Диагностическое значение различных микромицетов, выделенных из ногтевых пластин
На правах рукописи
ПУПКОВА
Марианна Андреевна
Диагностическое значение различных микромицетов,
выделенных из ногтевых пластин
03.02.12 – Микология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт–Петербург
2010 год
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт–Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
доктор биологических наук Васильева Наталья Всеволодовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Корнишева Вера Гавриловна
доктор медицинских наук, профессор Афиногенов Геннадий Евгеньевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт–Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «___»________ 2011г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.089.04 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт–Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, Санкт–Петербург, ул. Кирочная, д. 41)
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт–Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195196, Санкт–Петербург, Заневский пр, д. 1/82)
Автореферат разослан «___»_____________20__г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук М.А. Шевяков
Актуальность темы. Наиболее частыми возбудителями онихомикоза являются первичные патогены – дерматомицеты (Trichophyton rubrum, T. interdigitale, T. tonsurans и др.). Условно–патогенные микромицеты – дрожжевые (Candida spp. и др.) и нитчатые недерматомицеты (Scopulariopsis spp., Fusarium spp., Aspergillus spp., Acremonium spp. и др.) также могут играть важную роль в возникновении этого заболевания; их доля в этиологической структуре онихомикоза, по данным разных авторов, составляет 2–48% и 5,5–59,1% соответственно (Baran R. et al., 2006; А.Ю. Сергеев, 2007; Thomas J. et al., 2010). Такие вариации в этиологии связывают с особенностями климато–географических зон, а также с различными подходами к интерпретации данных, полученных при лабораторном исследовании (Summerbell R.C. et al., 2005).
В случае выделения нитчатых недерматомицетов и дрожжей имеются объективные трудности при интерпретации результатов культурального исследования патологического материала (ногтевых пластин). Поскольку ногтевые пластины не являются стерильным субстратом, то возможна контаминация на разных этапах проведения материала от пациента до чашки Петри при посеве, а кроме того, дрожжи рода Candida входят в состав нормобиоты нашего организма. Это может привести к гипер– или гиподиагностике онихомикоза, обусловленного нитчатыми недерматомицетами и/или дрожжами.
В настоящее время используют несколько методов исследования соскобов с ногтевой пластины, от традиционных, предложенных несколько десятков лет назад и актуальных в настоящее время, до новейших разработок в связи с внедрением методов молекулярной биологии в диагностику онихомикоза. Вместе с тем, применение молекулярно-генетических методов не дало ответ на вопрос о клинической значимости нитчатых недерматомицетов и дрожжей при онихомикозе (Ebiharta M. et al., 2009).
Существует несколько подходов к оценке клинического значения нитчатых недерматомицетов и дрожжей, выделенных при исследовании ногтевых пластин. Одни авторы считают, что при выделении недерматомицета необходимо подтверждение вида при повторном посеве; другие – предлагают ограничиться однократным посевом с подсчетом количества выросших колоний, признавая истинным возбудителем недерматомицет, выросший в 5–ти точках из 20–ти засеянных кусочков ногтевой пластины или в 11–ти из 15–ти; третьи предлагают забирать материал однократно, но из трех пораженных областей измененного ногтя; четвертые – сочетать культуральную диагностику с гистологическим исследованием ногтевой пластины (Lawry M.A. et al., 2000; Gupta A.K. et al., 2000; Summerbell R.C. et al., 2005; Shemer А. et al., 2009).
Следует признать, что в большинстве публикаций авторы сообщают данные об этиологии онихомикоза, вызванного нитчатыми недерматомицетами и дрожжами, полученные наиболее простым методом, т.е. с помощью критерия простой ассоциации. При этом любой микромицет, выделенный при посеве патологического материала, расценивают в качестве возбудителя, независимо от результата микроскопии патологического материала (Mercantini R. et al., 1996).
Есть мнение, что для выяснения роли нитчатых недерматомицетов и дрожжей в этиологии онихомикоза необходимо исследовать их кератиназную активность. Причем, единых подходов к ее выявлению в диагностике онихомикоза не предложено (Mitola G. et al., 2002; Anbu P. et al., 2006). Следовательно, вопрос об этиологической роли нитчатых недерматомицетов и дрожжей при онихомикозе остается открытым, поскольку реальные возбудители заболевания изучены недостаточно, так как универсального подхода к оценке клинической значимости нитчатых недерматомицетов и дрожжей в мире сегодня не существует. Очевидно, необходимы усилия специалистов по достижению консенсуса в области лабораторной диагностики онихомикоза.
Цель исследования. Определить клиническую значимость различных видов микромицетов, выделенных из ногтевых пластин.
Задачи исследования.
- Определить спектр микромицетов (дерматомицетов, нитчатых недерматомицетов и дрожжей), выделяемых из ногтевых пластин у пациентов в Санкт–Петербурге.
- Определить кератиназную активность различных видов микромицетов, выделенных из ногтевых пластин.
- Сравнить эффективность современных методов (микроскопических, культуральных и молекулярно–генетических) диагностики онихомикоза, обусловленного различными микромицетами.
- Разработать алгоритм определения диагностической значимости различных видов недерматомицетов и дрожжей, выделенных из ногтевых пластин.
Научная новизна исследования.
Впервые:
- Определена роль нитчатых недерматомицетов и дрожжевых организмов (наряду с дерматомицетами) в этиологии онихомикоза в Санкт–Петербурге.
- Проведено сравнение эффективности современных микроскопических, культуральных и молекулярно–генетических методов диагностики онихомикоза. Установлено, что наиболее эффективным в определении клинической значимости нитчатых недерматомицетов и дрожжей является «классический» метод культуральной диагностики.
- Изучена кератиназная активность дерматомицетов, нитчатых недерматомицетов и дрожжей, выделенных из ногтевых пластин у пациентов в Санкт–Петербурге, с помощью комплекса физико–химических методов и на моделях ex vivo. Установлено, что дерматомицеты обладают выраженной активностью, нитчатые недерматомицеты – от выраженной до слабой и дрожжевые организмы – слабой, или не обладают совсем.
- Установлено, что способность микромицета к инвазии в здоровую ногтевую пластину на модифицированной нами модели ex vivo является наиболее значимым показателем этиологической роли нитчатых недерматомицетов и дрожжей.
Практическая значимость.
- Показана необходимость выполнения микроскопического исследования соскобов с ногтевых пластин с применением химического красителя и/или флюорохрома; доказана более высокая эффективность культурального метода с повторным забором патологического материала и последующими посевами по сравнению с однократным посевом в 15–20 точках.
- Установлена возможность использования молекулярно-генетического метода в комплексной диагностике онихомикоза, обусловленного дерматомицетами.
- Разработан алгоритм диагностики онихомикоза, обусловленного нитчатыми недерматомицетами и дрожжами, позволяющий повысить качество лабораторного исследования патологического материала.
- Предложен способ определения кератиназной активности микромицетов, выделенных из ногтевых пластин на модели ex vivo.
Положения, выносимые на защиту.
- Условно–патогенные микромицеты – нитчатые недерматомицеты и дрожжи играют важную роль в развитии онихомикоза стоп и онихомикоза кистей. Соотношение «дерматомицеты: нитчатые недерматомицеты: дрожжи» среди возбудителей онихомикоза стоп в Санкт–Петербурге составляет 8:1:1, кистей – 6:1:22. Состав возбудителей онихомикоза стоп и/или кистей представлен 9 и 5 родами микромицетов соответственно.
- Кератиназная активность нитчатых недерматомицетов и дрожжей – важный показатель их роли в этиологии онихомикоза стоп и/или кистей.
- Повторное выделение культуры микромицета того же вида и определение ее кератиназной активности – важный этап в дифференциации нитчатых недерматомицетов и дрожжей как патогенов или контаминантов.
Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации доложены на XI, XII, XIII научно–практических конференциях по медицинской микологии (г. Санкт–Петербург, Россия, 2008, 2009, 2010), а также на научно–практической конференции «Диагностика и лечение микозов кожи и ее придатков. От первичного лабораторного исследования до комплексного лечения» (г. Калининград, Россия, 2010).
Внедрение результатов исследования. Результаты настоящего исследования внедрены в лечебно–диагностическую работу микологической клиники ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава, СПб ГУЗ «ГорКВД», СПб ГУЗ «КВД №11», в практическую работу «Российской коллекции патогенных грибов» и учебный процесс кафедры лабораторной микологии и патоморфологии микозов ГОУ ДПО СПбМАПО Росздрава.
Публикации по теме диссертационного исследования. По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, в том числе 4 статьи в рецензируемом журнале, рекомендованном ВАК.
Личный вклад автора в проведенное исследование. Автор планировала и выполняла основные экспериментальные исследования, участвовала в подготовке клинического материала и культур для проведения молекулярно–генетических исследований (ПЦР, ДНК–сиквенирования). В постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль. Доля участия автора в выделении и идентификации культур микромицетов – 97%; доля участия в обработке данных – 100%; анализе и обобщении экспериментального материала – 100%.
Объем и структура диссертации. Диссертационная монография изложена на 107 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы, их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 104 источника. Текст диссертации иллюстрирован 18 таблицами и 48 рисунками.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Объекты исследования: соскобы с ногтевых пластин от 508 пациентов с подозрением на наличие у них онихомикоза и обратившихся в микологическую клинику НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО.
Культуры микромицетов, используемые в исследовании для определения кератиназной активности, были выделены в период с 2008 по 2010 годы и включали следующие виды (штаммы №№): Trichophyton rubrum № 597, T. interdigitale № 148, Mucor racemosus № 100, Penicillium commune № 550, Acremonium pоtronii № 9, A. hyalinulum № 627, Aspergillus versicolor №№ 557, 290 и 514, A. nidulans № 424, A. terreus № 213, Fusarium oxysporum №№ 39, 566 и 671, Candida parapsilosis №№ 504 и 614, C. albicans №№ 362 и 499, C. dubliniensis № 281, C. lusitaniae № 126, Trichosporon mucoides № 281.
Для микроскопии патологического материала (соскобы с ногтевых пластин) использовали: 10% раствор KOH с добавлением 400 мл/л «димексида» (DMSO); 0,001% метиленового синего и 600 мл/л дистиллированной воды. Препараты вначале просматривали в световом микроскопе, затем – в люминесцентном, добавляя к вышеупомянутому раствору флюоресцентный маркер – калькофлюор белый. При просмотре препаратов отмечали наличие или отсутствие грибных элементов: гифы, артроспоры, дрожжевые, в т.ч. почкующиеся, клетки, псевдомицелий.
Посев производили на агар Сабуро с 2% глюкозы и хлорамфениколом (40 мг/л). Соскобы с ногтевых пластин засевали двумя способами: а) «классическим»: с повторными заборами патологического материала и последующими посевами и б) «альтернативным»: однократный посев в 15–20 точек и более. Посевы инкубировали при 28°С в течение 2–3 недель. Выросшие культуры нитчатых грибов идентифицировали до вида по макро– и микроморфологическим признакам (Hoog de G. et al., 2009) или ДНК–сиквенированием (генетический анализатор 3500 «Applied Biosystems», США). Видовую принадлежность дрожжей определяли биохимически с помощью тест–системы «Auxacolor®2» (BioRad, Франция).
Для выявления дерматомицетов провели молекулярно–генетическое исследование 248 образцов ногтевых пластин. Выделение ДНК из клинических образцов для ПЦР–анализа проводили с помощью набора «Реамикс» (Москва) с предварительной инкубацией в течение 2 часов при 37°С в лизирующем растворе. Амплификацию проводили с помощью диагностического набора «ТрифАм», позволяющего выявить Trichophyton rubrum и T. mentagrophytes var. interdigitale. Исследование выполняли в НИЛ молекулярно–генетической микологии НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина (заведующая лабораторией – Игнатьева С.М.).
Критерии диагностики онихомикоза, обусловленного нитчатыми недерматомицетами и дрожжами. При положительном результате микроскопии и выделении дерматомицета из патологического материала этиологический диагноз онихомикоза считали установленным.
В случае отсутствия роста культуры дерматомицета и обнаружения роста нитчатых недерматомицетов и дрожжей, последних считали этиологически значимыми, если они вырастали в 5–ти точках и более из 20–ти засеянных фрагментов (минимум в 25% от общего числа засеянного материала) (Walshe M.M. et al., 1966) или в 11–ти точках из 15–ти засеянных (минимум в 73% от общего числа засеянного материала) (Gupta A.K. et al., 2000) и обладали кератиназной активностью. В случае роста культуры микромицета в меньшем количестве точек проводили повторный забор патологического материала с целью получения этой же культуры и определения кератиназной активности.
Кератиназную активность микромицетов изучали пятью методами, оценивая их способность поражать волосы (перфорация и эрозия), инвазировать ноготь на модифицированной нами модели ex vivo, подщелачивать жидкие среды с кератином (№1, pH=7,7 и №2, pH=6,6) и высвобождать аминный азот в процессе гидролиза кератина грибом (формольное титрование) после инкубации через 7, 14, 21 и 28 суток в средах №1 и №2 (И.А. Дудка и др. 1982; Shu–hui Tan C. et al., 1994; Kaul S. et al., 1997; Kaul S. et al., 1999).
При определении способности грибов к перфорации и эрозии волос, инвазии ногтевой пластины на моделях ex vivo, использовали специальную жидкую питательную среду. В качестве кератинового субстрата использовали стерильные детские волосы и срезы со здоровых детских ногтей. В среду с кератином вносили взвеси испытуемых культур в объеме 400 мкл. Контролем служила среда с кератином без культуры гриба; инкубировали при 28 °С нитчатые грибы, при 32°С – дрожжевые в течение 2 недель. Затем кератин–содержащие субстраты отмывали от мицелия механическим путем в дезинфицирующем растворе и просматривали в световом микроскопе с использованием 10% KOH и DMSO с целью обнаружения перфорации волоса грибом, а в ногте – инвазии микромицета (Mitola G. et al., 2002; Kushwaha R. K. S. et al., 2008; Marchisio V. F. et al., 2000).
Полученные данные обрабатывали c использованием программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.5 Лиц. №AXXR402C29502 3FA). Сопоставление частотных характеристик качественных показателей проводили с помощью непараметрических методов 2, 2 с поправкой Йетса (для малых групп), критерия Фишера. Анализ количественных параметров кератиназной активности в исследуемых группах осуществляли с использованием критериев Манна–Уитни, Вальда, медианного хи–квадрат и модуля ANOVA. Сравнение показателей, получаемых разными методами, выполняли с помощью критерия знаков и критерия Вилкоксона. Критерием статистической достоверности получаемых данных считали величину p<0,05.
Результаты собственных исследований. Микроскопически исследовали 587 образцов патологического материала от больных с клиническим диагнозом онихомикоза стоп и/или кистей.
Из таблицы 1 следует, что данные, полученные при микроскопии с использованием раствора DMSO и KOH с добавлением красителя (метиленового синего) и флюорохрома (калькофлюора белого) сравнимы (p>0,05) и, следовательно, равноценно могут быть использованы при диагностике онихомикоза. В дальнейших исследованиях использовали оба метода.
Таблица 1
Результаты световой и люминесцентной микроскопии соскобов из ногтевых пластин
| Наличие элементов гриба при микроскопии (n=587) | |||
| световой (DMSO + KOH + метиленовый синий) | люминесцентной (DMSO + KOH + метиленовый синий + калькофлюор белый) | ||
| «–» | «+» | «–» | «+» |
| 225 | 362 | 197 | 390 |
| 38% | 62% | 34% | 66%* |
Примечание: * p>0,05
Для сравнительной оценки результатов культуральных исследований использовали выборку в количестве 508 образцов ногтевых пластин при однократном посеве в 15–20 точек и повторном заборе материала с последующим посевом. Положительный результат при микроскопии патологического материала регистрировали в 360 образцах (70,9%), при первичном посеве выделено 164 (32,3%) культур, из них 30 – с кистей, 134 – со стоп (табл. 2).
Таблица 2
Спектр микромицетов, выделенных при онихомикозе кистей и/или стоп после однократного микологического исследования
(«альтернативный» способ)
| Культура микромицета | Количество выделенных культур со стоп | Количество выделенных культур с кистей | Общее количество культур |
| Дерматомицеты | |||
| T. rubrum | 84 (62,7%) | 5 (16,7%) | |
| T. tonsurans | 9 (6,7%) | 1 (3,3%) | |
| T. interdigitale | 3 (2,2%) | – | |
| Всего | 96 (71,6%) | 6 (20%) | 102 (62,2%) |
| Нитчатые недерматомицеты | |||
| Acremonium sp. | 1 (0,7%) | – | |
| A. versicolor | 3 (2,2%) | – | |
| A. terreus | 1 (0,7%) | – | |
| A. nidulans | 1 (0,7%) | – | |
| Chaetomium globosum | 2 (1,5%) | – | |
| Fusarium spp. | 4 (3%) | 1 (3,3%) | |
| Scopulariopsis brevicaulis | 1 (0,7%) | – | |
| Mucor spp. | 4 (3%) | – | |
| Penicillium spp. | 5 (3,7%) | – | |
| Всего | 22 (16,4) | 1 (3,3%) | 23 (14%) |
| Дрожжи | |||
| Candida parapsilosis | 5 (3,7%) | 7 (23,3%) | |
| C. albicans | 2 (1,5%) | 5 (16,7%) | |
| C. lusitaniae | – | 1 (3,3%) | |
| Candida spp. | 5 (3,7%) | 8 (26,7%) | |
| Trichosporon mucoides | – | 1 (3,3%) | |
| Trichosporon sp. | 1 (0,7%) | – | |
| Всего | 13 (9,7%) | 22 (73,3%) | 35 (21,3%) |
| Ассоциации грибов | |||
| Trichophyton rubrum + Acremonium sp. | 2 (1,5%) | – | |
| Candida sp. + Exophiala sp. | – | 1 (3,3%) | |
| Acremonium sp. + Scytalidium hyalinum | 1 (0,7%) | – | |
| Всего | 3 (2,2%) | 1 (3,3%) | 4 (2,4%) |
| Всего выделено культур | 134 | 30 | 164 |
Из образцов ногтевых пластин с отрицательным результатом микроскопии при первичном посеве выделено 2 штамма Candida parapsilosis.
При посевах повторно забранного материала выделили 22 культуры (19,8%) среди них: дерматомицеты - 7 (Trichophyton rubrum), нитчатые недерматомицеты - 2 (Aspergillus versicolor, Fusarium sp.), дрожжи - 11 (3 Candida sp., 5 C. parapsilosis, 1 C. guilliermondii, 1 C. lusitaniae, 1 C.dubliniensis), микромицеты в ассоциациях - 2 (Trichophyton rubrum + Acremonium sp., Fusarium sp.+ C. guilliermondii).
Среди нитчатых недерматомицетов и дрожжей вновь были выделены 15 штаммов: 8 культур Candida sp., 2 культуры C. parapsilosis, C. guilliermondii, C. lusitaniae, C.dubliniensis, Fusarium sp., Fusarium sp.+C. guilliermondii и повторно 7 штаммов: 2 штамма Candida sp., 3 штамма C. parapsilosis, Aspergillus versicolor, Trichophyton rubrum+Acremonium sp.
При сравнении результатов двух способов посева («альтернативного» и «классического») последний достоверно эффективнее для выделения микромицетов в культуре (p<0,01) как для дерматомицетов, так и для нитчатых недерматомицетов и дрожжей, а также их ассоциаций (табл. 3) и, следовательно, является предпочтительным в оценке их этиологической значимости.
Таблица 3
Сравнение способов оценки клинической значимости микромицетов (культуральные методы)
| Возбудители | I посев («альтернативный» способ – рост в 5–ти из 20, в 11–ти из 15 точек) | II посев («классический» способ – повторные посевы) |
| Дерматомицеты | 102 (93%) | 109 (100%)* |
| Нитчатые | 13 (93%) | 14 (100%) |
| Дрожжевые | 30 (86%) | 35 (100%) * |
| Смешанные | 4 (80%) | 5 (100%) |
| ИТОГО | 149 (91%) | 163 (100%)** |
Примечание: * p<0,05
** p<0,01
Для оценки эффективности метода ПЦР («ТрифАм») в диагностике онихомикоза, обусловленного дерматомицетами, исследовали 248 образцов патологического материала, из них 226 (91,1%) были взяты со стоп и 22 (8,9%) с кистей. В 140 образцах не обнаружили ДНК гриба рода Trichophyton (56%), из них 11 (9,2%) - с кистей, 129 (90,8%) - со стоп. В 108 (44%) – обнаружили ДНК гриба рода Trichophyton, из них 11 (8,6%) - с кистей, 97 (91,4%) – со стоп.
Все исследованные образцы были подразделены на 5 групп (табл. 4).
Таблица 4
Результаты микроскопического, культурального и ПЦР-метода («ТрифАм–тест») исследования ногтевых пластин
| Методы диагности– ки Группы образцов | Микроскопия KOH+DMSO +калькофлю–ор белый | Культура | ПЦР | ||
| Кол–во результатов | % выявления дерматомицетов методом ПЦР | ||||
| «+» | «–» | ||||
| 1 группа n=77 | + | + (Trichophyton spp.) | 53 | 24 | 69% |
| 2 группа n=33 | + | + (недермато–мицеты) | 12 | 21 | 36% |
| 3 группа n=10 (лечение) | + | – | 2 | 8 | 20% |
| 4 группа n=69 ( без лечения) | + | – | 38 | 31 | 55% |
| 5 группа n=59 | – | – | 3 | 56 | 5% |
| % выявления микромицетов N=248 | 76%* | 44% | 44% | 56% | 43,5% |
Примечание: * – статистически значимое различие между выявлением грибов методом микроскопии, культуральным методом и методом ПЦР (p=0,0001).
Поскольку «ТрифАм ПЦР-тест» предназначен для детекции двух видов дерматомицетов, а именно T. rubrum и T.interdigitale, мы оценивали чувствительность, специфичность и прогностическую ценность этого теста по отношению к результатам микроскопии и культивирования, на образцах ногтей в группе 1 (табл.4). Как видно из таблицы 5 чувствительность тест–системы составила 69%, специфичность – 95%; прогностическая ценность положительного результата составила 95%, отрицательного результата – 70%.
Таблица 5
Оценка эффективности метода ПЦР («ТрифАм–тест») в сравнении
с микологическим исследованием (микроскопия и посев)
| Результаты | |||
| ПЦР теста | Микроскопического и культурального исследования | Прогностическая ценность (%) | |
| Положительный | Отрицательный | ||
| Положительный | 53 | 3 | 95 |
| Отрицательный | 24 | 56 | 70 |
| Итог | 69% | 95% | – |
Тест-система показала высокий результат, при этом чувствительность метода составила 69%, что значительно ниже чувствительности аналогичных ПЦР систем. Так, по результатам зарубежных исследователей (Arabatzis M. et al., 2007; Beifuss B. et al., 2009; Brillovska–Dabrowska A. et al., 2010; Kondori N. et al., 2010) чувствительность аналогичных ПЦР-тестов составила 85–100%, специфичность – 80–95%, прогностическая ценность положительного результата составила 51–100%, отрицательного – 82–100%.
Более того, по сравнению с результатами микроскопии, которая рекомендуется в стандарте диагностики и лечения онихомикоза в РФ, чувствительность этого метода ПЦР оказалась еще ниже и составила 55% (табл. 6).
Таблица 6
Оценка эффективности метода ПЦР («ТрифАм–тест»)
в сравнении с микроскопией патологического материала
| Результаты | |||
| ПЦР теста | Микроскопического исследования | Прогностическая ценность (%) | |
| Положительный | Отрицательный | ||
| Положительный | 105 | 3 | 97 |
| Отрицательный | 84 | 56 | 40 |
| Итог | 55% | 95% | – |
Процент обнаружения элементов грибов (дерматомицетов, нитчатых недерматомицетов и дрожжей) с помощью микроскопии патологического материала составил в целом 76 (т.е. в 59 случаях из 248 элементы гриба не были обнаружены). В соответствии с полученными нами данными эффективность выявления микромицетов культуральным методом была ниже, чем при микроскопии – 44%, причем, 31% из них составляют дерматомицеты. Таким образом, в результате выявления дерматомицетов молекулярно-генетическим и культуральным методами выраженных различий не обнаружено (p=0,06).
Исходя из результатов нашей работы, очевидно, что при диагностике онихомикоза, необходим более чем один микологический метод, и тест «ТрифАм» в настоящее время целесообразно использовать в сочетании с микроскопическим и культуральным исследованием. С целью подтверждения диагностической значимости выделенных нитчатых недерматомицетов и дрожжей мы изучили их кератиназную активность в сравнении с дерматомицетами (a priori ею обладающими) различными методами.
Результаты оценки выраженности поражения волос (поверхностная эрозия и перфорация волос), а также наличия инвазии гриба и его распространенности в ногте на моделях ex vivo представлены в таблицах 7 и 8.
Таблица 7
Оценка поражения волос и ногтевых пластин исследуемыми культурами микромицетов
| Оценочный индекс | Наличие перфорации и эрозии волос (активность) | Наличие инвазии микромицета в ноготь |
| ++++ (очень высокая) | В каждом волосе | В каждом или почти в каждом поле зрения |
| +++ (высокая) | Почти в каждом волосе | В 2/3 полей зрения |
| ++ (умеренная) | В половине из исследуемых волос | В 1/3 полей зрения |
| + (низкая) | Редко | Редко (единичные элементы гриба в 1–ом или 2–х полях зрения) |
| – (отрицательная) | отсутствует | отсутствует |
Таблица 8
Результаты теста на перфорацию волос микромицетами и их способности
к инвазии ногтевой пластины
| Исследуемая культура | Перфора–ция волос | Поверхност–ная эрозия волос | Инвазия в ногтевую пластину | Примечание | |
| Дермато–мицеты | Trichophyton rubrum 597 | – | + | ++++ | |
| Trichophyton interdigitale 148 | ++++ | ++++ | ++++ | ||
| Нитчатые дерматомицеты | Mucor racemosus 100 | +++ | ++ | – | В ногте обнаружены единичные споры |
| Penicillium commune 550 | – | – | – | ||
| Aspergillus nidulans 424 | ++ | +++ | ++ | ||
| Aspergillus versicolor 557 | +++ | ++ | + | ||
| Aspergillus versicolor 514 | ++ | +++ | – | ||
| Aspergillus versicolor 290 | – | ++ | + | Мицелий в ногте очень тонкий (1,6 мкм) | |
| Aspergillus terreus 213 | ++++ | – | ± | В ногте обнаружены споры | |
| Acremonium hyalinulum 627 | +++ | ++ | ++ | Мицелий в ногте очень тонкий (1,5 мкм) | |
| Acremonium potronii 9 | ++++ | +++ | +++ | ||
| Fusarium oxysporum 39 | ++ | ++ | ++ | У данного штамма мицелий в ногте тоньше, чем у других штаммов этого рода гриба (2,2 мкм) | |
| Fusarium oxysporum 566 | – | ++++ | ++++ | ||
| Fusarium oxysporum 671 | +++ | + | ++++ | ||
| Дрожжевые организмы | Candida albicans 362 | +++ | ++ | ++ | Кутикула волос лизирована в 80%, в ногтевой пластине обна–ружены только дрожжевые почкующиеся клетки |
| Candida albicans 499 | ++ | ++ | + | Адгезия | |
| Trichosporon mucoides 281 | ++ | ++ | + | Адгезия | |
| Candida parapsilosis 504 | ++ | ++ | + | Адгезия | |
| Candida parapsilosis 614 | +++ | ++ | + | Адгезия | |
| Candida lusitaniae 126 | +++ | ++ | + | Адгезия | |
| Candida dubliniensis 343 | +++ | ++ | + | Адгезия | |
Нами обнаружено, что Trichophyton rubrum в сравнении с T. interdigitale волосы не перфорирует (табл. 8), но слабо эрозирует кутикулу волоса, что совпадает с известными видовыми характеристиками; распространенность мицелия в ногте оценили максимальной (++++) для T. rubrum и для T. interdigitale (рис. 1).
Рис. 1. Trichophyton interdigitale. Перфорация и эрозия волоса (А) и активная инвазия гриба в чешуйки ногтевой пластины (Б). (Световая микроскопия (10% KOH и DMSO) х 400)
Mucor racemosus обладал умеренной активностью при перфорации волос (+++) и поверхностной эрозии (++), но не инвазировал ногтевую пластину. Penicillium commune был неактивен по этим показателям. Aspergillus nidulans и Acremonium hyalinulum были сравнимы по оцениваемым показателям (++); штаммы Aspergillus versicolor (557, 514, 290) были умеренно активными в отношении волос и, как правило, мало активными – в отношении инвазии ногтевой пластины. Для 514–го штамма A. versicolor было характерно разрушение волос при отсутствии размножения в ногте. Несмотря на то, что разрушительная активность Aspergillus terreus и Trichophyton interdigitale в отношении волос была оценена как очень высокая, следует отметить разный характер поражения волос. Так, T. interdigitale практически «пробуравливает» волос, тогда как Aspergillus terreus сильно меняет конфигурацию волоса, т.е. его стенки не параллельны друг другу и сильно бугристы, а перфорация незначительна, однако поражение наблюдали в каждом волосе. A. terreus в ногте не размножался, но были обнаружены споры. Acremonium potronii высоко активен по оцениваемым показателям и сравним по активности с T. interdigitale.
Примечательно, что Fusarium oxysporum 566 не перфорирует волосы при высокой способности к поверхностной эрозии и обильном размножении в ногтевой пластине.
Для F. oxysporum 671 характерно не только его обильное наличие, как у предыдущего штамма, но и высокая активность в отношении перфорации волос (+++). F. oxysporum 39 обладает умеренной активностью по перечисленным выше показателям (++).
При оценке дрожжей по этим показателям установлено, что почти все они оказались слабо активными применительно к перфорации и эрозии волос (в основном, это была поверхностная эрозия в виде лизиса кутикулы и небольшого изменения структуры волоса) и в отношении инвазии ногтевой пластины (единичные, редко почкующиеся дрожжевые клетки), за исключением штамма Candida albicans 362. Trichosporon mucoides обнаруживали в ногтевой пластине редко (+), однако в отличие от дрожжей рода Candida, наблюдали растущий мицелий, наряду с единичными почкующимися клетками.
Подщелачивание среды культивирования, в сравнении с контрольными средами №1 и №2, подтверждает способность лизировать кератин исследуемыми штаммами грибов. Тенденцию к подщелачиванию испытуемых сред отмечали при культивировании дерматомицетов (Trichophyton rubrum 597, T. interdigitale 148) и некоторых нитчатых недерматомицетов (Mucor racemosus 100, Acremonium potronii 9, Aspergillus versicolor 290, A. terreus 213, Fusarium oxysporum 39, F. oxysporum 566, F. oxysporum 671). Дрожжи после инкубации не изменяли значение pH.
Метод формольного титрования применяли в параллели с предыдущим методом на тех же средах, непосредственно после измерения pH. При этом оценивали степень ферментативного гидролиза кератина по количеству высвобождающегося аминного азота (на 21 и 28 сутки).
Как видно из таблицы 9, наибольшей кератиназной активностью обладали дерматомицеты Trichophyton rubrum 597 и T. interdigitale 148.
Таблица 9
Определение содержания аминного азота после инкубации
нитчатых грибов в питательных средах №№ 1 и 2
| №№ штаммов: | № среды | Содержание азота (мг) (M±m) через | |
| 21 сутки | 28 суток | ||
| Trichophyton rubrum 597 | № 1 | 0,28* | 1,47±0,41* |
| № 2 | 0,49±0,07* | 0,28* | |
| Trichophyton interdigitale 148 | № 1 | 1,05±0,21* | 0,70±0,08 |
| № 2 | 1,26±0,24* | 1,33±0,35* | |
| Mucor racemosus 100 | № 1 | 0 | 0 |
| № 2 | 0 | 0 | |
| Penicillium commune 550 | № 1 | 0 | 0 |
| № 2 | 0 | 0 | |
| Acremonium potronii 9 | № 1 | 0,525±0,035* | 0,525±0,035* |
| № 2 | 0,56* | 0,455±0,035* | |
| Acremonium hyalinulum 627 | № 1 | 0,28* | 0,42* |
| № 2 | 0,28* | 0,42* | |
| Aspergillus versicolor 557 | № 1 | 0,28* | 0,42* |
| № 2 | 0,28* | 0,42* | |
| Aspergillus versicolor 514 | № 1 | 0 | 0,28* |
| № 2 | 0 | 0 | |
| Aspergillus versicolor 290 | № 1 | 0 | 0,28* |
| № 2 | 0 | 0 | |
| Aspergillus nidulans 424 | № 1 | н/о | н/о |
| № 2 | 0 | 0 | |
| Aspergillus terreus 213 | № 1 | 0,14±0,08* | 0,21±0,07* |
| № 2 | 0 | 0,28* | |
| Fusarium oxysporum 39 | № 1 | 0,56* | 0,49±0,07* |
| № 2 | 0,455±0,035* | 0,49±0,07* | |
| Fusarium oxysporum 566 | № 1 | 0,49±0,04* | 0,56±0,16* |
| № 2 | 0,42±0,14* | 0,42±0,14* | |
| Fusarium oxysporum 671 | № 1 | 0,28* | 0,42±0,06* |
| № 2 | 0,28* | 0,42±0,06* | |
Примечание: * p<0,05
Среди нитчатых недерматомицетов в среде культивирования аминный азот обнаруживали у Acremonium potronii 9, A. hyalinulum 627, Aspergillus versicolor 557, Fusarium oxysporum 671, F. oxysporum 39, F. oxysporum 566. Примечательно, что у Mucor racemosus 100 и Penicillium commune 550 отсутствовал аминный азот в средах в сравнении с контролем, также как и у дрожжей. На основании данных исследования кератиназной активности микромицетов можно заключить, что наибольшую активность проявили дерматомицеты как в отношении волос, так и ногтевых пластин на моделях ex vivo, а также применительно к высвобождению аминного азота (формольное титрование). По этим показателям нитчатые недерматомицеты: Acremonium potronii 9, штаммы Fusarium oxysporum 566 и 671 обладали высокой активностью, F. oxysporum 39, A. hyalinulum 627 и Aspergillus nidulans 424 – умеренной активностью. Штаммы A. versicolor 557 и 290, а также A. terreus 213 – низкой активностью.
Из исследуемых дрожжевых грибов умеренной активностью по всем пяти тестам обладал штамм № 362 Candida albicans с высокой активностью в отношении перфорации волос и умеренной в отношении эрозии волос и инвазии ногтя на модели ex vivo при отрицательных результатах дезаминирования кератина. Дрожжи (Candida parapsilosis № 504, C. parapsilosis № 614, C. albicans № 499, C. dubliniensis № 343, C. lusitaniae № 126 и Trichosporon mucoides № 281) имеют высокую и умеренную активность в отношении волос и низкую активность в отношении ногтей на модели ex vivo.
Остальные исследуемые нитчатые микромицеты мы отнесли к грибам–контаминантам, так как Penicillium commune 550 не обладал кератиназной активностью (отрицательными были все используемые в эксперименте тесты), а также Mucor racemosus № 100 и Aspergillus versicolor № 514, у которых отмечали умеренную активность в отношении перфорации и эрозии волос, а также умеренную активность в тесте формольного титрования у A. versicolor № 514, но отсутствовала инвазия в ногтевую пластину у обоих штаммов. Наряду с этим, необходимо помнить о межштаммовых различиях микромицетов.
При статистической обработке данных, выявлено, что из пяти используемых методов, дифференцирующих группы возбудителей по кератиназной активности, приемлемыми оказались два метода: инвазия гриба в ногтевую пластину и формольное титрование (p<0,05) (рис. 2).
Учитывая, что метод инвазии гриба в ногтевую пластину наиболее приближен к реальному течению заболевания и достаточно прост в исполнении, полагаем, что наличие инвазии гриба вглубь здоровой ногтевой пластины на модели ex vivo может быть использовано в качестве показателя потенциальной способности микромицета поражать кератинизированные ткани и может служить одним из критериев определения патогенности микромицета в свете оценки результатов культурального исследования поражения ногтевых пластин при онихомикозе.
Рис. 2. Сравнение кератиназной активности микромицетов
различными методами
Отметим, что штаммы микромицетов, которым дана в этом исследовании комплексная оценка кератиназной активности, были выделены однократно в 5–ти из 20–ти или 11–ти из 15–ти точек посева («альтернативный» способ) или в результате повторных заборов патологического материала и его посевов на среды («классический» способ). Однако в ходе эксперимента выявлено, что не все из исследуемых штаммов обладали кератиназной активностью, следовательно, этиологическая структура онихомикоза стоп и онихомикоза кистей в г. Санкт–Петербурге, исключая клинически незначимые, может быть представлена следующим образом (рис. 3):
Рис. 3. Этиологическая структура онихомикоза кистей (n=30) (справа), онихомикоза стоп (n=124) (слева)
В настоящее время каждый из используемых способов оценки роли микромицетов в этиологии онихомикоза на основании культурального исследования не является универсальным (и это подтверждено нашими исследованиями). Учитывая полученные нами данные о кератиназной активности грибов, можно сделать вывод о том, что при решении вопроса о клиническом значении нитчатых недерматомицетов и дрожжей необходимо использовать «классический» культуральный метод (повторное выделение одного и того же вида гриба) в совокупности с определением способности гриба проникать в ноготь на модели ex vivo.
На основании представленных результатов исследования нами разработан алгоритм комплексной оценки этиологической значимости нитчатых недерматомицетов и дрожжей при онихомикозе (Рис. 4), что поможет правильно установить окончательный клинический диагноз и адекватно проводить лечебные мероприятия.
Рис. 4. Алгоритм диагностики онихомикоза, обусловленного нитчатыми недерматомицетами и дрожжами, выделенными из ногтевых пластин
Примечание: НДМ – нитчатые недерматомицеты.
ВЫВОДЫ
- Установлен спектр микромицетов (дерматомицетов, нитчатых недерматомицетов, дрожжей и их ассоциаций), изолированных от пациентов с онихомикозом в Санкт–Петербурге (стоп – 77,4%, 9,7%, 10,5% и 2,4% соответственно; кистей – 20%, 3,3% и 73,4% и 3,3% соответственно):
- дерматомицеты: на стопах – T. rubrum (67,7%), T. tonsurans (7,3%) и T. interdigitale (2,4%); на кистях – T. rubrum (16,7%) и T. tonsurans (3,3%).
- нитчатые недерматомицеты: на стопах – Acremonium sp. (0,8%), Aspergillus spp. (3,2%), Chaetomium globosum (1,7%), Fusarium spp. (3,2%) и Scopulariopsis brevicaulis (0,8%); на кистях – Fusarium spp. (3,3%).
- дрожжи: на стопах – Candida spp. (9,7%) и Trichosporon spp. (0,8%); на кистях – Candida spp. (70,1%) и Trichosporon spp. (3,3%).
- микромицеты в ассоциациях: на стопах Trichophyton rubrum и Acremonium sp. (1,6%), Acremonium sp. и Scytalidium hyalinum (0,8%); на кистях – Candida sp. и Exophiala sp. (3,3%).
- Микромицеты, выделенные из ногтевых пластин у больных онихомикозом, обладают различной кератиназной активностью: дерматомицеты – выраженной, нитчатые недерматомицеты – от выраженной до слабой и дрожжевые организмы – слабой или совсем не проявляют активности.
- Адгезия и инвазия дерматомицетами, нитчатыми недерматомицетами или дрожжами здоровой ногтевой пластины на модели ex vivo является показателем способности микромицетов поражать кератинизированные ткани и может служить одним из критериев патогенности микромицета.
- Воспроизведение роста культур нитчатых недерматомицетов и дрожжей в повторных посевах в сочетании с определением кератиназной активности (на модели инвазии грибом ногтевых пластин ex vivo) – основной критерий в разграничении клинически значимых патогенов и контаминантов при онихомикозе.
Практические рекомендации.
- При диагностике онихомикоза рекомендуется проводить исследование патологического материала с помощью люминесцентной (калькофлюор белый) или световой микроскопии с применением раствора KOH+DMSO+метиленовый синий.
- При культуральном методе исследования соскобов с ногтевых пластин предпочтение следует отдавать «классическому» методу с повторными заборами патологического материала и последующими посевами.
- Метод ПЦР–дагностики (тест–система «ТрифАм») рекомендуется использовать только для комплексной диагностики онихомикоза, обусловленного дерматомицетами (дополнительно к микроскопическому и культуральному).
- Для установления этиологической роли нитчатых недерматомицетов и/или дрожжей при онихомикозе целесообразно проведение теста на инвазию грибом ногтевой пластины на модели ex vivo.
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Пупкова М.А., Кубасова Н.Л. Этиологическая роль недерматомицетов в патогенезе онихомикоза. // Проблемы медицинской микологии. – 2008. – Т.10, №2. – С. 72–73.
- Васильева Н.В., Разнатовский К.И., Котрехова Л.П. [и др.]. Этиология онихомикоза стоп в г. Санкт–Петербурге и г. Москве. Результаты проспективного открытого многоцентрового исследования. // Проблемы медицинской микологии. – 2009. – Т.11, №2. – С. 14–18.
- Пупкова М.А. Определение кератинолитической активности некоторых микромицетов: (обзор). // Проблемы медицинской микологии. – 2010. – Т.12, №2. – С. 53–58.
- Кубасова Н.Л., Пупкова М.А., Васильева Н.В., Клиценко О.А. Особенности диагностики и лечения онихомикоза стоп, обусловленного нитчатыми недерматомицетами и дрожжами // Проблемы медицинской микологии. – 2010. – Т.12, №3. – С. 25–28.
- Пупкова М.А., Кубасова Н.Л. Кератиназная активность некоторых микромицетов, выделенных с ногтевых пластин пациентов с онихомикозом. // Проблемы медицинской микологии. – 2010. – Т.12, №3. – С. 29–38.
