное ее снижение.
Исходя из полученных данных, мы предположили, что применяя Циклоферон, вероятно, можно санировать передний отдел носа, снижая число стафилококковых бактерионосителей.
С целью проверки этого положения были проведены наблюдения по действию Циклоферона на динамику стафилококкового бактерионосительства у 20 резидентных бактерионосителей S. aureus.
Среднее значение АКрА у штаммов стафилококков, выделенных до санации, составило 2,9±0,24 мг/мл; на 1 день санации данный признак снизился до 2,9±0,25 мг/мл, ко 2 дню способность носительских штаммов инактивировать карнозин была равна 2,7±0,32 мг/мл. На 3, 4 и 5 дни санации АКрА стафилококков снизилась до 2,2±024, 1,8±0,27 и 1,6±0,25 мг/мл соответственно и к 6 дню составляла 1,4±0,6 мг/мл. Таким образом, за время санации АКрА снизилась на 1,6 мг/мл, что составило 52,7%.
Проведенное через месяц обследование этих же лиц показало, что у половины бактерионосителей золотистый стафилококк заменился на эпидермальный, а у тех лиц, у которых золотистый стафилококк продолжал высеваться, АКрА снизилась до 0,9±0,12 мг/мл. Через два месяца эпидермальный стафилококк высевался у 72% санированных лиц, а способность золотистых стафилококков к инактивации карнозина снизилась до 0,5±0,09 мг/мл.
Таким образом, применение Циклоферона позволяет нормализовать качественные характеристики микробного биоценоза слизистой оболочки носа за счет снижения антикарнозиновой активности у золотистых стафилококков и последующей их элиминации.
Подводя итог проделанной работе, следует отметить, что антикарнозиновая активность, контролирующая длительность пребывания стафилококков в организме, широко распространена среди штаммов разных видов, выделенных от бактерионосителей. Выявленная связь антикарнозиновой активности стафилококков с их персистированием в организме хозяина важна для понимания патогенеза бактерионосительства, связанного с длительным пребыванием возбудителя на слизистой оболочке переднего отдела носа. На основе полученных экспериментальных данных разработан способ дифференциации резидентных бактерионосителей от транзиторных, и использован новый методический подход к отбору препарата для санации стафилококковых бактерионосителей под контролем антикарнозиновой активности.
ВЫВОДЫ
1. Антикарнозиновая активность – широко распространенный признак у стафилококков, зависящий от источника их выделения. Высокие значения АКрА характерны для стафилококков, выделенных из биотопа с высокой концентрацией карнозина (слизистая оболочка переднего отдела носа) по сравнению со штаммами, изолированными из других биотопов от больных инфекционно-воспалительными заболеваниями.
2. Пенетрантность и экспрессия АКрА у стафилококков, выделенных со слизистой оболочки переднего отдела носа, нарастают в ряду: здоровые лица < резидентные бактерионосители < часто длительно болеющие.
3. На модели экспериментальной инфекции установлено, что золотистый стафилококк, обладающий высоким уровнем АКрА (3,0 мг/мл), длительнее выделяется из организма мышей, по сравнению со стафилококком с низкой АКрА (63 и 42 дня соответственно); динамика показателя микробной обсемененности почек находилась в прямой зависимости от исходного уровня антикарнозиновой активности.
4. Установлены адаптивные и реактивные изменения в про- и эукариотических организмах в условиях их взаимодействий: стафилококки с антикарнозиновым признаком вызывают большую деструкцию ультраструктурных компонентов эукариотических клеток, а также снижение их пролиферативной активности и являются более устойчивыми к действию защитных систем эукариот в сравнении со штаммами без признака.
5. Установлено, что ведущим свойством стафилококков, определяющим формирование бактерионосительства, является их антикарнозиновый признак, при этом высокий уровень АКрА у штаммов, вегетирующих на слизистой переднего носа у бактерионосителей, обуславливает развитие местных инфекционно-воспалительных заболеваний.
6. Разработана модель, позволяющая проводить дифференциальную диагностику резидентного и транзиторного бактерионосительства с учетом персистентных свойств стафилококков.
7. Установлена способность Циклоферона снижать антикарнозиновую активность стафилококков in vitro, что позволяет рекомендовать его для санации бактерионосителей.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Антикарнозиновая активность и ее роль в персистенции микроорганизмов / Бухарин О.В., Киргизова С.Б., Карташова О.Л., Потехина Л.П. // Вестник Оренбургского государственного университета. 2006. № 12. С. 23-26.
- Потехина Л.П. Антикарнозиновая активность микроорганизмов, выделенных от больных гнойно-воспалительными заболеваниями // Вестник Оренбургского государственного университета. 2006. № 13. С. 269-270.
- Диагностическое значение персистентных характеристик стафилококков при бактерионосительстве / Карташова О.Л., Киргизова С.Б., Потехина Л.П., Бухарин О.В. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2007. № 5. С. 13-16.
- Киргизова С.Б., Карташова О.Л., Потехина Л.П. Факторы персистенции стафилококков при бактерионосительстве // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва, 2007. С. 111.
- Потехина Л.П. Дифференциация стафилококков с помощью математической модели // Успехи современного естествознания. 2007. № 7. С. 33.
- Потехина Л.П. Роль антикарнозиновой активности при стафилококковом бактерионосительстве // Материалы I международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. Донецк, 2009. С. 298-299.
- Потехина Л.П. Использование персистентных свойств микроорганизмов для дифференциации резидентной и транзиторной микрофлоры // Вестник Оренбургского государственного университета. Оренбург. 2009. № 2. С. 134.
- Способ дифференциации стафилококковой микрофлоры слизистой оболочки носа человека / Карташова О.Л., Киргизова С.Б., Бухарин О.В., Потехина Л.П. // Патент РФ на изобретение № 2318021. Бюл. № 6. 2008.
ПОТЕХИНА ЛИДИЯ ПЕТРОВНА
АНТИКАРНОЗИНОВАЯ АКТИВНОСТЬ СТАФИЛОКОККОВ
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003
Подписано в печать 06.10.2010
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.
