Разработка и биофармацевтическое исследование лекарственных форм гатифлоксацина на основе полимерных наночастиц
На правах рукописи
Блынская Евгения Викторовна
РАЗРАБОТКА И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ ГАТИФЛОКСАЦИНА НА ОСНОВЕ ПОЛИМЕРНЫХ НАНОЧАСТИЦ
14.04.01. – технология получения лекарств
14.03.06. – фармакология и клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва, 2010
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Первый Московский Государственный Медицинский Университет имени И.М. Сеченова».
Научные руководители:
доктор медицинских наук, Аляутдин Ренад Николаевич
профессор
доктор фармацевтических наук,
профессор Алексеев Константин Викторович
Официальные оппоненты:
Доктор фармацевтических наук,
профессор Демина Наталья Борисовна
Доктор фармацевтических наук,
профессор Бунятян Наталья Дмитриевна
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский Университет Дружбы Народов»
Защита состоится « » 2010 года в часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 в Московской Медицинской Академии имени И.М. Сеченова по адресу 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова по адресу 117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49.
Автореферат разослан « » 2010 года
Ученый секретарь Диссертационного совета,
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность. Повышение избирательности действия всегда являлось одной из важнейших задач современной фармации. Помимо направленного действия, это привело бы еще к целому ряду терапевтически значимых эффектов, а именно: уменьшение токсичности, расширение спектра применения и т.д. Однако до сих пор этому препятствовала физиологичность, сопутствующая их приему, а также индивидуальные особенности лекарственных веществ.
В ходе развития фармацевтической технологии появилась возможность создания лекарственных средств направленного действия, причем не только на клеточном, но и на субклеточных уровнях. Сами по себе подходы и технологии были различны, объединяло их одно – векторность действия фармакологически активного вещества задавалась носителем, характеризующимся наноразмерностью. Именно вследствие наноразмерности, сопоставимой с диаметром капилляра, обеспечивалась направленность действия относительно хорошо кровоснобжаемых органах, а также быстрый захват иммунной системой (с чем удалось справиться рядом технологических приемов, таких как ПЭГ-илированием и др.). В дальнейшем появилась идея использовать свойство наноразмерных частиц захватываться клетками иммунной системы, в частности - макрофагами, для направленного лечения внутриклеточных инфекций, таких, например, как туберкулез. Известно, что внутри клеток способны размножаться микроорганизмы, такие как Mycobacteria, Legionella, Chlamidia, Toxoplasma, Listeria, Esherichia, способные сохранять патогенность во внутриклеточной среде Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Streptococcus В и другие возбудители. В отношении них активность на данный момент проявляет только небольшая группа противомикробных препаратов. В первую очередь - фторхинолоны последнего поколения. Они значительно отличаются друг от друга по степени проникновения в ткани, но по данному показателю, а также по показателю эффективности первые позиции занимает гатифлоксацин.
В связи с вышеперечисленным, создание лекарственных форм наночастиц гатифлоксацина для терапии наиболее распространенных и трудно поддающихся лечению внутриклеточных инфекций, используя при этом биодеградируемый и биосовместимый полимер, минимизирующий его индивидуальное воздействие на организм, является актуальным.
Цель исследования: Провести экспериментальное и теоретическое обоснование составов наночастиц гатифлоксацина, изучить фармакодинамическую активность и фармакокинетические показатели разработанных лекарственных форм на их основе.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:
1. Изучить физико-химические свойства субстанции гатифлоксацина,
2. Исследовать технологические факторы, влияющие на показатели качества наночастиц гатифлоксацина.
3. Обосновать выбор вспомогательных веществ для получения наночастиц гатифлоксацина, разработать составы и технологию лекарственных форм гатифлоксацина на основе наночастиц.
4. Осуществить разработку методик анализа полученных лекарственных форм, исследовать стабильность разработанных лекарственных форм гатифлоксацина в процессе хранения.
5. Изучить фармакодинамическую активность разработанных лекарственных форм на основе наночастиц гатифлоксацина.
6. Исследовать фармакокинетические параметры полученных лекарственных форм гатифлоксацина.
7. Осуществить сравнительную биофармацевтическую оценку разработанных лекарственных форм гатифлоксацина и таблетированной лекарственной формой, выпускаемой промышленностью.
8. Разработать необходимую нормативную документацию – ФСП, лабораторные регламенты.
Научная новизна полученных результатов. В результате проведенных исследований с использованием физико-химических методов разработан и научно обоснован состав наночастиц, лиофилизата и капсул гатифлоксацина. Установлено, что субстанция гатифлоксацина обладает рН-зависимой растворимостью. Максимальное значение растворимости (60 мг/мл) наблюдается при рН 3-5.
Впервые на основе комплекса технологических исследований разработана технология изготовления стабильных наночастиц гатифлоксацина с применением метода двойного эмульгирования полимеров.
Методом электронной микроскопии, спектрофотометрии и фотонной корреляционной спектроскопии изучены технологические факторы, влияющие на показатели качества наночастиц гатифлоксацина, определяемые природой полимера, органического растворителя и их соотношением. Сравнительный анализ полученных показателей размера частиц, степени включения гатифлоксацина в частицы и морфологических особенностей системы позволил выбрать составы с оптимальным соотношением полимера и органического растворителя.
Изучение влияния типа ПАВ и его концентрации на характеристические параметры образования наночастиц гатифлоксацина показало преимущества применения плюроник Ф68 в концентрации от 1 до 1,5 %.
Спектрофотометрическим методом осуществлен анализ зависимости степени включения гатифлоксацина от концентрации полимера, свидетельствующий об оптимальности соотношении 1:1.
Методоми потенциометрического и спектрофотометрического анализа определены оптимальные технологические параметры получения наночастиц гатифлоксацина: интервалы значений рН среды полимеризации и скорости перемешивания.
На модели стафилококкового сепсиса у мышей показано не только наличие фармакологической активности у лиофилизированной лекарственной формы, но и ее увеличение по сравнению с вводимой минимальной подавляющей концентрацией, что позволяет сделать вывод о сохранении и некоторой степени увеличения антибактериальной активности лиофилизированной формы гатифлоксацина на основе ПЛГА по сравнению со стандартной лекарственной формой гатифлоксацина сесквигидрата.
Биофармацевтические исследования разработанных капсул, содержащих наночастицы гатифлоксацина в сравнении с официнальной лекарственной формой, свидетельствуют об изменении фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: увеличивается период полувыведения (Т1/2) и среднее время удерживания лекарственного вещества в организме (MRT), площадь под фармакокинетической кривой «концентрация – время», что обеспечивает более длительное нахождение гатифлоксацина в кровеносном русле.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны:
- Состав и методики стандартизации лиофилизата наночастиц гатифлоксацина (проект ФСП на «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг», апробированный ЗАО «Ф-Синтез»),
- Состав и методики стандартизации капсул гатифлоксацина (проект ФСП на «Гатифлоксацин, капсулы 200 мг», апробированный ЗАО «Ф-Синтез»).
- Технология получения «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг», «Гатифлоксацин, капсулы 200 мг». (Лабораторные регламенты на производство апробированные ЗАО «Ф-Синтез»).
Положения, выносимые на защиту:
- результаты теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию состава и технологии получения наночастиц гатифлоксацина;
- результаты практических разработок в области создания «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг», «Гатифлоксацин, капсулы 200 мг»;
- результаты фармакотерапевтического и биофармацевтического изучения разработанных лекарственных форм.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на конференции «Физико-химические, биологические и медицинские аспекты нанотехнологии» (Астрахань, 2008 г.), на конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» (Белгород, 2008 г.), I Международный форум по нанотехнологиям Rusnanotech 08, на межкафедральной конференции фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова (Москва, 2010 г.).
Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 13 работ, в т.ч. 8 статей в журналах, рекомендованных ВАК.
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ММА им. И.М. Сеченова и является фрагментом исследований кафедры фармакологии фармацевтического факультета по теме: «Разработка и изучение систем доставки направленного транспорта лекарственных веществ».
Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение), выводов, списка литературы, а также Приложения. Работа иллюстрирована 39 таблицами и 22 рисунками. Библиографический указатель включает 180 источников, из них 111 на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цели и задачи исследования, обоснованы научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе (обзор литературы) рассмотрено современное состояние в области фармацевтической нанотехнологии.
Во второй главе приведена характеристика субстанции гатифлоксацина, вспомогательных веществ, использованных в ходе исследования; методики качественного и количественного определения; методики определения физико-химических свойств, технологических характеристик и оценки качества лекарственных форм, методики фармакотерапевтической и биофармацевтической оценки разработанных лекарственных форм.
В главе третьей изложены результаты по изучению технологических свойств субстанции гатифлоксацина, изложены результаты экспериментальных исследований по выбору состава и технологии изготовления нанокапсул, лифилизата для приготовления инфузий и капсул гатифлоксацина.
В четвертой главе представлены результаты экспериментальных исследований по фармакотерапевтической и биофармацевтической оценке разработанных лекарственных форм.
В приложении приведены проекты ФСП и регламенты на разработанные лекарственные формы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В работе использовали субстанцию гатифлоксацина сесквигидрат (ГФС) НД 42-13523-05 производства KRKA, Словения. В качестве полимерных компонентов применяли Eudragit L100-55, Evonik, Германия, полибутилцианоакрилат (ПБЦА) Sichel Werke, Германия, полимолочную кислоту и сополимер DL-молочной и гликолевой кислот сополимера (ПЛГА) (50:50), Boehringer Ingelheim, Германия.
Спектрофотометрию в УФ и видимой областях проводили на спектрофотометре Helios Alpha, Thermospectronics. Размер наночастиц определяли методом фотонной корреляционной спектроскопии (наносайзер Coulter N4MD, Coulter Electronics, U.K).
Оценку наночастиц методом сканирующей электронной микроскопии проводили на приборе «JEOL JSM-T330» (Япония) при напряжении 20 кВ с предварительным напылением слоя коллоидного золота (толщиной 70) на приборе «JEOL JFS -1100» (Япония).
Количественное содержание гатифлоксацина в лекарственных формах и определение примесей осуществляли методом ВЭЖХ на хроматографе Waters 2695, колонка Inertsil С18, 150 х 4,6 мм, 5 мкм.
Количественное содержание гатифлоксацина в биологических пробах проводили методом ВЭЖХ на хроматографе Series 200 фирмы Perkin Elmer (США), оснащенным градиентным насосом, спектрофотометрическим детектором и компьютером Pentium 4 с программным обеспечением «MultiChrom».
Условия хроматографирования: стационарная фаза – колонка «X Terra MS» фирмы Waters с обращённо-фазным сорбентом C18 (3.050 мм; 5 мкм); подвижная фаза – смесь ацетонитрила и 0.025 M раствора Na2HPO4 с рН3.0; (20 : 80; по объему); скорость подвижной фазы – 1,0 мл/мин; изократический режим работы насоса; детектирование на УФ-спектрофотометре при =293 нм, соответствующей максимуму поглощения вещества; объем петли хроматографа – 50 мкл.
Фармакокинетические параметры рассчитывались с использованием программы «M-IND», программы WinNonlin Professional v.5.2 (Pharsight Corp., USA.
С целью обоснования оптимального состава и технологии наночастиц нами изучены физико-технологические свойства ГФ, что позволило сделать предположение о перспективности выбора полимеризационных методов изготовления наночастиц, а также метода дисперсии готовых полимеров и испарения растворителя.
Ввиду поликомпонентности составов, исследуемых для получения наночастиц, в качестве определяющих параметров оптимизации состава наночастиц ГФ нами выбраны: размер частиц, степень включения ГФ в наночастицы, морфологические особенности наноразмерной системы.
Концентрация исходных растворов полимеров не является лимитирующим показателем при осуществлении получения наночастиц методом полимеризации, так как при проведении процесса концентрация полимера постепенно возрастает и доходит в своей фазе практически до 100 %. Однако данный параметр, так же как и порядок введения фаз, могут определять эффективность процесса, оказывая влияние на смачиваемость инкорпорируемого ГФ до испарения растворителя.
Таблица 1. - Влияние соотношения полимер: органический растворитель на структурно-технологические характеристики наночастиц гатифлоксацина
| Полимер: органический растворитель (мг/мл) | Размер частиц, нм | Степень включения ГФ в наночастицы, % |
| ПБЦА: ацетон | ||
| 10:1 | 391±2 | 1,4±0,2 |
| 50:1 | 448±3 | 5,6±0,7 |
| 100:1 | 546±3 | 15.8±0,9 |
| 150:1 | 589±6 | 37.1±1,3 |
| 200:1 | 606±2 | 38,9±1,7 |
| ПБЦА: дихлорметан | ||
| 10:1 | 303±2 | 2,3±0,2 |
| 50:1 | 414±2 | 5,9±0,4 |
| 100:1 | 469±2 | 17,1±0,4 |
| 150:1 | 648±5 | 32,4±1,3 |
| 200:1 | 693±7 | 36,3±1,2 |
| ПЛГА: ацетон | ||
| 10:1 | 399±5 | 3,5±0,2 |
| 50:1 | 484±4 | 16,4±1,3 |
| 100:1 | 491±4 | 28,9±1,5 |
| 150:1 | 631±6 | 30,1±1,4 |
| 200:1 | 704±6 | 31,0±1,7 |
| ПЛГА: дихлорметан | ||
| 10:1 | 443±2 | 7,3±0,1 |
| 50:1 | 529±1 | 21,4±1,5 |
| 100:1 | 687±4 | 37,8±1,5 |
| 150:1 | 739±4 | 37,9±1,3 |
| 200:1 | 809±7 | 38,1±1,8 |
При выборе органического растворителя нами принимались во внимание такие параметры, как растворимость в нем полимеров, легкость его отгонки и класс безопасности вещества. Большое значение имеют температура плавления, обуславливающая размер получаемых коацерватов, вязкость, гидрофильность/гидрофобность (определяемая, в частности по корреляции с кислотным индексом) и др. С учетом высокой значимости временного фактора и степени нагрузки ГФ полимера в процессе формирования характеристико-морфологических особенностей полимерных наночастиц предпочтение отдано таким растворителям, как дихлорметан и ацетон.
Сравнительный анализ полученных показателей размера частиц, степени включения ГФ и морфологических особенностей наночастиц позволил выбрать для дальнейшего исследования составы с соотношением полимера и органического растворителя: состав № 1 ПБЦА : ацетон 150 : 1; состав № 2 ПБЦА : дихлорметан 200 : 1; состав № 3 ПЛГА : ацетон 100: 1; состав № 4 ПЛГА : дихлорметан 100 : 1; состав № 5 полимолочная кислота : дихлорметан 100: 1.
Рисунок 1. - Электронная микроскопия наночастиц гатифлоксацина на основе ПЛГА
Основным направлением оптимизации технологического процесса создания наночастиц ГФ на основе полимерного носителя являются: уменьшение размеров частиц, повышение степени включения ГФ и стабильности образующейся суспензии. Для уменьшения агрегации наночастиц использовали введение в дисперсионную среду такие ПАВ, как плюроник F 68 и твин 80, которые сочетают высокие значения ГЛБ и нерастворимость во взятых органических растворителях.
Нами осуществлена оценка влияния выбора ПАВ, а также его концентрации на характеристические параметры образования наноразмерных частиц ГФ, путем включения различных концентраций плюроника Ф68 и твина 80 во внешнюю воду.
Рисунок 2. - Зависимость размера наночастиц от состава и выбранного ПАВ
Полученные экспериментальные данные позволили сделать вывод о предпочтительности использования следующих составов: состав № 2 с концентрацией плюроника Ф68 1,5%, состав № 3 с концентрацией плюроника Ф68 1,5%, состав № 4 с концентрацией плюроника Ф68 1,0%.
Выбранные составы характеризуются оптимальным соотношением размеров частиц и их морфологических особенностей. Однако во всех составах увеличение концентрации ПАВ привело, вследствие создания гидрофильной оболочки на поверхности частиц, к снижению степени включения ГФ в полимерные наночастицы. Для повышения степени сорбции ГФ нами проведено сравнительное исследование по выявлению влияния на данный показатель, а также на размер частиц системы, такого параметра, как соотношение объема внешней воды к объему органического растворителя, особенно значимого в случае включения гидрофильного ГФ.
Сопоставление функциональных значений размера частиц и степени включения ГФ позволило обосновать выбор оптимального технологического состава, характеризующегося следующими соотношениями: ПЛГА : дихлорметан 100 : 1; дихлорметан : внешняя вода 1 : 20; концентрация плюроника Ф68 во внешней воде 1%.
Таблица 2. – Влияние соотношения объема органического растворителя
к объему внешней воды на размер и степень включения гатифлоксацина
в наночастицы
| Соотношение объема органического растворителя к объему внешней воды | 1:5 | 1: 10 | 1: 20 | 1:25 | |
| Состав № 2 с концентрацией плюроника Ф68 1,5% | Степень включения ГФ,% | 16,7±0,4 | 28,3±0,7 | 49,4±2,1 | 51,0±2,8 |
| Размер частиц, нм | 401±3 | 364±4 | 292±2 | 288±3 | |
| Состав № 3 с концентрацией плюроника Ф68 1,5% | Степень включения ГФ,% | 13,9±0,7 | 25,6±1,5 | 38,4±1,9 | 39,3±2,4 |
| Размер частиц, нм | 425±5 | 407±3 | 303±4 | 269±4 | |
| Состав № 4 с концентрацией плюроника Ф68 1,0% | Степень включения ГФ,% | 31,4±2,3 | 41,5±1,8 | 63,4±2,4 | 65,4±3,2 |
| Размер частиц, нм | 343±3 | 298±3 | 263±5 | 268±2 | |
Для данной полимерной системы осуществлен анализ зависимости степени включения ГФ от концентрации полимера.
При увеличении концентрации полимера по отношению к включаемому ГФ выше соотношения 1 : 1, дальнейшего возрастания степени включения не происходит.
Для оптимизации процесса образования наночастиц и включения в них ГФ нами проведена серия экспериментов по варьированию физико-технологических параметров образования наночастиц на основе исследуемых полимеров. В качестве определяющего показателя нами выбрана степень включения ГФ в наночастицы.
Рисунок 3. – Зависимость степени включения гатифлоксацина в наночастицы от соотношения гатифлоксацин : ПЛГА
При подкислении среды растворимость ГФ увеличивается, и следовательно, увеличивается степень включения в водную фазу образующейся двойной эмульсии. При сдвиге рН в кислую сторону наблюдается быстрая коагуляция полимера, вследствие чего ГФ не успевает включиться в образующиеся наночастицы. В качестве оптимального показателя рН среды полимеризации нами выбрано значение 4,5.
Температура среды подбиралась с учетом физико-химических свойств дихлорметана, испаряющегося при 38 0С, а также принималась во внимание термолабильность ПЛГА. Совокупный анализ факторов позволил остановиться на температуре полимеризационной среды 40 0С.
Таким образом, проведенные исследования позволили обосновать технологию наноразмерных частиц ГФ методом двойного эмульгирования. С этой целью навеску ГФ растворяли в воде очищенной, к полученному раствору по каплям, при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке при 350 об/мин добавляли раствор ПЛГА в дихлорметане и перемешивали в течение 3-5 мин (эмульсия № 1). Эмульсию № 1 прибавляли к 0,1% водному раствору плюроника Ф68 (внешняя вода), при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке при 400 об/мин (эмульсия № 2). Перемешивание осуществляли в течение 3 ч до полного удаления дихлорметана из раствора. Затем полученную смесь фильтровали через стеклянный пористый фильтр 0,22 мкм, разливали по флаконам (объемом по 200 мл) и лиофилизировали (лиофильная сушка Alpha Christ 2-6, Германия) в течение 24 часов, после чего проводили оценку показателей качества.
Полученный в ходе производства лиофилизированнный порошок использовался нами при изготовлении капсул ГФ. С целью подбора вспомогательных веществ для получения капсульной массы изучены физико-химические и технологические свойства лиофилизата: сыпучесть, угол естественного откоса, насыпная плотность, форма и размер частиц, смачиваемость, влагосодержание, удельная поверхность, пористость. Принимая во внимание, что лиофилизат наночастиц обладает выраженными гидрофильными свойствами, хорошей прессуемостью и нулевой сыпучестью (0 г/с), для получения массы для капсулирования с необходимыми технологическими характеристиками применяли аэросил.
Таблица 3. - Состав «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг» и «Гатифлоксацин, капсулы 0,2 г»
| Вещества, входящие в состав лекарственной формы | Лиофилизат для приготовления инфузий, 400 мг | Капсулы, 200 мг |
| Гатифлоксацина сесквигидрата (НД 42-13523-05) | 400 мг (428,76) | 200 мг (214,38) |
| DL-молочной и гликолевой кислот сополимера (50:50) | 400 мг | 200 мг |
| Плюроник F 68 | 0,02 мг | 0,01 мг |
| Аэросил А | - | 12,43 мг |
Кроме того, включенный в состав аэросил 380 практически исключает негативное действие на лиофилизат влаги, препятствует слеживаемости, что приводит к повышению стабильности препарата.
Разработанные технологии легли в основу лабораторных технологических регламентов на производство лекарственных форм ГФ, подготовленных в соответствии с ОСТ «Продукция медицинской промышленности». На основании проведенных исследований составлены проекты ФСП на «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг» и «Гатифлоксацин, капсулы 0,2 г», спецификация на которые представлена в табл. 4.
Химиотерапевтическую эффективность препаратов изучали на модели стафилококкового сепсиса у мышей. Препараты вводили в хвостовую вену животных однократно через 1 час после заражения Staph. aureus. Разведения антибиотика готовили путем двукратных серийных разведений основного раствора антибиотика в мясо-петонном бульоне.
Анализ результатов, проведенных в ходе эксперимента показал не только наличие фармакологической активности у лиофилизированной лекарственной формы, но и ее увеличение по сравнению с вводимой минимальной подавляющей концентрацией, что позволяет сделать вывод о сохранении и некоторой степени увеличения антибактериальной активности лиофилизированной формы ГФ на основе ПЛГА по сравнению с субстанцией промышленного производства гатифлоксацина (KRKA, Словения).
Для сравнительного анализа биоэквивалентности разработанной лиофилизированной лекарственной формы ГФ после внутривенного введения в сравнении с субстанцией промышленного производства потребовалось изучение и сравнительный анализ особенностей фармакокинетики. В качестве объекта исследования нами использован лиофилизат наночастиц гатифлоксацина на основе ПЛГА, а также субстанция ГФ сесквигидрата KRKA, Словения.
- ЛВ, субстанция гатифлоксацина сесквигидрата
- ЛВ- лиофилизат наночастиц ПЛГА и ГФ
Рисунок 4. – Влияние наночастиц на жизнеспособность внутриклеточно локализованных S. Aureus.
Из значений основных фармакокинетических параметров ГФ, следует, что ГФ значительно медленнее выводится и соответственно дольше находится в кровяном русле после введения тестовой субстанции (Т1/2=17,32±1,05 ч), а не референсной (Т1/2=10,13±2,83 ч). Дополнительным подтверждением более интенсивной элиминации ГФ из системного кровотока животных после введения референсной субстанции также являются: низкая величина среднего времени удерживания ГФ в организме (MRT=9,44±1,25 ч); более высокий клиренс (Cl =122,67±13,27 мл/кг/ч) в сравнении с аналогичными фармакокинетическими параметрами, рассчитанными для тестовой субстанции (MRT=12,8±0,40 ч; Cl=74,45±4,29мл/кг/ч).
Таблица 4. – Спецификация «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг» и «Гатифлоксацин, капсулы 200 мг»
| Показатели | Методы | Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг | Гатифлоксацин, капсулы 200 мг |
| Описание | Визуальный | Лиофилизированный порошок или уплотненная пористая масса белого или белого со слабым желтоватым оттенком цвета. | Капсулы синего цвета № 00. Содержимое капсул – порошок белого цвета. |
| Подлинность | ВЭЖХ | Время удерживания основного пика на хроматограмме испытуемого раствора должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме РСО ГФ | Время удерживания основного пика на хроматограмме раствора препарата должно соответствовать времени удерживания основного пика на хроматограмме РСО ГФ |
| Растворение | ВЭЖХ | - | Через 1 ч – не более 15 %,через 4 ч – не более 30 %, через 24 ч – не менее 70 % |
| Ресуспенди-руемость | Визуально | При добавлении воды образуется коллоидный опалесцирующий раствор без осадка и видимых агломератов | - |
| Распадаемость | Время | - | Не более 15 минут |
| Средняя масса | ГФ Хl | В соответствии с требованиями | В соответствии с требованиями |
| рН | ГФ XII | От 5,5 до 7,0 | - |
| Посторонние примеси | ВЭЖХ | Содержание любой примеси не более 1,0%, суммарное содержание примесей не более 2,0%. | Содержание любой примеси не более 1,0%, суммарное содержание примесей не более 2,0%. |
| Остаточные органические растворители | ГФ XII ГЖХ | Дихлорметана – не более 1,5 % | Дихлорметана – не более 1,5 % |
| Пирогенность | ГФ XII, ОФС 42-0061-07 | Препарат должен быть апирогенным | - |
| Стерильность/ МБЧ | ГФ XII Метод прямого посева | Препарат должен быть стерильным | Категория 3А, изменение № 3 |
| Количественное определение | ВЭЖХ | От 392 – 408 мг/фл считая на среднюю массу | От 196 до 204 мг, считая на среднюю массу одной капсулы. |
| Вода | метод К. Фишера | Не более 2,0 % | - |
| Срок годности | 2 года | 2 года |
Полученные данные свидетельствуют о более длительном нахождении препарата в кровяном русле в концентрациях достаточных для эффективного воздействия, что позволяет предположить пролонгацию действия ГФ в виде наночастиц ПЛГА.
Рисунок 5. - Фармакокинетические кривые усредненных концентраций гатифлоксацина в плазме крови кроликов после однократного внутривенного введения изучаемых субстанций кроликам в дозе 2,86 мг/кг (n=6, M±SD).
Анализ фармакокинетических особенностей показал, что разработанная лекарственная форма в виде наночастиц ГФ в сравнении с официнальной таблетированной лекарственной формой приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: увеличивается период полувыведения (Т1/2) и среднее время удерживания ГФ в организме (MRT), площадь под фармакокинетической кривой «концентрация – время» и, таким образом, обеспечивают более длительное в сравнении с препаратом промышленного производства, нахождение ГФ в кровеносном русле.
Общие выводы:
1. Изучены физико-химические свойства субстанции гатифлоксацина. Установлено, что субстанция обладает рН-зависимой растворимостью в достаточно узком интервале значений, причем на растворимость при варьировании рН оказывают влияние некоторые виды ПАВ, что использовалось нами при разработке состава и технологии наночастиц гатифлоксацина полимеризационным методом.
2. Анализ технологических факторов, влияющих на показатели размера наночастиц, степени включения гатифлоксацина и морфологическую структуру наночастиц позволил обосновать выбор оптимального состава, характеризующегося следующими соотношениями: ПЛГА : дихлорметан 100:1; дихлорметан : внешняя вода 1: 20; концентрация плюроника Ф68 во внешней воде 1%.
3. На основании проведенных исследований определены оптимальные технологические параметры получения наночастиц гатифлоксацина: соотношение гатифлоксацин - концентрация полимера 1:1; значения рН среды полимеризации 4,5; интенсивность вращения магнитной мешалки 1000 об/мин. Обоснованы параметры проведения лиофильной сушки. Разработан оптимальный состав капсул гатифлоксацина, включающий в себя аросил, что позволяет получать капсулы гатифлоксацина без предварительного гранулирования
4. Разработаны методики анализа разработанных лекарственных форм «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг», «Гатифлоксацин, капсулы 200 мг» и установлены нормы по показателям: «Подлинность», «Посторонние примеси», «Растворение» и «Количественное определение». Проведено исследование стабильности разработанных лекарственных форм ГФ в процессе хранения. Установлено, что все контролируемые показатели качества препаратов (внешний вид, подлинность, посторонние примеси и количественное определение) остаются в пределах норм допустимых отклонений в течение срока, эквивалентного 2 годам хранения в естественных условиях.
5. Изучение на модели стафилококкового сепсиса химиотерапевтической активности наночастиц ГФ показало у наночастиц ГФ увеличение фармакологической активности по сравнению с вводимой минимальной подавляющей концентрацией гатифлоксацина сесквигидрата (KRKA, Словения)
6. Исследование фармакокинетики разработанной лекарственной формы лиофилизированного порошка для приготовления инъекций на основе наночастиц гатифлоксацина показало, что введение ГФ в виде наночастиц приводит к изменению фармакокинетического профиля ГФ в плазме крови: увеличивается время нахождении ГФ в кровяном русле в концентрациях достаточных для эффективного воздействия, что позволяет говорить о пролонгации действия ГФ в виде полимерных наночастиц.
7. Сравнительная биофармацевтическая оценка показала, что разработанная капсульная форма гатифлоксацина на основе наночастиц в сравнении с промышленной таблетированной лекарственной формой приводит к изменению фармакокинетического профиля препарата в плазме крови: увеличивается период полувыведения (Т1/2) и среднее время удерживания ГФ в организме (MRT), площадь под фармакокинетической кривой «концентрация – время» и, таким образом, обеспечивают более длительное относительно препарата сравнения нахождение ГФ в кровеносном русле.
8. Подготовлены проекты ФСП, лабораторные регламенты на разработанные лекарственные формы «Гатифлоксацин, лиофилизат для приготовления инфузий 400 мг», «Гатифлоксацин, капсулы 200 мг».
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Алексеев К.В., Блынская Е.В., Сульдин А.С. и др. Сравнительное изучение вспомогательных веществ, применяемых при капсулировании // Человек и лекарство: материалы конференции «Стратегия развития российской фармации» в рамках XV Российского национального конгресса. – М., 2008.– С. 130-132.
- Алексеев К.В., Блынская Е.В., Машутин А.Б. и др. Обоснование выбора пленочных покрытий для таблеток с модифицированным высвобождением // Человек и лекарство: материалы конференции «Стратегия развития российской фармации» в рамках XV Российского национального конгресса. – М., 2008. – С. 134-136.
- Алексеев К.В., Блынская Е.В., Сульдин А.С. и др. Технологические аспекты разработки твердых лекарственных форм методом прямого прессования // Человек и лекарство: материалы конференции «Стратегия развития российской фармации» в рамках XV Российского национального конгресса. – М., 2008.– С. 132-134.
- Блынская Е.В., Буй Т.З.К. Обоснование составов и технологических режимов создания наносомальных систем направленного транспорта лекарственных веществ на основе сополимеров молочной кислоты. //Международная научно-практическая конференция «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании» Белгород, 2008. - С. 163 – 165.
- Блынская Е.В. Разработка наносомальных систем направленного транспорта лекарственных веществ на основе сополимеров молочной кислоты //Научная конференция «Физико-химические, биологические и медицинские аспекты нанотехнологии», Астрахань, 2008. – С.119 -121.
- Алексеев К.В., Сизяков С.А., Блынская Е.В., Алексеева С.К., Дитковская А.Г. Современные пленочные покрытия в технологии таблеток // Фармация – 2009. – №8. – С. 45-49
- Алексеев К.В., Блынская Е.В., Сульдин А.С. и др. Вспомогательные вещества в технологии твердых капсул // Фармация – 2009. – №5. – С. 31-36.
- Алексеев К.В., Блынская Е.В., Сизяков С.А. Вспомогательные вещества в технологии таблеток с модифицированным высвобождением // Фармация – 2009. – №6. – С. 49-55.
- Алексеев К.В., Аляутдин Р.Н., Блынская Е.В. и др. Основные направления в технологии получения наноносителей лекарственных веществ. //Вестник новых медицинских технологий – 2009 – т. XVI, №2. – С. 142 – 145.
- Алексеев К.В., Е.В. Блынская, Литвин Е.А. Применение метода корреляции in vitro - in vivo при разработке и оптимизации лекарственных форм.// Вестник новых медицинских технологий – 2009 – т. XVI, №2. – с. 137 – 139.
- Кондаков С.Э., Мельников М.Я., Козаченко П.Н.. Блынская Е.В., Алексеев К.В. Применение неспецифических биосенсоров для контроля активности фармацевтических препаратов //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. – 2009. – Т. 50, № 4. – С.153-156.
- . Алексеев К.В., Аляутдин Р.Н., Блынская Е.В. и др. Наноразмерные системы доставки лекарственных веществ.//Вестник новых медицинских технологий – 2009 – т. XVI, №2. – С. 17 – 20.
- Блынская Е.В.,Балабаньян В.Ю, Аляутдин Р.Н., Алексеев К.В. получение наносомальной лиофилизированной формы гатифлоксацина // Фармация – 2010. – №5. – С. 35-40.
