Эколого-генетическая характеристика гадюковых змей (reptilia, viperidae) в нижнем поволжье и на сопредельных территориях

На правах рукописи

Ефимов Роман Вячеславович

эколого-генетическая характеристика

гадюковых змей (reptilia, viperidae)

в нижнем поволжье

и на сопредельных территориях

03.00.16 – экология

03.00.15 – генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Саратов – 2008

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего

профессионального образования «Саратовский государственный университет

им. Н.Г. Чернышевского» на кафедре морфологии и экологии животных

Научный руководитель –	доктор биологических наук, профессор Завьялов Евгений Владимирович
Официальные оппоненты:	доктор биологических наук, профессор
	Тырнов Валерий Степанович
	доктор биологических наук, профессор Ильин Владимир Юрьевич
Ведущая организация –	Зоологический институт РАН

Защита состоится « 2 » июля 2008 г. в 9.00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет им. Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, 83, учебный корпус № 5, аудитория № 61, факс (8452)511635, E-mail: [email protected].

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский ГУ».

Автореферат разослан « 30 » мая 2008 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Невский С.А.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Одним из важнейших событий в науке XX в. стало открытие двойной спирали ДНК. Впоследствии это привело к интенсивному развитию молекулярной генетики, становлению которой способствовала международная научная программа «Геном человека». Появились самостоятельные научные направления: генная диагностика, генная терапия, генная систематика, генная инженерия, занимающие передовые позиции в медицине и биологии. Молекулярная генетика позволила углубить представления о механизмах наследования и эволюции организмов, заложив тем самым основы филогенетики и генной систематики. Особое значение генная систематика приобрела при решении спорных вопросов относительно таксонов, систематический статус которых не был установлен. Данное направление интенсивно развивается в отношении змей, ящериц и черепах. Географические популяции пресмыкающихся зачастую характеризуются сходными морфологическими признаками, когда без применения методов молекулярной генетики решение спорных вопросов их систематики становится затруднительным (Горбунова и др., 1997; Чемерис и др., 1999; Калябина-Хауф и др., 2004; Семенова и др., 2004; Venter et al., 2001; Garrigues et al., 2005; Ursenbacher et al., 2006; Huang et al., 2007).

К группе рептилий, вопросы филогенетического родства, систематики и распространения которых остаются до конца не выясненными, относятся гадюковые змеи (Viperidae). На современном этапе развития эколого-таксоно-мических исследований повышенный интерес среди этих животных проявляется к гадюке Никольского (Vipera (Pelias) nikolskii Vedmederja, Grubant, Rudaeva, 1986), которая широко распространена в Европе. В настоящее время не существует единого мнения в отношении ее таксономического статуса. Некоторые авторы выделяют гадюку Никольского в качестве самостоятельного вида, другие рассматривают в качестве подвида обыкновенной гадюки или включают ее в состав комплекса «Vipera berus» в качестве черной морфы (Ведмедеря и др., 1986; Кудрявцев и др., 1998; Бакиев и др., 2004; Grubant et al., 1973; Joger at al., 1997; Milto et al., 2005; Zinenko et al., 2005; Kotenko, 2006).

Гадюка Никольского занесена в Красную книгу России и Украины как малоизученный вид. Сведения о состоянии его популяций в Нижнем Поволжье ограничены: не известен таксономический статус окраинных поселений, поэтому с приемлемой точностью не выявлены границы распространения змей. Отсутствуют достоверные данные о возможности гибридизации близкородственных видов гадюк в природе и их экологической сегрегации в зонах симпатрического обитания. Не разработаны методы оперативной диагностики видовой принадлежности рептилий в природе и лабораторных условиях. Указанные проблемы не позволяют определить категорию редкости и природоохранный статус вида, приступить к разработке действенных мероприятий по сохранению популяций этих животных, особенно на периферии ареала.

Использование только морфологических, экологических и кариологических методов не позволяет дать однозначные ответы на поставленные вопросы (Бакиев и др., 2004; Кайбелева и др., 2005). В связи с этим на современном этапе большое значение приобретают эколого-таксономические приемы и подходы, основанные на анализе молекул ДНК. Использование данных методов позволяет уточнить таксономический статус некоторых видов гадюковых змей, а значит значительно приблизиться к пониманию процессов и явлений их морфологической изменчивости под действием комплекса абиотических факторов среды. На основе применения молекулярно-генетического анализа возможно также установление генетической структуры популяций гадюк, а также выявление механизмов, лежащих в основе эволюции изучаемых змей.

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выявление распространения и экологической сегрегации гадюковых змей в Нижнем Поволжье, определение таксономического статуса их популяций с использованием молекулярно-генетических маркеров. В ходе реализации цели исследования решались следующие задачи:

- оценка таксономического статуса гадюки Никольского (Vipera nikolskii) в Нижнем Поволжье и на сопредельных территориях на основе анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов;

- установление генетической структуры популяций гадюк Никольского и обыкновенной с использованием анализа микросателлитных локусов, выявление факторов внешней среды, участвующих в ее формировании;

- определение границ ареала гадюки Никольского на территории Нижнего Поволжья и на сопредельных территориях;

- выявление механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии, уточнение гипотетической модели дивергенции и пространственного распространения видов рода Vipera;

- разработка экспресс-технологии идентификации популяций гадюковых змей (V. berus и V. nikolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено.

Научная новизна. Определен таксономический статус гадюки Никольского и выявлена северная граница ее распространения на территории Нижнего Поволжья на основе анализа нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов. Впервые секвенированы митохондриальные гены 12S рибосомной РНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы для гадюки Никольского; для обыкновенной гадюки (Vipera berus) определена нуклеотидная последовательность митохондриальных генов 12S рРНК и цитохром с оксидазы. Получены данные о генетической изменчивости популяций гадюковых змей, что позволило уточнить гипотетические модели дивергенции и расселения видов рода Vipera. Выявлены экологические факторы, определяющие генетическую и морфологическую изменчивость географических популяций гадюковых змей.

Научно-практическая значимость. На основе результатов анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена 12S рибосомной РНК разработана универсальная технология идентификации экземпляров гадюк Никольского и обыкновенной в зонах их симпатрического обитания. Заложены методические основы анализа генетических особенностей популяций восточной степной гадюки (Vipera renardii) с использованием микросателлитных локусов. Материалы диссертации вошли в «Практикум по молекулярной биологии (методы биоинженерии)», рекомендованный для использования в вузах при подготовке специалистов естественнонаучного профиля. Результаты диссертационной работы используются при проведении практических занятий по молекулярной биологии для студентов биологического факультета Саратовского государственного университета.

Апробация работы. Материалы исследования докладывались и обсуждались на: Четвертой конференции герпетологов Поволжья (Тольятти, 2007 г.); 3-й Московской конференции по вычислительной молекулярной биологии (Москва, 2007 г.); 49-й научной конференции Московского физико-технического института (Долгопрудный, 2006 г.); 6-й Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома (Новосибирск, 2008 г.); студенческих научно-практических конференциях Саратовского государственного университета «Исследования молодых ученых и студентов в биологии» (Саратов, 2005–2006 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ, две из которых в изданиях перечня ВАК РФ.

Декларация личного участия автора. Автор лично проводил экспериментальные исследования, выявлял молекулярные механизмы, лежащие в основе формирования структуры популяций. Анализ полученных данных, их интерпретация и оформление выполнялись автором самостоятельно. В совместных публикациях вклад соискателя составил 50–80%.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Гадюка Никольского является самостоятельным видом, наиболее близким в генетическом и морфологическом отношениях к обыкновенной гадюке.

2. Распространение гадюки Никольского в Поволжье связано преимущественно с интразональными ландшафтами долин рек Донского бассейна; в отличие от обыкновенной гадюки она редко встречается на водораздельных пространствах вне связи с пойменными местообитаниями.

3. Межпопуляционная генетическая изменчивость обыкновенной гадюки имеет клинальную зависимость в направлении от Республики Мордовия до Пермского края по градиенту комплекса абиотических факторов.

4. В условиях внутривековой динамики климатических показателей (преимущественно среднегодовой температуры и количества осадков) гадюка Никольского проявляет тенденцию к расселению на север.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 странице и включает 47 рисунков и 16 таблиц. Работа состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и приложения. Библиографический указатель включает 104 источника, из которых 42 на иностранных языках.

Содержание работы

Во Введении обосновывается актуальность исследования, его практическая и теоретическая значимость; сформулированы основная цель и задачи, а также пути их реализации.

Глава 1. Основные НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

в ЭКОЛОГИИ И систематике гадюковых ЗМЕЙ (обзор литературы)

Приводится эколого-морфологическая характеристика гадюки Никольского, представляются различные точки зрения относительно ее систематического положения. Материалы главы включают результаты эколого-морфологичес-ких, биохимических и молекулярно-биологических исследований. Представлена история становления и актуальность молекулярно-генетических методов в систематике. Описаны современные методы молекулярной биологии, используемые для определения таксономического статуса животных, растений и микроорганизмов. Особое внимание уделяется анализу нуклеотидных последовательностей, позволяющему определять степень родства на генетическом уровне, а также анализу микросателлитных локусов, обладающих высоким уровнем полиморфизма, что традиционно используется в популяционных исследованиях.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В главе представлены методы выделения ДНК, проведения полимеразной цепной реакции, определения нуклеотидной последовательности и анализа микросаллитных локусов. Предложены приборная база и реактивы для выполнения данной работы. Указаны пакеты прикладных программ, используемых для расчета генетических дистанций, построения «филогенетических деревьев», оценки уровня гетерозиготности и др.

Материалом для данной работы послужили полевые сборы, осуществленные в Саратовской, Самарской, Пензенской, Новгородской, Тульской областях, республиках Мордовия, Чувашия, Удмуртия и в Пермском крае с 2003 по 2007 гг., которые хранятся в Зоологическом музее Саратовского университета и Зоологическом институте РАН (таблица). В качестве материала использовали заспиртованные образцы печени гадюк. Тотальную ДНК из них выделяли по методике (Sambrook et al., 1989), применяемой в отношении рептилий. Тотальную ДНК из крови выделяли с использованием набора «Diatom Prep 100» (ГенЛаб) в соответствии с методикой фирмы изготовителя.

Для проведения полимеразной цепной реакции использовали олигонуклеотидные праймеры, подобранные по нуклеотидным последовательностям, имеющимся в базе данных Genebank (Франция). Секвенирование очищенных двухцепочечных ПЦР продуктов митохондриальных генов проводили по методу Сенгера (Sanger et al., 1977). Электрофоретическое разделение продуктов секвенирующей реакции проводили с помощью автоматического 8-капиллярного ДНК-секвенатора SEQ 2000XL (Bekman Coulter). Для выравнивания секвенированных нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов использовали программы Clustal W и BioEdit Sequence Alignment Editor. Для построения дендрограмм использовали пакет прикладных программ MEGA 4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (Tamura et al., 2007).

Географическая и количественная характеристика сборов гадюк,

использованных в анализе

№	Код	Место сбора	Вид	Кол-во	Источник
1	Sar	Саратовская область	V. nikolskii	23	ЗМ СГУ, ЗИН РАН
2	Sam	Самарская область	V. nikolskii?	15	ЗМ СГУ, ЗИН РАН
3	Chuv	Республика Чувашия	V. berus	5	ЗМ СГУ, ЗИН РАН
4	Pen	Пензенская область	V. berus	3	ЗМ СГУ
5	Mor	Республика Мордовия	V. berus	7	ЗМ СГУ
6	Per	Пермский край	V. berus	7	ЗИН РАН
7	Udm	Республика Удмуртия	V. berus	6	ЗИН РАН
8	Tul	Тульская область	V. berus	9	ЗИН РАН
9	Nov	Новгородская область	V. berus	5	ЗИН РАН
10	Vol	Волгоградская область	V. renardi	2	ЗМ СГУ

Анализ флуоресцентно-меченых продуктов амплификации микросателлитных локусов проводили с помощью генетического анализатора 3130XL (Applied Biosystems), вычисление частот аллелей и определение коэффициента инбридинга – с использованием программ GenAIEx 6. Генетические расстояния между популяциями гадюк и построение «филогенетического дерева» проводили с использованием программы Phylip 3.65.

Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО РОДСТВА ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ МИТОХОНДРИАЛЬНОЙ ДНК

В главе представлены результаты анализа нуклеотидных последовательностей трех митохондриальных генов: НАДН-дегидрогеназы (субъединица 2 – ND2), цитохром с оксидазы (субъединицы 3 - COIII) и 12S рибосомной РНК. На начальном этапе исследований была поставлена задача оценить уровень генетических различий между обыкновенной гадюкой и гадюкой Никольского. На основе анализа данных литературы по распространению гадюковых змей, в анализе использовались змеи из Саратовской и Самарской областей. По морфологическим признакам все экземпляры были определены как гадюки Никольского. Однако в соответствии с данными литературы, экземпляр из Самарской области должен был быть отнесен к обыкновенной гадюке. В связи с этим он рассматривался как вариант с неопределенным таксономическим статусом.

Для проведения полимеразой цепной реакции были подобраны следующие олигонуклеотидные праймеры:

на ген НАДН-дегидрогеназа

5/-GCATTTTCATGACCACCACC-3/

5/-GAGTGAGGGGTAAGATAGAG-3/

на ген цитохром с оксидаза

5/-aatgactcaccagctacacc-3/

5/-ggagcctcatcagtatactg-3/

на гена 12S рРНК

5/-CTCAACAACAGTGAGACAGCC-3/

5/-GGTGTGTACGCTCTTCATTGC-3/

Нуклеотидная последовательность гена НАДН-дегидрогеназы субъединицы 2 обычно используется для изучения молекулярной филогении животных и, в частности, змей (Garrigues et. al., 2005). Поэтому, для определения таксономического статуса гадюки из Самарской области использовалось сравнение именно нуклеотидных последовательностей митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы. На основе сравнения признаков гадюк из Саратовской и Самарской областей, а также змей, взятых из базы данных Genebank (V. berus, V. ursinii, V. a. aspis, V. am. ammodytes), были выявлены их филогенетические связи. Для этого использовали дистанционный метод (NJ). Экземпляры из Саратовской области представлены на «филогенетическом дереве» в виде отдельной группы с высоким уровнем достоверности 99% (рис. 1). Все остальные экземпляры располагаются на определенном расстоянии от данной группы. Следует отметить, что наиболее близкими к данной выборке являются экземпляры гадюки из Самарской области и V. berus из базы данных Gene bank.

Рис. 1. Филогенетические связи, выявленные на основе анализа нуклеотидной последовательности фрагмента гена НАДН-дегидрогеназы с использованием дистанционного метода (NJ):

* - нуклеотидные последовательности, взятые из базы данных Gene bank

Результаты анализа нуклеотидной последовательности митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы свидетельствуют о генетическом сходстве гадюк Никольского из Саратовской области. Как видно из схемы филогенетических связей, эти экземпляры образовали отдельный кластер, по сравнению со всеми остальными экземплярами, используемыми в анализе. Змеи из Самарской области попали в одну группу с V. berus из базы данных Gene bank. Отличия между данными экземплярами составили всего два нуклеотида. Данный уровень различий свидетельствует о высоком сходстве экземпляров гадюк из Самарской области и обыкновенной гадюки.

Необходимо отметить, что первоначально экземпляр гадюки из Самарской области по морфологическим признакам был отнесен к V. nikolskii. Однако результаты молекулярно-генетических исследований показали ее высокое сходство с обыкновенной гадюкой. Подобные результаты были получены и при сравнении нуклеотидной последовательности цитохром b, когда по морфологическим признакам гадюки идентифицировались как V. nikolskii, хотя основе молекулярно-генетического анализа они попадали в группу «V. berus» (Бакиев и др., 2004). На этом основании можно предположить, что гадюки из Самарской области, территориально располагающиеся выше границы Канев – Курск – Тамбов – Бузулук, уже не входят в ареал гадюки Никольского, а являются черной морфой обыкновенной гадюки.

Полученные результаты указывают на тот факт, что гадюки из Саратовской и Самарской областей являются представителями различных таксономических групп. Гадюки из саратовского Правобережья территориально, морфологически и генетически (на молекулярном уровне) определяются как гадюки Никольского. Гадюка из Самарской области по морфологическим признакам диагностируется как гадюка Никольского, но по территории распространения относится к обыкновенной гадюке. Молекулярно-генетические данные подтверждают принадлежность Самарских экземпляров к обыкновенной гадюке. В связи с этим следует рассматривать змей из Самарской области как обыкновенных гадюк.

На следующем этапе работ анализировались нуклеотидные последовательности митохондриального гена цитохром с оксидазы (субъединица 3 – СО III). Учитывая результаты сравнения митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы, для анализа цитохром с оксидазы было предложено расширить выборку гадюк из Саратовской и Самарской областей. Также дополнительно в анализ были включены экземпляры обыкновенной гадюки из Пензенской области и Республики Мордовия. В качестве внешней группы использовалась восточная степная гадюка (Vipera renardii) из волгоградской популяции.

Для построения «филогенетического дерева» использовались 20 экземпляров гадюк из Нижнего Поволжья и сопредельных территорий. Как и для гена НАДН-дегидрогеназы экземпляры из Саратовской и Самарской областей по результатам сравнения цитохром с оксидазы образовали отдельные группы (рис. 2). Вместе с этим в «самарскую» группу также вошли экземпляры из Пензенской области и Республики Мордовия.

Полученные результаты выявили строгую специфичность гадюк из Саратовской области, которые по морфологическим признакам были отнесены к гадюке Никольского. Незначительные отличия в виде отдельных мутаций были обнаружены у двух экземпляров V. nikolskii из Лысогорского района и одного из Ртищевского района Саратовской области. Данные результаты подтвердили выдвинутое предположение о высокой генетической специфичности гадюк из Саратовской области и принадлежности их к гадюке Никольского.

Гадюки, предварительно идентифицированные по морфологическим признакам как обыкновенная гадюка из Пензенской области и Республики Мордовия, образовали отдельную группу, отличающуюся от гадюк Никольского из Саратовской области. Змеи из Самарской области были также отнесены к группе обыкновенных гадюк, хотя морфологические признаки указывали на их принадлежность к гадюке Никольского.

Большинство исследователей указывают на то обстоятельство, что «самарские» гадюки находятся в зоне симпатрического обитания номинативного подвида обыкновенной гадюки и гадюки Никольского. Тем не менее, эти образцы проявляют сходство по нуклеотидной последовательности, что позволяет предположительно отнести их к обыкновенной гадюке. Экземпляр восточной степной гадюки образовал отдельный кластер, что свидетельствует о принадлежности данного экземпляра к самостоятельному виду.

На следующем этапе работ анализировались нуклеотидные последовательности митохондриального гена 12S рибосомной РНК. Учитывая результаты сравнения митохондриального гена НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы, было предложено расширить выборку гадюк из Саратовской и Самарской областей до 15 и 14 экземпляров соответственно. Также дополнительно в анализ были включены экземпляры обыкновенной гадюки из Пензенской и Тульской областей, Пермского края, республик Мордовия, Чувашия и Удмуртия. В качестве внешней группы использовалась восточная степная гадюка из волгоградской популяции.

Полученные результаты подтвердили строгую специфичность гадюк из Саратовской области, которые по морфологическим признакам были отнесены к гадюке Никольского (рис. 3). Незначительные отличия в виде отдельных мутаций были обнаружены у трех экземпляров V. nikolskii из Аркадакского района (окрестности c. Летяжевка, пойма р. Хопер) Саратовской области. Данные результаты по сравнению нуклеотидной последовательности 12S рРНК подтвердили предположение принадлежности «саратовских» змей к гадюке Никольского. Единственное исключение составил экземпляр гадюки с территории урочища Моховое болото (Новобурасский район Саратовской области), который не попал в данную группу. По морфологическим признакам он был определен как V. nikolskii, а по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей гена 12S рРНК как V. berus. Следует уточнить, что данный экземпляр был ювенильного возраста и, вероятно, ошибочно был отнесен к гадюке Никольского. Это связано с тем, что первогодки гадюк Никольского и обыкновенной имеют морфологическое сходство, особенно в окраске тела (Завьялов и др., 1998; Кудрявцев и др., 1998).

Следует отметить, что сходство результатов, полученных при анализе всех трех генов, свидетельствует о достоверности сделанных выводов. Во всех сравнениях восточная степная гадюка образовывала отдельный кластер. Она находилась практически на равном расстоянии от гадюк Никольского и обыкновенной. Обнаружен высокий уровень генетического единообразия внутри популяций изучаемых видов. Большинство нуклеотидных замен, по которым экземпляры отличались внутри кластеров, были единичны и не характеризовали группировки в целом. Однако популяция обыкновенной гадюки с территории Тульской области двумя нуклеотидными заменами отличается от остальных популяций обыкновенных гадюк. Данные нуклеотидные замены отмечены у всех исследованных экземпляров, в связи с чем «тульских» обыкновенных гадюк следует рассматривать как обособленную группу, однако имеющую уровень генетических отличий 0.3%, что не превышает межпопуляционный уровень (Калябина-Хауф и др., 2004).

Рис. 3. Филогенетические связи, выявленные по данным нуклеотидной последовательности фрагмента гена 12S рРНК с использованием дистанционного метода (NJ)

Принимая во внимание гипотезу о стабильной дивергенции митохондриальной ДНК, соответствующей 1 млн. лет на 2.5% генетических различий, обособление популяции Тульской области от основной ветви произошло примерно 120 тыс. лет назад. Вероятно, данное событие связано с наступлением ледников в течение плейстоцена, которое отрезало их от основной группы и способствовало формированию обособленной популяции.

В целом средний уровень различий между гадюкой Никольского и обыкновенной гадюкой по трем митохондриальным гена равен 2.36%. Принимая во внимание литературные данные по генетическим дистанциям между видами одного рода для рептилий (0.51%), уровень различий между данными гадюками свидетельствует об индивидуальности гадюки Никольского (Avise et al., 1982). Поэтому этих змей следует рассматривать в качестве самостоятельного вида гадюк.

Глава 4. Исследование внутривидовой ИЗМЕНЧИВОСТИ

ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ

В настоящее время гадюка Никольского является одним из самых распространенных представителей рода Vipera на территории Саратовской области. Выявленные различия между гадюками Саратовской области и остальными исследованными представителями позволили подтвердить обоснованность выделения гадюки Никольского в качестве самостоятельного вида. Наряду с этим заключением большой интерес представляет анализ различий между отдельными популяциями гадюк Никольского и обыкновенной. Подобный интерес связан с вероятностью гибридизации номинативного подвида обыкновенной гадюки и гадюки Никольского.

На первом этапе для оценки полиморфизма гадюки Никольского на территории Саратовской области с использованием микросателлитных локусов осуществлялся подбор олигонуклеотидных праймеров для амплификации необходимых участков ДНК. На основе результатов обзора литературы были подобраны 9 пар олигонуклеотидных праймеров. Однако всего три пары праймеров оказались наиболее подходящими для исследования гадюк. Наиболее информативный представляется микросателлитный локус 7–87, с помощью которого и были исследованы выборки гадюк.

С помощью микросателлитного локуса 7–87 было анализировано 82 экземпляра гадюк. Следует отметить, что из 23 образцов из Саратовской области 19 в своем составе имеют аллель размером 152 п.н. Один экземпляр с территории Новобурасс характеризуется аллелями 176 и 184 п.н. Два экземпляра (Sar17,19) являются гомозиготными с аллелями размером 184 п.н. У одного экземпляра (Sar3) обнаружены аллели не встречающиеся среди саратовских гадюк. Размер аллелей для данного экземпляра составляет 166, 190 п.н. Аллель 152 п.н. оказался высокоспецифичным для гадюки Никольского. Вместе с этим, практически все экземпляры обыкновенных гадюк содержали аллели размером от 176 до 192 п.н., что указывает на обособленность популяций гадюк Никольского Саратовской области и обыкновенных гадюк.

Нельзя не отметить и тот факт, что один экземпляр из Тульской области и два из республики Мордовия содержат аллель 152 п.н. характерный гадюке Никольского из Саратовской области. Вероятно, данное явление возникает в результате миграции и гибридизации между гадюкой Никольского и обыкновенной гадюкой. Это свидетельствует о высоких адаптивных возможностях гадюк Никольского, которые в условиях внутривековой динамики климата проявляет тенденцию к расселению на север (рис. 4). Что же касается гадюк Пермского края, республик Чувашии, Мордовии, Удмуртии для них характерно разнообразие аллелей по микросателлитному локусу 7–87. При этом выявлена тенденция в увеличении длины аллелей в направлении от республики Мордовия до Пермского края.

Вероятно, данное явление связано со сменой природных зон: зона широколиственных лисов (республики Мордовия и Чувашия), зона подтаежных лесов (Республика Удмуртия), зона тайги (Пермский край). Вместе с этим гадюки с этих территорий проявляют больший уровень полиморфизма по сравнению с гадюками из Самарской, Пензенской и Новгородской областей. Это связано с широким разнообразием природных зон от республики Мордовия до Пермского края.

Принимая во внимание результаты, полученные при анализе нуклеотидных последовательностей и микросателлитного локуса следует предположить следующую гипотетическую модель расселения и формирования ареала гадюк (см. рис. 4). В этом случае необходимо придавать ведущее значение фактам истории четвертичного ледникового периода, которая оказала влияние на формирование видов (Калябина-Хауф и др., 2004).

Основные колебания климата приурочены к среднему плейстоцену (700 тыс. лет назад). Происходило наступление ледников с цикличностью 100 тыс. лет и смена их на непродолжительные теплые межледниковые периоды. Принимая во внимание гипотезу о стабильной скорости эволюции митохондриальной ДНК (2.5% на 1 млн. лет) (Wilson et al., 1985; Kocher et al., 1989; Калябина-Хауф и др., 2004) дифференциация гадюки Никольского и обыкновенной произошла около 700 тыс. лет назад (1.8%).

Вероятно, гадюка Никольского заняла территорию лесостепной зоны ниже 52–54о с.ш., а обыкновенная гадюка зону широколиственных лесов далее на север. Так как обыкновенная гадюка находилась в условиях постоянно меняющегося климата (смена ледниковых и межледниковых периодов), у нее происходило постепенное увеличение длины аллелей микросателлитного локуса. В противоположность, гадюка Никольского на протяжении широкого промежутка времени находилась в слабо изменяющихся условиях, что характеризуется наличием у нее коротких аллелей микросателлитного локуса.

На современном этапе произошло разобщение гадюки Никольского и обыкновенной о чем свидетельствует анализ митохондриальной ДНК. В связи с этим следует уточнить, что в основе механизмов экологической сегрегации гадюк Никольского и обыкновенной в зонах симпатрии лежит их приуроченность к различным биотопам. Гадюка Никольского в своем обитании приурочена пойменным ландшафтам рек правобережья и долины р. Волга, избегает остепненные целинные участки и агроценозы. Обыкновенная гадюка предпочитает смешанные леса с полянами и пойменные болота. Вместе с этим в зонах симпатрии имеются особи, проявляющие гибридогенный характер (по результатам анализа микросателлитного локуса), что свидетельствует о гибридизации между гадюкой Никольского и обыкновенной гадюкой.

Глава 5. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ГЕНОТИПИРОВАНИЯ

ГАДЮКОВЫХ ЗМЕЙ

В главе предложена низкозатратная технология идентификации гадюк, таксономическое положение которых не возможно определить на основе морфологических и биохимических характеристик. В основе данной технологии лежит аллель-специфичная ПЦР.

Выявленные нуклеотидные замены в митохондриальном гене 12S рибосомной РНК у гадюки Никольского и обыкновенной гадюки были положены в основу технологии генотипирования. При конструировании олигонуклеотидных праймеров для аллель-специфичной ПЦР нуклеотидная замена вводилась во второе положение на 3/-конце.

Для подтверждения работоспособности технологии идентификации гадюк с использованием аллель-специфичной ПЦР она была проверена на экземплярах гадюк, таксономический статус которых уже был определен с использованием секвенирования митохондриального гена 12S рРНК.

Проведенные экспериментальные исследования показали работоспособность технологии идентификации гадюк. Данная технология позволит за более короткое время и с меньшими материальными затратами проводить идентификацию гадюк, таксономическое положение которых не возможно определить на основе морфологических и биохимических характеристик. Вместе с этим, при наличии соответствующей приборной базы данные исследования возможно проводить непосредственно в полевых условиях. Это позволит забирать биологический материал и выпускать животных обратно в среду их обитания, что будет способствовать сохранению биологического разнообразия.

ВЫВОДЫ

В результате осуществленных исследований впервые секвенированы нуклеотидные последовательности митохондриальных генов 12S рРНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы для гадюки Никольского (Vipera nikolskii); для обыкновенной гадюки (Vipera berus) определена нуклеотидная последовательность митохондриальных генов 12S рРНК и цитохром с оксидазы, что позволило сделать следующие выводы:

1. Подтверждена видовая самостоятельность популяций гадюки Никольского, приуроченных в своем обитании к основной части ее ареала. Сравнительный анализ митохондриальных генов 12S рибосомной РНК, НАДН-дегидрогеназы и цитохром с оксидазы указывает на отличия нуклеотидных последовательностей митохондриальных генов у гадюковых змей Среднего Поволжья, что позволяет отнести их к меланистической форме обыкновенной гадюки. Вероятное время дивергенции рода Vipera в отношении гадюк Никольского и обыкновенной приходится на средний плейстоцен (около 700 тыс. лет назад).

2. Область распространения гадюки Никольского в Поволжье простирается в волжской долине на север до нижней зоны Саратовского водохранилища (южнее г. Хвалынска Саратовской области); в западном направлении граница ареала проходит по территории южных административных районов Пензенской области; волжская долина является восточным пределом распространения вида.

3. Выявлено наличие на территории Поволжья (северные районы Правобережья Саратовской области) популяций гадюковых змей, результаты анализа нуклеотидных последовательностей митохондриального гена 12S рибосомной РНК и микросателлитного локуса 7–87 которых указывают на гибридогенный характер их происхождения (V. berus V. nikolskii). Это свидетельствует о возможности перекрывания пространственных ниш гадюк в зоне их симпатрического обитания.

4. Определены признаки (аллель 152 п.н.), позволяющие диагностировать популяции гадюки Никольского в основной части ареала. В зонах гибридизации регистрация у гадюковых змей выявленного признака позволяет предположить высокие адаптивные возможности гадюки Никольского. Определена межпопуляционная клинальная изменчивость в пределах ареала обыкновенной гадюки по микросателлитному локусу 7–87, проявляющаяся в северо-восточном направлении в отношении увеличения длины аллелей.

5. Разработана экспресс-технология (на основе результатов сравнения нуклеотидной последовательности митохондриального гена 12S рРНК) идентификации популяций гадюковых змей (V. berus и V. nikolskii), таксономическое положение которых по комплексу морфологических и биохимических признаков затруднено. Предлагаемая методика основана на детекции единичных мутаций с использованием аллель-специфичной полимеразной цепной реакции.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

* – публикации в изданиях перечня ВАК РФ

1. Ефимов Р.В. ПЦР-амплификация и секвенирование генов НАДН-дегидрогеназы ND2 и 12S РНК гадюки Никольского Vipera nikolskii // Исследования молодых ученых и студентов в биологии. – Саратов, 2005. – Вып. 3. – С. 35–38.

2. Ефимов Р.В. Применение автоматического секвенирования для определения таксономического статуса гадюк // Тр. 49-й науч. конф. Московского физико-технического институтата (факультет аэрофизики и космических исследований). М., 2006. – С. 23.

3. Великов В.А., Ефимов Р.В., Завьялов Е.В., Кузнецов П.Е., Табачишин В.Г., Шляхтин Г.В., Кайбелева Э.И. Генетическая дивергенция, некоторых видов гадюк (Reptilia: Viperidae, Vipera) по результатам секвенирования генов НАДН-дегидрогеназы и 12S рибосомной РНК // Современная герпетология. – 2006. – Т. 5/6. – С. 41–49.

4. * Великов В.А, Ефимов Р.В., Назаров А.К., Кузнецов П.Е. ПЦР-амплификация и секвенирование генов НАДН-дегидроегназы и 12S рибосомальной РНК гадюки Никольского (Vipera nikolskii) // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. – 2006. – № 3. – С. 3–7.

5. Ефимов Р.В., Завьялов Е.В., Великов В.А., Табачишин В.Г. Предварительные данные о генетической дифференциации нижневолжских популяций гадюки Никольского (Vipera nikolskii, Viperidae) по результатам секвенирования генов 12S рибосомной РНК и цитохромоксидазы III // Современная герпетология. – 2007. – Т. 7, вып. 1/2. – С. 69–75.

6. Efimov R.V., Zavialov E.V., Tabachisan V.G. Analysis of genetic divergence of different Vipera species (Reptilia: Viperidae, Vepera) from gene sequention of cytochrome oxidase subunit III and 12S ribosomal RNA // Proceedings of The 3-rd Moscow Conference On Computational Molecular Biology. – M., 2007. – Р. 324–225.

7. Ефимов Р.В., Завьялов Е.В., Табачишин В.Г. Сравнительная генетическая характеристика поволжских популяций обыкновенной гадюки (Vipera berus) и гадюки Никольского (Vipera nikolskii) по результатам секвенирования генов 12S рибосомной РНК и цитохромоксидазы III // Актуальные проблемы герпетологии и токсинологии. – Тольятти, 2007. – Вып. 10.– С. 56–60.

8. * Ефимов Р.В., Завьялов Е.В., Великов В.А., Табачишин В.Г. Генетическая дивергенция популяций Vipera berus и Vipera nikolskii (Reptilia: Viperidae, Vipera) Нижнего Поволжья и сопредельных территорий по результатам секвенирования генов цитохромоксидазы III И 12S рибосомной РНК // Генетика. – 2008. – Т. 44, № 2. – С. 283–286.

9. Efimov R.V. Zavialov E.V., Tabachishan V.G. Features of microsatellite loci in population of some kinds of adders (Viperidae, Vipera) // The 6-th International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure. – Novosibirsk, 2008. – С. 93.

Подписано в печать 21.05.2008. Формат 6084 1/16.

Бумага офсетная № 1. Гарнитура Таймс. Печать офсетная.

Усл. печ. л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 91

Отпечатано в типографии ООО «Тироль».

410005, Саратов, ул. Чернышевского, 203.