Влияние алкилоксибензолов на ростовые и персистентные характеристики микроорганизмов
На правах рукописи
Гордеева Светлана Валерьевна
ВЛИЯНИЕ АЛКИЛОКСИБЕНЗОЛОВ НА РОСТОВЫЕ
И ПЕРСИСТЕНТНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ
МИКРООРГАНИЗМОВ
03.02.03 – «Микробиология»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Оренбург – 2011
Работа выполнена в УРАН «Институт клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН»
| Научный руководитель: академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор | Бухарин Олег Валерьевич |
| Официальные оппоненты: | |
| доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО Оренбургская государственная медицинская академия Министерства здравоохранения и соцразвития | Усвяцов Борис Яковлевич |
| доктор медицинских наук, профессор ГОУ ВПО Башкирский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения и соцразвития | Габидуллин Зайнулла Гайнулинович |
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и соцразвития
Защита состоится « » 2011 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д. 208.066.03. при Оренбургской государственной медицинской академии по адресу: Россия, 460000, г. Оренбург, ул. Советская, д. 6, телефон: (3532) 40-35-62, факс (3532) 77-24-59, зал заседаний диссертационного совета, официальный сайт: http://www.orgma.ru/
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ОрГМА
Автореферат разослан «___» ______________ 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
д. м. н., профессор Немцева Наталия Вячеславовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Микроорганизмы в развивающихся культурах, колониях и иных структурированных ансамблях связаны между собой сложными системами межклеточных взаимоотношений и для своего выживания широко используют преимущество коллективного поведения (QS), (Г.И. Эль-Регистан, 2006; Ю.А. Николаев, 2007; А.Л. Мулюкин, 2010). Феномен «quorum sensing» бактерий осуществляется различными способами, включая: механический (контактный), (Ю.А. Николаев, 2000); коммуникативный, опосредованный физическими полями, (В.П. Казначеев, А.П. Михайлова, 1981); химический
(А.С. Хохлов, 1988; А.С. Капрельянц, и др. 1993; Г.И. Эль-Регистан, 2005).
В настоящее время активно изучаются механизмы QS-взаимодействий микроорганизмов, в частности, химическая коммуникация, осуществляемая посредством низкомолекулярных соединений различной химической природы, синтезируемых и выделяемых в окружающую среду клетками микробной популяции или их частью (К. Stephens, 1986). В плане определения механизмов выживания микроорганизмов в окружающей среде, интерес представляет изучение d1 - факторов – алкилоксибензолов (АОБ), контролирующих рост микроорганизмов и этапность основных стадий их онтогенетического развития. Продукция d1-факторов клетками бактерий характерна для широкого круга как грамнегативных, так и грампозитивных микроорганизмов
(Г.И. Эль-Регистан, 1988; Е.С. Бабусенко с соавт, 1991; А.Л. Мулюкин, 1996). Алкилоксибензолы являются адаптогенами, проявляют антиоксидантную активность (Ю.А. Николаев и др., 2004), взаимодействуют с ДНК (О.К. Давыдова, 2006), стабилизируют и модулируют активность белков (А.И. Колпаков 2000, Е.И. Мартиросова, 2007). Однако открытым остается вопрос о влиянии алкилоксибензолов на важнейшие физиологические функции выживания бактерий - рост микроорганизмов и их персистентные характеристики, что и предопределило цель нашей работы.
Цель и задачи исследования
Цель исследования - изучение влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов.
Для реализации этой цели были поставлены и решены следующие задачи:
- Изучить влияние алкилоксибензолов на структуру популяции различных микроорганизмов по антилизоцимному признаку.
- Оценить воздействие алкилоксибензолов на популяции грамнегативных и грампозитивных микроорганизмов по способности формировать биопленки.
- Изучить влияние алкилоксибензолов на кинетику роста исследуемых микроорганизмов.
- Выявить особенности структуры популяций условно - патогенной микрофлоры и представителей нормофлоры по персистентным и ростовым характеристикам при влиянии на них алкилоксибензолов.
Новизна исследования
Установлено, что алкилоксибензолы – (метилрезорцин и гексилрезорцин) оказывали влияние на ростовые свойства, антилизоцимную активность бактерий и их способность формировать биопленки.
Предложено использование метода популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на персистентные свойства микроорганизмов (по антилизоцимному признаку и способности образовывать биопленки), выявляющего особенности структурных перестроек популяции условно-патогенных микроорганизмов и представителей нормальной микрофлоры человека.
Установлено, что действие АОБ на популяции условно-патогенных бактерий и представителей нормофлоры по антилизоцимному признаку различалось перестройкой структуры популяции микроорганизмов – более выраженным снижением антилизоцимной активности у условно-патогенных бактерий в сравнении с представителями нормальной микрофлоры.
Выявлена связь структуры алкилоксибензолов с их ингибирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий. Препарат алкилоксибензола с короткой цепочкой алкильного радикала – метилрезорцин (С7-АОБ) вызывал снижение среднего уровня АЛА микроорганизмов за счет появления клонов без антилизоцимного признака и исчезновения клонов с высоким уровнем АЛА, тогда как препарат алкилоксибензола с длинной цепочкой алкильного радикала - гексилрезорцин (С12-АОБ) не изменяя среднепопуляционного уровня АЛА бактерий, увеличивал долю клонов с высокой способностью ингибировать лизоцим, наряду с сохранением числа клонов с отсутствием данного признака.
Изменения ростовых свойств аутохтонных и аллохтонных бактерий и их способности формировать биопленки под воздействием АОБ имели различия, которые характеризовались усилением изученных функций у бифидобактерий и лактобацилл и их угнетением у представителей условно-патогенных микроорганизмов (K. pneumoniae, гемолитическая E. coli,
B. cereus, S. aureus).
Практическая значимость
Полученные в работе данные расширяют теоретические представления о механизмах выживания бактерий под влиянием алкилоксибензолов.
Методика популяционного анализа для оценки влияния алкилоксибензолов на ростовые и персистентные свойства микроорганизмов пригодна для изучения механизмов «quorum sensing» в бактериальных сообществах и может быть использована для отбора и тестирования различных препаратов, в том числе синбиотиков в научно-исследовательских и производственных лабораториях.
Кроме того, полученные данные могут быть использованы для разработки ингибиторов образования биопленок УПМ и веществ, обладающих антиперсистентным действием, пригодных для борьбы с условно-патогенной персистирующей микрофлорой, что открывает перспективу для создания новых синбиотиков с целью коррекции дисбиотических состояний микробиоценозов организма человека.
Положения, выносимые на защиту:
- Алкилоксибензолы регулируют важнейшие физиологические функции выживания бактерий - ростовые и персистентные характеристики, проявляя выраженный дозозависимый эффект.
- В среде культивирования алкилоксибензолы стимулируют рост и биопленкообразование аутохтонной микрофлоры, обеспечивая преимущество её развития по сравнению с аллохтонными бактериями.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на:
- VI Всероссийской конференции «Персистенция микроорганизмов» (Оренбург, 2009).
- XII и XIII Всероссийских научно-практических конференциях по медицинской микологии «Кашкинские чтения» (Санкт-Петербург, 2009, 2010).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК.
Объем и структура диссертационной работы
Диссертация изложена на 143 страницах машинописного текста и содержит введение, обзор литературы, главу с описанием материалов и методов исследования, 3 главы собственных исследований, заключение, выводы и указатель литературы, включающий 111 отечественных и 113 зарубежных источников. Иллюстрации представлены 22 таблицами и 9 рисунками.
Связь работы с научными программами
Диссертационное исследование выполнено по открытому плану НИР, номер регистрации 0120. 0 853339. Отдельные фрагменты исследования выполнены по программе Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», в рамках проекта № 09-П-4-1007 «Механизмы формирования и регуляция ассоциативного симбиоза человека», а также в рамках целевой программы поддержки интеграционных проектов № 09-И-4-3001 «Выявление биомишеней и разработка способов регуляции персистентного потенциала микроорганизмов».
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Материалом для исследования послужили 6 штаммов факультативно-анаэробных и облигатно-анаэробных грампозитивных и грамнегативных микроорганизмов, являющихся представителями условно-патогенной и нормальной микрофлоры кишечника человека. К ним относились эталонные и производственные штаммы Вifidobacterium bifidum № 791 (препарат пробиотик «Бифидумбактерин» ЗАО «Экополис», г. Ковров); Lactobacillus acidophilus №1 (препарат пробиотик «Лактобактерин», ФГУП НПО «Микроген», г. Москва); Klebsiella pneumoniae № 278 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), Bacillus cereus № 279 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), а также клинические изоляты микроорганизмов - гемолитическая Escherichia coli № 101, Staphylococcus aureus № 104.
Клинический штамм Escherichia coli № 101 был изолирован из фекалий пациента при обследовании на дисбиоз кишечника, а культура Staphylococcus aureus № 104 из раны больного с гнойно-воспалительными заболеваниями мягких тканей. Полученные клиничесике изоляты идентифицированы общепринятыми бактериологическими методами по культуральным, морфологическим и биохимическим признакам с использованием коммерческих тест-систем ("ENTEROtest 24", "STAPHYtest 16" (LACHEMA, Чехия).
В качестве химических аналогов микробных ауторегуляторов использовали метилрезорцин (С7-АОБ) и гексилрезорцин (С12-АОБ) из группы алкилоксибензолов, со степенью чистоты 99,9 % («Sigma-Aldrich», США). Рабочий раствор готовили растворением АОБ в этаноле с добавлением 3 % диметилсульфоксида («ДИА М», Испания) до конечной концентрации препарата 1 мг/мл. Из рабочего раствора готовили разведения изучаемых препаратов в LB-бульоне 0,1; 1 и 10 мкг/мл. Среду с АОБ (и без него, но с эквивалентным количеством этанола с 3% DMSO, контроль) разливали в стерильные пробирки по 9,9 мл и вносили 0,1 мл суспензии клеток 1-суточной агаровой культуры бактерий в физиологическом растворе. Конечная концентрация клеток (доводимая по стандарту мутности или по ОП) – 1*104 КОЕ/мл, конечная концентрация этанола не превышала 0,067 %. В качестве контроля использовали взвесь чистой культуры микроорганизмов на LB-бульоне, без добавления АОБ. Посевы инкубировали при температуре 370 С в шейкере-инкубаторе «BioSan» (Латвия) при высоком уровне аэрации культуры (250 об/мин) в течение 9 часов до перехода в стационарную фазу роста. Выросшие микроорганизмы осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин., отделяли надосадочную жидкость и стерилизовали её фильтрованием ( пор 200 мкм). Выделение клонов осуществляли путем рассева суточной бульонной культуры на плотную питательную среду, с последующим определением антилизоцимной активности и способности формировать биопленки. Уровень АЛА оценивали по способности стерильного супернатанта инактивировать лизоцим («Sigma-Aldrich», США), фотометрическим методом по методике О.В. Бухарина (1999 г.). Образование биоплёнок оценивали по способности штаммов к адгезии на поверхности 96-луночных полистироловых планшет (O`Toole G., 2000). Ростовые свойства микроорганизмов изучали фотометрическим методом при помощи 8-канального фотометра Elx 808 («Biotek», США).
Данные были подвергнуты статистической обработке в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы «Биостат» путем подсчета средней арифметической (M) и средней ошибки средней величины (m), вероятность значений разницы (p). Данные по определению влияния алкилоксибензолов на биологические свойства исследуемых бактерий были статистически обработаны параметрическим методом с применением t-критерия Стьюдента. Разница между сравниваемыми величинами считалась достоверной при значении р<0,05 (Гланц С., 1999).
Результаты исследования и их обсуждение
Установлено, что препараты алкилоксибензола (С7-АОБ и С12-АОБ) изменяли популяционную структуру как условно-патогенных микроорганизмов (K. pneumoniae № 278, E. coli № 111, B. cereus № 279,
S. aureus № 104), так и представителей нормальной микрофлоры человека
(L. acidophilus №1, B. bifidum № 791) по антилизоцимному признаку.
Эффект влияния С7-АОБ и С12-АОБ на структуру популяции изучаемых бактерий по антилизоцимному признаку различался. Препарат С7-АОБ снижал средний уровень АЛА условно-патогенных микроорганизмов на 62±2,1% (p<0,05), за счет перестройки популяции в сторону снижения (до полного исчезновения) числа клонов с высоким и средним значением изучаемого признака (рис. 1). Было отмечено увеличение доли клонов с низким значением АЛА и появление доли клонов, не обладающих способностью инактивировать лизоцим. В отличие от С7-АОБ, С12-АОБ не изменял среднепопуляционного уровня изучаемого признака у представителей условно-патогенных микроорганизмов за счет нарастания доли клонов с высоким значением АЛА, а также ростом числа клонов, не обладающих способностью ингибировать лизоцим (рис. 2).
При влиянии С7-АОБ на представителей нормальной микрофлоры были получены аналогичные изменения, но степень снижения АЛА-признака была менее выраженной, чем у представителей УПМ. Средний уровень антилизоцимной активности при влиянии С7-АОБ на представителей нормальной микрофлоры снижался на 26±1,8% (p<0,05) от исходного уровня признака. С12-АОБ, как и в случае УПМ, не изменял среднего уровня выраженности АЛА признака (рис. 3).
Условные обозначения:
1 – контроль (без АОБ) 2 – С7-АОБ 10,0 мкг/мл
| I - K. pneumoniae № 278 | II – E. coli № 111 | III – B. cereus № 279 | IV – S. aureus № 104 |
Рис. 1 - Изменение популяционной структуры УПМ по АЛА под влиянием С7-АОБ
Условные обозначения те же (рис. 1).
1 – контроль (без АОБ) 2 – С12-АОБ 10,0 мкг/мл
Рис. 2 - Изменение популяционной структуры УПМ по АЛА под влиянием С12-АОБ
Условные обозначения:
1 – контроль (без АОБ) 2 – С7-АОБ 10,0 мкг/мл 3 – С12-АОБ мкг/мл
| V – B. bifidum № 791 | VI – L. acidophilus № 1 |
Рис. 3 - Изменение популяционной структуры представителей нормальной микрофлоры по по АЛА под влиянием С7-АОБ и С12-АОБ.
Возможно, что одним из механизмов действия алкилоксибензолов на антилизоцимную активность бактерий может быть связан с изменением конформации АЛА-фактора, являющегося по химической природе анионным белком (В.Ю. Соколов, 1990). В пользу этого предположения свидетельствуют данные о том, что алкилоксибензолы могут функционировать как химические шапероны, стабилизируя структуру и изменяя конформацию белков, обуславливая сопряженные изменения их каталитической активности (И.Ю. Степаненко, 2005; Е.И. Мартиросова, 2007).
Выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся нарастанием изменений структуры популяции исследуемых микроорганизмов по мере увеличения концентрации препаратов в среде. Максимальные изменения перестройки популяции наблюдались при внесении гомологов алкилоксибензола (С7-АОБ и С12-АОБ) в среду культивирования микроорганизмов в концентрации 10,0 мкг/мл, что согласуется с данными, полученными ранее другими авторами (Г.И. Эль-Регистан и др., 1988; Е.И. Мартиросова, 2005;
А.Л. Мулюкин, 2006; Н.А. Голод, 2009).
Химические аналоги алкилоксибензолов (С7-АОБ и С12-АОБ) обладали видонеспецифичным действием в отношении АЛА микроорганизмов, изменяя структуру популяции бактерий, независимо от их видовой принадлежности, что соотносится с данными литературы (А.Л. Маргулис и др., 2001).
Принимая во внимание, что в настоящее время активно изучаются механизмы регуляции образования биопленок (Y.H. Li. et al. 2002; E.P. Greenberg 2003; D. Balestino et al. 2005 и др.), мы изучили влияние химических аналогов алкилоксибензола на биопленкообразование бактерий.
При изучении влияния гомологов алкилоксибензола на биопленкообразование бактерий было установлено изменение среднепопуляционного уровня данного признака и выявлена перестройка популяций грамнегативных и грампозитивных бактерий. Среди условно-патогенных микроорганизмов эффект влияния С7-АОБ и С12-АОБ различался. Присутствие С7-АОБ в среде культивирования приводило к снижению среднепопуляционного уровня биопленкообразования УПМ на 32±2,4% (p<0,05) от исходного уровня выраженности признака за счет перестройки популяции в сторону снижения доли клонов с высокими и средними значениями изучаемого признака и увеличения числа клонов с низкой способностью пленкообразования
(рис. 4). В отличие от С7-АОБ, С12-АОБ не изменял среднепопуляционного уровня биопленкообразования условно-патогенных микроорганизмов, за счет того, что, наряду с увеличением доли клонов с низкими значениями свойства, нарастала численность клонов с высокими показателями биопленкообразования (рис. 5).
Напротив, препараты алкилоксибензолов у микроорганизмов, представителей нормальной микрофлоры стимулировали биопленкообразование в 2 раза. Под действием С7-АОБ и С12-АОБ популяции исследуемых штаммов перестраивалась в сторону увеличения количества клонов с высоким и средним значением изучаемого признака и снижения доли клонов с низкой способностью пленкообразования (рис. 6).
Условные обозначения:
1 – контроль (без АОБ) 2 – С7-АОБ 10,0 мкг/мл
| I - K. pneumoniae № 278 | II – E. coli № 111 | III – B. cereus № 279 | IV – S. aureus № 104 |
Рис. 4 - Изменение популяционной структуры УПМ по способности формировать биопленки под влиянием С7-АОБ
Условные обозначения те же (рис 4).
1 – контроль (без АОБ) 2 – С12-АОБ 10,0 мкг/мл
Рис. 5 - Изменение популяционной структуры УПМ по способности формировать биопленки под влиянием С12-АОБ
Условные обозначения:
1 – контроль (без АОБ) 2 – С7-АОБ 10,0 мкг/мл 3 – C12-АОБ мкг/мл
| V – B. bifidum № 791 | VI – L. acidophilus № 1 |
Рис. 6 - Изменение популяционной структуры представителей нормальной микрофлоры по способности формировать биопленки под влиянием
С7-АОБ и С12-АОБ
Также был выявлен дозозависимый эффект АОБ, характеризующийся нарастанием изменений структуры популяции исследуемых микроорганизмов с увеличением концентрации препаратов в среде культивирования бактерий. Наиболее выраженные изменения структуры популяции изучаемых микроорганизмов по способности образовывать биопленки наблюдались при внесении С7-АОБ и С12-АОБ концентрации препаратов 10,0 мкг/мл.
Таким образом, действие алкилоксибензолов на популяцию условно-патогенных микроорганизмов приводило к угнетению их антилизоцимной активности и биопленкообразования, что в совокупности может способствовать ухудшению колонизации транзиторными микроорганизмами биотопов организма хозяина. Напротив, у представителей нормальной микрофлоры, наряду с незначительным снижением антилизоцимной активности отмечена стимуляция образования биопленок под воздействием обоих препаратов АОБ, что может быть одним из условий, обеспечивающих индигенной микрофлоре преимущество в биотопе толстого кишечника человека.
Интенсивность роста микроорганизмов зависит от присутствия в среде различных факторов как эндо-, так и экзогенного происхождения, которые способны усиливать рост бактерий либо приводить к его угнетению. Одним из таких факторов являются сигнальные метаболиты, основная функция которых заключается в обеспечении межклеточных взаимодействий, а также во взаимодействии микроорганизмов со средой, которое направлено на успешный рост популяции и сохранение вида. В связи с этим, на следующем этапе работы было изучено модифицирующее действие алкилоксибензолов в отношении ростовых свойств аллохтонных и аутохтонных бактерий.
Установлено, что химические аналоги из группы алкилоксибензолов
С7-АОБ и С12-АОБ влияют на кинетику роста грамнегативных и грампозитивных бактерий. Выявлено, что оба препарата оказывали угнетающее действие на ростовые свойства условно-патогенных микроорганизмов, которое проявлялось преждевременным выходом на стационарную фазу роста, наряду с уменьшением длительности лаг- и лог-фаз роста, а также снижением прироста биомассы исследуемых штаммов. На рисунке 7 представлен график по влиянию С7-АОБ на ростовые свойства УПМ на примере K. pneumoniae № 278. Препарат С7-АОБ в концентрациях 0,1; 1,0 и 10,0 мкг/мл угнетал ростовые свойства клебсиелл на 19 %, 43% и 70 % (p<0,05), соответственно. Препарат С12-АОБ оказывал аналогичное влияние на популяции других видов УПМ.
Полученные данные согласуются с результатами работ А.Л. Мулюкина (2006) показавшего, что внесение гомосеринлактонов в начальные фазы роста бактериальных культур индуцировало остановку клеточного деления и ускорял их переход в стационарную фазу. Ингибирование роста микробных культур было видонеспецифическим (бациллы, микрококки, стафилококки и др.), дозозависимым и наблюдалось при переходе клеток в состояние покоя, это может иметь значение при расшифровке механизмов формирования колонизационной резистентности биотопа кишечника человека.
Условные обозначения:
МР – метилрезорцин (С7-АОБ)
Рис. 7 - Кинетика ростовых свойств K. pneumoniae № 278 под влиянием С7-АОБ в различных концентрациях
Условные обозначения:
ГР – гексилрезорцин (С12-АОБ)
Рис. 8 - Кинетика ростовых свойств B. bifidum № 791 под влиянием
С12-АОБ в различных концентрациях
Изучение влияния препаратов алкилоксибензола на рост представителей нормальной микрофлоры человека выявило преждевременный выход культур бифидобактерий и лактобацилл в стационарную фазу, снижение продолжительности лаг- и лог-фаз роста, и увеличение прироста биомассы данных микроорганизмов, отражая стимулирующий эффект препарата.
На рисунке 8 представлены данные кинетической кривой роста
B. bifidum под влиянием С12-АОБ в различных концентрациях. С12-АОБ в концентрации 0,1 мкг/мл не оказывал влияния на рост бифидобактерий в сравнении с контролем, а при увеличении концентрации до 1,0 и 10,0 мкг/мл была отмечена стимуляция ростовых свойств бифидобактерий на 18 и 32% соответственно в сравнении с контролем. В отличие от гексилрезорцина, метилрезорцин вызывал незначительную стимуляцию ростовых свойств у представителей нормальной микрофлоры только при концентрации 10,0 мкг/мл.
Изменения ростовых свойств УПМ и представителей нормальной микрофлоры человека, как и в случае антилизоцимной активности и биопленкообразования бактерий, носили дозозависимый характер: при увеличении концентрации С7-АОБ и С12-АОБ в среде культивирования нарастали изменения ростовых свойств микроорганизмов. Полученные данные согласуются и с результатами других авторов (Н.Г. Лойко, 2003; Н.А. Голод, 2009).
Не исключено, что полученные данные о различном влиянии С7-АОБ и С12-АОБ на популяции представителей нормальной микрофлоры вероятно связаны с различием химической структуры гомологов алкилоксибензола, а именно с длинной цепочкой алкильного радикала молекулы алкилоксибензола, придающего препаратам антиоксидантные свойства (Н.А.Голод, 2007).
Таким образом, соинкубирование таких облигатно-анаэробных микроорганизмов, как бифидобактерии, обладающих высокой чувствительностью к действию кислорода с С12-АОБ, имеющего в сравнении с С7-АОБ более длинную цепь алкильного радикала, способствует увеличению выживаемости аутохтонной микрофлоры в организме хозяина, что подтверждалось и материалами, полученными Н.А.Голод (2007) при моделировании стрессовых воздействий у лактобактерий.
Полученные данные можно использовать как для решения фундаментальных вопросов современной микробиологии, по изучению выживаемости бактерий в организме хозяина, так и для решения прикладных биотехнологических задач, для повышения эффективности культивирования и сохранения промышленных штаммов микроорганизмов, использующихся для создания препаратов пробиотиков.
Таким образом, проведенная работа позволила выделить три основных момента:
- Алкилоксибензолы являются регуляторами таких важнейших физиологических функций бактерий, как ростовые и персистентные характеристики, обеспечивающие выживание аутохтонных и аллохтонных микроорганизмов в биотопах организма хозяина.
- Установлена связь химической структуры алкилоксибензолов с их ингибирующим влиянием на антилизоцимную активность бактерий: уменьшение длины алкильной цепи АОБ способствовало усилению ингибирующего действия данных препаратов на АЛА микроорганизмов.
- Присутствие алкилоксибензолов в среде культивирования обеспечивает преимущество роста аутохтонной микрофлоры и стимулирует ее способность к образованию биопленок, в отличие от аллохтонных бактерий, у которых отмечено угнетение роста и биопленкообразования под действием этих препаратов.
ВЫВОДЫ:
- Химические аналоги из группы алкилоксибензолов оказывали модифицирующее влияние на антилизоцимную активность, биопленкообразование и ростовые свойства микроорганизмов.
- При изучении влияния алкилоксибензолов на биологические свойства изучаемых бактерий был выявлен дозозависимый эффект, характеризующийся нарастанием изменений ростовых свойств и структуры популяции микроорганизмов по антилизоцимной активности, биопленкообразованию микроорганизмов по мере увеличения концентрации препаратов в среде культивирования.
- Препараты алкилоксибензолов способны разнонаправлено воздействовать на кинетику роста изучаемых микроорганизмов, причем эффект влияния препаратов зависит как от их дозы, так и от химического строения.
- Изменение структуры популяции микроорганизмов по антилизоцимному признаку под влиянием метилрезорцина характеризовалось снижением среднего уровня АЛА, за счет перестройки популяции в сторону снижения доли клонов с высоким АЛА признаком, увеличением числа клонов с низким значением АЛА и появлением клонов, не ингибирующих лизоцим. Гексилрезорцин, не изменяя среднего уровня изучаемого признака, способствовал перестройке популяции как в сторону увеличения числа клонов с высоким значением АЛА, так и появления клонов без признака.
- Внесение метилрезорцина в среду культивирования УПМ приводило к перестройке популяции микроорганизмов по их способности формировать биопленки, снижая среднепопуляционный уровень биопленкообразования. Гексилрезорцин не затрагивал изменений среднего уровня биопленкообразования микроорганизмов.
- Выявлены отличия в динамике изменений роста и способности формировать биопленки аутохтонными и аллохтонными бактериями. Отмечено усиление изученных функций у бифидобактерий и лактобацилл и их угнетение у условно-патогенных микроорганизмов (K. pneumoniae, гемолитическая E. coli, B. cereus, S. aureus).
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ:
- Влияние химического аналога внеклеточных микробных ауторегуляторов на антилизоцимную активность бактерий / Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Эль-Регистан Г.И., Николаев Ю.А., Явнова С.В. (Гордеева С.В.), Молостов Е.В., Кириллов Д.А. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. – Москва, 2007, № 6. – С. 3-6.
- Бухарин О.В., Явнова (Гордеева С.В.), Перунова Н.Б. Модификация ростовых свойств Candida albicans под действием алкилоксибензолов // Проблемы медицинской микологии. – Санкт-Петербург, 2008. Т.10, № 2. – С. 30.
- Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Явнова (Гордеева С.В.) Изменение популяционной структуры бактерий по антилизоцимному признаку под влиянием гексилрезорцина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - Москва, 2008, № 6. – С. 7-10.
- Перунова Н.Б., Явнова С.В. (Гордеева С.В.) Влияние внеклеточных ауторегуляторов микробного метаболизма на ростовые свойства Сandida albicans // Сборник материалов второго съезда микологов России «Современная микология в России». – Москва, 2008. - С. 282-283.
- Гордеева С.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Образование биопленок в популяции Сandida albicans под влиянием аутоиндукторов анабиоза // Проблемы медицинской микологии. Санкт-Петербург, 2010. Т.12, № 2. – С. 79.
- Перунова Н.Б., Гордеева С.В., Бухарин О.В. Ростовые свойства, образование биопленок и антилизоцимная активность Bifidobacterium bifidum при воздействии химических аналогов алкилоксибензолов // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. Москва, 2010, № 5. – С. 49-53.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
QS – quorum sensing (чувство кворума)
АОБ – алкилоксибензолы
УПМ – условно-патогенные микроорганизмы
АЛА – антилизоцимная активность
БПО – биоплёнкообразование
С7-АОБ – метилрезорцин
С12-АОБ - гексилрезорцин
ОП – оптическая плотность
Eд.ОП – единицы оптической плотности
ГОРДЕЕВА СВЕТЛАНА ВАЛЕРЬЕВНА
Влияния алкилоксибензолов на ростовые
и персистентные характеристики микроорганизмов
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
___________________________________________________________________
Оригинал макет подготовлен в программе Word for Windows 2003
Подписано в печать 10/03/2011
Формат 60*84/16. Усл.-печ. л. 1,0. Печать оперативная.
Бумага офсетная. Гарнитура Times.
Тираж 100 экз.
