WWW.DISUS.RU

БЕСПЛАТНАЯ НАУЧНАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ БИБЛИОТЕКА

 

Активностьэритроцитов в отношениивакцинных штаммов возбудителей чумы,сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза иобоснование её роли в патогенезе данныхзаболеваний

На правах рукописи

Оборин ВикторАфанасьевич

БАКТЕРИОФИКСИРУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬЭРИТРОЦИТОВ

В ОТНОШЕНИИВАКЦИННЫХ ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ЧУМЫ,СИБИРСКОЙ ЯЗВЫ, ТУЛЯРЕМИИ, БРУЦЕЛЛЕЗА ИОБОСНОВАНИЕ ЕЁ РОЛИ В ПАТОГЕНЕЗЕ ДАННЫХЗАБОЛЕВАНИЙ

14.03.03 – патологическаяфизиология

03.02.03 –микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации насоискание ученой степени

доктора медицинскихнаук

Саратов – 2011

Работа выполнена вГосударственном образовательномучреждении высшего профессиональногообразования «Вятский государственныйуниверситет» Министерства образования инауки Российской Федерации.

Научныйконсультант:

член-корреспондент РАН,

доктор медицинских наук,профессорПименов ЕвгенийВасильевич.

Официальныеоппоненты:

доктор медицинских наук,профессорМоррисон ВиталийВикторович;

доктор медицинских наук,профессорСпицын АнатолийПавлович;

доктор биологическихнаук,профессорИгнатов ОлегВладимирович.

Ведущаяорганизация: Государственноеобразовательное учреждение высшегопрофессионального образования «Казанскийгосударственный медицинский университет»Министерства здравоохранения исоциального развития РоссийскойФедерации.

Защита диссертациисостоится « » _________ 2011 г. в« » часов на заседаниидиссертационного совета Д 208.094.03 при ГОУВПО Саратовский ГМУ им. В.И. РазумовскогоМинздравсоцразвития России по адресу: 410012,г. Саратов, ул. Б. Казачья, 112.

С диссертацией можноознакомиться в библиотеке ГОУ ВПОСаратовский ГМУ им. В.И. РазумовскогоМинздравсоцразвития России.

Автореферат разослан« » _____________ 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

доктор медицинских наук,

профессорКодочигова А.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКАРАБОТЫ

Актуальностьпроблемы. Чума, сибирскаяязва, туляремия и бруцеллез относятся кзооантропонозным природно-очаговым особоопасным инфекциям, вспышки которыхпостоянно регистрируются в России, странахближнего и дальнего зарубежья (Онищенко Г.Г., 2003; Смирнова Н.И.,Кутырев В.В., 2006; Топорков В.П., 2007;Безсмертный В.Е., ГорошенкоВ.В., Попов В.П., 2009; Попов Н.В. Куклев Е.В., Кутырев В.В., 2008; Arbaji А., KharabshehS., Al-Azab S., 2005; DayaM., Nakamura Y., 2005;Begier E.M., 2006; Frazier A.A., Franks T.J., Galvin J.R., 2006). Впоследние годы наблюдается тенденция кувеличению количествазаболеваний животных илюдей, вызванных данными возбудителями (Покровский В.И., ПакС.Г., 2004; Онищенко Г.Г., 2007; КутыревВ.В., Смирнова Н.И.,2008). Это обусловлено миграционнымипроцессами, развитием индустрии туризма,экологическими проблемами. Не исключенавозможность применения возбудителейданных инфекций в качестве агентовбиотерроризма (Онищенко Г.Г., 2005; АфанасьеваГ.А., Чеснокова Н.П.,Дальведянц С.М., 2008; Lippi D., Conti A., 2002) и появлениязаболеваний, вызванных измененнымиформами микроорганизмов (Наумов А.В., ЛедвановМ.Ю., Дроздов И.Г., 1992;Домарадский И.В., 1998). Несмотря на достигнутые успехи впрофилактике указанных выше инфекцийэффективность лечения поздних случаевчумы и сибирской язвы остается на низкомуровне. Решение этих проблемможет быть осуществлено только с учетомрасширения знаний об их патогенезе.

Патогенез инфекционныхзаболеваний представляет собой многокомпонентный и многостадийный процесс,обусловленный как патогенными свойствамивозбудителей болезни, так и ответнойреакцией организма на их внедрение. На сегодняшний день установленыосновные факторы патогенности Y. pestis, B. anthracis, F. tularensis,B. melitensis, B. bovis, B. оvisи B. canis(Ерошенко Г.А., Кутырев В.В., 2003; Кутырев В.В.,Смирнова Н.И., 2003; Попов Н.В.,Безсмертный В.Е., Новиков Н.Л., 2006; Смирнова Н.И., Кутырев В.В., 2006).Доказана защитная роль микро- и макрофаговпри данных инфекциях (НаумовА.В., Кузмиченко И.А.,Тараненко Т.М., 1995;Афанасьева Г.А., Чеснокова Н.П.,Дальведянц С.М., 2008; БываловА.А., Гаврилов К.Е.,Крупин В.В., 2008; ДентовскаяС.В., Платонов М.Е., КомбароваТ.И., 2009; Ben-Gurion R.,Shafferman A., 1981). Фагоцитарная функциялейкоцитов имеетважное значение вреализации естественнойрезистентности и специфического иммунитета причуме, сибирской язве, туляремии,бруцеллезе. Вместе с тем при попадании вкровь и возникновении бактериемии, которая является необходимымусловием эпидемического распространениявозбудителейпри трансмиссивных инфекциях, велика вероятность контактавозбудителей этих заболеваний сэритроцитами – самой многочисленной популяциейклеток крови.

Общеизвестно, чтоэритроциты ворганизме осуществляюттранспорт газов. Однаконаряду с газотранспортной ролью онивыполняют и другие витальные функции, в томчисле транспортируют на своей поверхностиразличные эндо- и экзогенные субстанции, которыенаходятся в кровеносном русле. Потенциальные возможностиэритроцитов для взаимодействия смикробами, попавшими вкровь, очень велики. Этообусловлено тем, что в организме здоровогочеловека находится 2,3х1013 эритроцитов, что в сотни раз больше,чем количество лейкоцитов, аплощадь поверхности всехэритроцитов составляет 3800 м2, что в 2000 разпревышает поверхность телавзрослого человека. Кроме того, скоростьдвижения эритроцитов по кровеноснойсистеме позволяет им совершать одинкругооборот за 50 секунд (Баев В.М., 2001;Зинчук В.В., Максимович Н.А.,Борисюк М.В., 2003;Воробьев А.И.,2005).

Косвенным подтверждением того, чтовозбудители указанных выше инфекционныхзаболеваний взаимодействуют сэритроцитами, являются клиническиенаблюдения. У больных чумой, сибирскойязвой и туляремией нередко выявляютсягеморрагические изменения на коже ислизистых оболочках, а также наблюдаетсяснижение количества эритроцитов (Гинсбург Н.Н., 1976; Наумов А.В., ЛедвановМ.Ю., Дроздов И.Г., 1992; Домарадский И.В., 1993; ЛитусовН.В., ВасильевН.Т., Васильев П.Г., 2002). При патоморфологическихисследованиях животных и людей, погибшихот чумы и сибирской язвы, обнаруживаетсявыраженный гемолиз эритроцитов всосудистом русле, печени и селезенке(Лобанов В.Н., 1964; Чалисов И.А., Хазанов А.Т.,1980; Абрамова А.А., Гринберг Л.М., 1993).Результаты исследований гемолитическихсвойств Y.pestis, B. anthracis и F.tularensis(Олсуфьев Н.Г., 1975; Бургасов П.Н. Рожков Г.И., 1984;Домарадский И.В., 1998) косвенносвидетельствуют о воздействии этихвозбудителей на эритроциты. Известно, чточумной, сибиреязвенный и туляремийныймикробы лучше растут на плотныхпитательных средах, в которыепредварительно добавляетсядефибринированная кровь (Туманский В.М., 1958;Олсуфьев Н.Г., 1975; Арасланова В.А., 2009). Внастоящее время у чумного исибиреязвенного микробов обнаруженыбелки, относящиеся к сидерофорам, которыепозволяют вирулентным штаммам Y. pestis и B. anthracis усваиватьжелезо, находящееся в организме хозяина(Ледванов М.Ю., Карниел Э.,Тихонов С.Н., 1995; GeoffroyV.A., Fetherston J.D., Perry R.D., 2000;Gong S., BeardenS.W., Geoffroy V.A., 2001; Perry R.D., ShahJ., Bearden S.W., 2003;Maresso A.W.,2006). Впоследние годы появились сообщения о том,что чумной микроб способен проникатьвнутрь эритроцитов и утилизировать изгемоглобина ионы железа (Федорова В.А.,Девдариани З.Л., 2007), однако эти данныеносят фрагментарный характер. Сведений об изучении фиксирующей активности эритроцитов вотношении возбудителей чумы, сибирскойязвы, туляремии и бруцеллеза в доступнойнам литературе не обнаружено. В связи с этим для лучшего пониманияпатогенеза и оптимизации лечения этихинфекций представляется целесообразнымпроведение исследований по изучениюбактериофиксирующейактивности эритроцитов (БФАЭ)в отношении вакцинных штаммоввозбудителей чумы, сибирской язвы,туляремии и бруцеллеза в условиях in vitro и in vivo и установление еёзначения в развитии данныхзаболеваний.

Цельисследования. Определениемеханизмов фиксирующейактивности эритроцитов человека и других видовмлекопитающих в отношениибактерий вакцинных штаммов возбудителейчумы, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза иобоснование её роли вразвитии инфекционных процессов при данных заболеваниях.

Задачиисследования.

1. Изучить способностьэритроцитов человека фиксировать насвоей поверхности клеткиY. pestis EV НИИЭГ и спорыB. anthracis 55 ВНИИВВиМ, атакже другиемикроорганизмы в условиях in vitro,используя методы В.И. Брилиси С.С. Гизатулиной, которые применяютсяпри оценке адгезивныхсвойств бактерий.

2. Разработатьфотоколориметрический методколичественного определениябактериофиксирующей активностиэритроцитов (БФАЭ) человека и животных,применяя в качестве моделимикроорганизмов клеткиY. pestis EV НИИЭГ.

3. Модифицировать методгемосканирования длянаблюдения за процессомадгезии бактерий на эритроцитах людей и различных видовживотных вдинамике.

4. Изучить БФАЭ человека,а также лабораторных,сельскохозяйственных и домашнихживотных, вотношении вакцинных штаммов Y. pestis EV НИИЭГ, B. anthracis(СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ, II вакцины Ценковского), F. tularensis 15 НИИЭГ и B. abortus 19 ВА, используяфотоколориметрический метод и методгемосканирования.

5. Исследовать механизмыБФАЭ в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ, в том числе рольгидрофобных взаимодействий иэлектростатических сил.

6. Изучить фиксирующую активностьэритроцитов человека с клетками вакцинныхштаммов возбудителей чумы и сибирской язвы(споровая форма) в условиях in vivo при раздельномвведении эритроцитов и микробных клеток вбрюшную полость белых мышей.

7. Выдвинуть гипотезу ороли БФАЭ в развитии и реализацииинфекционных процессов, обусловленныхY. pestis, B. anthracis, F. tularensis и Brucella spp.

8.Обосновать принципиальнуювозможность патогенетического методалечения чумы, сибирской язвы, туляремии ибруцеллеза с помощью адресной доставкиантибиотиков в эритроцитарныхконтейнерах.

Научная новизна. Впервые разработанфотоколориметрический метод определенияБФАЭ в отношении микроорганизмовбактериальной природы (патент РФ на изобретение№ 2360969 от 10.07.2009 г.),который позволяет осуществлятьколичественную оценку связыванияэритроцитами бактерий. Для визуальногонаблюдения запроцессом адгезии модифицирован методгемосканирования, дающий возможность вдинамике исследовать взаимодействие эритроцитов сбактериями. Впервые с помощью данных методов изучена БФАЭ человека иразличныхвидов животных в отношении клетоквакцинных штаммов Y. pestisEV НИИЭГ,F. tularensis 15 НИИЭГ иB. abortus 19 ВА, а также споровыхформ вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакциныЦенковского. Установлено, что эритроцитылюдей и животных способны фиксировать насвоей поверхности клетки вакцинныхштаммов чумного, туляремийного микробов, атакже споры вакцинных штаммовсибиреязвенных бацилл, в то же времяэритроциты человека не фиксируют бактериивакцинного штамма бруцеллезного микроба.Показано, что БФАЭ человека в отношениибактерийY. pestis EV НИИЭГ зависит отморфофункционального состояния адгезиновмикробных клеток, рецепторного аппаратаэритроцитов и условий, вкоторых происходит адгезия.Установлено, что основную роль вфиксирующей способности эритроцитовчеловека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ играютгидрофобные силы, тогда как электрическийзаряд на поверхности клеток не оказываетсущественного влияния на ихвзаимодействие.

Впервые выявленысущественные различия в БФАЭ у людей иразличных видов животных в отношенииштамма Y.pestis EV НИИЭГ. При этомустановлено, что эритроцитычеловека ивысокочувствительных кзаражению возбудителемчумы животных (крыса, белая мышь,морская свинка, кролик, свинья) обладаютвысокой бактериофиксирующейспособностью, а эритроцитымало чувствительных кинфицированию возбудителемчумы животных (лошадь, кошка) фиксируют насвоей поверхности клетки Y. pestisEV взначительно меньшей степени. Аналогичныеданные получены в отношении спор штаммаB. anthracis55 ВНИВВиМ. У чувствительных кинфицированию возбудителем сибирской язвымлекопитающих (человек, корова, кролик,морская свинка) эритроциты обладают болеевысокой фиксирующей способностью к спорамсибиреязвенного микроба, чем эритроцитырезистентных к заражению B. anthracisживотных (свинья, белая крыса).

Впервые исследованафиксирующая способность эритроцитовчеловека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, находящихсянепосредственно в крови, а также изученоантиадгезивное действие различныхкомпонентов плазмы крови и рядаантибактериальных препаратов.Установлено, что белки плазмы кровиздорового человека (альбумины, глобулины ифибриноген) обладают антиадгезивнойактивностью в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, в то времякак изученные антибиотики,используемые при лечении чумы (ампициллин, доксициклин,гентамицин, цефотаксим), в терапевтическихконцентрациях не влияют на процессфиксации эритроцитами бактерий.

В условиях in vivo при раздельномвведении эритроцитов и бактерий вакцинныхштаммов чумного или спор сибиреязвенногомикроба в брюшную полость белым мышамподтверждено, что эритроциты сохраняютспособность фиксировать на своейповерхности клетки Y. pestisEV НИИЭГ илиспоры B. anthracis55 ВНИВВиМ.

Теоретическаязначимость. Гипотеза о роли эритроцитов вреализации инфекционного процесса причуме, сибирской язве, туляремии ибруцеллезе, выдвинута намина основании анализа данныхлитературы о патоморфологическихизменениях при этих заболеваниях, в томчисле полученных автором ранее приизучении патоморфогенеза сибирской язвы, атакже на основании результатов настоящихисследований по изучению БФАЭ человека иразличных видов животных в отношениивакцинных штаммов Y. pestisEV НИИЭГ,B. anthracis СТИ-1, 55ВНИИВВиМ и IIвакцины Ценковского, F. tularensis 15 НИИЭГ и B аbortus 19 ВА в условияхin vitro и in vivo. Согласно этойгипотезе, клетки Y. pestis, F. tularensis и споры B. anthracis припроникновении в кровяное руслочувствительных к чуме, туляремии исибирской язве млекопитающих фиксируютсяна поверхности эритроцитов. Этоспособствует транспорту микроорганизмов иих поглощению макрофагами селезенки ипечени. В этих клетках возбудителистановятся недоступными длянеспецифических факторов защиты организмаи интенсивно пролиферируют, так как вмакрофагах создаются все необходимые дляэтого условия, в том числе достаточноеколичество ионов железа, поступающих изразрушенных эритроцитов. После интенсивногоразмножения бактерий макрофаги погибают,микробные клетки в большом количествепопадают в кровеносное русло, т.е.наступает вторичная бактериемия. Этоприводит к септическому состоянию.Массовый лизис эритроцитов вызываетгипоксию тканей и анемию, что способствуетгибели организма хозяина. В то же время прибруцеллезе, возбудитель которого нефиксируется на эритроцитах, основнымклиническим симптомом являетсяспецифическая аллергическая перестройкаорганизма хозяина.

Данная гипотезапозволила впервые обосноватьперспективность и принципиальнуювозможность адресной доставкиантибиотиков с помощью эритроцитарныхконтейнеров при экстренной профилактике илечении указанных выше опасныхинфекционных заболеваний. Предложеннаягипотеза позволяет объяснитьскоротечность и высокую летальность особоопасных инфекций (чумы, сибирской язвы,туляремии), особенности развитияхронических инфекций типабруцеллеза.

Результатыисследований расширяют представления офункциональныхвозможностях эритроцитов, аименно, об ихспособности избирательно фиксировать итранспортировать отдельные видымикроорганизмов в печень и селезенку, чтоприводит к их дальнейшему фагоцитозу вэтих органах. Таким образом, приинфекционных процессах, вызванныхзаражением вирулентными штаммами Y. pestis,B. anthracis и F. tularensis,эритроциты обеспечивают развитиезаболевания, а при иммунизации – доставляютбактерии живых вакцин в органыиммуногенеза, способствуяформированиюспецифического иммунитета.

Практическаязначимость и внедрение.Разработанные фотоколориметрический метод имодифицированный метод гемосканированияприменяются при изучении БФАЭ в отношении вакцинных штаммоввозбудителей чумы, сибирской язвы,туляремии, бруцеллеза, атакже используются при исследованииадгезивных свойств микробных культур,входящих в состав пробиотическихпрепаратов и продуктов функциональногопитания в ГОУВПО «ВятГУ» и ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА».

По результатам исследований полученпатент РФ на изобретение №2360969 «Способ определениябактериофиксирующей активности эритроцитов» от 10.07.2009 г.

Результатыисследований отражены в «Методическихрекомендациях по изучению адгезиибактерий кэритроцитам людей и животных с помощьюфотоколориметрии» (ФГОУ ВПО«ВятскаяГСХА», Киров, 2009), в методическихрекомендациях «Фотоколориметрическийметод изучения взаимодействия бактерий сэритроцитами людей и животных» (ГОУ ВПО «ВятГУ»,Киров, 2010), в учебно-методическом пособии «Методы определениябактериофиксирующей активностиэритроцитов и оценки адгезивных свойствмикроорганизмов бактериальнойприроды» (ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА»,Киров, 2011), утвержденном в УМО.

Результатыисследований используются при чтении лекций ипроведении лабораторно-практическихзанятий со студентами ФГОУВПО «Вятская ГСХА»специальности 310800 – «Ветеринария» покурсу «Ветеринарная микробиология», со студентами ГОУ ВПО «КировскаяГМА» специальностей 060101 «Лечебное дело»,060103 «Педиатрия», 060109 «Сестринское дело», покурсу «Микробиология,вирусология, иммунология», специальности 080401«Товароведение и экспертиза товаров всфере производства и обращениясельскохозяйственного сырья ипродовольственных товаров»по курсам –«Основы микробиологии», «Микробиологияпродовольственных товаров,санитария и гигиена», со студентами ГОУВПО «ВятГГУ»специальностей 032102.65 «Адаптивнаяфизическая культура», 050720«Физическая культура» и010707.65 «Медицинская физика»,по курсам –«Общая физиология», «Безопасность жизнедеятельности», атакже привыполнении дипломных работ студентами ГОУ ВПО«ВятГУ» специальностей 020209«Микробиология», 240901 «Биотехнология» по курсам –«Микробиология» и «Биотехнология». Это подтвержденоактами внедрения, утвержденнымируководителями данных высших учебныхзаведений.

Декларация личногоучастия автора.Экспериментальные исследования выполнялисьлично автором при его непосредственномруководстве научной группой. Обработкаполученных данных, их интерпретация иоформление осуществлены авторомсамостоятельно.

Основные положения,выносимые на защиту

1. Эритроциты человека обладаютвыраженной способностью фиксировать насвоей поверхности клетки вакцинныхштаммов Y.pestis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ, а также споры вакцинныхштаммов B.anthracis СТИ-1, 55ВНИИВВиМ и IIвакцины Ценковского, но не фиксируют клеткиB. abortus 19 ВА.Это позволяет сделатьпредположение о том, что наряду спатогенными свойствами возбудителейданных заболеванийБФАЭ млекопитающих играетроль в развитии и реализациипатологического инфекционного процесса при чуме, сибирской язве,туляремии и бруцеллезе.

2. Фиксирующая активностьэритроцитов в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ и B. anthracis 55 ВНИИВВиМзависит от видовой принадлежности эритроцитов. У высокочувствительных к инфицированиювозбудителем чумы видов млекопитающих(человек, белая мышь, белая крыса, кролик,свинья) БФАЭ в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ высокая, а умалочувствительных к инфицированиювозбудителем чумы животных (лошадь,кошка) – низкая. Эритроциты животных,чувствительных к заражению B. anthracis (человек,морская свинка, кролик, корова), обладаютвыраженной фиксирующей способностью вотношении спор вакцинного штаммасибиреязвенного микроба, а эритроцитысвиньи и белой крысы, резистентных кинфицированию возбудителем сибирскойязвы, фиксируют споры B. anthracis 55 ВНИИВВиМ в незначительнойстепени. Это подтверждаетнаше предположение ипозволяет выдвинуть гипотезу о роли БФАЭ в развитииинфекционного процесса и объясняетчувствительность млекопитающих к чуме исибирской язве.

3. БФАЭ в отношениибактерий Y. pestis EV НИИЭГ зависит оттрех составляющих: адгезивных свойствмикробных клеток, фиксирующей способности эритроцитови среды, в которойпроисходит адгезия. Вприкреплении бактерий кэритроцитам, определяющее значение имеютгидрофобные свойства микробных клеток,обусловленных их поверхностнымиструктурами. Фиксирующая способностьэритроцитов обусловлена видовыми ииндивидуальными особенностями ихгликофоринов. Белки плазмы крови (альбумины,глобулины ифибриноген) снижают БФАЭ вотношении вакцинного штамма чумногомикроба, в то время как антибактериальныепрепараты (ампициллин,гентамицин, доксициклин, цефотаксим) не влияют на нее.

4. Эритроциты человека сохраняютфиксирующуюактивность в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ и спорВ. anthracis 55ВНИИВВиМ в условиях in vivo, что показано привнутрибрюшинном раздельном введенииживотным эритроцитов и бактерий. Данные оБФАЭ различных видов млекопитающих вотношении вакцинных штаммов возбудителей чумы,сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза,полученные в условиях in vitro и in vivo наряду с данными литературыо геморрагических проявлениях у больныхчумой, сибирской язвой, туляремией ипатоморфологических исследованияхпогибших от чумы и сибирской язвы людей иживотных подтверждают рабочую гипотезу о роли БФАЭ вразвитии инфекционного процесса приэтихзаболеваниях. Выдвинутая гипотезапозволяет обосновать перспективностьприменения эритроцитарных контейнеров дляадресной доставки антибиотиков приэкстренной профилактике и лечении этихинфекций.

Апробациядиссертационной работы.Результаты исследований были доложены иобсуждены:

– наВсесоюзной конференции«Современные направления создания иоценки качества готовых лекарственныхпрепаратов, антибиотиков иантимикробных веществ», 27 – 28 ноября 1990 г.,Москва;

– наМежведомственной научной конференции«Актуальные вопросы профилактики опасныхинфекционных заболеваний» 26 – 27 марта 1991 г.,Киров;

– наВсесоюзной конференции «Актуальныепроблемы химиотерапии бактериальныхинфекций, 22октября 1991 г., Москва;

– наНаучно-практической конференции и школе поинфекционной патологии с международнымучастием, 20– 24 октября2007 г., Москва;

– наМеждународной конференции «Международноесотрудничество и развитие биотехнологий вКировской области», 27 – 28марта 2008 г., Киров;

– наВсероссийской научно-практическойконференции «Достижения ветеринарной науки и практики»,17 – 18 апреля 2008 г., Киров;

– наМеждународной научно-практическойконференции, посвященной 100-летию со днярождения профессора П.Г. Петского«Современные научные достижения вживотноводстве», 16 – 17апреля 2009 г., Киров;

– наОтделении общества физиологов имени И.П.Павлова в Кировской государственноймедицинской академии 3 июня 2009 г.,Киров;

– наVIIМеждународной конференции по гемореологиии микроциркуляции (от функциональныхмеханизмов – вклинику), 14июня 2009 г., Ярославль;

– наВсероссийской научно-практическойконференции, посвященной 60-летию филиала ФГУ«48 ЦНИИ Минобороны России – ЦБТП БЗ», 16 июля2009 г.,Екатеринбург;

– наМеждународной научно-практическойконференции, посвященной 80-летию Вятскойгосударственной сельскохозяйственнойакадемии, 15 апреля 2010 г., Киров;

– наIIрегиональной молодежной конференции«Вопросы фундаментальной и прикладнойфизиологии в исследованиях студентов»,24 мая 2010 года,Киров;

– нарегиональной научно-практическойконференции «Актуальные проблемыпотребительского рынка товаров и услуг», 26мая 2010 года, Киров;

– наВсероссийской научно-практическойконференции «Актуальные вопросытрансфузиологии и клинической медицины»,посвященной 50-летию ФГУ «Кировскийнаучно-исследовательский институтгематологии и переливания крови ФАБАРоссии» с международным участием, 7 октября2010 г., Киров;

– наVIIIВсероссийской конференции с международнымучастием «Современные проблемыбиомониторинга и биоиндикации», 1 декабря 2010 года,Киров.

Публикации результатовисследований. По темедиссертации опубликованы 49 работ, из них12 статей в журналах,рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ, 1патент и 2 авторскихсвидетельства наизобретения, 2 монографии, методические рекомендации иучебно-методическое пособие, утвержденноев УМО по медицинскому ифармацевтическому образованию вузовРоссии.

Исследованиявыполнялись с1978 по 1996 годы в 48 ЦНИИ Министерства обороныРоссийской Федерации в рамках 18 плановыхнаучных тем. С 2006 года исследования проводились в ФГОУ ВПО «ВятскаяГСХА» по теме: «Разработка иоценка лечебно-профилактическойэффективности новых антимикробных ибиологически активных препаратов,пробиотиков при инфекционных заболеванияхживотных». С 2008 года исследования проводятся потеме докторской диссертации«Бактериофиксирующаяактивность эритроцитов в отношениивакцинных штаммов возбудителей чумы,сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза иобоснование её роли в патогенезе данныхзаболеваний»,утвержденной 3 июля 2008 г. на Ученомсовете ГОУВПО «ВятГУ».

Объем и структураработы. Диссертация изложена на 280 листах машинописного текста,состоит из введения и пяти глав, включающихобзор литературы и результаты собственныхисследований, заключения и выводов. Работаиллюстрирована 18 таблицами и 35 рисунками. Библиографическийсписок включает 564 источника, из них 357 отечественных и207 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕРАБОТЫ

1. Материалы и методыисследований

Штаммы.Основными объектамиисследований в работе являлись вакцинныештаммы: Y.pestis EV линии НИИЭГ,B. anthracis СТИ-1, II вакциныЦенковского и F.tularensis 15НИИЭГ, полученные из ФГУ «48 ЦНИИ МинобороныРФ» (г. Киров), а также вакцинные штаммыB. anthracis 55 ВНИИВВиМ иB. аbortus 19 ВА,предоставленные ОАО «Агровет» (г.Киров).

В сравнительныхисследованиях применяли штамм E. coli М-17, выделенныйиз «Колибактерина» (ОАО «Микроген», г.Москва), штамм B. bifidum № 1, выделенный из«Бифидумбактерина» (ОАО «Микроген», г.Москва), производственные штаммы L. plantarum P4 и L. buhneri Р0, полученные из ОАО«Агровет» (г. Киров), штамм L. casei DN-114001, выделенный изпрепарата функционального питания «Actimel», штамм L. rhamnosus ATCC 53103, выделенныйиз препарата функционального питания«Bio Баланс»,штамм L. acidophilus, выделенныйиз препарата пробиотика «Лактобактерин» «Микроген» НПО ФГУП(Иммунопрепарат, г. Уфа), штамм L. bulgaricus, выделенный из кисломолочногопродукта «Вятушка», клинические штаммыE. coli серогрупп О86, О112,О124, О142, О144 и О152, полученные избактериологической лаборатории госпиталяв/ч 1407 ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ», музейныештаммы E.coli, P.аeruginosa,P. vulgaris, P. mirabilis, S.epidermidis, S. saprophyticus, S. marcescens, K. pneumoniae из коллекциикафедры морфологии и микробиологии ФГОУВПО «ВятскаяГСХА».

Питательныесреды. Для выращиваниявакцинного штамма Y. pestisEV НИИЭГ использовали ГРМ-агар рН 7,2(ФГУН ГНЦПМБ, г. Оболенск), а также мясо-пептонный агар (МПА)и агар Хоттингера (АХ) рН 7,2, приготовленныев лабораторных условиях. В качестведополнительных ингредиентов к питательнымсредам использовали сульфит натрия (Na2SO3) игенцианвиолет (ГВ). Культуры бактерийY. pestis EV НИИЭГ выращивалипри температуре (28±1) С в течение 48часов. Клинические и музейные штаммывыращивали на ГРМ-агаре рН 7,2 притемпературе (37±1) С в течение 24 часов.Для выращивания лактобацилиспользовали питательную среду Мозера-Рогоза-Шарпа(MRS). Культуры B.anthracis 55ВНИИВВиМ выращивали на МПАпри температуре (37±1) С в течение 24часов. Споры вакцинных штаммов B. anthracis СТИ-1 и II вакциныЦенковского, бактерии F. tularensis (15 НИИЭГ) и B. abortus (19 ВА) использовали в работе безпредварительного культивирования.Выращенные на питательных средах илиофильно-высушенные культурысуспензировали в стерильном 0,9%-номрастворе хлорида натрия (рН 7,2).

Антибиотики: ампициллин (ОАО«Органика», г. Новокузнецк),гентамицин (РУП «Борисовский завод медпрепаратов», г.Борисов), доксициклин (РУП«Белмедпрепараты», г.Минск), клафоран(цефотаксим) («Авентис фарма лимитед»,Великобритания).

Препараты крови: альбумин человеческий нормальный(НПО «Биомед», г. Пермь), иммуноглобулинчеловеческий нормальный (ОАО «Микроген», г.Москва), сыворотка лошадиная нормальная (ОАО «Микроген», г. Москва).

Гемоконсервирующиерастворы: CPDA-1 («Бакстер АГ», США).Состав: лимонной кислоты моногидрат– 3,27 г,натрия цитрата дигидрат - 26,3 г, натрияфосфата одноосновного моногидрат – 2,22 г, декстрозымоногидрат – 31,9 г, аденин – 0,275 г, вода дляинъекций – 1000,0 мл.

Глюгицир (ОАО «Биосинтез», г.Пенза). Состав: натрия гидроцитрат(двузамещенный) – 20 г, глюкоза – 30 г (в пересчетена безводную глюкозу), вода дляинъекций – 1000,0 мл.

Материалом дляполучения эритроцитовслужила венозная кровь клиническиздоровых людей и животных. Пробы кровилюдей получали из ФГЛУ «Кировскаяобластная станция переливания крови»,пробы крови животных – из вивария ФГОУВПО «Вятская ГСХА» (белые мыши, кролики),питомника ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны РФ» (белыекрысы, морские свинки, золотистые хомячки),ФГУ «Кировская областная станция по борьбес болезнями животных» (собаки, кошки),ветеринарной клиники и лабораторииконеводства ФГОУ ВПО «Вятская ГСХА»(коровы, лошади), ОАО «Кировскиймясокомбинат» (свиньи), а также хозяйствчастного сектора Кировской области(бараны). В качествеантикоагулянтов использовали 3,8%-ный растворлимоннокислого натрия (1:10) или гепарин (3,0ЕД/мл крови).

Оборудование. Стерилизацию питательных средпроводили в паровом стерилизаторе ВК-75-01(ОАО «Тюменский завод медицинскогооборудования», г. Тюмень) в режиме: рабочеедавление 150 кПа, температура (110±5) С, времястерилизации – 30 мин.

Измерение рН растворови сред проводили с помощью рН метра рН-150М(РУП «Гомельский завод измерительныхприборов», г. Гомель) в соответствии синструкцией к прибору.

Разделениенеоднородных жидкостей (суспензий)выполняли на центрифуге типа УЛМН-Р10-01(ООО «Элекон-М»).

Микроскопию объектовпроводили, пользуясь световым микроскопом«Миктрон-400М» (ООО «Петролазер», г.С.-Петербург).

Фотографированиемикрообъектов выполняли с помощьюцифровой видеокамеры DCE-1, установленнойна световом микроскопе.

Определениеконцентрации эритроцитов в суспензиипроизводили в счетной камере Горяева пометодике, описанной А.Я.Любиной, Л.П.Ильичевой,Т.В. Котосовой(1984).

Определениеоптической плотности (ОП) суспензиймикробных клеток осуществляли наколориметре фотоэлектрическомконцентрационном КФК-2 (ЗОМЗ, г. Загорск) придлине волны проходящего света 540 нм,рабочем объеме кюветы 2,3 мл и длинеоптического пути кюветы 5 мм.

Оценкуэлектрофоретической активностиэритроцитов и микробных клетокосуществляли с помощьюавтоматизированного приборногокомплекса «Цито-Эксперт»(НТУ «Инженерно-техническийцентр», г. Ижевск, по методике Е.П.Сухенко (2009).

Методы

Микробные культуры,выращенные на плотных питательных средах,а также лиофилизированные культурысуспензировали в 0,9%-ном растворе хлориданатрия. Концентрацию бактерий в суспензииопределяли методом высева на плотныепитательные среды.

Эритроцитарную массу,плазму и сыворотку крови получали пометодике,описанной А.Я. Любиной, Л.П.Ильичевой,Т.В. Котосовой(1984).

Обработку эритроцитовформалином проводили по методике,рекомендованной Т.В. Колгановой, А.В. Ермолаева, Р. Дж. Дойла (2002). Танизированные эритроцитыготовили по методике В.М. Бондаренко, М.М. Баркус, В.И. Брилис(1987).

Определение уровняадгезии бактерий к эритроцитамосуществляли методами В.И. Брилис, Т.А. Брилене, Л.А. Левкова (1986) и С.С. Гизатулиной, М.О. Биргер, Л.И. Кулинич (1991).

Гидрофобные свойствабактерий определяли по методике Е.В. Серебряковой, И.В.Дармова, Н.П. Медведева(2002).

Гемагглютинирующуюспособность микробов проводили пометодике, описанной Ю.М.Ломовым, Н.Р.Телесманич, А.В. Колякиной(2007).

Трипсинизациюбактерий выполняли по методике К.Б Грабовской,А.А. Тотолян(1977).

Статистическуюобработку результатов исследованийосуществляли при помощи компьютерной программы «Biostat», версия 4.03. с вычислениемзначений средней арифметической (М), ошибкисредней арифметической (m), коэффициентадостоверности (р) и корреляционнойзависимости (r). Достоверность различий междугруппами оценивали с использованиемt-критерияСтьюдента. Графическая обработкаисследований проводилась сиспользованием программы «Microsoft Office Excel2003».

2. Результатыисследований

2.1. Изучениефиксирующей активности эритроцитов вотношении микроорганизмов бактериальнойприроды с помощью традиционныхметодов

На сегодняшний день в литературеотсутствует описаниеметодик, которые позволяютопределятьБФАЭ в отношении микроорганизмовбактериальной природы,поэтому на первом этапеисследований при изучении БФАЭиспользовали методы, которые применяютсяпри определении адгезивных свойствмикробных клеток к эритроцитам. В нашейстране для этих целей используют метод В.И.Брилис Т.А. Брилене, Л.А.Левкова (1986)и способ С.С. Гизатулиной М.О.Биргер, Л.И. Кулинич (1991), которые позволяют в первомслучае оценивать взаимодействиебактериальных клеток с эритроцитами поиндексу адгезии микроорганизмов (ИАМ), а вовтором –выявлять адгезивно-активные колонии (ААК)микроорганизмов. При определении ИАМустанавливают количество бактерий,прикрепившихся к одному эритроциту,участвующему в процессе адгезии. По этому показателю микроорганизмыподразделяются на высокоадгезивные – ИАМ более 4,0,среднеадгезивные – ИАМ от 2,51 до 4,0, низкоадгезивные– ИАМ от 1,75до 2,50. При ИАМ ниже 1,75 бактерии считают неадгезивными.Метод С.С. Гизатулинойпозволяет выявлять процент микробных колоний,вокруг которых образуется ободок изэритроцитов. По этому показателю можносудить о взаимодействии эритроцитов сбактериями, находящимися в колонии.

Первоначально провели сравнительное изучениефиксирующей активности эритроцитовчеловека 0(I)Rh+ группыкрови в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ, спори вегетативных клетокB. anthracis 55 ВНИИВВиМ, а также ряда другихмикроорганизмов бактериальной природы,при помощи методов,приведенных в табл. 1.

Таблица 1

Показатели адгезииразличных видов бактерий к эритроцитамчеловека, определенные при помощи методовВ.И.Брилис (ИАМ) и С.С. Гизатулиной (ААК%) (М±m;n=5)

Бактерии Показатель
ИАМ ААК,%
Вакцинныештаммы B. anthracis 55 ВНИИВВиМ 4,91±0,67 10,91±1,58
Y. рestis EV НИИЭГ 7,02±0,95 0
Пробиотические штаммы E. coli М-17 2,67±0,28 0
L. plantarum P4 2,07±0,41 0
B. bifidum №1 1,93±0,51 0
Штаммы,выделенные из кишечника людей E. coli О151 3,53±0,44 9,33±4,49
E. coli О124 3,15±0,18 0
E. coli О142 2,14±0,41 8,33±2,41
E. coli О144 3,09±0,20 21,33±6,39
E. coli О186 2,99±0,36 0
E. coli О112 1,85±0,16 10,01±1,53
Музейныештаммы P. аeruginosa 2,22±0,19 0
K. pneumoniae 1,65±0,24 0
E. coli 2,11±0,32 7,33±1,86
P. vulgaris 1,87±0,18 0
P. mirabilis 1,68±0,25 0
S. epidermidis 1,73±0,24 0
S. saprophyticus 1,84±0,18 0
S. marcescens 1,72±0,19 0
M. luteus 1,46±0,20 0

Адгезивно-активныеколонии выделялись в небольшом количествелишь у 6 из 20 исследуемых микробных культур,чаще у клинических штаммов кишечнойпалочки, выделенных из кишечника людей. Вакцинный штаммEV НИИЭГчумного микроба адгезивно-активныхколоний не образовывал(рис. 1 А). В то же времявакцинный штамм 55 ВНИИВВиМ сибиреязвенного микробаформировал колонии, вокруг которых в 10%случаев образовывался незначительновыраженный ободок изэритроцитов (рис. 1 Б). Вокруг колоний штаммов кишечнойпалочки, выделенных из кишечника людей,формировался выраженный ореол изэритроцитов (рис. 1 В). Учитывая полученные результаты ипринимая во внимание,что методом С.С. Гизатулиной изучается взаимодействиеэритроцитов не с отдельными микробными клетками, а с колониямибактерий, был сделан выводо том, что данныйметод не может бытьиспользован при изучении БФАЭ в отношениивакцинных штаммов чумногои сибиреязвенногомикробов.

Рис. 1. Микроскопическая картинавзаимодействия эритроцитов с микробнымиколониями по методу С.С. Гизатулиной: А – адгезивно-неактивная колония Y.pestis EV НИИЭГ; Б– адгезивно-активная колония B. anthracis №55 ВНИИВВиМ; В–адгезивно-активная колония E. coli О144. Микрофотосъемка в падающем свете.80. 1 – микробная колония; 2 – эритроцитывокруг колонии

При определении ИАМ вотношении эритроцитов человека по методуВ.И. Брилисвыявлено, что вакцинные штаммывозбудителей чумы и сибирской язвыявляются высокоадгезивными (табл. 1). ИАМдля вакцинного штамма Y. рestis EV НИИЭГ составил7,02±0,95; для вакцинного штамма B. anthracis 55 ВНИИВВиМсоответственно – 4,91±0,67. Установлено, чтобольшинство штаммов музейных микробныхкультур являются низкоадгезивными итолько пять штаммов кишечной палочкипроявили среднеадгезивные свойства, изкоторых четыре были выделены из кишечникалюдей. Следовательно, метод В.И. Брилиспозволял изучать БФАЭ человека в отношениимикроорганизмов бактериальной природы, втом числе вакцинных штаммоввозбудителей чумы исибирской язвы. Однако при определениипоказателя ИАМ возникли следующиезатруднения.

Во-первых, с помощьюметода В.И. Брилис практически невозможноустановить факт фиксации бактерий наэритроцитах (рис. 2). Бактерии могут находиться рядомс эритроцитом, не прикрепившись к нему.Во-вторых, исследуется взаимодействиебактерий всего с 50 эритроцитами. В-третьих, в разных полях зрениямикроскопическихпрепаратов определяютсяразличные результаты показателяИАМ.

Рис. 2. Микроскопическая картинавзаимодействия эритроцитов человека сбактериями Y. pestis EV НИИЭГ (А) иS. epidermidis (по методу В.И.Брилис). Окраска по Граму. 1000. 1 – эритроциты; 2 – микробные клетки

Кроме того, присопоставлении показателей ИАМ и ААК необнаружено какой-либозависимости. Так,высокоадгезивный вакцинный штамм чумногомикроба не образовывал ААК, анизкоадгезивный штамм E. coli О112, выделенный из кишечникачеловека, в 10% случаевформировал ААК.

Таким образом, нами показано,что методы С.С. Гизатулиной и В.И. Брилис не способны вполной мере охарактеризовать БФАЭ в отношенииклеток Y. pestisEV НИИЭГ испор B. anthracis 55 ВНИИВВиМ.Вакцинный штамм чумного микроба необразует адгезивно-активные колонии, наподсчете которых основана методика С.С.Гизатулиной. Метод В.И. Брилис, наряду с егодостаточной трудоемкостью и ограниченнымколичеством исследуемых эритроцитов, непозволяет установить сам факт фиксациибактерий на эритроцитах и обладаетсубъективностью при учете результатов исследований.

Следовательно, дляизучения механизмов БФАЭ в отношениивакцинных штаммов возбудителей чумы,сибирской язвы, туляремии и бруцеллеза иобоснования её роли в патогенезе данныхзаболеваний необходиморазработать и использовать болееинформативные методы, позволяющие болееточно определять фиксацию бактерий наэритроцитах и количественно оцениватьвзаимодействие большого числа эритроцитовс микробными клетками.

2.2. Разработкафотоколориметрического методаопределения фиксирующей активностиэритроцитов в отношении микроорганизмовбактериальной природы

Приступая кразработке нового метода определения БФАЭ,использовали следующие методическиеприемы. Во-первых, факт прикреплениябактерий к эритроцитамустанавливали послецентрифугирования суспензии, содержащеймикробные клетки и эритроциты. Большинствобактерий легче эритроцитов, поэтому послеосаждения последних они оставались внадосадочной жидкости. Если бактериификсировались на эритроцитах, то ониосаждались вместе с эритроцитами и внадосадочной жидкости отсутствовали илиже обнаруживались в небольшом количестве. Во-вторых,определение количествамикробных клеток, оставшихся послецентрифугирования в надосадочнойжидкости, проводили с помощьюфотоколориметрии.

При проведении серииэкспериментов, основанных на этихметодических приемах, использовали двемикробные культуры: вакцинный штамм Y.pestis EV НИИЭГ, каквысокоадгезивный, и музейный штамм S. epidermidis – как неадгезивный(табл. 1). Концентрациябактерий в суспензии соответствовала 1,0единице оптической плотности (ОП) Для стандартизацииэкспериментов на данном этапеисследований применяли эритроциты одногои того же донора 0(I) Rh+группы крови вконцентрации 0,1109/мл.

Первоначально изучилипринципиальную возможность использованияпредлагаемых методических приемов дляоценки фиксации эритроцитами бактерии. Дляэтого в пробиркахсмешивали по 2,5 мл суспензиимикробных клеток и 1,0 мл суспензииэритроцитов. Вкачестве контроля применяли пробы,содержащие 2,5 мл суспензии микробныхклеток и 1,0 мл 0,9%-ного раствора хлориданатрия (рН 7,2) (контрольная проба №1); 1,0 млсуспензии эритроцитов и 2,5 мл 0,9%-ногораствора хлорида натрия (рН 7,2) (контрольнаяпроба №2). Пробы помещали на вращающуюся платформу,инкубировали при температуре 37±1 С в течение30 мин споследующим центрифугированием при 300 g в течение 1,5 мин для осажденияэритроцитов, после чего измерялиоптическую плотность (ОП) надосадочнойжидкости. Оценку взаимодействияэритроцитов с бактериями осуществляли спомощью показателя бактериофиксирующейактивности эритроцитов (ПБФАЭ), которыйрассчитывали по формуле:

где ПБФАЭ – показательбактериофиксирующей активностиэритроцитов; Дк1 –ОП надосадочной жидкости в контрольнойпробе №1; Дк2 - ОП надосадочной жидкости вконтрольной пробе №2; Доп – ОП надосадочнойжидкости в опытной пробе. Результатыопределения ПБФАЭ человека в отношениибактерий Y.pestis EV НИИЭГ и S. еpidermidis приведены втабл. 2.

Таблица 2

ПБФАЭ человека вотношении клеток Y. pestisEV НИИЭГ иS. еpidermidis, определяемыйфотоколориметрическим методом (М±m, n=5)

Микроорганизм Показатели
Доп Дк1 Дк2 ПБФАЭ,%
Y. pestis EV НИИЭГ 0,39±0,030 0,50±0,009 0,03±0,003 26,83±6,07
S. epidermidis 0,65±0,020 0,63±0,007 0,03±0,003 1,52±2,99

Установлено, что ПБФАЭ в отношении штамма Y. pestisEV НИИЭГсоставил (26,83±6,07)%, что свидетельствовало оприкреплении к эритроцитамсоответствующего процента бактерий. В то же времяклетки S. epidermidis к эритроцитам человекапрактически не фиксировались – ПБФАЭ в ихотношении составил (1,52±2,99)%.

Показавпринципиальную возможность оценки фиксирующей способностиэритроцитов в отношении вакцинного штаммачумного микроба при помощифотоколориметрическогометода, осуществиливыбор условия, при которыхспособность эритроцитов фиксироватьклетки Y. pestis EV НИИЭГ проявляласьмаксимально.

Первоначально изучиливлияние на ПБФАЭ различных соотношенийэритроцитов и бактериальных клеток. Для этого в эксперименте использовали однуи ту же концентрацию клетокY. pestis EV НИИЭГ и различныеконцентрации эритроцитов (рис. 3).

 Рис. 3. ПБФАЭ в отношениибактерий Y. -7

Рис. 3. ПБФАЭ в отношениибактерий Y. рestisEV НИИЭГ иS. еpidermidis в зависимостиот концентрации эритроцитов

Увеличение концентрации эритроцитов в пробах склетками Y.рestis EV НИИЭГ приводило к существенномуповышению ПБФАЭ, в то время как приувеличении количестваэритроцитов в пробах, содержащих S. epidermidis, данныйпоказатель оставался без изменения. В дальнейших исследованиях применяликонцентрацию эритроцитов 1,0109/мл. При её использовании ПБФАЭ в отношении клеток Y. рestis EV НИИЭГ былдостаточно высоким – на уровне 80%, но вто же время в пробахоставались бактерии, несвязанные с эритроцитами (около 20% отобщего количества).

Из данных литературы(Зайцева Е.А., СомовГ.П., 2006; Ананьева Н.В., Ганина В.И., Ленченко Е.М., 2007) известно, что на уровеньадгезии микробных клеток к эритроцитамсущественное влияние оказывают температура, рН среды ипродолжительность инкубации, поэтому вследующей серии экспериментов изучаливлияние на БФАЭ человека в отношениибактерий Y.рestis EV НИИЭГ различныхусловий инкубации эритроцитов смикробными клетками. При этом эритроциты ибактерии инкубировали в статических идинамических (вращающаяся платформа)условиях при температурах 20±1 °С и 37±1 °С втечение различного времени (рис. 4).

 Рис. 4. ПБФАЭ человека вотношении клеток Y.pestis EV -8

Рис. 4. ПБФАЭ человека вотношении клеток Y.pestis EV НИИЭГ при различныхусловиях инкубации проб

Установлено, чтоэритроциты человека максимально фиксируютбактерии вакцинного штамма чумногомикроба уже после 5 мин их совместнойинкубации. Температурный фактор визученном диапазоне и динамическиеусловия не оказывали выраженного влиянияна фиксирующую способность эритроцитов вотношении клеток Y. pestisEV НИИЭГ.Однако при изучении БФАЭ кошки в отношенииэтого же штамма выявлено, что уровеньфиксации бактерийэритроцитами зависит оттемпературы и условий инкубации(рис. 5). Более выраженная способностьфиксировать микробные клетки уэритроцитов кошки проявляется приинкубации проб на вращающейся платформепри температуре 37±1 °С в течение 30 мин.

 Рис. 5. ПБФАЭ кошки в отношении клетокY. -9

Рис. 5. ПБФАЭ кошки в отношении клетокY. pestis EV НИИЭГ приразличных условиях инкубации проб

Полученные данныесвидетельствуют о том, что эритроцитычеловека и кошки отличаются по способностификсировать на своей поверхностимикробные клетки вакцинного штаммачумного микроба не только в количественномотношении, но и по условиям инкубации. Это,вероятно, связано с особенностямиструктур, находящихся на поверхности эритроцитов иотвечающихза процесс прикрепления бактерий. Дляполучения сопоставимых результатовопределения ПБФАЭ необходимо осуществлять эксперименты по изучениюфиксирующей способности эритроцитовразных видов млекопитающих в стандартныхусловиях,поэтому вдальнейшем при изучении БФАЭ человека иживотных пробы инкубировали притемпературе 37±1 °С на вращающейсяплатформе в течение 30 мин.

При изучении влияниярН инкубационной среды на уровеньфиксирующей способности эритроцитовчеловека в отношении клеток вакцинногоштамма чумного микроба было установлено,что самый высокий ПБФАЭ проявляется при рНсреды 7,2 (рис. 6). Смещение рН средыинкубации как в кислую, так и в щелочнуюсторону, приводило к снижению ПБФАЭ.По-видимому, адгезины Y. pestisEV НИИЭГ ирецепторы эритроцитов человека призначении рН инкубационнойсреды, близком к физиологическомузначению крови, находятся вболее активном состоянии. В связи с этим вдальнейших исследованиях использовали рНсреды инкубации 7,2.

 Рис. 6.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis-10

Рис. 6.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ приразличных рН среды инкубации проб

Далее изучили влияниесостава среды инкубации на ПБФАЭ человекав отношении штамма Y. pestisEV НИИЭГ.Микробные клетки и эритроцитысуспендировали в 0,9%-ном растворе хлориданатрия рН 7,2, 0,1М фосфатном буфере рН 7,2 и 0,05М трис-HClбуфере рН 7,2. После совместной инкубациибактерий и эритроцитов вуказанных растворахзначения ПБФАЭ достоверно не отличались(рис. 7). Впоследующих экспериментах инкубациюбактерий с эритроцитами осуществляли в0,9%-ном растворе хлорида натрия.

 Рис. 7. ПБФАЭ человека в отношении клеток Y.pestis -11

Рис. 7. ПБФАЭ человека в отношении клеток Y.pestis EV НИИЭГ в различныхсредах инкубации проб

Для получениявоспроизводимых результатов определенияБФАЭ важно не только использоватьопределенные условия инкубирования проб,но и применять стандартную микробнуюкультуру, поэтому в следующей серииэкспериментов изучили влияние на ПБФАЭсостояния микробных культур, полученных различнымиспособами. Первоначальнопровели сравнительные исследованияпоказателя БФАЭ человека вотношении культуры Y. pestis EV НИИЭГ, полученнойв результате разведения чумной живой сухойвакцины 0,9%-ным раствором натрия хлорида, икультуры, выращенной на плотнойпитательной среде и суспендированной в0,9%-ном растворе натрия хлорида. В одномварианте эксперимента клетки,приготовленные из лиофилизированногосостояния, дважды отмывали отстабилизаторов путем центрифугированияпри 2000 g втечение 10 мин, а в другом - применяли безотмывания. Установили, что значения ПБФАЭчеловека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенныхна питательной среде и полученных излиофильно-высушенной формы, статистическизначимо друг от друга неотличались (рис. 8). Полученные результатысогласуются с данными Н.Н.Костюковой и С.Р. Карась (1987),которые показали, что лиофилизациябактерий не влияет на их адгезивнуюактивность,поэтому дляопределения ПБФАЭ человека и,животных можноиспользовать как лиофилизированные клетки Y.pestis EV НИИЭГ, так имикробные клетки, выращенные на плотнойпитательной среде.

 Рис. 8.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis-12

Рис. 8.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ, выращенныхна питательной среде и полученных излиофильного состояния

В дальнейшем провелиоценку влияния сроков хранения микробныхклеток на их способность фиксироваться наэритроцитах. Свежеприготовленнуюсуспензию бактерий в 0,9%-ном растворехлорида натрия хранили при температуре 4±2°С. Через 1, 3, 7, 14, 21 и 28 суток осуществлялиопределение ПБФАЭ в отношении хранившихсябактерий Y.pestis EV НИИЭГ. Дляисследования использовали свежиеэритроциты одного и того же донора.Эксперименты показали, что фиксирующаяспособность эритроцитов в отношениикультуры, хранившейся при температуре4±2 °Сдо 21 суток, не изменяется.Однако ПБФАЭ человека вотношении микробных клеток, хранившихся втечение 28 суток, резко снижался (рис. 9).

 Рис. 9. ПБФАЭ в отношенииклеток Y.pestis EV НИИЭГ -13

Рис. 9. ПБФАЭ в отношенииклеток Y.pestis EV НИИЭГ взависимости от срока их хранения притемпературе 4±2 °С

Снижение ПБФАЭсвязывали с образованием микробнымиклетками конгломератов, которыевыявлялись при микроскопии содержимогопроб. Данное обстоятельство учитывали придальнейших исследованиях БФАЭ. При определенииБФАЭ клеткиY. pestisEV НИИЭГпредложили хранить притемпературе 4±2 °С не более 21 суток.

Для стандартизацииметода определения БФАЭважными условиями являлисьстабилизация исохранение способностиэритроцитов фиксироватьмикроорганизмы бактериальнойприроды,поэтому в следующей серииэкспериментов изучили влияние сроков иусловий хранения эритроцитов на ихфиксирующую активность в отношении клетокY. рestis EV НИИЭГ. Для этогоэритроциты суспендировали в 0,9%-номрастворе хлорида натрия, 0,1 М фосфатном буфере,0,05 М трис-HClбуфере, а также в гемоконсервирующихрастворах –«Глюгицире» и CPDA-1 и помещали на хранение притемпературе 4±2 С. Определялификсирующую активность эритроцитов,хранившихся в указанных растворах втечение 1, 3, 5 и 7 суток (табл. 3).

Таблица3

ПБФАЭ человека вотношении бактерий Y. рestis EVНИИЭГ, хранившихся при температуре4± 2 С втечение различного времени (M±m; n=5)

Суспендирую-щий раствор ПБФАЭчеловека в %,хранившихся в течение… сут.
0 1 3 5 7
0,9%-ный раствор хлориданатрия 76,2±3,76 75,28±1,23 71,58±4,81 74,73±4,83 гемолиз
0,1Мфосфатный буфер - 81,85±3,41 81,07±1,14 79,49±5,25 гемолиз
0,05М трис-HCl буфер - 69,83±6,51 77,63±3,96 69,1±4,85 гемолиз
«Глюгицир» - 79,89±2,39 гемолиз гемолиз гемолиз
«CPDA-1» - 80,63±3,99 71,62±3,79 81,72±1,72 гемолиз

ПБФА эритроцитов,хранившихся в 0,9%-ном растворе хлориданатрия, буферных растворах и CPDA-1 до 5 суток, неотличался от исходного значения. Однакопосле 7 суток хранения использоватьэритроциты человека для изучения ихбактериофиксирующей активности было невозможно,так как при их инкубации с микробнымиклетками наблюдался гемолиз. Выраженность БФАЭ вотношении клеток Y. рestis EVНИИЭГ, хранившихся в «Глюгицире» в течениеодних суток, по сравнению со свежимиэритроцитами не изменялась. Вместе с темпосле хранения эритроцитов в данномрастворе в течение 3 суток при их инкубации сбактериями проявлялся выраженныйгемолиз.

Учитывая относительно короткиесроки хранения нативных эритроцитов,изучили возможность использования вэксперименте эритроцитов, обработанныхтанином и формалином (рис. 10).Установили, что величинаПБФАЭ человека в отношении бактерий Y. рestisEV НИИЭГ,обработанных танином, снижается в 2,1 раза, аобработанных формалином – в 14,7 раза посравнению с нативными эритроцитами, поэтому впоследующих экспериментахпредварительную обработку эритроцитовтанином и формалином не проводили; исследованиебактериофиксирующей активностиосуществляли с использованием нативныхэритроцитов, хранившихся в течение неболее 5 суток в 0,9%-ном растворе хлориданатрия при температуре 4±2 С.

 Рис. 10.ПБФА нативных и обработанных танином -14

Рис. 10.ПБФА нативных и обработанных танином иформалином эритроцитов человека вотношении бактерий Y. рestis EVНИИЭГ

Выбравоптимальные условия взаимодействияэритроцитов человека с бактериямивакцинного штамма чумного микроба, провелитестирование разработанногофотоколориметрического метода. Для этогоопределили БФАЭ человека в отношении рядамикроорганизмов бактериальной природы(табл. 4).

Таблица 4

ИАМ и ПБФАЭ человека вотношении различных микроорганизмовбактериальной природы (M±m; n=5)

Микроорганизмы ИАМ ПБФАЭ,%
Вакцинныештаммы B.anthracis № 55 ВНИИВВиМ 4,91±0,67 46,69±2,77
Y.рestis EV НИИЭГ 7,00±0,95 77,41±5,29
Пробиотические штаммы E.coli М-17 2,67±0,28 6,11±0,91
L.plantarum P4 2,07±0,41 7,34±2,19
L.buchneri Р0 2,21±0,17 32,13±3,11
L.casei DN-114001 4,23±0,62 55,25±4,17
L.rhamnosus ATCC 53103 1,12±0,07 14,72±1,25
L.acidophilus 0,12±0,02 0,25±0,04
L.bulgaricus 2,64±0,12 гемолиз
B.bifidum №1 1,93±0,51 0,66±2,54
Штаммы,выделенные из кишечника людей E.coli О151 3,53±0,44 20,74±2,19
E.coli О124 3,15±0,18 17,94±1,68
E.coli О142 2,14±0,41 2,49±1,75
E. coliО144 3,09±0,20 2,72± 2,15
E. coliО86 2,99±0,36 28,26±2,23
E. coliО112 1,85±0,16 3,11±5,34
Музейные штаммы P. аeruginosa 2,22±0,19 12,05±1,64
K. pneumoniae 1,65±0,24 2.42±2,02
E. coli 2,11±0,32 9,47±1,53
P. vulgaris 1,87±0,18 0,81±2,69
P. mirabilis 1,68±0,25 2,56±3,68
S. epidermidis 1,73±0,24 1,46±3,61
S.saprophyticus 1,84±0,18 0,34±2,69
S.marcescens 1,72±0,19 3,83±9,29
M. luteus 1,46±0,20 0,28±1,81

Установили, чтофиксирующая способность эритроцитовчеловека в отношенииизученных микробных культур значительно варьирует. Высокуюстепень бактериофиксирующей активностиэритроциты человека проявили в отношенииклеток Y.рestis EV НИИЭГ, L. casei DN-114001 испор B. anthracis № 55ВНИИВВиМ. Фиксирующая способностьэритроцитов человека в отношениимикроорганизмов, выделенных из кишечникачеловека, и музейных штаммов была выраженазначительно слабее. Сравнивая полученныерезультаты, между значениями ПБФАЭ и ИАМустановили сильную положительнуюкорреляционную связь (r=0,9).

Сопоставлениерезультатов, полученныхфотоколориметрическим методом, с даннымиметода В.И. Брилис позволило ввести шкалуоценки ПБФАЭ. При значениях ПБФАЭ ниже 5%считали, что эритроциты не обладаютспособностью фиксировать микробныеклетки; приПБФАЭ в диапазоне 5–15% фиксирующую способностьэритроцитов считали низкой, 15 – 40% – средней, 40–60% высокой, а свыше 60% – очень высокой.

Согласно предложенной шкалеоценки фиксирующаяспособность эритроцитов вотношении бактерий Y. рestis EV НИИЭГ была очень высокой, вотношении спор B. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, а также бактерий L.casei DN-114001 –высокой; в отношении клетокклинических штаммов E. coliО151, О124, О124 и лактобацилл L. buchneri РО –средней; в отношении бактерийпробиотических штаммов E. coli М17, L. plantarum P4, L. rhamnosus ATCCи музейного штамма E. сoli – низкой; бактериидругих штаммов к эритроцитам человека нефиксировались.

Таким образом, нами былразработан фотоколориметрический методопределения БФАЭ, который имел значительныепреимущества перед традиционным методомопределения адгезивных свойств бактерий.Во-первых, разработанныйметод позволялустанавливать процент бактерий, прочнофиксированных на эритроцитах; во-вторых,давал возможность оцениватьвзаимодействие миллионов микробных клетоки эритроцитов; в-третьих, регистрацияприкрепившихся бактерий к эритроцитамосуществлялась с помощью прибора, чтоисключало субъективность в оценкерезультатов исследования.

2.3. Модификация методагемосканирования для изучения фиксирующейактивности эритроцитов вотношении бактерий

В последние годы вклинической и лабораторной практикеиспользуются методы, основанные насовременных технологиях. Одним из такихметодов является гемосканирование,предложенное К. Грейджем (2002). Пригемосканировании исследуется каплякапиллярной крови. Она анализируется сразупосле взятия крови под большим увеличениемсветового микроскопа (1000 – 1500 раз). При этомизображение передается через видеокамеруна монитор и может сохраняться в видефотографий или динамических изображений(видеороликов). Данных об использованиигемосканирования при изучениивзаимодействия эритроцитов с бактериями вдоступной нам литературе необнаружено.

Первоначально нами былаисследована принципиальная возможностьприменения метода гемосканирования дляизучения процессафиксации эритроцитами бактерий Y. рestis EV НИИЭГ и E. сoli М17. Выбор микроорганизмов,основанный на проведенных ранееисследованиях (табл. 4), обусловлен тем, чтов первом случае фиксирующая способностьэритроцитов человека в отношении Y.рestis EVНИИЭГ является высокой, а по отношениюЕ. сoli М17 – низкой. Впредварительных исследованиях былоустановлено, что для оценкивзаимодействия эритроцитов с бактериямипри помощи гемосканирования пробы следует инкубировать притемпературе 37±1 °С в течение 30 мин навращающейся платформе. Поокончанию инкубации пробкаплю смеси эритроцитов и бактерийнаносили на предметное стекло, закрывалипокровным стеклом и исследовали в иммерсионной системе. Входе экспериментов быливыбраны оптимальные концентрацииэритроцитов и бактерий, а также ихсоотношение. Применениеравных объёмов суспензий эритроцитов ибактерий в концентрациях 0,11012/л и 1,01012/л соответственнопозволяло выявлять взаимодействиемикробов с эритроцитами. При соблюденииданных условий при микроскопии наблюдалибактерии Y.pestis EV НИИЭГ, прикрепившиесяк эритроцитам. В то же время клетки Е. coliМ 17 находились в межэритроцитарномпространстве и на эритроцитах не фиксировались (рис. 11).

АБ

Рис. 11. Микроскопическаякартина при гемосканировании эритроцитовчеловека с нативными клетками Y. pestis EV НИИЭГ (А) иЕ. coli М 17 (Б).1000. 1 - эритроциты; 2 - микробныеклетки

Для лучшей визуализациипроцесса взаимодействия эритроцитов сбактериями последние предварительноокрашивали. При выборе красителя и егооптимальной концентрации соблюдали дваусловия: во-первых, чтобы микробы хорошобыли видны при микроскопировании,во-вторых, чтобы испытуемый краситель невлиял на процесс прикрепления бактерий кэритроцитам. Из трех испытанных красителей(конго-рот, малахитовый зеленый,метиленовый синий) наилучшие показатели вданном отношении проявил метиленовыйсиний. Бактерии Y. pestis ЕV НИИЭГ и Е. coli М17, обработанные метиленовым синим,в оптимальной концентрации были хорошовидны при микроскопии и сохраняли свойствовзаимодействовать с эритроцитами,оставаясь жизнеспособными (рис. 12).

 АБ Микроскопическаякартина при гемосканировании -17

АБ

Рис. 12. Микроскопическаякартина при гемосканировании эритроцитовчеловека с окрашенными метиленовой синьюбактериями Е. coli М 17 (А) и Y. рestis EV НИИЭГ (Б). 1000. 1 - эритроциты; 2 -микробные клетки

Как видно измикрофотографий, представленных на рис. 11 и12, с помощью модифицированного методагемосканирования удалось выявить рядзакономерностей взаимодействияэритроцитов с бактериями. Пригемосканировании бактерий Е. coli М17 сэритроцитами микробные клетки находятся вмежэритроцитарном пространстве и нефиксируются на поверхности эритроцитов, вто время как при исследовании пробы, вкоторой предварительно инкубировалисьэритроциты и бактерии Y.рestis EV НИИЭГ, наблюдаетсяфиксация микробных клеток на эритроцитах,в межэритроцитарном пространстве бактериипрактически отсутствовали. Прикреплениеклеток вакцинного штамма чумного микроба кэритроцитам происходит достаточно прочно.Это определяется при незначительномвращении микровинта микроскопа, врезультате чего происходит смещениеэритроцита вместе с микробной клеткой.Кроме того, обнаружено, что как толькобактерия фиксируется на эритроците, онастановится неподвижной. В том случае, еслификсированной микробной клетки касаетсядругая бактерия, она сразу жеприкрепляется к ней и также становитсянеподвижной. Преимуществомодифицированного методагемосканирования перед другими методамиизучения БФАЭ заключается в том, что дляего использования необходимы минимальныеобъемы крови, которые можно получить изкапилляров пальца человека или изхвостовой вены лабораторных животных.Метод прост в исполнении, позволяет вдинамике изучать взаимодействиеэритроцитов с микробными клетками и ихфункциональное состояние, а результатыисследований могут сохраняться наэлектронных носителях и анализироваться вдальнейшей работе. Усовершенствованныйметод гемосканирования использовали дляподтверждения фиксации бактерий наэритроцитах после фотоколориметрическойоценки их взаимодействия.

Таким образом, намимодифицирован метод гемосканирования,позволяющий проводить исследование БФАЭ вкапле крови, что приближает условияэксперимента к условиям in vivo. Даннымметодом подтверждается факт фиксацииэритроцитами клеток Y. рestisEV НИИЭГ. Метод можетприменяться при изучениибактериофиксирующей активностиэритроцитов человека и разных видовживотных в отношении вакцинных штаммовсибиреязвенного, туляремийного,бруцеллезного микробов, а также длякачественной оценки фиксирующейактивности эритроцитов в отношенииразличных микроорганизмов бактериальнойприроды, находящихся в споровой иливегетативной форме.

2.4. Фиксирующаяактивность эритроцитов людей и животных вотношении клеток вакцинных штаммоввозбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза испоровых форм вакцинных штаммоввозбудителя сибирской язвы

Разработкаинформативного фотоколориметрическогометода количественного определения БФАЭ имодифицирование метода гемосканирования вдальнейшем помогла провести исследованияпо определению БФАЭ в отношении клетоквакцинных штаммов чумного, туляремийного ибруцеллезного микробов, а также спорвакцинных штаммов сибиреязвенного микроба(табл. 5). Как показали исследования,эритроциты человека обладали способностьюфиксировать на своей поверхности клеткивакцинных штаммов возбудителей чумы,туляремии и споры вакцинных штаммоввозбудителя сибирской язвы. При этом впоказателях БФАЭ человека в отношенииисследуемых штаммов выявлялисьсущественные различия.

Таблица 5

ПБФАЭчеловека в отношении вакцинных штаммоввозбудителей чумы, сибирской язвы,туляремии и бруцеллеза (М±m, n=5)

Видымикроорганизмов Штаммы ПБФАЭ,%
Y.рestis EVлинии НИИЭГ 77,41±5,29
B. anthracis (споровые формы) № 55ВНИИВВиМ 46,69±2,77
СТИ-1 46,29±2,72
IIвакцина Ценковского 56,69±2,77
F.tularensis 15линии НИИЭГ 64, 52±,37
B.abortus 19ВА 0,86±0,42

Высокий уровень фиксирующей активности выявлен у эритроцитов человекав отношении вакцинныхштаммов чумного итуляремийного микробов. Показано, чтоПБФАЭ человека в отношении спорсибиреязвенного микроба зависит отштамма.Эритроциты человека в большейстепени фиксируют на своейповерхности споры B. anthracis II вакцины Ценковского, чем споры штаммовСТИ-1 и № 55 ВНИИВВиМ.Установлено, что эритроциты человека нефиксируют на своейповерхности бактерии вакцинного штамма19 ВА бруцеллезного микроба.

Результатыфотоколориметрической оценки БФАЭ былиподтверждены данными гемосканированиясуспензии микробных клеток и спор сэритроцитами человека. При микроскопиикапли эритроцитов со спорами B. anthracis 55 ВНИИВВиМ и бактериями Y. pestis EV НИИЭГ и F. tularensis 15 НИИЭГ наблюдали фиксацию спор и клеток к эритроцитам. В то же времяклетки B. abortus 19 ВА находилисьв межэритроцитарном пространстве и кэритроцитам не прикреплялись.

Таким образом, нами было установлено, что эритроцитычеловека в условиях in vitroобладают выраженной фиксирующей активностью в отношении клетокY. рestis EV линии НИИЭГ,F. tularensis 15 линии НИИЭГ,а также спор B. anthracis № 55 ВНИИВВиМ, СТИ-1и II вакциныЦенковского. В то же время эритроцитычеловека не фиксируют на своей поверхностибактерии B.abortus 19 ВА. Полученные результатыпозволили предположить, чтонаряду с патогенными свойствамивозбудителей БФАЭ, вероятно, влияет на вразвитие иреализациюинфекционных процессов при чуме, сибирскойязве, туляремии и бруцеллезе. При первыхтрех заболеваниях, протекающих у людей вострой форме, эритроциты обладаютспособностью фиксировать на своейповерхности возбудителей заболеваний, апри бруцеллезе,характеризующемсяхроническим течением, эритроциты людей нефиксируют патогены.

На следующем этапеисследований изучили взаимодействиеэритроцитов различных видов животных с бактериямиY. pestis EV НИИЭГ. Результатыопределения БФАЭ млекопитающих вотношении вакцинного штамма чумногомикроба представлены в табл. 6.Эксперименты показали зависимость фиксирующей активностиэритроцитов в отношении вакцинного штаммачумного микроба от их видовойпринадлежности. Высокие показатели БФА вотношении клеток Y. pestisEV НИИЭГустановлены у эритроцитов белой мыши,белой крысы, человека, морской свинки,кролика, свиньи. Низкие показатели БФА вотношении этого микроба выявлены уэритроцитов кошки и лошади.

Таблица 6

ПБФАЭ разных видовмлекопитающих в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ и данныелитературы по их чувствительности к инфицированиювозбудителем чумы

Груп-па Эритроцитымлекопитающих Количество обследованных ПБФАЭ,%(М±m) Чувствительность кинфицированию
1 Белой мыши 12 70,70±3,61 Высокая
Белой крысы 8 83,97±5,01 Высокая
Свиньи 6 76,94±4,01 Высокая
Кролика 8 74,52±4,63 Высокая
Человека 12 76,37±7,15 Высокая
Морской свинки 12 61,12±2,82 Высокая
2 Золотистого хомячка 10 47,09±4,361 Низкая
Козы 8 51,28±7,361 Средняя
Коровы 8 45,31±3,121 Средняя
Овцы 5 43,38±3,741 Средняя
Собаки 6 57,08±3,881 Низкая
3 Лошади 6 30,59±1,881,2 Низкая
Кошки 6 22,11±5,531,2 Низкая

Примечание: 1 –различия сгруппой 1; 1,2– различия сгруппами 1 и 2 достоверны (<0,05) по критериюСтьюдента.

Полученные данные оразличной БФАЭ разных видов животных в отношениибактерий Y. рestisEV НИИЭГ вомногом совпадали с результатамиисследований, отображенными в научнойлитературе,о чувствительности животных кинфицированию возбудителем чумы(Домарадский И.В., 1998; Туманский В.М.,1958; Watson R.L.,FullnerK. J., Kolter R., 2001). Этоподтвердило предыдущее предположение ипозволило выдвинуть гипотезу обопределенной роли эритроцитов в развитии иреализации инфекционного процесса приданном заболевании. Животные, обладающиевысокими показателями БФАЭ в отношениичумных бактерий, более чувствительны к инфицированиюY. рestis, а виды животныхс низким ПБФАЭ менее восприимчивы к заражениювозбудителем чумы.

Для подтверждениявыдвинутой гипотезы были проведеныисследования по изучению фиксирующейактивности эритроцитов различных видовживотных в отношении спор вакцинногоштамма № 55ВНИИВВиМ сибиреязвенного микроба. Дляэтого использовалиэритроциты человека иживотных, обладающих различной чувствительностью к инфицированиювозбудителем сибирской язвы. Из данныхлитературы известно, чтосвиньи и белые крысы обладают естественнойрезистентностью кзаражению B.anthracis, акоровы, кролики и морскиесвинки, как и человек,чувствительны кинфицированию данным возбудителем(Литусов Н.В.,Васильев Н.Т., Васильев П.Г.,2002; Онищенко Г.Г., Кожухов В.В., 2010; Peters C.J.,Calson S.,Pierson D.E.,2002). В связи с этим представляло интерес изучениеБФАЭ в отношении спор B. anthracis 55 ВНИИВВиМ именноэтих видов млекопитающих (табл. 7).

Таблица 7

БФАЭразных видов млекопитающих в отношенииспор B.anthracis55 ВНИИВВиМ иданные литературы по ихчувствительности кинфицированию возбудителем сибирской язвы

Груп-па Эритроциты млекопитающих Количествообследованных ПБФАЭ, % (М±m) Чувствительность кинфицированию
1 Коровы 5 39,18±2,24 Высокая
Кролика 5 46,24±3,18 Высокая
Человека 5 46,69±2,77 Высокая
Морской свинки 6 41,21±2,16 Высокая
2 Белой крысы 6 4,52±1,08 Низкая
Свиньи 5 4,23±0,31 Низкая

Примечание: 1 – различия с группой 1 достоверны(<0,05) по критерию Стьюдента.

Установлено, чтофиксирующая активность в отношении спорB. anthracis № 55 ВНИИВВиМвыражена у эритроцитов коровы, кролика, морской свинки и человека, в то время какэритроциты свиньи и белой крысы фиксируютспорысибиреязвенного микроба вочень незначительной степени. Таким образом,исследования показали такую жезакономерность, что и при изучениификсирующей активности эритроцитов млекопитающих вотношении вакцинного штамма чумногомикроба.

Из анализа данных табл.6 и 7 следует, что фиксирующая активностьэритроцитов в отношении спор B. anthracis 55 ВНИИВВиМ значительно ниже, чембактерий Y.рestis EV НИИЭГ. Вдальнейших исследованиях былоустановлено, что припрорастании спор их способность прикрепляться кэритроцитам усиливается. В то жевремя изучить взаимодействие вегетативныхклеток сибиреязвенного микроба с помощьюсуществующих в настоящее время методовневозможно, так как они находятся в видецепочек и при центрифугировании оседаютвместе с эритроцитами, а пригемосканировании очень сложно установить факт прикрепленияклеток к эритроцитам.

2.5. Изучениемеханизмов взаимодействия эритроцитовчеловека с бактериями Y. рestis EV НИИЭГ

Как известно,взаимодействие про- и эукариотическихклеток представляет собой сложные физико-химическийи биологический процессы. На первой стадииадгезивного процесса происходят приближениебактерий (до 100 нм) и удержание их наповерхности клеток хозяина. По мнению В.В.Федорович, С.В. Калюжный, Вандер Мирен (2002) и Н.Ф. Дмитриевой, Ю.М.Тимофеевой, Н.И. Брико(2007),основную роль в этом процессе играютгидрофобно-гидрофильные свойстваповерхностей.

Для подтвержденияданного положения были проведенысравнительные исследования адгезивнойактивности и гидрофобных свойств культурY. pestis EV НИИЭГ, выращенныхна ГРМ-агаре при различных температурныхрежимах (рис. 13). Микробные клетки, культивируемыепри температурах 20±1 С и 28±1 С и обладающиевыраженными адгезивными свойствами,проявляли достаточно высокуюгидрофобность (значения ПГ составляли38–44%). Укультуры, выращенной при температуре 37±1С ихарактеризующейся низкой адгезивностью,гидрофобные свойства были выраженыотносительно слабо – ПГ находился на уровне 8%.

 Рис. 13.ПБФАЭ и ПГ культур Y. pestisEV -19

Рис. 13.ПБФАЭ и ПГ культур Y. pestisEV НИИЭГ,выращенных при различных температурныхрежимах

Последующиеэксперименты показали, что БФАЭ человека в отношении бактерий Y.pestis EV НИИЭГ игидрофобность микробной культуры этогоштамма зависят не только от температурыкультивирования, но и от составапитательной среды (табл. 8).При выращивании бактерий наАХ их адгезивные и гидрофобные свойства былизначительно выше, чем при выращивании наМПА. При этом добавление в состав МПАсульфата натрия и генцианвиолета неоказывало значительного влияния наадгезивность и гидрофобность микробныхклеток; в тоже время внесение этих ингредиентов в АХприводило к значительному повышениюуровня адгезии и в меньшей степени -гидрофобности испытуемой культуры. Междузначениями ПБФАЭ и ПГ микробных культурвыявили высокую степень корреляционнойсвязи (r=0,9),что позволило высказатьпредположение о важной роли гидрофобныхсил в процессе фиксации эритроцитамичеловека клеток Y. pestisEVНИИЭГ.

Таблица 8

ПБФАЭ человека в отношении бактерий Y.pestis EVНИИЭГ и ПГ микробных культур, выращенных при 28±1 С на питательныхсредах различного состава (М±m, n=5)

Дополнительные ингредиенты впитательной среде Питательная среда
МПА АХ
ПБФАЭ, % ПГ, % ПБФАЭ, % ПГ, %
Отсутствуют 35,93±3,87 15,26±3,34 59,67±3,81 27,44±3,32
Сульфитнатрия 29,24±4,75 13,52±3,02 74,48±2,71 30,48±3,48
Генцианвиолет 34,26±4,48 16,95±3,75 78,21±3,21 29,15±3,57
Сульфитнатрия и генцианвиолет 38,97±9,19 15,72±3,96 76,63±2,97 32,26±0,77

В то же время приизучении электрофоретической подвижностимикробных культур Y. pestisEVНИИЭГ, выращенных приразных температурах и на различных посоставу питательных средах, существенныхразличий не выявлено. Следовательно, всближении эритроцитов склетками Y.рestis EVНИИЭГ основную роль играютгидрофобные взаимодействия.

После приближениябактерий к клеткам-мишенямна расстояние менее 100 нмначинают проявлять действиеван-дер-ваальсовы и водородные силы,которые обеспечивают лиганд-рецепторноевзаимодействие бактерий с клеткой хозяина(Езепчук Ю.В., 1985; ДмитриеваН.Ф., Тимофеев Ю.М., БрикоН.И., 2007). При этом происходит узнаваниеадгезинами бактерийрецепторов эукариотических клеток.Первоначально нами были проведены исследования поизучению влияния на процесс фиксации кэритроцитам адгезинов микробных клетокY. pestis EV НИИЭГ. Для этогооценивалиадгезивную способность микробных культур,выращенных на различных по составупитательных средах. Эксперименты показали,что микробные клетки, культивируемые на АХи ГРМ-агаре,обладают более выраженной способностьюфиксироваться на эритроцитах, чембактерии, выращенные наМПА. Кроме того, былоустановлено, что дополнительныеингредиенты (сульфит натрия игенцианвиолет) повышают адгезивныесвойства культур придобавлении их в АХ и ГРМ-агар(табл. 9).

Таблица 9

ПБФАЭчеловека в отношении клетокY. pestis EV НИИЭГ, выращенныхна различных питательных средах (М±m; n=5)

Дополнительные ингредиенты ПБФАЭ, %
МПА ГРМ-агар АХ
Отсутствуют 35,93±3,87 55,73±2,62 59,67±3,81
Сульфитнатрия 29,24±4,75 71,42±2,85* 74,48±2,71*
Генцианвиолет 34,26±4,48 78,91±2,17** 78,21±3,21*
Сульфитнатрия и генцианвиолет 38,97±9,19 73,88±2,31** 76,63±2,97*

Примечание: * P<0,05; ** P<0,01 – по сравнению суровнем БФАЭ в отношении бактерий,выращенных на питательной среде бездополнительных ингредиентов.

Далее изучили ПБФАЭ вотношении 24-, 48- и 72-часовых микробныхкультур, выращенных при температурах 20±1,28±1 и 37±1 °С на ГРМ-агаре с генцианвиолетом (рис. 14).

 Рис. 14.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. -20

Рис. 14.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ взависимости от температурывыращивания и возрастамикробной культуры

Как показалиисследования, в наибольшей степениэритроциты человека фиксировали клеткиY. pestis EV НИИЭГ, выращенныепри температуре (28±1) °С. При этом у 24- и48-часовых культур величинаПБФАЭ имела наибольшие значения 78–81%. В то же время у72-часовых культур, выращенных при даннойтемпературе, отмечали достоверное (Р<0,05) снижение ПБФАЭ по сравнению с 24- и48-часовой культурами. ПБФАЭ в отношении микробныхклеток, культивируемых при температуре 20±1°С, находился на уровне 60%. При этомзначения БФАЭ в отношении культур сразличными сроками выращиваниястатистически значимо друг от друга неотличались. Бактерии, выращенные притемпературе 37±1 °С, фиксировались на эритроцитах взначительно меньшей степени. Значения ПБФАЭ дляних находились в пределах 10 – 20%и достоверно не отличались у 24-, 48- и72-часовых культур.

Согласно данным Г.Я.Ценевой,Н.Ю. Солодовниковай, Е.А.Воскресенской (2002),охарактеризованный ранее адгезин Y. pestis (белок рН6антиген) экспрессируется только вдиапазоне температур 35…41 С в кислых условияхсреды. Наши результаты, показывающиевысокую адгезивную активность клетокY. pestis EV НИИЭГ приотносительно низких температурах,свидетельствовали о наличии у чумногомикроба и других адгезинов,что совпадало с данными,полученными И.В.Бахтеевой (2008).

На следующей стадии исследованийоценивали взаимодействиемикробных культур, подвергнутых обработкетрипсином и прогреванию при температуре56±1С.Результаты проведенных экспериментов отражены на рис. 15 и16. Установили, что величина ПБФАЭ, после обработкимикробных клеток трипсином в течение1 – 3 часов, а такжепосле прогревания суспензиибактерий втечение 10 – 30минут,значительноснижалась.

 Рис.15.Зависимость ПБФАЭ человека в отношениибактерий -21

Рис.15.Зависимость ПБФАЭ человека в отношениибактерий Y.pestis EV НИИЭГ отпродолжительности обработки бактерийтрипсином

 Рис. 16. Зависимость ПБФАЭчеловека в отношении бактерий -22

Рис. 16. Зависимость ПБФАЭчеловека в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ от продолжительностипрогревания микробной культуры притемпературе 56±1С

Проведенныеисследования позволяют предположить, чтоструктуры бактерий Y. pestisEV НИИЭГ,отвечающие за прикрепление к эритроцитамчеловека, имеют белковую природу, однако привоздействии высокой температуры иферментативной обработки бактерий ихспособность связываться с эритроцитамиполностью не исчезала. Следовательно, вфиксации бактерий на эритроцитах, помимоповерхностных белков, участвуют и другиесубстанции. Учитывая высокуюкорреляционную связь гидрофобности и адгезивности клеток Y. pestisEV НИИЭГ,можно предположить, что структуры,ответственные за связывание бактерий эритроцитами,являются липопротеидами.

Для оценки влиянияэкстрацеллюлярных метаболитов наспособность бактерий фиксироваться наэритроцитах человека провелисравнительные исследования БФАЭ вотношении микробных культур, триждыотмытых 0,9%-ным раствором хлорида натрия, икультур, полученных, минуя стадию отмывания. УровеньБФАЭ в отношении микроорганизмов,выращенных на различных по составу средахпосле отмывания достоверно не отличался отконтроля, следовательно, внеклеточныепродукты метаболизма бактерий не влияли наих способность фиксироваться наэритроцитах человека.

Далее изучали БФАЭ в отношениикультур Y. pestis EV НИИЭГ, которыепассировали через питательную среду и организм белых мышей (рис. 17,18).

 Рис. 17. ПБФАЭ человека вотношении клеток Y. pestisEV -23

Рис. 17. ПБФАЭ человека вотношении клеток Y. pestisEV НИИЭГпосле различного количества пассажейбактерий через питательную среду

 Рис. 18.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. -24

Рис. 18.ПБФАЭ человека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ послеразличного количества пассажей бактерийчерез организм белых мышей

Данные рис. 17 и 18свидетельствуют о том, что уровень БФАЭ вотношении бактерий достоверно неотличался от исходного после 12 пересевовчерез среду выращивания (ГРМ-агар сгенцианвиолетом), а также после 5 пассажейчерез организм белых мышей. Следовательно,пассажи и пересевы бактерий Y. pestis EV НИИЭГ неоказывают влияния на состояние структурмикробных клеток, которые ответственны завзаимодействие с рецепторами эритроцитов,но имеется тенденция к снижению ПБФАЭ взависимости от количества пассажей ипересевов.

Таким образом,установлено, что уровеньбактериофиксирующей активностиэритроцитов зависит от адгезиновмикробных клеток. Показано, что эритроцитычеловека обладают более выраженнойфиксирующей способностью в отношениимикробных клеток, выращенных притемпературе 28±1 °С втечение 1– 2 суток на АХ иГРМ-агаре. Известно, что именно эти условияиспользуются при приготовлении живойчумной вакцины (Коробкова Е.И., 1956; НаумовА.В.,Ледванов М.Ю., Дроздов И.Г., 1992;Наумов А.В., Самойлова Л.В.,1992). Вероятно, высокая фиксирующая активностьэритроцитов в отношении бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, выращенныхв оптимальных условиях, играетопределенную роль в формированииспецифического иммунитета при чуме.

Считается, что уровеньадгезии бактерий к эритроцитам зависит нетолько от лигандов бактерий, но и отрецепторов эукариотических клеток (Езепчук Ю.В., 1985;Дмитриева Н.Ф. Тимофеев Ю.М.,Брико Н.И., 2007), поэтому наследующем этапе исследований изучиливлияние на БФАЭ в отношении Y. pestis EV НИИЭГ рецепторовэритроцитов людей, отвечающих за групповуюпринадлежность по системе АВ0 и Rh.Как показали результаты экспериментов,значения БФАЭ доноров 0(I), А(II), В(III), АВ(IV) в отношенииштамма Y.рestis EV НИИЭГстатистически значимо друг от друга неотличались (рис. 19). Достоверных различий между ПБФАЭпри использовании эритроцитоврезус-положительных (Rh+) ирезус-отрицательных (Rh–)доноров также не было выявлено (рис. 20).

 Рис. 19. ПБФАЭ людей сразличными группами -25

Рис. 19. ПБФАЭ людей сразличными группами крови посистеме АВ0 вотношении штамма Y. рestis EVНИИЭГ

 Рис. 20. ПБФАЭ людей сразличными группами крови по-26

Рис. 20. ПБФАЭ людей сразличными группами крови по системеRh вотношении штамма Y. рestis EVНИИЭГ

Вместе с тем, уровеньсвязывания микробных клеток эритроцитамиотдельных доноров значительно варьировал.Минимальная величина ПБФАЭ былазарегистрирована в отношении эритроцитовдонора В., В(III) Rh+группы крови –35,6±2,79%, максимальная – в отношенииэритроцитов донора С., АВ(IV) Rh+ группы крови–90,61±2,62%.Однако для эритроцитов большей частидоноров –43 человека (77,79% от общего количества) – значения ПБФАЭнаходились в пределах60–90% (рис. 21).

 Рис. 21. ПБФАЭ различныхдоноров(N=56) вотношении штамма-27

Рис. 21. ПБФАЭ различныхдоноров(N=56) вотношении штамма Y. рestis EV НИИЭГ

Полученные результатысвидетельствуют о том, что БФАЭ здоровыхдоноров не зависит от их групповойпринадлежности и резус-фактора, но при этомотмечаются значительные индивидуальныеколебания данного показателя, причиныкоторых не установлены. Вероятно, БФАЭ в отношенииштамма Y. рestis EV НИИЭГ обусловленагенетическими особенностями эритроцитовлюдей, которые не связаны с антигенами,отвечающими за групповуюпринадлежность и резус-фактор. Известно, что привозникновении эпидемий чумы часть людейвыживала, однако объясненийэтому нет.Выявленной особенностьюколебаний ПБФАЭ в отношении клеток Y. рestis EV НИИЭГ можнообъяснить индивидуальнуючувствительность млекопитающих одноговида к заражению возбудителем чумы.

На следующем этапеисследований определяли влияние навеличину БФАЭ человека в отношениибактерий Y.pestis EV НИИЭГ нативнойплазмы и сыворотки кровичеловека, а также альбуминаи нормального иммуноглобулина человека.Для этого в суспензию отмытых эритроцитовчеловека добавляли испытуемые препараты исуспензию бактерий. ПБФАЭ определяли через30 мин инкубации проб в динамическихусловиях при температуре 37±1 С (табл. 10).

Таблица 10

ПБФАЭ в отношениибактерий Y.pestis EV НИИЭГ вприсутствии препаратов плазмы и сывороткикрови (М±m;n = 5)

Препарат ПБФАЭ (в %) при … степениразведения препарата Конт- роль
Б/р 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128
Сывороткакрови 10,0± 1,4*** 12,8± 2,4*** 23,1± 2,7*** 33,9± 3,9*** 43,2± 4,7*** 53,8± 4,6** 66,0± 2,1** 76,4± 3,0
77,6± 2,1
Плазмакрови 4,9± 1,3*** 18,0± 2,3*** 20,9± 3,6*** 35,1± 2,8*** 43,7± 2,7*** 58,9± 3,1** 65,3± 3,4* 72,2± 4,8
Альбумин 31,0± 2,2*** 48,3± 3,7*** 53,5± 1,8*** 67,8± 2,9* 77,1± 2,9 77,6± 2,1 71,3± 3,5 76,8± 4,6
Иммуно-глобулин 39,7± 2,3*** 52,6± 3,8*** 55,5± 3,4*** 69,4± 2,1* 76,4± 3,0 74,6± 2,3 81,5± 2,6 72,2± 5,4

Примечание: *P<0,05; **Р<0,01;***Р<0,001 различия статистически достоверныпо сравнению с контролем;б/р – безразведения.

Анализ экспериментовпоказал, что все тестируемые препаратыоказывали выраженное ингибирующеедействие на процесс прикреплениямикробных клеток к эритроцитам. Наибольшейантиадгезивной активностью обладали плазма и сывороткакрови, которые при использовании в цельномвиде снижали величину ПБФАЭ в 15,9 и 7,8разасоответственно. Их ингибиторный эффектпроявлялсядо разведения 1:64 и исчезалпри разведении 1:128. Цельные альбумин и иммуноглобулин снижалиПБФАЭ в 2,5 и 2,0 раза соответственно.Антиадгезивное действие данных препаратоврегистрировали до разведения 1:8. Болеевыраженную ингибиторную активностьцельной плазмы по сравнению с цельнойсывороткой связывали с антиадгезивнымисвойствами фибриногена, входящего в еёсостав. Полученные результаты свидетельствовали о наличии уплазмы (сыворотки) кровисобственного защитного антимикробногодействия, направленного на снижениеприкрепления чумных бактерий кэритроцитам, и вовлечении целого ряда её компонентов в данный процесс.

В следующей серииэкспериментов быловыявлено, что прединкубация эритроцитов или бактерий с сывороткойкрови,альбумином и иммуноглобулином перед ихсоединением с необработанными клеткамиобеспечивала более значительное снижениеПБФАЭ по сравнению с добавлениемсоответствующих компонентов в пробынепосредственно перед смешиваниеммикробных клеток с эритроцитами (рис. 22). Следовательно, подавлениефиксирующей активности эритроцитов вотношении клеток Y. pestisEV НИИЭГиспытуемыми препаратами может объяснятьсяблокированием как адгезинов бактерий, таки рецепторов эритроцитов.

 Рис. 22.ПБФАЭ человека в отношенииштамма Y.pestis EV -28

Рис. 22.ПБФАЭ человека в отношенииштамма Y.pestis EV НИИЭГ приразличных вариантах добавления препаратов сыворотки крови в систему«бактерии-эритроциты»

Далее исследоваливозможность воздействия сыворотки крови,альбуминов и глобулинов на бактерии, ужеприкрепившиеся кэритроцитам (рис. 23). Дляэтого препараты добавляли всуспензию предварительно инкубированныхбактерий с эритроцитами.Было установлено, что при добавлении в пробы сыворотки кровивеличина ПБФАЭ снижалась на 30,95% (P<0,05) по сравнениюс контролем. Альбумин и иммуноглобулин прианалогичном способе внесения снижалиуровень фиксации бактерий на эритроцитахна 16,04% (P<0,05)и 23,08% (P<0,05).Следовательно, сыворотка крови, альбумин иглобулин человека способны«отрывать» часть клетокисследуемого штамма,фиксированных на эритроцитах.

 Рис. 23. ПБФАЭ человека вотношении штамма Y. pestisEV -29

Рис. 23. ПБФАЭ человека вотношении штамма Y. pestisEV НИИЭГ придобавлении препаратов сыворотки крови впробы после инкубации бактерий с эритроцитамичеловека

Анализ полученныхрезультатов позволил сделать вывод о том,что белковые компоненты плазмы кровиобладают выраженной антиадгезивнойактивностью в отношенииштамма Y. pestis EV НИИЭГ. При этомустановлено, что снижение фиксациибактерий на эритроцитах осуществляют всеизученные белки: альбумины,иммуноглобулины и фибриноген. Показано,что указанные белки одновременноблокируют как рецепторы эритроцитов, так иадгезины бактериальных клеток. Кроме того,выявлено, что компоненты сыворотки кровиспособны «отрывать» клетки чумногомикроба, прикрепившиеся к эритроцитам.Следовательно, организм человека обладаетестественной белковой защитой,препятствующей контакту эритроцитов спопавшими в кровь клетками чумногомикроба, которые стремятся к гемоглобину -источнику ионов железа.

На следующем этапеисследований провели изучение влияния нафиксирующую способность эритроцитовчеловека в отношении бактерий штаммаY. pestisEV НИИЭГразличных антибиотиков. Для этого кэритроцитам и бактериям в различныхвариациях добавляли субтерапевтические итерапевтические концентрацииантибиотиков: гентамицин и доксициклин– 3,0 и 6,0мкг/мл, ампициллин – 10,0 и 20,0 мкг/мл, цефотаксим - 40,0 и 100,0мкг/мл. Установили, что указанныепрепараты в испытанных дозах не оказываютвлияния на процесс фиксации бактерий наэритроцитах. Следовательно, изученныеантибиотики не обладаютантиадгезивным действием в отношении клетоквакцинного штамма чумного микроба.

2.6. Исследованиефиксирующей активности эритроцитовчеловека в отношении вакцинного штаммаY. pestis EV НИИЭГ и спор вакцинногоштамма B. anthracis 55 ВНИИВВиМ вусловиях invivo

На следующем этапеисследований изучилиспособность эритроцитовфиксировать клетки Y. pestis EV НИИЭГ испоры B. anthracis 55 ВНИИВВиМ в организме высокочувствительных к чуме и сибирской язве животных. С этой целью белыммышам внутрибрюшинно, с интервалом 10мин, сначалавводили взвесь эритроцитов человека, азатем взвесь бактерий(спор). Через 30 мин послевведения бактерий осуществляли отборсодержимого брюшной полости и подвергалиего микроскопии (рис. 24).

АВ

Рис. 24. Микрокартинасодержимого брюшнойполости белых мышей через30 минутпосле раздельного введения эритроцитовчеловека с клетками Y. pestisEV НИИЭГ (А) испорами B.anthracis 55ВНИИВВиМ (В). 1000. 1 – эритроцит; 2 – бактерии,фиксированные на эритроците; 3 – спора,фиксированная эритроцитом

Установлено, что вбрюшной полости белых мышейживотных эритроцитычеловека сохраняютспособность фиксировать на своейповерхности бактерии вакцинного штаммачумного и споры вакцинного штаммасибиреязвенного микробов.

Далее провелиисследования фиксирующей активностиэритроцитов белых мышей приэкспериментальной чумной инфекции. Длямоделирования инфекционного процессаиспользовали метод, который применялся дляэкспрессной оценки антибактериальныхпрепаратов при ряде инфекционныхзаболеваний, в том числе приэкспериментальной чуме у белых мышей(Оборин В.А., Васильев Н.Т., Васильев П.Г., 1990;Романов В.Е., Оборин В.А., Ежов А.В., 1991). Белыммышам в брюшную полость одновременновводили бактерии вакцинного штаммачумного микроба в дозе 200 млн микробныхклеток и 5 мг сернокисло-закисного железа вобъеме 0,5 мл. За животными наблюдали втечение трех суток. В случае гибелиживотные подвергались вскрытию ипатоморфологическому исследованию. Особоевнимание обращали на изменения,происходящие в печени и селезенке.

Исследования показали,что микроскопически обнаружить бактериивакцинного штамма в крови белых мышей неудается. В то же время при посеве проб кровии содержимого внутренних органов отпогибших животных выделяли микробныекультуры с характерными для чумногомикроба типичным ростом итинкториально-морфологическимисвойствами. У погибших животных наблюдалиувеличение в размерах печени и селезенки, апри разрезе данных органов выявилиполнокровие с обильным кровянистымотделяемым. При микроскопии отпечатковорганов (печень, селезенка) обнаружилибольшое скопление микробных клеток иэритроцитов. Бактерии находились околоэритроцитов, которые имели измененнуюформу и были частично разрушены, чтокосвенно подтверждало воздействиемикробных клеток на эритроциты.

На следующем этапепровели сравнительные исследования пооценке фиксирующей активности отмытыхэритроцитов и эритроцитовдефибринированной крови человека иразличных видов животных в отношениивакцинного штамма чумного микроба.Результаты исследований представлены втаблице 11.

Таблица 11

ПБФАЭ и ПБФАЭК человекаи различных видов животных в отношениибактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ

Принадлежность эритроцитов Количествообследованных ПБФАЭ,% ПБФАЭК,%
Белая мышь 10 70,70±3,61 15,32±0,98
Белая крыса 8 83,97±5,01 18,73±1,16
Свинья 6 76,94±4,01 17,38±0,82
Кролик 8 74,52±4,63 16,39±1,35
Человек 25 69,37±2,15 14,84±1,26
Морская свинка 12 61,23±2,82 11,57±0,62
Собака 10 57,09±4,361 6,01±0,09
Коза 8 57,08±3,88 4,14±0,03
Корова 8 51,28±7,36 1,03±0,01
Золотистый хомячок 6 47,09±4,36 0
Лошадь 6 30,59±1,88 0
Кошка 6 22,11±5,53 0

Данные табл. 11свидетельствуют о том, что вдефибринированной крови фиксирующаяактивность эритроцитов значительноснижается по сравнению с отмытымиэритроцитами. Эритроциты золотистыххомячков, лошадей и кошек, находящиеся вдефибринированной крови, не способныфиксировать на своей поверхности бактериивакцинного штамма возбудителя чумы, в товремя как у млекопитающих,высокочувствительных к чуме, эритроцитысохраняют эту способность.

Таким образом, вусловиях in vivo при раздельном введении вбрюшную полость эритроцитов человека ибактерий Y. pestisEV НИИЭГ и спор B. anthracis 55 ВНИИВВиМ подтверждена БФАЭ вотношении данных штаммов. Приэкспериментальной инфекции у белых мышей,обусловленной заражением Y. pestis, EV НИИЭГ иодновременным введениемсернокисло-закисного железа установлено,что в печени и селезенке бактериинаходятся около эритроцитов. ИсследованияБФАЭ человека и животных, находящихсянепосредственно в дефибринированнойкрови, показали, что, хотя фиксирующаяспособность эритроцитов снижается, онасохраняется у восприимчивых к чумемлекопитающих. Следовательно, можнопредполагать, что и в организмевосприимчивых к заражению возбудителямичумы, сибирской язвы и туляремии животных,эритроциты обладают способностьюфиксировать патогены.

На основаниидоказательства фиксации бактерий Y. pestis EV НИИЭГ, F. tularensis 15 НИИЭГ испор B. anthracis СТИ-1, 55 ВНИИВВиМ и II вакциныЦенковского на эритроцитах человека иживотных в условиях in vitro и in vivo выдвинутаследующая гипотеза: возбудители чумы,сибирской язвы, туляремии при попадании вкровь восприимчивых и чувствительных кинфицированию животных фиксируются наэритроцитах и транспортируются ими впечень и селезенку, где поглощаютсямакрофагами. В макрофагах клетки Y. pestis, F. tularensis и спорыB. anthracisстановятся недоступными длянеспецифических факторов защиты организмаи интенсивно пролиферируют. Для этого вмакрофагах создаются все необходимыеусловия, в том числе достаточноеколичество ионов железа, поступающее изразрушенных эритроцитов, и ацидоз, которыйспособствует экспрессии микробами белков,ответственных за патогенность. Послеинтенсивного размножения бактериймакрофаги погибают, микробные клетки вбольшом количестве попадают в кровеносноерусло, т.е. наступает вторичнаябактериемия. Это приводит к развитиюсептического состояния. Массовый лизисэритроцитов и образование патологическихформ гемоглобина вызывают гипоксию тканейи анемию, что способствует гибелиорганизма хозяина.

2.7. Теоретическое иэкспериментальное обоснованиеперспективности адресной доставкиантибактериальных препаратов с помощьюэритроцитарных контейнеров при экстреннойпрофилактике и лечении опасныхинфекционных заболеваний

Выдвинутая гипотезапозволяет открыть новое направление вэкстренной профилактике и лечении опасныхинфекционных заболеваний, возбудителикоторых способны к внутриклеточномусуществованию и размножению. Для адреснойдоставки антимикробных препаратов вмакрофаги, где локализуются возбудители,целесообразно использоватьэкстракорпоральный способ введенияантибиотиков с помощью эритроцитарныхконтейнеров. Это позволит не толькоосуществить адресную доставку препаратови эффективно воздействовать на бактерии,расположенные в макрофагах, но и уменьшитпобочное действие антибиотиков наорганизм хозяина.

Обоснованием адреснойдоставки антибиотиков при чуме, сибирскойязве и туляремии являются данные,представленные в научной литературе, о том,что физиологическая утилизация старых иизмененных форм эритроцитовосуществляется в основном селезеночнымимакрофагами (Пухова Я.И., 1979; Шишкин А.В., 1986;Козлов В.А., 2001), поэтому эритроцитарныеконтейнеры с антибиотиками будутпоглощаться макрофагами селезенки. В то жевремя из выдвинутой нами гипотезы следует,что при развитии инфекционных процессовпри чуме, сибирской язве и туляремиивозбудители находятся и размножаются вэтих же макрофагах. Следовательно,эритроцитарные контейнеры с антибиотикамибудут доставлены в места локализации ипролиферации бактерий. При этом влияниеантибиотиков на другие органы и тканимакроорганизма будет минимальным, адействие антибактериальных препаратовбудет более длительным, чем при другихспособах их введения.

Экспериментальнымиисследованиями показано, что эритроцитычеловека, подвергшиеся гипоосмотическомушоку, способны нагружаться гентамицином ипревращаться в эритроцитарные контейнеры.Это свидетельствует о перспективности ивозможности введения антибактериальныхпрепаратов с помощью эритроцитарныхконтейнеров при экстренной профилактике илечении опасных инфекционных заболеваний,что позволит осуществлять адреснуюдоставку антибиотиков в печень иселезенку, пролонгировать действие иминимизировать вредные последствияантибактериальных препаратов.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что методыС.С. Гизатулиной и В.И. Брилис не способны вполной мере охарактеризовать БФАЭчеловека в отношении клеток Y. pestis EV НИИЭГ и спорB. anthracis 55ВНИИВВиМ, так как вакцинный штамм чумногомикроба не образует адгезивно-активныеколонии, наличие которых необходимо вметоде С.С. Гизатулиной; метод же В.И.Брилис, наряду с его трудоемкостью исубъективностью, не позволяет установитьсам факт фиксации бактерий наэритроцитах.

2. На модели вакцинногоштамма Y. pestis EVНИИЭГ разработан фотоколориметрическийметод количественного определения БФАЭ,позволяющий оценивать взаимодействиемиллионов микробных клеток с эритроцитами(патент РФ на изобретение № 2360969 от 10.07.2009г.). В его основу положенафотоколориметрическая регистрациясодержания микробных клеток внадосадочной жидкости после осаждениясмеси эритроцитов и микробов прицентрифугировании – чем меньше ее оптическая плотность,тем выше БФАЭ по отношению к исследуемомувиду бактерий.

3. Модифицирован методгемосканирования, позволяющийосуществлять наблюдение за процессомадгезии бактерий на эритроцитахвегетативных и споровых форм бактерийпутем микроскопии. Этот метод даетвозможность исследовать БФАЭ человека иразличных видов животных в условиях,близких к in vivo.

4. Фотометрическимметодом и методом гемосканированияустановлено, что эритроциты человека иживотных фиксируют на своей поверхностиклетки Y. pestis EVНИИЭГ и F. tularensis 15 НИИЭГ, а также споры штаммовB. anthracis СТИ-1, 55ВНИИВВиМ и II вакцины Ценковского. В то жевремя эритроциты человека с бактериямиB. abortus 19 ВА имикробными клетками сапрофитноймикрофлоры не взаимодействуют.

5. Фиксация эритроцитамибактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ зависитот их видовой принадлежности – у человека, белыхмышей, морских свинок, белых крыс, кроликов,домашних свиней БФАЭ высокая, а у лошадей икошек - низкая. Аналогичная тенденциявыявлена при изучении БФАЭ млекопитающих вотношении спор вакцинного штамма B. anthracis 55 ВНИИВВиМ.ПБФАЭ в отношении спор штамма 55 ВНИИВВиМ умлекопитающих, восприимчивых к сибирскойязве, находится на высоком уровне, а уустойчивых к заражению B.anthracis – на низком уровне.

6. БФАЭ человека вотношении бактерий Y.pestis EV НИИЭГ обусловленагидрофобными свойствами микробных клеток;уровень фиксации эритроцитами бактерийзависит как от морфофункциональногосостояния поверхностных структурбактерий, так и от рецепторного аппаратаэритроцитов. БФАЭ человека снижается подвлиянием белков плазмы крови (альбумина,глобулинов и фибриногена), но не зависит отантибактериальных препаратов (ампициллин,гентамицин, доксициклин, цефотаксим),используемых в терапевтическихконцентрациях.

7. В опытах на белых мышахустановлено, что эритроциты человекасохраняют способность фиксировать насвоей поверхности бактерии Y. pestis EV НИИЭГ и спорыB. anthracis 55ВНИИВВиМ в брюшной полости у белых мышей, атакже во внутренних органах (печень,селезенка) при экспериментальной чумнойинфекции у данных животных, обусловленнойвнутрибрюшинным введением вакцинногоштамма возбудителя чумы на фонесернокисло-закисного железа. Этоподтверждает способность эритроцитоввзаимодействовать с бактериями илиспорами в условиях in vivo.

8. На основанииполученных результатов и данныхлитературы выдвинута гипотеза о ролиэритроцитов в реализации инфекционныхпроцессов при чуме, туляремии и сибирскойязве, согласно которой возбудители данныхзаболеваний, попав в кровяное русло,фиксируются эритроцитами и доставляются впечень и селезенку, где поглощаютсямакрофагами. В макрофагах микробыинтенсивно размножаются. После гибели иразрушения макрофагов бактерии в массовомколичестве выходят в кровеносное русло,что способствует развитию септическогосостояния, а гемолиз эритроцитов иобразование метгемоглобина приводят канемии и гипоксии, усугубляющих течениеинфекционных процессов при данныхзаболеваниях.

9. Эритроциты человека,подвергшиеся гипоосмотическому шоку,способны нагружаться антибиотикомгентамицином, т.е. превращаться вэритроцитарные контейнеры. Этосвидетельствует о перспективностиприменения экстракорпорального способавведения антибактериальных препаратов приэкстренной профилактике и лечении опасныхинфекционных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕРЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанныефотоколориметрический метод определениябактериофиксирующей активностиэритроцитов в отношении микроорганизмовбактериальной природы и модифицированныйметод гемосканирования можно применятьпри отборе наиболее перспективных штаммовпробиотических препаратов,используемых при лечениидисбиотических состояний.

2. С целью повышения эффективностиантибиотиков при экстренной профилактикеи леченииинфекционных заболеваний целесообразноразрабатывать и использовать адресную доставкупрепаратов с помощью эритроцитарныхконтейнеров.

3. Предлагаемые методыфотоколориметрии и гемосканированиярекомендуется применять при изучениипроцесса адгезии между про- иэукариотическими клетками в учебномпроцессе при прохождении студентамивысших учебных заведений учебныхдисциплин - нормальной, патологическойфизиологии, микробиологии.

СПИСОК РАБОТ,ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Специфические инеспецифические факторыпротивоинфекционной защиты у свиней присибирской язве / В.С. Смирнов, Л.И. Маринин,В.А. Оборин и др. // Иммунология. – 1985. – № 5. – С. 80 – 81.

2. Спектрчувствительности Francisellatularensis к антибиотикам исинтетическим антибактериальнымпрепаратам / В.А. Оборин, Н.Т. Васильев, П.Г.Васильев и др. // Антибиотики ихимиотерапия. – 1989. - № 9. – С. 662 –665.

3. Оборин, В.А. Ускореннаяоценка эффективности антибактериальныхпрепаратов при экспериментальнойтуляремии / Н.Т. Васильев, П.Г. Васильев В.А.Оборин // Антибиотики и химиотерапия.– 1990. – № 8. – С. 37 – 38.

4. Экспрессный методоценки эффективностиантибактериальных препаратов in vivo / В.А.Оборин, И.Д. Кравец, Н.Т. Васильев и др. //Современные направления создания и оценкикачества готовых лекарственных препаратовантибиотиков и антимикробных веществ:Тезисы докладов Всесоюзной конференции.– М., 1990. – С. 192.

5. Изучение антимикробнойактивности аминогликозидов приэкспериментальном сапе и мелиоидозе / В.А.Оборин, И.Д. Кравец, М.Н. Корнилов и др. //Актуальные проблемы химиотерапиибактериальных инфекций: Тезисы докладовВсесоюзной конференции. – М., 1991. – С. 470 – 471.

6. Использованиевакцинного штамма ЕВ для разработкибезопасного метода экспрессной оценкиэффективности антибактериальныхпрепаратов в отношении возбудителя чумы /В.Е. Романов, В.А. Оборин, А.В. Ежов и др. //Актуальные вопросы профилактики опасныхинфекционных заболеваний: Тезисы докладовМежведомственной научной конференции.– Киров, 1991.– С. 86 – 87.

7. Изучение возможностииспользования показателя фагоцитарнойактивности лейкоцитов крови для оценкисостояния противочумного иммунитета / С.Н.Чигринов, И.Д. Кравец, В.А. Оборин и др. //Актуальные вопросы профилактики опасныхинфекционных заболеваний: Тезисы докладовМежведомственной научной конференции.– Киров, 1991.– С. 116 – 117.

8. Ускоренный методоценки эффективности антибактериальныхлекарственных препаратов / В.А. Оборин, И.Д.Кравец, Н.Т. Васильев, и др. // Антибиотики ихимиотерапия. – 1992. – Т.37, № 3. – С.6–9.

9. Обоснование подходовк ранней диагностике чумы / С.Н. Чигринов,В.Б. Калининский, В.А. Оборин // Материалыюбилейной научной конференции,посвященной 70-летию НИИ микробиологии МОРФ. – Киров, 1998.– С. 107 – 108.

10. Выбор методов,перспективных для ранней диагностики чумы/ С.Н. Чигринов, В.А. Оборин, В.Б. Калининскийи др. // Материалы юбилейной научнойконференции, посвященной 70-летию НИИмикробиологии МО РФ. – Киров, 1998. – С. 269.

11. Патоморфогенезсибирской язвы монография / Н.В. Литусов,П.Г. Васильев, В.А. Оборин и др. – М.: Медицина, 2002.– 240 с.

12. Фотометрическийметод определения бактериофиксирующейактивности эритроцитов в отношениивозбудителей бактериальных инфекций / В.А.Оборин, А.Л. Бондаренко, В.Е. Романов и др. //Материалы научно-практической конференциии школы по инфекционной патологии смеждународным участием. – М.: МДВ, 2007. – С. 76.

13. Оборин, В.А. Разработкаи перспективы применения фотометрическогометода определения бактериофиксирующейактивности эритроцитов (БФАЭ) вветеринарии / А.Г. Ивонин, В.А. Оборин //Известия Оренбургского государственногоаграрного университета. – 2008. - № 3. – С. 80–82.

14. Оборин, В.А.Разработка и применение фотометрическогометода определения бактериофиксирующейактивности эритроцитов в отношениивозбудителей бактериальных / В.А. Оборин,Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Международноесотрудничество и развитие биотехнологий вКировской области: Тезисы докладовмеждународной конференции. – Киров, 2008. – С. 79 – 85.

15. Оборин, В.А. Методыизучения адгезивных свойствмикроорганизмов / А.Г. Ивонин, В.А. Оборин //Науке нового века – знания молодых: Сборник статей 8-йнаучной конференции аспирантов исоискателей. –Киров: Вятская ГСХА, 2008. – С. 12 – 14.

16.Фотоколориметрический метод определениябактериофиксирующей активностиэритроцитов / А.Г. Ивонин, В.Е. Романов, В.А.Оборин, Е.Л. Нехорошкина // Достиженияветеринарной науки и практики: Сборникстатей Всероссийской научно-практическойконференции. –Киров: Вятская ГСХА, 2008. – С. 63 – 69.

17. Изучениевзаимодействия эритроцитов крови людей,имеющих различную групповуюпринадлежность, в отношении вакцинногоштамма ЕВ чумного микроба / В.А. Оборин, И.В.Предеина, А.Г. Ивонин и др. // Актуальныепроблемы физической культуры и спорта ипути их решения: Сборникнаучно-методических статей. – Киров: Изд-во ВятГГУ,2008. –С. 59–62.

18. Перспективыприменения антиадгезивной терапии приинфекционных заболеваниях, обусловленныхвозбудителями чумы, сибирской язвы исальмонеллеза / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г.Ивонин, В.Е. Романов // Диагностика, лечениеи профилактика опасных и особо опасныхинфекционных заболеваний. Биотехнология:Материалы Всероссийской научнойконференции, посвященной 80-летию со дняоснования ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России».– Киров: ФГУ «48ЦНИИ Минобороны России», 2008. – С. 99–103.

19. Оборин, В.А. Изучениеадгезивных свойств вакцинного штамма EVчумного микроба с помощью различныхметодов / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г.Ивонин // Диагностика, лечение ипрофилактика опасных и особо опасныхинфекционных заболеваний. Биотехнология:Материалы Всероссийской научнойконференции, посвященной 80-летию со дняоснования ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России».– Киров: ФГУ «48ЦНИИ Минобороны России», 2008. – С. 198–202.

20. Исследованиебактериофиксирующей активностиэритроцитов (БФАЭ) крови различных видовживотных и человека в отношении вакцинногоштамма EV чумного микроба / В.А. Оборин, Е.В.Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов //Диагностика, лечение и профилактикаопасных и особо опасных инфекционныхзаболеваний. Биотехнология: МатериалыВсероссийской научной конференции,посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48ЦНИИ Минобороны России». – Киров: ФГУ «48 ЦНИИМинобороны России», 2008. – С. 202–205.

21. Роль эритроцитов вгенерализации инфекционного процесса прибактериальных инфекциях / В.А. Оборин, Е.В.Пименов, А.Г. Ивонин, В.Е. Романов //Диагностика, лечение и профилактикаопасных и особо опасных инфекционныхзаболеваний. Биотехнология: МатериалыВсероссийской научной конференции,посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48ЦНИИ Минобороны России». – Киров: ФГУ «48 ЦНИИМинобороны России», 2008. – С. 205–209.

22. Изучение адгезииклеток вакцинного штаммa EV Yersinia pestis кэритроцитам человекафотоколориметрическим методом / В.А.Оборин, А.Г. Ивонин, Е.В. Пименов и др. //Вестник Новосибирского государственногоуниверситета. Серия: Биология, клиническаямедицина. – 2009.- Т. 7. – Вып. 3.– С. 25–29.

23. Оборин, В.А. Влияниеразличных условий и сроков храненияэритроцитов на показатель ихбактериофиксирующей активности / А.А.Костяев, А.Г. Ивонин, В.А. Оборин //Гематология и трансфузиология. – 2009. - № 6. – С. 45–47.

24. Изучение механизмоввзаимодействия микробов с эритроцитами /В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин и др. //Актуальные проблемы биологической защитывойск и населения. Диагностика, лечение ипрофилактика опасных инфекционныхзаболеваний. Эпидемиология иэпизоотология. Микробиология.Биотехнология. Экология: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции. –Екатеринбург, 2009. – С. 62–64.

25. Гемосканирование– возможностии перспективы применения при изучениивопросов взаимодействия бактерий склетками живой крови / В.А. Оборин, Е.В.Пименов, Ф.И. Абашева и др. // Актуальныепроблемы биологической защиты войск инаселения. Диагностика, лечение ипрофилактика опасных инфекционныхзаболеваний. Эпидемиология иэпизоотология. Микробиология.Биотехнология. Экология: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции. –Екатеринбург, 2009. – С. 61–62.

26. К вопросу о ролиэритроцитов в инфекционной патологии / В.А.Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин и др. //Актуальные проблемы биологической защитывойск и населения. Диагностика, лечение ипрофилактика опасных инфекционныхзаболеваний. Эпидемиология иэпизоотология. Микробиология.Биотехнология. Экология: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции. –Екатеринбург, 2009. - С. 64–66.

27. Оборин, В.А. Рольэритроцитов в реализации инфекционногопроцесса / В.А. Оборин // Гемореология имикроциркуляция (от функциональныхмеханизмов в клинику): Материалымеждународной научной конференции. – Ярославль, 2009.– С. 136.

28. Oborin, V.A. Gemoscaning: potentialitiesand prospects when used studing bacteria interaction with blood cells / F.I.Abasheva, V.A. Oborin // Scientific and practical conference of post-graduates,candidacy applicants, graduates, undergraduates in modern languages «Exprofesso». Transactions. - Kirov: Vyatka State University, 2009. – P. 11–13.

29. Оборин, В.А. Изучениеадгезии бактерий вакцинного штамма Y. pestis EV НИИЭГ кэритроцитам животныхфотоколориметрическим методом /В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин //Проблемы особо опасных инфекций. – 2010. – Вып. 103. – № 1. – С. 48–50.

30. Оборин, В.А. Влияниеусловий культивирования штамма Yersinia pestis EVНИИЭГ на его адгезивные свойства / В.А.Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин // Проблемыособо опасных инфекций. – 2010. – Вып. 105. - № 3. – С. 54–57.

31. Оборин, В.А.Бактериофиксирующая активностьэритроцитов: монография / В.А. Оборин; поднаучной редакцией чл.-корр. РАН Е.В.Пименова: - Киров: Вятская ГСХА, 2010. – 194 с.

32. Оборин, В.А.Фотоколориметрический метод изучениявзаимодействия бактерий с эритроцитамилюдей и животных / В.А. Оборин, А.Г. Ивонин,Е.В. Пименов  // Методические рекомендации.– Киров, 2010. - 20с.

33. Оборин, В.А. Способызагрузки эритроцитов лекарственнымипрепаратами / О.В. Вылегжанина, В.А. Оборин //Науке нового века – знания молодых: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции молодых ученых: аспирантов исоискателей, посвященной 80-летию ВятскойГСХА – Киров:Вятская ГСХА, 2010. - Ч. 2. - С. 6 – 9.

34. Оборин, В.А. Изучениеадгезивных свойств бактерий при помощиметода гемосканирования / Ф.И. Лянгасова,В.А. Оборин // Науке нового века – знания молодых.Материалы Всероссийскойнаучно-практической конференции молодыхученых, аспирантов и соискателей,посвященной 80-летию Вятской ГСХА Сборникнаучных трудов. – Киров: Вятская ГСХА, 2010. – Ч. 2. – С. 35 – 37.

35. Перспективы адреснойдоставки антибактериальных препаратов спомощью эритроцитов крови в ветеринарии /В.А. Оборин, Е.В. Пименов, О.В. Вылегжанина идр. // Современные научно-практическиедостижения в ветеринарии: Сборник статейМеждународной научно-практическойконференции, посвященной 80-летию Вятскойгосударственной сельскохозяйственнойакадемии. Выпуск 1. – Киров: Вятская ГСХА, 2010. - С. 141 – 144.

36. Адгезивные свойстваспор вакцинного штамма 55 НИИВВиМсибиреязвенного микроба в отношенииэритроцитов человека и некоторых видовживотных / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г.Ивонин и др. // Современныенаучно-практические достижения вветеринарии: Сборник статей Международнойнаучно-практической конференции,посвященной 80-летию Вятскойгосударственной сельскохозяйственнойакадемии. Выпуск 1. – Киров: Вятская ГСХА, 2010. – С. 144 – 148.

37. Оборин, В.А. Роль железав патогенезе бактериальных инфекций / В.А.Оборин, Е.В. Пименов, В.Е. Романов //Современные научно-практическиедостижения в ветеринарии: Сборник статейМеждународной научно-практическойконференции, посвященной 80-летию Вятскойгосударственной сельскохозяйственнойакадемии. Выпуск 1. – Киров: Вятская ГСХА, 2010. - С.148 – 151.

38. Бактериофиксирующаяактивность эритроцитов крови здоровыхдоноров в отношении вакцинного штаммаYersinia pestis EVНИИЭГ / В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин идр. // Актуальные вопросы трансфузиологии иклинической медицины: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции, посвященной 50-летию ФГУ«КНИИГиПК ФМБА России» с международнымучастием. - Киров, 2010. - С. 89 – 90.

39. Оборин, В.А. Влияниеусловий и сроков хранения эритроцитов напоказатели их бактериофиксирующейактивности в отношении вакцинного штаммаYersinia pestis EVНИИЭГ / А.А. Костяев, В.А. Оборин, А.Г. Ивонин //Актуальные вопросы трансфузиологии иклинической медицины: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции, посвященной 50-летию ФГУ«КНИИГиПК ФМБА России» с международнымучастием. - Киров, 2010. – С. 177 –178.

40. Обоснованиеприменения эритроцитарных контейнеров дляадресной доставки антибиотиков прилечении опасных инфекционных заболеваний /В.А. Оборин, Е.В. Пименов, О.В. Вылегжанина идр. // Актуальные вопросы трансфузиологии иклинической медицины: МатериалыВсероссийской научно-практическойконференции, посвященной 50-летию ФГУ«КНИИГиПК ФМБА России» с международнымучастием. - Киров, 2010. – С. 346 –347.

41. Оборин, В.А. Методыизучения адгезивной активности Lactobacillus иих практическое применение / О.В. Смирнова,В.А. Оборин // Общество – наука – инновации:Материалы Всероссийскойнаучно-технической конференции. В 4 т.– Киров: Изд-воГОУ ВПО «ВятГУ», 2010. - Том 1. БФ, ФАМ, ХФ.– С. 43 – 45.

42. Оборин, В.А. Рольадгезивных свойств лактобацилл приполучении эффективных пробиотическихпрепаратов / О.В. Смирнова, В.А. Оборин //Общество –наука –инновации: Материалы Всероссийскойнаучно-технической конференции. В 4 т.– Киров: Изд-воГОУ ВПО «ВятГУ», 2010. Том 1. БФ, ФАМ, ХФ. – С. 150 – 152.

43. Методы определениябактериофиксирующей активностиэритроцитов и оценки адгезивных свойствмикроорганизмов бактериальной природы /В.А. Оборин, Е.В. Пименов, С.Н. Копылов и др.Учебно-методическое пособие. – Киров: Вятская ГСХА,2010. - 27 С.

44. Оборин, В.А. Исследование адгезивнойактивности культур лактобацилл, входящих всостав различных пробиотическихпрепаратов / О.В. Смирнова, В.А. Оборин // Вопросыфундаментальной и прикладной физиологии висследованиях студентов вузов: МатериалыIIрегиональной молодежной научнойконференции – Киров, 2010. - С. 39 – 40.

45. Оборин, В.А. Определение электрическогопотенциала эритроцитов различных видовживотных / Ю.О. Данилов,В.А. Оборин// Вопросы фундаментальной иприкладной физиологии в исследованияхстудентов вузов: Материалы II региональной молодежной научнойконференции.–Киров, 2010.-С. 16 – 18.

46. Оборин, В.А.Сравнительный анализ информативностиметодов определения бактериофиксирующейактивности эритроцитов /В.А. Оборин, Е.В. Пименов, А.Г. Ивонин //Теоретическая и прикладная экология.– 2011. – № 1.– С. 22–28.

47. Оборин, В.А. Модификация методагемосканирования для изучения механизмовадгезии бактерий на эритроцитах / В.А. Оборин, Е.В.Пименов, А.Г. Ивонин // Теоретическая иприкладная экология. – 2011. – № 2.– С. 24–29.

48. Пименов, Е.В. Фиксирующая активностьэритроцитов человека исельскохозяйственных животных в отношениибактерий пробиотических штаммов / Е.В. Пименов, В.А.Оборин, А.Г.Ивонин // Ветеринарная медицина. – 2011. – №1. – С. 36 – 38.

ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Пат. RU 2360969 / Способ определениябактериофиксирующей активностиэритроцитов / В.Е. Романов, А.Г. Ивонин, А.Л.Бондаренко, В.А. Оборин, Е.Л. Нехорошкина (РФФГУ ВПО Вятская государаственнаясельхозакадемия). - № 2007 141246/13; Заявл. 06. 11.2007; Опубл. 10. 07. 2009. Бюл. № 19. С. 5.

СПИСОКПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ААК –адгезивно-активная колония

АХ – агарХоттингера

БФАЭ –бактериофиксирующая активностьэритроцитов

ГВ –генцианвиолет

ГРМ-агар – агар на основегидролизата рыбной муки

Е – экстинкцияраствора (оптические единицы)

ИАМ – индекс адгезиимикроорганизма

К – коэффициентучастия эритроцитов в адгезивномпроцессе

МПА – мясопептонныйагар

ОП – оптическаяплотность

ПА – показательадгезии

ПБФАЭ – показательбактериофиксирующей активностиэритроцитов

ПБФАЭК – показательбактериофиксирующей активностиэритроцитов в крови

ПГ – показательгидрофобности

РГА – реакциягемагглютинации

S-слой–поверхностный (surface) паракристаллический слой клетокпрокариот

Подписано впечать…………………Объем– 2 печ. л.

Тираж – 100. Заказ №

Отпечатано втипографии по адресу:



 



<
 
2013 www.disus.ru - «Бесплатная научная электронная библиотека»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.