WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Характеристика условно-патогенных микроорганизмов, выделенных при диагностике дисбактериоза толстого кишечника

На правах рукописи

Нилова Людмила Юрьевна

ХАРАКТЕРИСТИКА УСЛОВНО-ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ,

ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ДИАГНОСТИКЕ

ДИСБАКТЕРИОЗА ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Бойцов Алексей Геннадьевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Королюк Александр Михайлович

доктор медицинских наук,

профессор Кветная Ася Степановна

ведущее учреждение: ГОУДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования».

Защита диссертации состоится «24» марта 2009 г. в час. на заседании диссертационного Совета ДМ 208.086.03 при ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Росздрава» (195067, Санкт-Петербург, Пискаревский пр., д. 47).

Автореферат разослан « » февраля 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Бойцов А.Г.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Бактериологический метод диагностики дисбактериоза толстого кишечника широко востребован врачами разного профиля и реализуется во многих лабораториях страны. Результаты исследований служат основанием для назначения препаратов, используемых для коррекции дисбактериоза. Существуют многочисленные рекомендации, описывающие технику проведения таких исследований, разработан отраслевой стандарт ОСТ 91500.11.0004-2003 «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника».

В то же время проблема дисбактериозов вызывает острые дискуссии. Это обусловлено многими причинами, среди которых ведущей является отсутствие достоверных методов его диагностики.

Так, профессор А.Н. Маянский [1999] пишет: «Фактически это дорогостоящее (тем более что тестирование рекомендуется делать в динамике), трудоемкое исследование с невысокой (если не с нулевой) отдачей. Принимая во внимание огромный опыт такого рода исследований, представляется возможным почти безошибочно ставить регламентированный инструкциями диагноз "дисбактериоз", опираясь на клинику». С ним солидарны и многие гастроэнтерологи, подчеркивающие, что препараты типа «Лактулоза», «Бифидумбактерин», «Хилак», а также многие другие, способствующие нормализации состава микрофлоры можно назначить и, не зная количества лактобактерий и бифидобактерий в испражнениях. В то же время, действующий ОСТ 91500.11.0004-2003 провозглашает: «Поскольку дисбактериоз кишечника в ряде случаев протекает бессимптомно, решающее значение при постановке диагноза имеют микробиологические показатели».

В ОСТ 91500.11.0004-2003 приведена информация о содержании в фекалиях здоровых людей 15 групп микроорганизмов, однако, очевидно, это лишь малая доля от числа видов, обитающих в кишечнике человека. Следует признать, что дать исчерпывающую характеристику состава нормальной микрофлоры кишечника невозможно даже в научных, а тем более в практических лабораториях.

По-видимому, надо уделять внимание только тем группам бактерий, количество которых в той или иной степени влияет на тактику коррекции дисбактериоза. Основное внимание при этом должно уделяться условно-патогенным бактериям и грибам, численность которых чрезмерна. Однако критерии оценки значимости отдельных штаммов, выделенных от пациента в генезе дисбиотических нарушений, не разработаны.

При коррекции дисбиотических нарушений кишечной микрофлоры одновременно со стимуляцией «полезной» составляющей микробиоты необходимо подавить микроорганизмы, численность которых чрезмерна. Выбор оптимальной схемы коррекции состава микрофлоры без лабораторных исследований крайне затруднен, однако оптимальный перечень подобных исследований не определён.

Существующее мнение о безвредности пробиотиков для пациента в настоящее время поколеблено [Besselink M.G.H. et al., 2008; Vleggaar F.P. еt al., 2008], а литературные данные об их эффективности не однозначны [Watkinson P.J. еt al., 2007]. Установлено, что пробиотические препараты могут подавлять индигенные лактобациллы пациента [Глушанова Н.А., Шендеров Б.А., 2005]. Способность к адгезии к эпителиальным клеткам хозяина – признанный тест при отборе потенциальных штаммов пробиотиков [Dunne C. et al., 2001]. Однако, адгезивная активность - сугубо индивидуальное свойство: штамм пробиотика, обладающий высокой адгезией к эпителию пациентки «А», может практически не прикрепляться к эпителию «Б» [Бойцов А.Г. и соавт., 2004].

Коррекция состава факультативно-анаэробной части микрофлоры кишечника требует назначения таких препаратов, как бактериофаги и антибиотики. Их правильный выбор не возможен без адекватного лабораторного пособия.



Таким образом, специальные лабораторные тесты могут облегчить правильность выбора пробиотиков и антимикробных препаратов. Необходимость в таких тестах ещё до конца не осознана медицинской общественностью, а техника их выполнения не стандартизирована.

Цель исследования - характеристика условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), выделенных от больных с дисбактериозом толстого кишечника и выбор на её основе лабораторных тестов, необходимых для обеспечения правильного выбора пробиотических и антибактериальных препаратов.

Задачи исследования:

  1. Оценить значимость условно-патогенных микроорганизмов в развитии дисбактериоза толстого кишечника при некоторых патологических состояниях.
  2. Определение факторов колонизации (антилизоцимной активности и адгезивности) УПМ, выделенных при дисбактериозе.
  3. Выбор методов определения чувствительности УПМ к антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и B.cereus.
  4. Определение чувствительности УПМ к антибиотикам, бактериофагам, антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и B. cereus.
  5. Изучение свойств пробиотических микроорганизмов, влияющих на эффективность их применения на фоне избыточной численности УПМ в кишечнике.

Научная новизна. Сопоставлены спектры условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых при дисбактериозе толстой кишки различного генеза. Впервые изучена адгезивность УПМ, выделенных у больных с дисбактериозом толстого кишечника, по отношению к собственным эпителиальным клеткам кишечника. Получена новая информация о чувствительности УПМ указанного происхождения к антибиотикам, бактериофагам и об их антилизоцимной активности. Дана оценка значимости адгезивных и антагонистических свойств пробиотических штаммов, влияющих на эффективность коррекции дисбактериоза толстого кишечника.

Практическая значимость. Предложены схемы выбора препаратов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника на основании данных бактериологического исследования. Показана необходимость внедрения в работу бактериологических лабораторий индивидуального подбора препаратов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника. Показана эффективность фаготерапии при определении чувствительности к бактериофагам до начала лечения. Предложена методика определения антагонистической активности бацилл, входящих в состав эубиотиков. Рекомендованы методы определения антагонистической активности пробиотических микроорганизмов и B. cereus.

Дана оценка значимости адгезивных и антагонистических свойств пробиотических штаммов и B. cereus, влияющих на эффективность коррекции дисбактериоза толстого кишечника.

Материалы работы внедрены в работу бактериологической лаборатории клиник СПбГМА им. И.И. Мечникова больницы Петра Великого, и Санкт-Петербургского научно-исследовательского института эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Получены удостоверения на рационализаторские предложения № 1804, № 1805, № 1806, принятые ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова 05.12.2008 г. к использованию под наименованиями: «Способ определения in vitro адгезивной активности пробиотических препаратов, содержащих лакто- и бифидумбактерии, используемых для коррекции дисбиоза толстого кишечника»; «Способ индивидуального подбора in vitro пробиотических препаратов, содержащих лакто- или бифидумбактерии для коррекции дисбиоза толстого кишечника на основе антагонистической активности, адгезивной активности и биосовместимости»; «Способ индивидуального подбора in vitro пробиотических препаратов, содержащих лакто- или бифидумбактерии для элиминации условно-патогенных микроорганизмов при дисбиозе толстого кишечника на основе антагонистической активности».

Кроме того, результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии ГОУВПО СПбГМА им. И.И. Мечникова для врачей-интернов, ординаторов и слушателей факультета усовершенствования врачей.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Выбор пробиотиков, эубиотиков, антибиотиков и бактериофагов для коррекции дисбактериоза толстого кишечника должен быть индивидуальным, учитывающим особенности организма хозяина и биологических свойств микроорганизма и основываться на данных лабораторных исследований.

2. Разработана схема лабораторного тестирования для выбора препаратов пробиотиков, основанная на определении адгезивных свойств препарата к клеткам эпителия пациента, антагонистических свойств по отношению к индигенным штаммам - представителям его микрофлоры и УПМ, количество которых избыточно. Осуществлен выбор оптимальных методов тестирования.

3. Подтверждена эффективность коммерческих препаратов бактериофагов в отношении условно-патогенных микроорганизмов при условии их выбора на основании обязательного лабораторного тестирования.

4. Разработан метод определения антагонистической активности эубиотиков, который может быть использован для оптимального выбора препарата.

Апробация работы. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ. Основные положения работы доложены на отчетных научно-практических конференциях сотрудников и молодых ученых СПбГМА им. И.И. Мечникова (Санкт-Петербург, 2006, 2007), на четвертой международной конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ имени Пастера и 120-летию Парижского института Пастера «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008), а также в выступлении на 6-й международной Германо-Российской конференции Кох-Мечников «От Ильи Мечникова и Пауля Эрлиха к современным достижениям медицинской науки и практики» (Санкт-Петербург, 2008).

Личный вклад диссертанта. Личное участие автора осуществлялось на всех этапах работы и заключалось в выполнении всех микробиологических исследований, статистической обработке результатов, анализе полученных данных, в обобщении и оформлении результатов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 142 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и практических рекомендаций. Диссертация содержит 27 таблиц и 10 рисунков. В работе использовано 117 отечественных и 79 иностранных источников литературы.





МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования служили условно-патогенные микроорганизмы, выделенные из фекалий больных с дисбактериозом толстого кишечника.

Для бактериологической диагностики дисбактериоза на базе кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии СПбГМА им. И.И. Мечникова нами было проведено обследование 608 человек: группа сравнения- 25 человек, 456 больных с различными патологическими состояниями, 80 детей в возрасте до 1 года и 47 детей от 1 года до шести лет. Все обследовавшиеся взрослые пациенты, находились на лечении в клиниках гастроэнтерологии, урологии и внутренних болезней больницы Петра Великого. Дети до 1 года обследовались нами по направлениям педиатров в связи с изменением характера стула и вздутием живота. Обследование включало определение числа бифидобактерий, бактероидов, лактобактерий, кишечных палочек с типичными и атипичными свойствами, условно-патогенных и патогенных энтеробактерий, неферментирующих грамотрицательных бактерий, стафилококков, гемолитических форм микроорганизмов, энтерококков, дрожжеподобных грибов рода Candida.

Инкубация посевов на плотных средах для выделения лакто- и бифидумбактерий осуществлялась в анаэростатах АЭ-01 (ОАО «НИКИ МЛТ», Санкт-Петербург) и OXOID (England)с использованием газогенерирующих пакетов «Анаэрогаз». Идентификацию анаэробных микроорганизмов осуществляли с помощью ANAEROTEST 23 (Lachema, Чешская республика). Идентификацию условно-патогенных энтеробактерий проводили с использованием общепринятых схем идентификации с использованием ПБДЭ («Диагностические системы», Нижний Новгород), ENTEROTEST 24 (Lachema, Чешская республика), НЕФЕРМтесте (Lachema, Чешская республика), а также сред Гисс. Оценка результатов проводилась в соответствии с нормативами, приведенными в Отраслевом стандарте «Протокол ведения больных. Дисбактериоз кишечника» 91500.11.0004- 2003.

Адгезию УПМ осуществляли на буккальный эпителий больных, у которых были выделены данные микроорганизмы согласно методике Бойцов А.Г. и соавт., [2004]. Антилизоцимную активность определяли по стандартной методике [Бухарин О.В. и соавт., 1985]. Чувствительность к антибиотикам определяли на Мюллер-Хинтон агаре в соответствии с МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам». Определение фагорезистентности проводили на 1,5% питательном агаре по аналогии с методом фагодифференцировки с использованием коммерческих бактериофагов.

Для изучения свойств пробиотиков, влияющих на эффективность элиминации УПМ было использовано 10 коммерческих биопрепаратов: 5 препаратов, содержащих лактобациллы: «Лактобактерин» («Микроген» Пермь); «Лактобактерин» («Имбио» Нижний Новгород); «Лактобактерин» («Иммунопрепарат» Уфа); «Нормофлорин-Л» (ООО «Бифилюкс» Москва), йогурт «Актимель» (Россия) и 5 биопрепаратов, содержащих бифидобактерии: «Бифидумбактерин сухой» («Микроген» Пермь); «Бифидумбактерин» («Экополис» Ковров); «Бификол» («Биомед» им. И.И.Мечникова Московская область); «Нормофлорин-Б» (ООО «Бифилюкс» Москва); «Бифиформ» («Ferrosan» Дания).

Антагонистическая активность пробиотических препаратов была проверена методами отсроченного антагонизма (метод штрихов) [Постникова Е.А. и соавт., 2004], прямого совместного культивирования [Глушанова Н.А. и соавт., 2004], перевернутого агара [Арзуманян В.Г. и соавт., 2005], двуслойного агара [Е.И.Ермоленко и соавт., 2004]. Биосовместимость определялась по аналогии с методом прямого совместного культивирования [Глушанова Н.А., и соавт., 2005].

Для определения антагонистической активности Bacillus cereus была использована специально разработанная методика с использованием питательных сред с антибиотиками.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась в компьютерной оболочке Windows с помощью процессора электронных таблиц Microsoft Office Excel 2003 и программы Биостат [Гланц С., 1999]. Были использованы непараметрические методы сравнения - критерий 2, F – тест, коэффициенты корреляции Пирсона (r) и Спирмена (), однофакторный дисперсионный анализ [Рунион Р., 1982; Гланц С., 1999].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

При обследовании взрослых, страдающих различными формами патологии пищеварительного тракта, инфарктом миокарда, больных, прошедших длительный курс антибиотикотерапии по поводу урологических заболеваний, детей разных возрастных групп с разной частотой отмечались изменения анаэробной составляющей кишечного микробиоценоза. Снижение численности индигенной анаэробной микрофлоры зарегистрировано практически во всех обследованных группах: бифидумбактерий в 472 случаях (81%), бактероидов – в 540 случаях (92,6%), лактобактерий – в 284 случаях (48,7%). Однако в большинстве случаев величина отклонения от нормы была незначительна и сопоставимы с ошибкой метода.

Наиболее часто снижение численности бифидобактерий выявлено в группах с синдром раздраженного кишечника (63 случая – 92,6%), хронического гастродуоденита (28 – 90,3%), неспецифического язвенного колита (42 – 85,7%), и в группе с клиническими симптомами дисбактериоза (71 – 88,8%).

Среди детей в возрасте до 1 года достоверно реже по сравнению с группой сравнения наблюдалось снижение численности лактобактерий: 16 случаев - (20%) против 13 - (52%) в группе сравнения.

Изменения численности УПМ также были выявлены практически у всех групп обследованных больных, причем как на фоне снижения численности индигенной флоры, так и без него. При этом чаще всего наблюдалось увеличение числа условно-патогенных энтеробактерий (УПЭ), которые были выделены у 344 пациентов (59%), при этом ассоциации энтеробактерий были выделены у 130 из них (37,8%). Общее число выделенных культур энтеробактерий составило 455. Среди них: Enterobacter spp. – 159 штаммов (35% от общего числа находок условно-патогенных энтеробактерий), Klebsiella spp. – 113 (24,8%), Citrobacter spp. – 107 (23,5%), Proteus spp. – 49 (10,8%), Hafnia spp. – 17 (3,7%), Morganella spp. – 7 (1,5%), Serratia spp. – 3 (0,7 %).

Наличие гемолитических микроорганизмов выявлено у 82 пациентов (14,1%). Увеличение количества коагулазоотрицательных стафилококков отмечалось в 98 случаях (16,8%), а присутствие золотистого стафилококка – в 83 (14,2%). Дрожжеподобные грибы рода Candida обнаруживались в количествах, превышающих норму у 66 пациентов (11,3%), клостридии – у 28 (4,8%), неферментирующие грамотрицательные бактерии – у 22 (3,8%).

Наибольшее количество изменений выявлено в группе детей до 1 года: у 70 детей (87,5%) выделены УПЭ в количествах, превышающих норму, при этом у 27 (33,8%) они выявлялись в ассоциациях. Увеличение количества коагулазоотрицательных стафилококков отмечалось в 39 случаях (48,8%), появление S.aureus - в 35 случаях (43,8%).

Статистически достоверной взаимосвязи между снижением количества бифидобактерий и увеличением УПМ не выявлено ни в одной из групп. Таким образом, снижение количества бифидобактерий может приводить к избыточному размножению УПМ, но может и не влиять на этот процесс и, напротив, при нормальном содержании бифидобактерий может иметь место увеличение числа УПМ.

Для оценки возможной агрессивности УПМ, выделенных при дисбиозе из фекалий в значимом количестве, было проведено определение способности их к адгезии к эпителиальным клеткам и их антилизоцимной активности.

Объектом для адгезии служили клетки буккального эпителия пациентов, у которых были выделены тестируемые УПМ. Интенсивность адгезии оценивали по 5 бальной системе. Была проведена оценка степени адгезии 118 штаммов УПМ, выделенных у больных с дисбиозом толстого кишечника. Адгезивные свойства проявляли все штаммы УПМ. Однако степень адгезии микроорганизмов варьировала. Так, адгезивная активность у всех штаммов Candida spp. была невелика и находилась в пределах одного балла. Штаммы со степенью адгезии 5 баллов чаще встречались среди коагулазоотрицательных стафилококков (53,3% штаммов), S.aureus (20%) и Enterobacter spp. (20%). Адгезивная активность гемолитических штаммов E.faecalis и E.coli, P.aeruginosa и Klebsiella spp. составляли преимущественно от 1 до 3 баллов. Полученные данные не дают оснований предполагать, что определение адгезивности УПМ может иметь прогностическое значение.

Изучена антилизоцимная активность 178 штаммов УПМ. Большинство выделенных условно-патогенных микроорганизмов обладали ею – 123 штамма, что составляет 69,1%. Из 87 штаммов грамотрицательных микроорганизмов антилизоцимная активность выявлена у 64 культур (73,6% грамотрицательных микроорганизмов), что значительно выше, чем у грамположительных микроорганизмов. Среди штаммов Candida spp. 22 оказались активны (75,9% штаммов).

При анализе частоты встречаемости антилизоцимной активности у разных видов УПЭ максимальная выраженность данного признака выражена у гемолитических штаммов E.coli - 18 штаммов (94,7%), Enterobacter spp. - 15 (78,9%), Klebsiella spp. - 75,9%. что соответствует данным литературы. Наименьшую активность проявляли штаммы Citrobacter spp. и гемолитические штаммы Enterococcus spp. - в 30% и 40% случаев соответственно. Полученные данные указывают на то, что УПМ обладают разным уровнем антилизоцимной активности, однако это часто встречающийся признак, он прогнозируем и не может быть рекомендован для обязательного определения при оценке степени агрессивности УПМ, выделенных при дисбактериозе.

Пробиотики часто служат основным средством для подавления УПМ и коррекции численности резидентной микрофлоры. Наиболее часто применяются препараты на основе бифидо- и лактобактерий. Они должны обладать определенным набором свойств, чтобы конкурировать с УПМ и успешно колонизировать биотоп. К их числу относят антагонистическую активность и способность к адгезии к эпителию.

Для оценки антагонистической активности пробиотических штаммов использовали различные вариации метода отсроченного антагонизма (метод штрихов, метод перевернутого агара, метод двуслойного агара) и метод прямого совместного культивирования (капельная методика). Последнюю методику использовали также с целью оценки антагонистической активности УПМ по отношению к пробиотическим штаммам. В качестве тест-культур изучали 110 штаммов УПМ: по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli и 10 штаммов P.aeruginosa.

При определении антагонизма пробиотических препаратов методом штрихов выявлено незначительное количество чувствительных штаммов УПМ. В отношении штаммов Klebsiella spp антагонистическая активность пробиотических препаратов варьировала от 0 до 15%, в отношении изолятов Citrobacter spp, S.aureus и «атипичной» E.coli от 0 до 10%, среди Enterobacter spp чувствительных штаммов выявлено не было.

Достоинством испытанной методики является очевидная простота. Однако такой подход не позволяет одновременно оценить антагонистическую активность обоих испытуемых микроорганизмов – пробиотика и УПМ, выделенного от данного пациента.

Метод перевернутого агара [Арзуманян В.Г. и соавт., 2005] применяли в нашей модификации: количество микроорганизмов определяли по методу Gold. Препараты бифидобактерий проявляли выраженную антагонистическую активность в отношении Klebsiella spp. (60-100%), «атипичной» E.coli и S.aureus (25-100%). В отношении штаммов Enterobacter spp. и Citrobacter spp. эффективность различных препаратов бифидобактерий была нестабильной - от 0 до 100%. Эффективность препаратов лактобактерий независимо от группы УПМ была существенно ниже – 0-45%.

Метод двуслойного агара [Ермоленко Е.И. и соавт., 2004] использовали в модифицированном нами варианте: на поверхность верхнего слоя приготовленного по стандартной методике агара засевали мерно тест – культуры УПМ по методике Gold. В опыте использованы 10 штаммов пробиотических препаратов лакто- и бифидобактерий. Тестировали по 20 штаммов Enterobacter spp., Klebsiella spp., Citrobacter spp., S.aureus, «атипичной» E.coli. Мощность антагонистического воздействия пробиотических штаммов оценивали по степени интенсивности подавления штаммов УПМ по сравнению с контролем в 3 степенях: 1 – подавление на 1-2 lg, 2 – на 3-4 lg, 3– на 5 и более lg.

Закономерностей в эффективности подавления различных УПМ тем или иным биопрепаратом не выявлено. Антагонистическая активность пробиотических лактобактерий в отношении штаммов Klebsiella spp. варьировала от 30 до 75%, Enterobacter spp. от 15 до 70%, Citrobacter spp. от 0 до 70%, «атипичной» E.coli от 25 до 90% и S.aureus от 20 до 45%; Активность пробиотических бифидумбактерий была так же нестабильной и варьировала в отношении штаммов Klebsiella spp. от 25 до 100%, Enterobacter spp. от 20 до 75%, Citrobacter spp. от 0 до 90%, «атипичной» E.coli от 0 до 60% и S.aureus от 0 до 100%.

Для оценки взаимного влияния пробиотиков и УПМ использовали метод прямого совместного культивирования [Глушанова Н.А. и соавт., 2004], позволяющий определить следующие варианты взаимодействия пробиотика с УПМ: 1) подавление УПМ, 2) угнетение роста пробиотика или 3) отсутствие взаимного влияния.

В подавляющем большинстве случаев (73,1% из 550 тестов) отсутствовало взаимное влияние пробиотика и УПМ. Подавление пробиотика УПМ отмечено в 9,4%, а подавление УПМ пробиотиком в 17,5%. По-видимому, каждый штамм УПМ, выделенный при дисбактериозе в значимом количестве, нуждается в проверке антагонистических свойств в отношении штаммов пробиотиков. В противном случае применение пробиотиков становится неэффективным.

Обращает на себя внимание несовпадение результатов тестирования одного и того же пробиотика в отношении одного и того же набора штаммов УПМ при использовании разных методов выявления антагонистической активности (таб.1).

Таблица 1

Выявление антагонистической активности

пробиотических лакто- и бифидумбактерий разными методами

Метод или их сочетание* Общее количество культур чувствительных к пробиотическим лактобактериям в методе. абс. (%) Общее количество культур чувствительных к пробиотическим бифидубактериям в методе. абс. (%)
1 23 (4,6) 10 (2)
2 100 (18,2) Не проводили**
3 97 (19,4) 260 (52)
4 233 (46,6) 260 (52)
5 327 (65,4) 413 (82,6)

Примечание: * 1 – метод перпендикулярных штрихов, 2 – метод совместного культивирования, 3 – метод перевернутого агара, 4 - метод двуслойного агара, 5 – все методы одновременно;

** - данный метод не использовался для определения антагонизма пробиотических бифидумбактерий

По всей видимости, это связано с многообразной природой антагонизма: накопление в среде культивирования органических кислот (молочной, муравьиной, уксусной) и изменение рН, разная скорость размножения, конкуренция за пищевой субстрат, выработка лизоцима, бактериоцинов, других биологически активных веществ и др. Поэтому, применяя один метод определения антагонизма пробиотика, затруднительно судить о достоверности получаемых результатов, а отрицательный результат не означает отсутствие активности. Одновременное использование нескольких методов определения антагонистической активности повышает эффективность выбора препарата для коррекции микрофлоры кишечника. При этом в случае даже одного положительного результата можно говорить о наличии антагонистической активности пробиотика к изучаемому штамму микроорганизма.

Каждый штамм лактосодержащих пробиотиков нами оценивался четырьмя методиками, а бифидумсодержащих тремя. Антагонистическая активность пробиотиков, содержащих лактобактерии была выявлена с помощью хотя бы одного метода у «Лактобактерина», «Микроген», Пермь по отношению к 49% протестированных штаммов УПМ, у «Лактобактерина», «Имбио», Нижний Новгород - 61%, «Лактобактерина», «Иммунопрепарат», Уфа – 49%, «Нормофлорина-Л» - 83%, лактобактерий из йогурта «Актимель» - 80%.

Антагонистическая активность пробиотиков, содержащих бифидобактерии была выявлена с помощью хотя бы одного метода у «Бифидумбактерина», «Микроген», Пермь, и «Бифидумбактерин», «Экополис», Ковров по отношению к 100% протестированных штаммом УПМ, - «Бификола» - 65%, «Нормофлорина-Б» - 84%, «Бифиформа» - 66%.

В связи с вышеизложенным, рекомендуется использовать несколько методик определения антагонизма, например, капельную методику, методику перевернутого агара и двуслойного агара, а в случае выявления даже одного положительного результата в одном из методов можно говорить о наличии антагонистической активности данного пробиотика к данному штамму микроорганизма.

Одним из важных требований к препаратам пробиотиков является их адгезивная активность [Брилис В.И. и соавт., 1982; Бершадская Е.Д. и соавт., 1986; Schillinger U. et al., 2005]. Предполагается, что эффективность адгезии и дальнейшего приживления пробиотических штаммов зависит от соответствия рецепторов штамма пробиотиков рецепторам эпителиальных клеток.

Оценивали адгезивную активность пробиотических штаммов к эпителиальным клеткам конкретных пациентов с использованием 10 коммерческих препаратов. Объектом адгезии служили клетки кишечного эпителия, забранные с помощью ректальной петли. Параллельно использовали буккальный эпителий этих же больных, чтобы сравнить степень адгезии на двух типах эпителия и оценить возможность использования буккального эпителия вместо кишечного в качестве тест-объекта.

При сравнительном анализе различий в результатах, полученных на сопоставляемых тест-объектах (буккальном и кишечном эпителиях), взятых у 11 пациентов, проводили с помощью двухвыборочного F–теста для дисперсии для каждого препарата и каждого пациента отдельно, учитывая количество адгезированных микроорганизмов на каждой из пяти клеток одного вида эпителия. В настоящем исследовании было показано, что в 94,4% случаях (в 85 опытах) была доказана недостоверность различий между двумя выборками, степень прикрепления к разным видам эпителия одно пациента была сопоставима (F-критерий составил от 0,004 до 6,205 при критическом F=7,71; =0,05 (dF = 5, критерий односторонний). Для определения силы взаимосвязи между количеством адгезированных пробиотических микроорганизмов на буккальном и кишечном эпителиях результаты обрабатывали методами корреляционного анализа - определения коэффициента корреляции Пирсона (r) и Спирмена (). Наблюдалась сильная достоверная корреляционная взаимосвязь между степенью адгезии к буккальному и кишечному видам эпителия: коэффициент линейной корреляции (r) колебался от 0,7 до 1, коэффициент ранговой корреляции Спирмена – от 0,6 до 1 (P >0.05).

Таким образом, независимо от типа препарата, степень его адгезии зависит не столько от типа эпителия, сколько от соответствия рецепторам эпителия конкретного пациента, что свидетельствует о возможности использования оценки степени адгезии пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий к клеткам буккального эпителия для представления об их адгезивной способности по отношению к кишечному эпителию пациента.

Проверяли адгезивность пяти биопрепаратов лактобактерий и пяти бифидумбактерий к буккальному эпителию 20-ти пациентов (200 опытов). Интенсивность адгезии пробиотических микроорганизмов оценивали в баллах от 1 до 5 в зависимости от количества прикрепившихся микроорганизмов. В целом адсорбция экзогенных лакто - и бифидобактерий достаточно низка и находится в пределах 1-2 баллов.

Для оценки значимости разницы степени адгезии разных пробиотических препаратов к эпителию больного использовали однофакторный дисперсионный анализ. Было доказано, что каждый из пробиотических штаммов обладает индивидуальной адгезивной активностью (F-критерий составил от 3,5 до 45; при F критическом равном 3,48; =0,05; dF = 5, критерий односторонний) (рис. 1).

Л1, Л2, Л3, Л4, Л5 – пробиотические препараты, содержащие лактобактерии; Б1, Б2, Б3, Б4, Б5 – пробиотические препараты, содержащие бифидобактерии

Рис. 1. Сравнение адгезивной активности пробиотиков к буккальному эпителию разных пациентов.

Для оценки биосовместимости лактобактерий и бифидумбактерий, входящих в состав коммерческих пробиотических препаратов, и индигенных лакто - и бифидумбактерий, выделенных от больных с дисбиозом толстого кишечника, использовали метод совместного культивирования на плотной питательной среде [Глушанова Н.А., Шендеров Б.А, 2005]. В сумме подавление индигенных лактобактерий пробиотическими штаммами было зарегистрировано в 53,8% случаев, а бифидобактерий – в 33,1% (таб.2).

Таблица 2

Взаимоотношения индигенных лактобактерий и бифидумбактерий

с пробиотическими штаммами при их совместном культивировании

Подавление роста индигенных штаммов «Лактобактерин» Пермь «Лактобактерин» Н.Новгород «Лактобактерин» Уфа «Нормофлорин-Л» йогурт«Актимель» «Бифидумбактерин»Пермь «Бифидумбактерин»Ковров «Бификол» «Нормофлорин-Б» «Бифиформ»
Лактобактерий абс. (%) 2 (13) 2 (13) 13 (81) 12 (75) 11 (69) 12 (75) 13 (81) 2 (25) 11 (68) 8 (50)
Бифидобактерий абс. (%) 3 (25) 2 (17) 7 (58) 8 (66) 5 (41) 7 (58) 8 (66) 3 (25) 5 (41) 5 (41)

Таким образом, для прогнозирования эффективности того или иного пробиотического препарата в отношении конкретного пациента рекомендуется проводить комплексное лабораторное тестирование нескольких пробиотиков по следующим направлениям:

  1. определение антагонистической активности пробиотических штаммов несколькими способами в отношении условно-патогенного микроорганизма, выделенного от конкретного пациента;
  2. определение адгезивной активности пробиотических штаммов с использованием буккального эпителия конкретного пациента;
  3. определение биосовместимости пробиотических и индигенных лакто- и бифидумбактерий.

Для подавления избыточной численности УПМ могут применяться антибиотики и бактериофаги. Для оценки оправданности их применения проанализированы антибиотико- и фагорезистентность выделенных при дисбактериозе толстого кишечника УПМ. В результате оценки 256 штаммов показано, что антибиотикорезистентные УПМ встречаются относительно редко, но спектр антибиотикорезистентности отдельных видов не предсказуем. Среди энтеробактерий наиболее высокие уровни резистентности зарегистрированы по отношению к ампициллину и тетрациклину (более 30% устойчивых штаммов), среди S.aureus - по отношению к бензилпенициллину, макролидам и тетрациклину (более 15% устойчивых штаммов).

Для оценки целесообразности применения бактериофагов для лечения дисбактериоза определяли чувствительность УПМ к моно- и комбинированным препаратам бактериофагов, присутствующим в настоящее время на отечественном рынке. Следует обратить внимание на то, что одна и та же культура может отличаться по чувствительности к препаратам с одинаковым названием, но выпускаемыми разными производителями, поэтому назначение фагов без предварительного определения чувствительности может привести к неэффективности терапии.

Контроль эффективности фаготерапии предварительно подобранными фагами был проведен у 25 больных. При повторном исследовании, проведенном спустя 2 недели после лечения подобранными бактериофагами, элиминации удалось достигнуть у 80% обследуемых, а у 12%) снизился титр ранее выделенных УПМ.

Для коррекции измененного микробиоценоза кишечника нередко используют эубиотики. Наиболее часто в состав эубиотиков входят представители рода Bacillus.

Антагонистическую активность бацилл оценивали на примере штамма Bacillus cereus, входящего в состав препарата «Бактисубтил» (Франция) – одного из наиболее широко применяемого во многих странах. В качестве тест-культур изучали штаммы УПМ, изолированные от пациентов с дисбактериозом толстого кишечника – по 20 изолятов S.aureus, S.epidermidis, Klebsiella spp., E.coli с типичными свойствами, E.coli с измененной ферментативной активностью, Enterobacter spp., Citrobacter spp., P.aeruginosa.

При определении антагонизма бацилл методом штриха изучаемый штамм B.cereus не проявлял активности в отношении ни одной из тест-культур. Некоторые активно подвижные штаммы УПМ (P.aeruginosa и E.coli) росли на поверхности бациллярных колоний.

Считается, что метаболиты бацилл оказывают более мощное антагонистическое действие, нежели живые культуры, поэтому использовали методику отсроченного антагонизма с промежуточной убивкой штамма-продуцента хлороформом [Блинкова Л.П., 2003]. При наличии способности продуцировать бактериоцины должна наблюдаться зона ингибиции роста тест-штамма вокруг колонии B.cereus. Антагонистическая активность бацилл не выявлена, т.к. отмечался рост тест-культур УПМ «газоном» на поверхности среды с предполагаемыми бактериоцинами. Аналогичные данные были получены методом двуслойного агара с посевом бацилл газоном с последующей убивкой и наслаиванием тест-культуры УПМ.

В связи с этим нами была разработана методика определения антагонистической активности путем высева на плотную среду после совместной инкубации штамма-продуцента и тест-культуры в физиологическом растворе. Предложена плотная питательная среда для подавления эубиотического штамма B.cereus без ущерба для всхожести тест-культур.

1 мл суспензии тест-культур УПМ в физиологическом растворе в концентрации 109 клеток по ОСО мутности смешивали с 1 мл суспензии Bacillus cereus в такой же концентрации. Во избежание размножения бацилл или УПМ использование любых жидких питательных сред для совместной инкубации сочли нецелесообразным. Смесь инкубировали 48 ч при 37оС. Предполагалось, что в течение этого времени происходило отмирание УПМ под влиянием метаболитов бацилл. Проводили количественный высев мерной петлей диаметром 3 мм и емкостью 2 мкл по Gold. Высевали на питательный агар с антибиотиками для подавления бацилл и на среду без антибиотиков для контроля роста культур обоего типа. Для исключения других возможных факторов подавления роста УПМ и бацилл (отсутствие питательной основы) параллельно проводили контрольный высев монокультур после инкубации в аналогичных условиях.

С использованием предложенной среды с антибиотиком изучали антагонизм Bacillus cereus и 96 культур УПМ, выделенных в значимом количестве при диагностике дисбактериоза кишечника: Citrobacter spp. (16 штаммов), Klebsiella spp. (17), S.aureus (18), Enterobacter spp. (15), типичная E.coli (15), E.coli с атипичными свойствами (15). Следует отметить, снижение количества УПМ было незначительным – на 0,5-2 lg. Устойчивыми и даже способными к размножению в присутствии эубиотика оказались 79,0% (81 изолят) испытуемых штаммов. Т.к. эубиотики не предназначены для заселения кишечного биотопа и подразумевается, что их действующим началом является способность к мощному антагонизму, выбор эубиотика, вероятно, должен быть лабораторно обоснованным и дифференцированным в зависимости от спектра его антагонистической активности.

ВЫВОДЫ:

  1. Глубина дисбиотических нарушений во многом определяется условно-патогенными микроорганизмами и их ассоциациями. Наиболее часто при дисбиотических состояниях в испражнениях увеличивается численность условно-патогенных энтеробактерий (59% случаев), в том числе Enterobacter spp. (35% от общего числа находок условно-патогенных энтеробактерий), Klebsiella spp. (24,8%), Citrobacter spp. (23,5%), Proteus spp. – (10,8%).
  2. Ряд штаммов условно-патогенных бактерий выделенных от больных с дисбактериозом обладал важными факторами колонизации: адгезивными свойствами и антилизоцимной активностью. Наиболее высокая адгезивность была выявлена у стафилококков. Штаммы с антилизоцимной активностью были выделены у E.coli (94,7%), коагулазоотрицательных стафилококков (78,6%), клебсиелл (75,9%), грибов рода кандида (75,9%) и гемолитических штаммов стафилококков (60,6%).
  3. Выбор пробиотических препаратов должен основываться на предварительном лабораторном тестировании, включающее определение адгезивных свойств препарата к клеткам эпителия пациента, антагонистических свойств по отношению к индигенным штаммам - представителям его микрофлоры и условно-патогенным микроорганизмам, количество которых избыточно.
  4. Уровень чувствительности выделяемых при дисбактериозах условно-патогенных бактерий к антибактериальным препаратам, бактериофагам и эубиотикам является штаммовым признаком, что требует лабораторного тестирования каждого изолята перед назначением лекарственного препарата для его элиминации.
  5. Назначению бактериофага обязательно должно предшествовать лабораторное тестирование выделенных штаммов на фагорезистентность с препаратами нескольких производителей. Коммерческие препараты лечебных бактериофагов активны в отношении большинства штаммов соответствующих им условно-патогенных бактерий. Их применение позволило в 80% случаев добиться элиминации, а в 12% - снижения численности нежелательных микроорганизмов.

Практические рекомендации

  1. При исследовании испражнений с целью выявления дисбиотических изменений необходимо особое внимание уделять условно-патогенным микроорганизмам.
  2. Назначению пробиотиков должно предшествовать их лабораторное тестирование:
  1. Для определения адгезивной активности целесообразно использовать буккальный эпителий пациента;
  2. Антагонизм пробиотика к индигенным бифидум- и лактобактериям оптимально определять методом биосовместимости;
  3. Для выявления антагонистического действия пробиотика на условно-патогенные бактерии оптимальным является параллельное использование двух или более методов: перевернутого агара, двуслойного агара и капельной методики.

3. Для коррекции дисбиотических состояний целесообразно использовать коммерческие препараты бактериофагов. При лабораторной диагностике дисбактериоза целесообразно определять чувствительность выделенных условно-патогенных энтеробактерий одновременно к нескольким коммерческим препаратам бактериофагов соответствующей специфичности.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Нилова Л.Ю. Возможность использования лечебного питания для коррекции нарушений микробиоценоза кишечника больных гастроэнтерологической патологией / Н.В. Барышникова, В.В.Петренко, Н.А. Орлова, Е.А. Нилова, Л.Ю. Нилова. // Врач-Провизор-Пациент 2005: материалы 3-й Санкт-Петербургской Медицинской Ассамблеи. – СПб, 2005. - С. 10-11.

2. Нилова Л.Ю. Оценка эффективности пробиотика "Ламинолакт" в лечении больных хроническим гастродуоденитом и дисбиозом кишечника / Н.В. Барышникова, И.А. Лоева, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. -2006. - №1-2. - С. М12.

3. Нилова Л.Ю. Здоровье и болезнь: клинико-микробиологические особенности микробиоценоза кишечника / Ю.П. Успенский, Н.В. Барышникова, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова, Л.Н. Белоусова // Донозология - 2006. Проблемы диагностики и коррекции состояния здоровья в напряженной экологической среде обитания: материалы второй международной научной конференции, посвященной 80-летию со дня рождения академика АМН СССР (РАМН), профессора Г.И. Сидоренко, СПб, 2006. - С. 56-58.

4. Нилова Л.Ю. Бактериофаги: монография / А.Г. Бойцов, В.П. Иванов, О.Н. Ластовка, А.А. Порин, К.Г. Косякова, Л.Ю. Нилова / под ред. В.П. Иванова. – СПб: СПбГМА им И.И. Мечникова.-2006. – 100 с.

5. Нилова Л.Ю. Фаготерапия дисбактериоза кишечника / Л.Ю. Нилова, Е.А. Оришак, С.Л. Ильинская // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова - 2007. - №1. (приложение) - С. 152-153.

6. Нилова Л.Ю. Дисбактериоз: проблемы и возможные пути решения / А.Г. Бойцов, Е.А. Оришак, Л.Ю. Нилова. // Материалы Всероссийской научной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии» (ХХХХ юбилейная конференция "Хлопинские чтения"), СПб, 2007. - С.33-38.

7. Нилова Л.Ю. Оценка микробного пейзажа при дисбактериозе кишечника у взрослых и детей / Л.Ю. Нилова // Материалы Всероссийской научной конференции «Современные проблемы медицинской микробиологии» (ХХХХ юбилейная конференция "Хлопинские чтения"), СПб, 2007. - С.235-237.

8. Нилова Л.Ю. Рекомендации по ведению преаналитического этапа микробиологических лабораторных исследований: учебно-методическое пособие / А.Г. Бойцов, Л.А. Кафтырева, О.Н. Ластовка, Ю.А. Чугунова, Л.Ю. Нилова, А.М. Пустынникова, В.Л. Эмануэль; под. ред. А.Г. Бойцова.–Тверь: ООО «Издательство «Триада», 2007.– 64 с.

9. Нилова Л.Ю. К вопросу о применении бактериофагов при дисбактериозе толстого кишечника / Л.Ю. Нилова, Е.А. Оришак // Вестник Российской Военно-медицинской академии. – СПб, 2008. - № 2, Ч. I. (приложение) - С. 128-129.

10. Нилова Л.Ю. Дисбиотические нарушения микрофлоры толстого кишечника: проблемы диагностики и коррекции / А.Г. Бойцов, Л.Ю. Нилова, Е.А. Оришак // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2008. - №3. - С. 120-123.

11. Нилова Л.Ю. К вопросу о применении пробиотиков для коррекции дисбактериоза толстого кишечника / Л.Ю. Нилова, А.Г. Бойцов, Е.А. Оришак // Вестник СПбГМА им. И.И. Мечникова. - 2008. - №3. - С. 154-157.



 





<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.