WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Процессы окрашивания биологических объектов растворами индоцианина зеленого

На правах рукописи

Кулябина Татьяна Валериевна

ПРОЦЕССЫ ОКРАШИВАНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТОВ РАСТВОРАМИ ИНДОЦИАНИНА ЗЕЛЕНОГО

03.00.02 – биофизика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата физико-математических наук

Саратов 2006

Работа выполнена на кафедре оптики и биомедицинской физики

Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Научный руководитель: доктор физико-математических наук, профессор

Кочубей Вячеслав Иванович

Официальные оппоненты доктор физико-математических наук, профессор

Березин Валентин Иванович

кандидат химических наук,

Федоров Евгений Евгеньевич

Ведущая организация Саратовский государственный медицинский университет, г. Саратов

Защита диссертации состоится 3 апреля 2007г. в 15 часов 30 минут

на заседании диссертационного совета Д. 212.243.05

при Саратовском государственном университет им. Н.Г. Чернышевского

по адресу: 410026, г. Саратов, ул. Астраханская, 83.

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной Научной библиотеке

Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского

Автореферат разослан «__» _________ 2007г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Дербов В.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В качестве одного из типов оптических индикаторов при диагностике заболеваний в медицинской практике широкое применение нашли органические красители. Одним из таких красителей является индоцианин зеленый (ICG). ICG, применяемый ранее в фотодинамической терапии, в настоящее время активно используется в самых различных областях медицины: онкологии, офтальмологии, определения объема крови, исследования функции печени, ангиографии, а также флуоресцентных исследований ферментов и протеинов, хирургии, диагностики, косметологии и др.

Внедрение органического красителя индоцианина зеленого в медицинскую практику обусловлено значительным коэффициентом поглощения в спектральной области, совпадающей с областью излучения хирургических лазеров, а также близостью спектральных положений максимума его поглощения и изобестической точки для поглощения гемоглобина в районе 800 нм. Важным является также низкая токсичность и быстрое выведение красителя из организма.

ICG может вступать во взаимодействие с компонентами биологических тканей и крови. Одним из проявлений такого взаимодействия является смещение положения максимума полосы поглощения красителя. Например, при связывании с альбумином крови происходит смещение в длинноволновую область до 805 нм. Однако, изменения спектров поглощения ICG, вызванные его взаимодействием с биологическими тканями при их окрашивании, в настоящее время исследованы недостаточно.

В спектрах поглощения ICG наблюдаются две полосы поглощения, при этом длинноволновая полоса соответствует поглощению мономера, коротковолновая – димера красителя. В водных растворах красителя димеризация наблюдается уже при концентрациях 110-7 моль/см3. При высоких концентрациях зависимость эффективности поглощения света красителем от его концентрации нелинейна, т.к. при больших концентрациях в воде краситель имеет тенденцию к агрегации в крупные частицы, как в водных растворах, так и в плазме человека. Более того, интенсивность и положения полос поглощения ICG зависят от используемых растворителей.

При использовании ICG часто применяются растворы сложного состава: не просто раствор ICG, например, в воде, а с добавлением различных веществ. Используемые растворы имеют спектральные характеристики, отличные от характеристик чистых растворов ICG. В то же время, исследования эффективности воздействия светового (лазерного) излучения на объект чаще всего проводятся одновременно с оценкой амплитуды и положения спектров поглощения ICG в растворе, или же в исследуемом объекте. Такие оценки обусловливают необходимость исследований изменений спектров растворов ICG при смене растворителя или же изменении концентрации красителя с последующим изучением взаимодействия применяемого раствора с биологическим объектом. Таким образом, возникает необходимость исследования спектральных характеристик красителя в зависимости от его окружения.

Цель работы

Основной целью настоящей диссертационной работы являются in vivo и in vitro исследования процессов взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого с биологическими объектами и составляющими их молекулами методами спектрофотометрии и хроматографии.

Для достижения поставленной цели был решен ряд промежуточных задач:

– исследование закономерности изменения спектров поглощения растворов индоцианина зеленого в зависимости от метода приготовления раствора: используемого растворителя или смеси растворителей, а также концентрации красителя и метода окрашивания;

– исследование поведения красителя в физиологическом растворе и растворах поваренной соли в разных концентрациях;

– выявление причин изменения спектров поглощения ICG при его взаимодействии с молекулярными компонентами эпидермиса кожи человека или волос при их окрашивании in vivo или in vitro;

– определение основного механизма, обусловливающего окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем индоцианином зеленым;

– исследование эффективности окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов;

– установление влияния взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации;

– решение вопроса о безопасности растворов индоцианина зеленого для живых организмов;

– экспериментальное определение степени диффузии красителя в различных материалах хроматографическими методами.

Научная новизна

Научная новизна определяется комплексом впервые выполненных исследований и полученных результатов, которые сводятся к следующему:

– с целью выяснения механизмов взаимодействия молекул органического красителя индоцианина зеленого с различными типами растворителей получены новые данные о воздействии на смещение максимума полосы поглощения следующих параметров: влиянии состава растворителя и концентрации красителя, влиянии полярности раствора, связи положения полос поглощения с показателем преломления растворителя, поведении индоцианина зеленого в составе физиологического раствора;

–получены данные об изменении спектров поглощения индоцианина зеленого вследствие взаимодействия молекул красителя с поверхностными слоями эпидермиса, волосами, плазмой и сывороткой крови человека; и их макромолекулами – кератином кожи и волос, меланином, альбумином;

– получены данные об эффективности переноса молекул красителя индоцианина зеленого внутрь ткани биообъекта.

Практическая значимость результатов

Полученные результаты могут быть использованы при разработке методов лечения и диагностики человека как при использовании индоцианина зеленого, так и, используя полученные закономерности, других красителей. Кроме того, материалы работы могут быть использованы в учебном процессе.

Достоверность результатов

Достоверность результатов представленных в данной работе экспериментов подтверждается их воспpоизводимостью, сопоставлением с экспериментальными и теоретическими данными, опубликованными другими исследователями, использованием стандартных методик регистрации спектральных характеристик исследуемых образцов, а также учетом систематических и случайных погрешностей.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту

1) Растворимость индоцианина зеленого в физиологическом растворе резко снижается по сравнению с растворимостью в воде, что приводит к агрегации красителя и выпадению осадка при концентрациях от 0.01 до 1 мг/мл.

2) Спектральные характеристики окрашенной ткани зависят от взаимодействия красителя с данной тканью и не зависят от используемого растворителя. Выбор растворителя влияет только на глубину окрашивания.

3) Впервые получены спектры поглощения волос человека, окрашенных растворами индоцианина зеленого. При взаимодействии индоцианина зеленого с веществом волос полосы поглощения красителя смещаются в длинноволновую область спектра на 23±5 нм для мономеров и 33±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах.

4) Смещение полос поглощения индоцианина зеленого в область больших длин волн при его взаимодействии с меланином составляет 42±5 нм для мономеров и 32±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы докладывались на российских и международных научных конференциях:

– 5-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (2–5 октября 2001)

– 7-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (7–10 октября 2003)

– 8-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (21–24 сентября 2004)

– Третий международный оптический конгресс «Оптика – XXI век» конференция «Фундаментальные проблемы оптики – 2004», Санкт – Петербург, Россия, (18– 21 октября 2004 г)

– II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2005», Москва, Россия (21–24 июня 2005)

– 9-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (27–30 сентября 2005).

Личный вклад соискателя

Личный вклад соискателя состоит в соучастии в постановке исследовательских задач, проведении экспериментальных работ и обработке и частичной интерпретации полученных результатов.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, четырех глав и библиографического списка, состоящего из 128 наименований. Общий объем текста составляет 156 страниц текста, включающего 9 таблиц и 67 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность выбранной темы диссертационной работы, ее новизна и практическая значимость, определена цель работы, представлены основные результаты, полученные в ходе работы и основные положения, выносимые на защиту.

Первая глава диссертации носит обзорный характер. В ней рассматриваются как характеристики, общие для класса цианиновых красителей, так и специфические особенности и основные физико-химические свойства индоцианина зеленого, благодаря которым данный краситель получил широкое распространение. Особое внимание уделено процессам агрегации красителя, вследствие того, что эти процессы играют важную роль в формировании смещения максимума положения полосы поглощения растворов красителя. Также рассматриваются способы применения индоцианина зеленого в медицинской практике, исходя из которых была поставлена часть исследовательских задач, решаемых в выполняемой работе. Рассматриваются существующие разногласия в вопросах поведения спектральных характеристик красителя в растворах различных составов. Обосновывается необходимость исследования зависимостей изменения спектральных характеристик растворов индоцианина зеленого при окрашивании ими in vitro и in vivo биообъектов, таких как кожа, волосы и плазма крови человека, а так же наличие или отсутствие взаимодействия индоцианина зеленого с меланином.

Во второй главе приводятся результаты исследований взаимодействия молекул индоцианина зеленого с различными типами растворителей в зависимости от метода приготовления раствора: используемого растворителя или сложной смеси растворителей, наличия примесей, а также концентрации красителя в растворе.

В разделе 2.1. описывается методика проведения экспериментов, и приводятся основные полученные результаты. Из полученных спектров поглощения водного, спиртового и глицеринового растворов индоцианина зеленого следует, что положение, полуширина и соотношение интенсивностей двух полос поглощения растворов различаются в зависимости от типа растворителя. В проведенных экспериментах концентрация красителя в растворах менялась от 0.01 до 1 мг/мл. В водных растворах преобладают димеры красителя, причем положение и соотношение амплитуд полос зависит от концентрации. Лишь при концентрации 0.01 мг/мл начинает преобладать полоса поглощения мономера.

При использовании в качестве растворителей глицерина или этанола в спектрах растворов с аналогичными концентрациями ICG наблюдается общее смещение полос поглощения в длинноволновую область. При этом поглощение мономера красителя преобладает. При изменении концентрации красителя без добавления воды положение полос и соотношение их амплитуд остается неизменным. Разбавление использованных в эксперименте растворителей водой в соотношении 1:1, как правило, снижает коэффициент поглощения этого раствора и смещает максимумы поглощения в коротковолновую область. Амплитуды полос поглощения выравниваются. Исключением является этанол: при разбавлении его водой в соотношении 1:1 соотношение между амплитудами двух полос поглощения больше, чем для раствора с той же концентрацией красителя, но без добавления воды. При дальнейшем разбавлении исходных растворов водой (с уменьшением концентрации ICG в растворах до 0.1 мг/мл) форма спектров этих растворов становится похожа на форму спектров водного раствора ICG при аналогичной концентрации красителя.

Из полученных данных следует, что при использовании чистых растворителей зависимость положения спектральных полос от концентрации красителя очень слабая. Степень димеризации красителя в водных растворах увеличивается с ростом его концентрации, в спиртовых растворах такая зависимость отсутствует. Полученные закономерности согласуются с литературными данными: в то время как в водных растворах ICG димеризацию наблюдали при концентрациях красителя свыше 110-4моль/дм3 (0.075 мг/мл), в спиртовых растворах вплоть до концентраций 210-3моль/дм3 (1.55 мг/мл) в спектрах преобладает полоса поглощения мономеров. При увеличении концентрации ICG в спиртовых растворах образуются близко расположенные пары молекул красителя: молекулы спирта препятствуют созданию димеров.

Рис. 1. Спектры поглощения ICG, растворённого в водных растворах глицерина с концентрацией 1, 0.1 и 0.01 мг/мл

Рис. 2. Спектр поглощения ICG, растворённого: в водных растворах этанола с концентрацией 1, 0.1 и 0.01 мг/мл

Исходя из наших данных, в водно-спиртовых растворах, в зависимости от соотношения концентраций растворителей и ICG, положение полос изменяется сложным образом. Из полученных спектров для смесей растворителей следует, что, если соотношение воды и спирта (или глицерина) не ниже 1/1, определяющим фактором является влияние спиртов. При повышении концентрации воды в смеси происходит смещение полос поглощения в коротковолновую область и резкое увеличение степени агрегации молекул (Рис 1, 2). Таблица 1 демонстрирует все основные полученные в этом разделе результаты.

Таблица 1.

Зависимость спектральных характеристик растворов индоцианина зеленого от растворителя и концентрации красителя

Растворитель Концентра-ция ICG, мг/мл Коротковолновая полоса Длинноволновая полоса Отношение амплитуд Ад/Ам
, нм Амплитуда Ад, отн. ед. , нм Амплитуда Ам, отн. ед.
Спирт 0,01 727 0,0086 789 0,027 0,32
0,1 725 0,056 788 0,19 0,3
1,0 731 0,54 788 1,64 0,33
Вода 0,01 710 0,0073 783 0,0037 1.97
0,1 697 0,085 779 0,042 2.02
1,0 696 1,04 778 0,3 3.47
Глицерин 0,01 732 0.015 795 0,032 0.47
0,1 729 0,084 795 0,29 0,29
1,0 738 0,667 798 1,31 0,51
Спирт+вода (1/100) 0,01 723 0,012 792 0,014 0,85
Спирт+вода (1/10) 0,1 703 0,11 779 0,08 1,37
Спирт+вода(1/1) 1,0 725 0,62 787 2,26 0,27
Глицерин+вода (1/100) 0,01 716 0,025 786 0,018 1,38
Глицерин+ вода (1/10) 0,1 700 0,079 780 0,051 1,55
Глицерин+ вода (1/1) 1,0 723 0,69 790 1,15 0,63

Раздел 2.2 содержит анализ полученных результатов и включает в себя подразделы, рассматривающие возможные параметры, влияющие на смещение максимумов положения полос поглощения. Оно может происходить вследствие: изменения концентрации красителя в растворе, химического взаимодействия молекул ICG с молекулами растворителей сложных составов (раздел 2.2.1); различной полярности растворителей (раздел 2.2.2); изменения показателя преломления смеси растворителей (раздел 2.2.3); взаимодействия молекул веществ-растворителей между собой (раздел 2.2.4).

Отдельно в Разделе 2.3 рассматриваются особенности поведения индоцианина зеленого в разной концентрации в физиологическом растворе. Нами исследована агрегация молекул индоцианина зеленого в водных (Рис. 3) и водно-солевых (Рис. 4.) (физиологических) растворах при различной (от 0.01 до 1 мг/мл) концентрации красителя.

Рис. 3. Спектр поглощения водных растворов ICG с концентрацией 1 мг/мл. Цифрами указан день регистрации спектра, начиная со дня приготовления раствора

Рис. 4. Спектры поглощения водных растворов индоцианина зеленого с концентрацией 0.5 мг/мл. Цифрами без индекса обозначены спектры водного раствора, цифрами с индексом – спектры водно-солевого раствора в соответствии с днем регистрации спектра

В водно-солевой смеси растворимость исследуемого вещества значительно слабее. Это приводит к тому, что агрегация молекул красителя происходит быстрее, что также следует из спектров. Сам спектр имеет более сложный характер, появляются дополнительные полосы поглощения. Это вызвано тем, что в водно-солевом растворе на второй день агрегировавшие частицы красителя выпадают в осадок.

Нами показано, что в водно-солевых растворах происходит эффективная агрегация индоцианина зеленого, причем эта агрегация имеет место уже на стадии приготовления раствора и при концентрациях красителя значительно меньших, чем используемые в медицинской практике. Вследствие отсутствия исследований влияния таких агрегатов на организм, не исключено, что отмеченные случаи неблагоприятного воздействия индоцианина зеленого на пациентов связаны именно с такой агрегацией.

В третьей главе исследуется взаимодействие индоцианина зеленого с различными биологическими объектами: поверхностными слоями эпидермиса, волосами, плазмой и сывороткой крови человека; и их макромолекулами – кератином кожи и волос, меланином, альбумином. Описывается и иллюстрируется определение основного механизма, обусловливающего окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем (раздел 3.1.); исследование эффективности окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов (раздел 3.2.); установление влияния взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации (раздел 3.4). В разделе 3.3. приводятся результаты исследований по окрашиванию индоцианином зеленым меланина полученного из разных источников (ретины глаза и волос), разными методами и в различных концентрационных соотношениях. На примере взаимодействия меланина с растворами индоцианина зеленого получены данные о существовании различий в результатах окраски меланина, получаемого различными методами из волос или ретины глаза.

Рис. 5. Спектры поглощения кожи окрашенной спиртовым раствором ICG после проведения последовательных отрывов (0 – спектр окрашенной кожи без отрыва, 1 – спектр окрашенной кожи после первого отрыва, 2 – спектр окрашенной кожи после второго отрыва, 3 – спектр окрашенной кожи после третьего отрыва)

 Спектры поглощения кожи окрашенной глицериновым раствором ICG (0 –-5

Рис. 6. Спектры поглощения кожи окрашенной глицериновым раствором ICG (0 – спектр окрашенной кожи без отрыва, 1 – спектр окрашенной кожи после первого отрыва, 2 – спектр окрашенной кожи после второго отрыва, 3 – спектр окрашенной кожи после третьего отрыва)

Рис. 7. Спектры поглощения кожи не очищенной от защитного жирового слоя. 1 – не окрашенная кожа, 2 – кожа окрашенная глицериновым раствором ICG, 3 – кожа окрашенная водным раствором ICG, 4 – кожа окрашенная спиртовым раствором ICG

 Спектры поглощения кожи очищенной от защитного жирового слоя. 1 –-7

Рис. 8. Спектры поглощения кожи очищенной от защитного жирового слоя. 1 – кожа окрашенная водным раствором ICG, 2 – кожа окрашенная спиртовым раствором ICG, 3 – кожа окрашенная глицериновым раствором ICG

Для определения эффективности окрашивания поверхностных слоев эпидермиса человека индоцианином зеленым нами использовались водный, спиртовой и глицериновый растворы индоцианина зеленого с концентрацией 1 мг/мл. После окрашивания, при помощи клейкой ленты, проводилось последовательно по четыре отрыва верхних слоев эпидермиса и, соответственно, после каждого отрыва регистрировались спектры отражения кожи предплечья in vivo. Полученные графики представлены на рисунках 5-8 с представлением данных в форме Abs=log(1/R).

Коэффициент поглощения ткани, окрашенной спиртовым раствором индоцианина зеленого, в области около 650-800 нм уменьшается с каждым последующим отрывом (рис. 5), что, учитывая толщину каждого послойного отрыва, свидетельствует о том, что краситель проникает при таком способе окрашивания на глубину не более 10 мкм. Разложение спектра в области 650-800 нм на гауссовы составляющие показывает неизменное положение полос: 741 нм для мономеров и 795 нм для димеров индоцианина. Данные значения отличаются от положений максимумов полос в спиртовых и водных растворах (731 и 788 нм, а также 696 и 778 нм, соответственно, см. Гл.1). Данный факт должен свидетельствовать о том, что индоцианин в исследуемом объекте (эпидермисе кожи предплечья) находится в связанном состоянии, т.е. произошло взаимодействие красителя с молекулами эпидермиса. Неизменность положения полос говорит также о том, что краситель находится только в связанном состоянии, т.к., в противном случае, т.е. при изменении концентрационного соотношения связанный/несвязанный краситель, положение полос менялось бы. Как следует из данных главы 1, смещение полос вследствие изменения концентрации красителя или соотношения спирт/вода не приводит к таким положениям полос поглощения индоцианина.

Для кожи, окрашенной глицериновым раствором индоцианина, такая закономерность не наблюдается. Наиболее вероятно, что данные изменения связаны с изменением рассеивания света в зависимости от концентрации в нем глицерина вследствие хорошо известного эффекта просветления. Из сравнения глубины прокрашивания спиртовым и глицериновым растворами, следует, что использование спиртового раствора красителя целесообразнее, т.к. глубина прокраски для него больше, чем для глицеринового раствора такой же концентрации. Этот вывод подтверждается и сравнением спектров на рис. 7 и 8.

При рассмотрении разности между спектрами отражения окрашенной и неокрашенной кожи (рис. 9-10), очевидно, что различия в спектрах обусловлены не только наличием красителя. Наличие красителя приводит к росту сигнала в области 700-800 нм, причем разность становится положительной. В то же время, практически для всех разностных спектров имеет место общий наклон и отрицательные значения в области 400-600 нм. Такие изменения разности могут объясняться только частичным просветлением поверхностных слоев эпидермиса и увеличением, вследствие этого, влияния поглощения света кровью, расположенной в нижележащих слоях кожи. Следует отметить, что просветление различно для разных растворителей и слоев эпидермиса, причем наибольшее наблюдается в случае использования спиртового раствора. Это может быть объяснено различием в концентрации внедрившегося растворителя.

Основным механизмом, определяющим взаимодействие индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека, по-видимому, является связывание молекул красителя молекулами, содержащимися в коже. Такими молекулами могут быть, в первую очередь, молекулы альбумина цитоплазмы клеток эпидермиса. Это предположение хорошо согласуется как с литературными данными, так и с тем фактом, что поверхностный слой эпидермиса окрашивается плохо. Хорошо известно, что поверхностный, роговой слой эпидермиса, состоит, в основном, из кератинизированных клеток, а кератин практически не взаимодействует с индоцианином зеленым.

 Разностные кривые спектров поглощения окрашенной кожи без отрыва-8

Рис. 9. Разностные кривые спектров поглощения окрашенной кожи без отрыва поверхностного слоя. 1 – кожа окрашенная водным раствором ICG, 2 – кожа окрашенная глицериновым раствором ICG, 3 – кожа окрашенная спиртовым раствором ICG

Рис. 10. Разностные кривые спектров поглощения окрашенной кожи после первого отрыва. 1 – кожа окрашенная водным раствором ICG, 2 – кожа окрашенная глицериновым раствором ICG, 3 – кожа окрашенная спиртовым раствором ICG

Таким образом, показано, что in vivo растворы индоцианина зеленого за время в пределах 30 мин проникают только в поверхностную область рогового слоя эпидермиса. Эффективность и глубина окрашивания зависит от используемого растворителя. Тот факт, что окрашивание достаточно эффективно даже для водных растворов, скорость диффузии которых меньше, чем для глицериновых и спиртовых, говорит о том, что проникновение в данном случае происходит в разрыхленную область эпидермиса. Удаление этой области без нарушения остальной части рогового соя приводит к уменьшению эффективности и глубины прокрашивания. Максимумы спектров поглощения индоцианина зеленого, связанного с клетками эпидермиса, смещаются относительно максимумов поглощения водных растворов в длинноволновую область на 12-16 нм для мономеров и на 30-40 нм для димеров. Более точные цифры получить невозможно, т.к. положение максимумов в водных растворах зависит от концентрации красителя. Кроме того, возможно, что на результаты может влиять рассеяние света кожей. Диффузия растворителя приводит к частичному просветлению верхних слоев эпидермиса в спектральных областях, в которых поглощение красителя отсутствует.

Окрашивание волос (Рис.11 – 12) показало, что эффективность окрашивания зависит, в первую очередь, от целостности поверхности волоса. При использовании препаратов, приводящих к нарушению поверхности (щелочи, перекиси водорода) эффективность окрашивания повышается. Показано наличие смещений максимумов полос поглощения индоцианина зеленого при окрашивании им волос. Согласно литературному анализу, такое смешение можно объяснить взаимодействие красителя с материалом волос, наиболее вероятно, с альбумином или меланином.

Показано, что кислотно-щелочные методы получения меланина из волос приводят к частичному разрушению гранул меланина. Уменьшение концентрации красителя в растворе при увеличении концентрации в том же растворе меланина говорит от проникновения индоцианина в гранулы меланина, а смещение полос поглощения свидетельствует о наличии взаимодействия индоцианина и меланина.

Рис. 11. Спектры пропускания прядей волос, окрашенных индоцианином зеленым, в зависимости от времени выдержки в растворе красителя: 1 – 30 мин., 2 – 45 мин., 3 – 60 мин

Рис. 12. Спектры отражения волос и овечьей шерсти, окрашенных в спиртовом растворе индоцианина зеленого

В процессе исследований не обнаружено изменений структуры кристаллизованной плазмы крови человека, которое свидетельствовало бы об изменении структуры белов плазмы под влиянием индоцианина.

Глава 4 содержит сведения об исследованиях процессов переноса красителя в биологический объект методами тонкослойной хроматографии.

Наличие зависимости скорости и эффективности диффузии в биологический объект от типа используемого растворителя, в соответствии с теорией трансдермальной доставки лекарств свидетельствует о том, что в основе переноса красителя в объект лежит увлечение молекул красителя молекулами раствортеля. Наряду с учетом зависимости эффективности переноса от взаимодействия красителя и растворителя с самим объектом, перенос красителя может описываться теорией жидкостной хроматографии.

Нами проведены опыты по исследованию эффективности переноса красителя на бумаге, крахмале, казеине, сухой пленке плазмы крови, коллагеновой пленке, тонком слое эпидермиса, полученном как в случае фотоэритемы, так и методом отрыва.

Проведенные опыты по исследованию эффективности переноса красителя от типа биомолекул и их организации в модельной среде, а также от используемого метода хроматографии свидетельствуют, с одной стороны, о возможности использования данного метода для исследования наличия или отсутствия взаимодействия красителя с биологическими молекулами, с другой – о том, что для такого исследования необходима среда – носитель с высокой эффективностью диффузии растворителя и отсутствие взаимодействия с красителем. Наиболее оптимальным представляется использование стандартных пластинок для тонкослойной хроматографии на основе порошка MgO, на поверхность которого наносится исследуемое вещество.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

Диссертационная работа посвящена детальному in vivo и in vitro исследованию процессов взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого с биологическими объектами и составляющими их молекулами методами спектрофотометрии и хроматографии. В работе исследованы закономерности изменения спектров поглощения растворов индоцианина зеленого в зависимости от метода приготовления раствора: используемого растворителя или смеси растворителей, а также концентрации красителя и метода окрашивания. Исследовано поведение красителя в разных концентрациях растворенного в физиологическом растворе. Выявлены причины изменения спектров поглощения ICG при его взаимодействии с молекулярными компонентами эпидермиса кожи человека или волос при их окрашивании in vivo или in vitro. Определен основной механизм, обусловливающий окрашивание поверхностных слоев эпидермиса человека органическим красителем индоцианином зеленым. Исследована эффективность окрашивания волос человека раствором индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов. Установлено влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации. Решен вопрос о безопасности растворов индоцианина зеленого для живых организмов.

Список опубликованных работ по теме диссертации

По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.

  1. Kulyabina T.V., Drajevsky R.A., Kochubey V.I., Zimnyakov D.A. Coherent optical analysis of crystal-like patterns by human plasma desiccation // Proc. SPIE. 2001. Vol.4242, P.282-285
  2. Кулябина Т.В., Кочубей В.И. In vivo исследования растворов индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека // Проблемы оптической физики, 2004, книга 1, стр. 68-73.
  3. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. In vivo investigation of interaction of indocyanine green solutions with human epidermis // Proc. SPIE. 2004, Vol.5474, P.339-343
  4. Кулябина Т.В. Агрегация индоцианина зеленого в водных растворах // Труды третьей международной конференции «Фундаментальные проблемы оптики», 2004, стр.47-49.
  5. Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Спектральные характеристики индоцианина зеленого при его взаимодействии с биологическими тканями // Оптика и спектроскопия, 2005, том 99, № 4,
    С. 582–588.
  6. Кулябина Т.В., Кочубей В.И., Прохорова Е.Н. Спектральные исследования взаимодействия индоцианина зеленого с меланином // Труды II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика – 2005», 2005, С. 281–282.
  7. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. Efficiency of staining hair with indocyanine green // Proc. SPIE. 2005, Vol. 5771, Р. 372-376
  8. Кулябина Т.В., Кочубей В.И. Эффективность окрашивания волос человека растворами индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, 2005, книга 1, стр. 68-73.
  9. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. The interaction of indocyanine green with blood plasma and features of crystallization in Saratov Fall Meeting 5005: Optical Technologies in Biophysics and Medicine VII, edited by Valery V. Tuchin, Proceedings of SPIE Vol. 6163 (SPIE, Bellingham, WA, 2006) 61631K
  10. Кулябина Т.В., Кочубей В.И. Влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови на процесс ее кристаллизации // Проблемы оптической физики, Материалы 9-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, 2006, С. 43–48.
  11. Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.А. Исследования индоцианина зеленого в растворах с перспективой создания стандартного образца // Законодательная и прикладная метрология, 2006, № 5, С. 43–47.


 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.