Роль кальциевых каналов разных типов в регуляции квантовой секреции в нервно-мышечных синапсах мыши и лягушки
На правах рукописи
Васин Александр Львович
РОЛЬ КАЛЬЦИЕВЫХ КАНАЛОВ РАЗНЫХ ТИПОВ
В РЕГУЛЯЦИИ КВАНТОВОЙ СЕКРЕЦИИ В НЕРВНО-МЫШЕЧНЫХ СИНАПСАХ МЫШИ И ЛЯГУШКИ
03.03.01 – физиология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Казань 2010
Работа выполнена в лаборатории биофизики синаптических процессов Учреждения Российской Академии наук Казанского института биохимии и биофизики Казанского научного центра РАН и на кафедре медицинской и биологической физики ГОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Бухараева Элля Ахметовна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Гайнутдинов Халил Латыпович
доктор биологических наук, доцент
Ситдикова Гузель Фаритовна
Ведущая организация: Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова (биологический факультет)
Защита состоится «14» сентября 2010 г. в ___ часов на заседании Диссертационного совета при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстан, 2
Автореферат разослан «___» ________2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор медицинских наук,
профессор Зефиров Т.Л.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
Исследование молекулярных механизмов процессов передачи возбуждения в синапсе является одним из перспективных подходов для понимания способов обеспечения пластичности нервной системы, лежащих в основе таких фундаментальных физиологических процессов как обучение, память, управление движением, патогенез ряда заболеваний центральной и периферической нервной системы, а также для создания фармакологических препаратов, избирательно действующих на разные этапы процесса передачи информации в синапсе. Традиционно в качестве ведущих пресинаптических факторов обеспечения синаптической пластичности рассматриваются изменение количества квантов медиатора, освобождающихся в ответ на нервный импульс (Zucker R.S. and Regehr W.G., 2002) и размера кванта (Van der Kloot W., 1991). Вместе с тем, в последние годы показано существование еще одного, ранее не учитываемого эффективного механизма пресинаптической модуляции передачи возбуждения, связанного с изменением временного хода (кинетики) секреции выделения квантов, формирующих многоквантовый ответ (Bukharaeva E. et al., 1999, 2002; Nikolsky E. et al., 2004). Ранее проведенные экспериментальные исследования дают основания полагать, что механизмы, контролирующие кинетику секреторного процесса, являются кальций-зависимыми, однако отличными от механизмов, определяющих количество освобождаемых квантов медиатора (Bukharaeva E. et al., 1999; Parnas I. et al., 1999; Neher E., 2005; Bukharaeva E. et al., 2007), что ставит задачу более тщательного изучения путей кальциевой регуляции кинетики выделения квантов.
Вход ионов кальция в нервное окончание через потенциал-зависимые кальциевые каналы инициирует цепь событий, приводящих к экзоцитозу синаптических везикул (для обзора: Зефиров А.Л. и Ситдикова Г.Ф., 2010; Catterall W.A. and Few A.P., 2008). Принято считать, что в отличие от синапсов центральной нервной системы, где в запуске процесса секреции участвуют потенциал-зависимые кальциевые каналы разных типов, в синапсах периферической нервной системы взрослых животных экзоцитоз опосредован преимущественно одним типом кальциевых каналов. Для нервно-мышечного соединения теплокровных это P/Q каналы (по современной классификации CaV2.1), а для синапсов лягушки - N (CaV2.2) каналы (Uchitel O.D. et al., 1992; Wright С.E. and Angus J.A., 1996; Katz E. et al., 1995, 1996). Тем не менее, современные данные, полученные методами иммуногистохимии, свидетельствуют о наличие на двигательных нервных окончаниях каналов других типов (Robitaille R. et al., 1996; Day N.C. et al., 1997; Sand O. et al., 2001; Pagani R. et al., 2004). Однако вопрос о том, какую роль играют разные каналы в регуляции таких параметров секреторного процесса как кинетика и количество освобождаемых квантов, остается открытым. В связи с многообразием пресинаптических потенциал-зависимых кальциевых каналов, разным представительством в нервно-мышечных синапсах теплокровных и холоднокровных, для понимания механизмов регуляции интенсивности и кинетики секреции и поиска эффективных способов избирательного воздействия на эти механизмы, актуальным является сопоставление роли потенциал-зависимых кальциевых каналов, участвующих в регуляции вызванной секреции ацетилхолина в нервно-мышечных синапсах позвоночных.
Цель и задачи исследования
Целью исследования является изучение роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов в регуляции количества и кинетики секреции квантов, освобождаемых из двигательных нервных окончаний лягушки и мыши.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
- Исследовать зависимость количества освобождаемых квантов и кинетики их секреции в синапсах лягушки и мыши от содержания ионов кальция во внеклеточной среде.
- Изучить влияние неспецифических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов магния и кадмия на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.
- Определить влияние специфических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов (N, P/Q и L) на параметры квантовой секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши.
- Оценить эффекты совместной блокады потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки и мыши.
Положения, выносимые на защиту
- В нервно-мышечном синапсе холоднокровных (лягушка) N, P/Q и L потенциал-зависимые кальциевые каналы участвуют в регуляции как количества квантов ацетилхолина, освобождаемых в ответ на нервный импульс, так и кинетики их секреции.
- В нервно-мышечном синапсе теплокровных (мышь) P/Q потенциал-зависимые кальциевые каналы контролируют только количество выделившихся квантов медиатора, а каналы L-типа участвуют в модуляции числа выделяемых квантов и кинетики их секреции в условиях высокой степени асинхронности освобождения, каналы N-типа не принимают участия в регуляции вызванной секреции квантов.
Научная новизна
В ходе проведенных исследований сопоставлена кальциевая регуляция параметров вызванной квантовой секреции ацетилхолина в традиционных для классической нейрофизиологии объектах - синапсах лягушки и мыши. Впервые выявлено, что в исследованном диапазоне концентраций кальция, который позволяет оценить кинетику секреции отдельных квантов, при качественно одинаковой кальциевой зависимости количества выделяемых квантов в этих синапсах наблюдается разная кинетика их освобождения. Кинетика секреции квантов в синапсах мыши проявляет более выраженную зависимость от внеклеточной концентрации ионов кальция, чем в синапсах лягушки, и освобождение становится более синхронным при насыщающей концентрации кальция. Впервые на основании сопоставления коэффициентов Хилла для концентрационных зависимостей квантового состава и кинетики секреции в синапсах лягушки и мыши сделан вывод о том, что количество освобождаемых квантов и кинетика их выделения находятся под контролем разных механизмов с отличающейся чувствительностью к ионам кальция. Несмотря на то, что при уменьшении концентрации кальция степень асинхронности секреции возрастает в обоих типах синапсов, уменьшение входа кальция при использовании неспецифических блокаторов кальциевых каналов сопровождается разнонаправленным изменением степени синхронности секреции. Впервые показано, что в синапсах лягушки кальциевые каналы N, P/Q и L типов участвуют в регуляции как квантового состава, так и кинетики секреции. В синапсах мыши проявляются различия в функциональной роли этих каналов: каналы P/Q-типа регулируют только квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, а каналы L-типа могут принимать участие в регуляции как количества секретируемых квантов, так и их кинетики в условиях исходно высокой степени асинхронности секреции.
Научно-практическая значимость
Основное значение результатов проведенного исследования состоит в получении данных о функционально различной роли потенциал-зависимых кальциевых каналов разных типов в синапсах теплокровных и холоднокровных, о разном характере зависимости кинетики секреции квантов от концентрации кальция в этих синапсах, что необходимо учитывать при анализе эффектов различных фармакологических агентов, обладающих каналоблокирующими свойствами. Выявленная способность блокатора P/Q каналов в синапсах мыши избирательно модулировать квантовый состав, не затрагивая кинетику секреции, дает дополнительное доказательство того, что разные механизмы участвуют в регуляции квантового состава и кинетики секреции медиатора. Полученные данные важны для сравнительной физиологии, а также для понимания механизмов развития каналопатий и фармакологических исследований, направленных на тестирование новых лекарственных препаратов, обладающих каналоблокирующими свойствами.
Апробация работы
Материалы работы доложены на VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology (Kazan, 2006); Всероссийских научно-практических конференциях «Молодые ученые в медицине» (Казань, 2007, 2008, 2009); Международной школе PENS Summer course «Contemporary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity» (Kazan, 2007); международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008, 2010); IV и V международных междисциплинарных конгрессах «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, 2008, 2009); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2009).
Работа выполнена при поддержке грантами РФФИ № 08-04-00923, Президента РФ «Ведущая научная школа» НШ-4177.2008.4 и Американского Фонда Гражданских исследований (CRDF RUB1-2823-KA06).
Структура и объём диссертации
Диссертация изложена на 107 страницах., иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список цитируемой литературы содержит 165 источников, из них 154 иностранных авторов.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнялись на изолированном френико-диафрагмальном препарате белых лабораторных мышей обоего пола весом 20-25 г и на изолированном нервно-мышечном препарате кожно-грудинной мышцы озерных лягушек (R. ridibunda) в осенне-зимний период. Приготовление изолированных нервно-мышечных препаратов производили в условиях эфирного наркоза.
Выделенные мышцы с фрагментом нерва закрепляли на подложке из смолы Sylgard в экспериментальной ванночке, объемом 5 мл, через которую со скоростью 5 мл/мин протекал физиологический раствор следующего состава: а) для теплокровных (ммоль/л): NaCl - 115.0; KCl - 5; Hepes 5.0; глюкоза 11.0; б) для холоднокровных: NaCl 113.0; KCl 2.5; NaHCO3 3.0. Концентрацию CaCl2 изменяли в диапазоне 0.2 - 0.6 ммоль/л, а MgCl2 4.0 – 8.0 ммоль/л. Для сохранения изоосмотичности растворов, изменение содержания двухвалентных катионов корректировали соответствующим изменением концентрации NaCl. pH растворов поддерживали на уровне 7.2 – 7.4. Все эксперименты проводили при температуре 20.0±0.3оС, стабилизацию которой осуществляли при помощи встроенных в дно ванночки элементов Пельтье и отслеживали с помощью миниатюрного датчика, расположенного в ванночке в непосредственной близости от микроэлектрода.
В экспериментах были использованы следующие вещества (все фирмы Sigma): -конотоксин GVIA, -агатоксин IVA, нитрендипин, ДМСО (диметилсульфоксид). Поскольку нитрендипин растворялся в ДМСО, конечная концентрация которого в растворе не превышала 0.1%, то предварительно были проведены эксперименты по анализу эффектов растворителя на исследуемые процессы.
Одновременная регистрация токов действия нервного окончания и одноквантовых токов концевой пластинки
Для одновременной регистрации токов действия нервного окончания и токов концевой пластинки (ТКП) под визуальным контролем к области синапса подводился микроэлектрод, заполненный физиологическим раствором, с оплавленным кончиком и диаметром 2.5-3.5 мкм, (сопротивление 2.0-4.0 Мом). Для визуализации синаптической области использовали микроскоп Olympus BW-51, оснащенный водоимерсионным объективом LUMPPlan FI 40х фирмы Olympus. Микроэлектрод подводили таким образом, чтобы была возможна одновременная регистрация токов действия нервного окончания и постсинаптического ТКП в проксимальной области синаптического контакта на расстоянии 5-10 мкм от последнего перехвата Ранвье.
Стимуляцию двигательного нерва осуществляли с помощью «всасывающего» электрода прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0.1 мс супрамаксимальной величины с частотой 0.5 имп/с.
Зарегистрированные сигналы после фильтрации до 10 кГц усиливали и подавали на вход 16 разрядного аналого-цифрового преобразователя, квантуя с интервалом 3-5 мкс. Анализ вызванных сигналов в «окне» регистрации длительностью 10 мс осуществляли с помощью персонального компьютера и созданной в нашей лаборатории программы.
Так как при попадании в «окно» регистрации спонтанно возникающих миниатюрных ТКП возможны искажения результатов измерения, в каждом опыте на основании измерений средней частоты спонтанных сигналов рассчитывали вероятность их попадания в окно регистрации. Если эта вероятность превышала значение 0.005 (то есть 5 сигналов на 1000 стимулов), то такой эксперимент не принимался в расчет.
Анализ параметров токов действия нервного окончания и одноквантовых ТКП
Для оценки параметров тока действия нервного окончания измеряли максимальное значение амплитуды натриевой компоненты и ее длительность на уровне 50% от максимальной амплитуды. Для оценки одноквантовых токов концевой пластинки (ТКП) анализировали максимальную амплитуду, время нарастания переднего фронта от 20 до 80% максимального значения амплитуды и постоянную времени спада ТКП. Амплитуду зарегистрированных экстраклеточных сигналов выражали в мВ.
Средний квантовый состав (m) определяли, используя прямой метод подсчета количества выделившихся квантов или метод «выпадений» (Del Castillo J. and Katz B., 1954; Katz B. and Miledi R., 1965; Martin A., 1955), по формуле: m=ln N/nо, где N - общее число импульсов, nо - число выпадений. Количество зарегистрированных одноквантовых ответов в каждом опыте варьировало в пределах 300-500.
Оценка параметров временного хода вызванной секреции квантов медиатора
Величину истинной синаптической задержки определяли как временной интервал от пика натриевой компоненты тока нервного окончания до начала ТКП на уровне 20% от максимального значения его амплитуды. Для анализа временного хода квантовой секреции медиатора строили гистограммы и кумулятивные кривые распределения истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП.
Анализировали следующие характеристики временного хода секреции:
1) величину минимальной синаптической задержки. С этой целью зарегистрированные величины истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП ранжировали по возрастанию и усредняли первые 5% значений от общего количества сигналов в контрольных условиях или после подачи вещества.
2) главную моду гистограммы распределения синаптических задержек.
3) степень асинхронности секреции квантов медиатора. Исходя из результатов измерения истинных синаптических задержек для отобранных одноквантовых ТКП (соответствующих первому пику на гистограмме амплитуд всех зарегистрированных ТКП) строили кумулятивные кривые и анализировали значение квантиля на уровне 90% (Бронштейн И.Н. и Семендяев К.А., 1986; Van der Kloot W., 1991). Параметр Р90 характеризовал временной интервал, в который попадало 90% измеренных значений истинных синаптических задержек одноквантовых ТКП. Чем выше значение параметра Р90, тем более выражена асинхронность секреции медиатора.
Статистическая обработка результатов
Для статистической обработки использовали программу Microcal Origin 7.5. Использовали стандартные методы определения средних величин, стандартных ошибок, а также параметрический t-критерий Стьюдента для попарно связанных вариант. Достоверность различия двух кумулятивных кривых определяли по критерию Колмогорова-Смирнова (Бронштейн И.Н. и Семендяев К.А., 1986; Van der Kloot W., 1991) на уровне значимости 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сопоставление параметров секреции медиатора в синапсах лягушки и мыши при варьировании внеклеточной концентрации ионов кальция [1]
Прежде чем сопоставлять роль потенциал-зависимых кальциевых каналов в регуляции параметров вызванной секреции в синапсах теплокровных и холоднокровных, необходимо было сравнить характер зависимости параметров секреции квантов от изменения внеклеточной концентрации ионов кальция ([Ca2+]o) для того, чтобы определить насколько существенно сказывается изменение входа кальция из внеклеточной среды на количестве освобождаемых квантов и временном ходе их выделения. Число освобождающихся квантов и их истинные синаптические задержки оценивали при варьировании [Са2+]o в диапазоне от 0.2 до 0.6 ммоль/л при постоянной концентрации ионов магния (4 ммоль/л). Амплитудно-временные параметры одноквантовых ТКП и параметры тока действия нервного окончания в препаратах лягушки и мыши не изменялись при варьировании [Са2+]o. Эти данные свидетельствуют об отсутствии изменения чувствительности постсинаптической мембраны к ацетилхолину и возбудимости мембраны нервного окончания в исследуемом диапазоне концентраций кальция.
Характер изменения среднего квантового состава постсинаптических ответов при варьировании [Са2+]o в обоих исследованных препаратах (Рис.1А) соответствовал описанной ранее экспоненциальной зависимости (Dodge F.A. and Rahamimoff R., 1967; Shahrezaei V. et al., 2006). Коэффициент Хилла для концентрационной зависимости квантового состава в синапсах мыши составил 3.01±0.22 (n=10), а для лягушки 3.15±0.21 (n=7), что свидетельствует о необходимости кооперативного связывания не менее 3 ионов Са2+ для освобождения каждого кванта (Dodge F.A. and Rahamimoff R., 1967). Анализ временных параметров секреторного процесса показал, что как в синапсах мыши, так и у лягушки значения минимальной синаптической задержки и главной моды гистограмм синаптических задержек не изменялись при варьировании [Са2+]o. Эти данные свидетельствуют о независимости ранней фазы синхронной секреции квантов от кальция. Сопоставление степени флуктуаций синаптических задержек, выполненное при сравнении гистограмм их распределения и параметра Р90 показало, что качественно характер изменения кинетики секреции в синапсах мыши и лягушки одинаков: при понижении [Са2+]o степень флуктуаций синаптических задержек увеличивалась, что отражалось в возрастании величины параметра Р90, т.е. наблюдалось повышение асинхронности секреции квантов. При этом в обоих видах синапсов повышение [Са2+]o до 0.4 ммоль/л сопровождалось резким падением параметра Р90, величина которого выходила на насыщение при дальнейшем увеличении [Са2+]o. Однако количественные характеристики зависимости степени синхронности от [Са2+]o в исследуемых синапсах были различны. Так при минимальной [Са2+]o=0.2 ммоль/л, несмотря на более высокий квантовый состав, в синапсах мыши секреция имела менее синхронный характер (существенное превышение параметра Р90 в синапсах мыши, по сравнению с лягушкой), тогда как стационарный уровень параметра Р90 при более высокой [Са2+]o (>0.4 ммоль/л) был выше (т.е. секреция была более несинхронна) в синапсах лягушки (Рис. 1Б). Коэффициент Хилла, вычисленный для концентрационной зависимости параметра Р90, в синапсах мыши составил 0.92±0.49 (n=10), а для лягушки 0.35±0.60 (n=7), что существенно ниже, чем этот коэффициент для величины квантового состава. Различия величин коэффициентов кооперативности свидетельствует о том, что количество освобождаемых квантов и кинетика их выделения контролируются различными механизмами. Проведенные исследования показали, что в синапсах лягушки и мыши наблюдалась качественно сходная по характеру зависимость от [Са2+]o как числа выделяющихся в ответ на нервный стимул квантов, так и временных параметров их освобождения: уменьшение квантового состава при понижении [Са2+]o сопровождалось увеличением несинхронности секреции. Однако количественно временные параметры секреции (как временные, так и квантового состава) при разных [Са2+]o отличались в синапсах лягушки и мыши, указывая на то, что морфологические особенности строения активных зон секреции и их сопряжения с потенциал-зависимыми кальциевыми каналами, запускающими процесс экзоцитоза в этих синапсах (Harlow M.L. et al., 2001; Nagwaney S. et al., 2009), вносят вклад в определение кинетики секреции квантов.
Рис. 1. Зависимость квантового состава (А) и степени синхронности секреции (Б) от концентрации кальция в синапсах мыши и лягушки
2. Эффекты блокирования потенциал-зависимых кальциевых каналов в синапсах лягушки
2.1. Влияние неспецифического блокатора потенциал-зависимых кальциевых каналов кадмия на выделение медиатора в синапсах лягушки
Учитывая описанные выше данные о разной степени синхронности секреции в зависимости от [Са2+]o, а также полученные ранее сведения о том, что выраженность модуляции временных параметров в синапсах лягушки зависит от исходной степени несинхронности выделения квантов (Bukharaeva E. et al., 2002; Nikolsky E. et al., 2004) в качестве исходных условий была выбрана [Са2+]o=0.3 ммоль/л, при которой параметр Р90 еще не достигал насыщения. Экспериментальным путем была подобрана концентрация 1 мкмоль/л хлорида кадмия (CdCl2), блокирующего все типы потенциал-зависимых кальциевых каналов (Lansman J.B. et al., 1986), при которой интенсивность вызванной секреции квантов была достаточна для того, чтобы накопить не менее 200-300 одноквантовых ТКП.
Под действием CdCl2 средний квантовый состав уменьшился от 0.47±0.09 до 0.12±0.03 кванта (n=7, p<0.05), т.е. на 74%, что примерно соответствовало снижению числа выделяющихся квантов при уменьшении [Са2+]o от 0.2 ммоль/л до 0.3 ммоль/л. Однако в отличие от десинхронизации секреции, наблюдаемой при снижении [Са2+]o, уменьшение квантового состава под действием CdCl2 сопровождалось падением параметра Р90 до 1.70±0.17 мс по сравнению с исходной величиной 2.12±0.29 мс (n=7, p<0.05), т.е. синхронизацией процесса выделения квантов. Примерно такое же по выраженности изменение степени флуктуаций синаптических задержек наблюдалось при повышении [Са2+]o от 0.2 ммоль/л до 0.3 ммоль/л. Полученные данные демонстрируют, что уменьшение входа ионов Са2+ в нервное окончание за счет снижения концентрационного градиента (при понижении [Са2+]o) и за счет уменьшения количества открываемых во время пресинаптического потенциала действия ионных каналов (при блокировании их CdCl2), вызывая примерно равное по величине угнетение квантовой секреции, диаметрально противоположно меняют кинетику секреции: блокада каналов синхронизирует освобождение, тогда как уменьшение градиента, напротив - десинхронизирует. Для того чтобы выяснить, какой именно тип кальциевых каналов может участвовать в регуляции кинетики секреции проводили эксперименты со специфическими блокаторами каналов разных типов.
2.2 Влияние специфического блокатора N (CaV2.2) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах лягушки
Согласно данным литературы основным типом потенциал-зависимых кальциевых каналов, обеспечивающих процесс экзоцитоза квантов медиатора из двигательных нервных окончаний лягушки, являются каналы N (CaV2.2) типа (Сohen M.W. et al., 1991; Katz E. et al., 1995). Одним из наиболее специфических блокаторов каналов этого типа является -конотоксин GVIA (GTX) (McCleskey E.W. et al., 1987). Исследуемая концентрация GTX, составляющая 10 нмоль/л, была подобрана экспериментально так, чтобы наблюдаемое уменьшение числа выделяющихся квантов позволяло набирать достаточное для анализа синаптических задержек количество одноквантовых ТКП. Через 1.5 часа после введения GTX в перфузионный раствор, его удаляли, для того, чтобы избежать дальнейшего падения уровня секреции. GTX уменьшал средний квантовый состав на 66±5% (n=8, p<0.05). При этом наблюдалось уменьшение флуктуаций синаптических задержек одноквантовых ТКП, т.е. синхронизация секреции, что проявлялось в уменьшении параметра Р90 на 21±5% (n=8, p<0.05). Эти эффекты не устранялись при отмывке, т.е. были необратимыми. Причем, степень уменьшения параметра Р90 была более выражена в тех синапсах, где в исходных условиях асинхронность выделения квантов была выше.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что также как и блокада потенциал-зависимых кальциевых каналов неспецифическим блокатором CdCl2, действие специфического блокатора каналов N (CaV2.2) типа наряду со снижением квантового состава вызывала синхронизацию выделения квантов ацетилхолина. Появившиеся в последние годы данные о возможности совместного сосуществования на двигательных нервных окончаниях кальциевых каналов других типов (Katz E. et al., 1995; Sand O. et al., 2001; Thaler C. et al., 2001) позволяют предполагать их участие в регуляции параметров экзоцитоза. В связи с этим было проведено исследование влияния блокаторов каналов других типов.
2.3. Влияние специфического блокатора P/Q (CaV2.1) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах лягушки
В периферических синаптических контактах другим наиболее распространенным видом Са2+ каналов, участвующих в процессе экзоцитоза, являются P/Q (CaV2.1) каналы. В связи с этим было исследовано действие -агатоксина IVA - специфического блокатора этих каналов. В концентрации 20 нмоль/л токсин вызывал необратимое снижение среднего квантового состава на 38±8% по сравнению с исходной величиной (n=8, р<0.05). При этом также наблюдалось уменьшение количества ответов, имеющих большие синаптические задержки и величина параметра Р90 уменьшалась на 23±7% от исходного значения (n= 9, р<0.05).
Увеличение концентрации блокатора до 40 нмоль/л не приводило к более выраженному изменению квантового состава, что свидетельствует о том, что концентрация блокатора 20 нмоль/л уже является насыщающей. Таким образом, также как и блокада основного для синапсов лягушки N (CaV2.2) типа каналов, выключение P/Q (CaV2.1) каналов приводило к снижению квантового состава и синхронизации секреторного процесса.
2.4. Квантовая секреция при совместном блокировании P/Q (CaV2.1) и N (CaV2.2) каналов в синапсах лягушки
Для выявления возможности совместного, модулирующего секрецию, действия N (CaV2.2) и P/Q (CaV2.1) каналов исследовали одновременное действие их блокаторов. Добавление 20 нмоль/л -агатоксина IVA (блокатора P/Q каналов) в раствор после развития эффектов GTX (блокатора N каналов) приводило к дальнейшему снижению среднего квантового состава, т.е. наблюдалась аддитивность эффектов блокаторов на величину квантового состава. Однако при этом не наблюдалось дополнительного снижения параметра Р90. Полученные данные свидетельствуют о том, что на фоне повышенной синхронности секреции, вызванной «выключением» N (CaV2.2) каналов, блокатор P/Q (CaV2.1) каналов, продолжая снижать квантовый состав, не оказывал влияния на кинетику выделения квантов медиатора, что указывает на различия и независимость работы механизмов, обеспечивающих регуляцию количества освобождаемых квантов и временных параметров их выделения.
2.5. Влияние блокатора L (CaV 1.2) кальциевых каналов на параметры квантовой секреции в синапсах лягушки
Потенциал-зависимые дигидропиридин-чувствительные L (CaV 1.2) каналы, согласно данным литературы, во многих химических синапсах являются более долгоживущими и пространственно удаленными от мест освобождения медиатора, чем каналы других типов (Atchison W.D., 1989; Meir A. et al., 1999). В связи с этим можно предположить, что кванты, выделившиеся с более длинными синаптическими задержками, могут быть обусловлены активацией именно этих каналов. Для проверки этой гипотезы были проведены исследования действия нитрендипина, блокатора L (CaV 1.2) каналов, в концентрации 5 мкмоль/л, превышающей величину IC50=20-150 нмоль/л (Mery P.F. et al., 1996). Нитрендипин вызывал обратимое снижение квантового состава на 27±7% (n=9, р<0.05). При этом, также как и при действии блокаторов других каналов, наблюдалось уменьшение степени несинхронности секреции квантов: параметр Р90 снижался на 22±4% (n= 9, р<0.01).
Таким образом, проведенное исследование влияния блокаторов потенциал-зависимых Са2+ каналов в синапсах лягушки показало, что при действии как неспецифического блокатора – ионов кадмия, так и специфических блокаторов основных типов Са2+ каналов (N, P/Q и L) снижение количества освобождаемых в ответ на нервный импульс квантов сопровождалось устранением квантов, выделившихся с синаптическими задержками, существенно превышающими значения главной моды гистограмм распределения синаптических задержек. Повышение степени синхронности секреции и снижение квантового состава, наблюдаемые вследствие блокирования Са2+ каналов, позволяют сделать вывод о том, что все исследованные каналы вносят вклад в секреторный процесс.
3. Исследования эффектов блокирования потенциал-зависимых кальциевых каналов в синапсах мыши
3.1. Влияние неспецифических блокаторов потенциал-зависимых кальциевых каналов кадмия и магния на выделение медиатора в синапсах мыши
По аналогии с исследованиями, проведенными на синапсах лягушки, изучение роли кальциевых каналов разных типов в синапсах мыши начали с экспериментов с неспецифическим блокатором Са2+ каналов CdCl2. Для того, чтобы достичь сопоставимого с наблюдаемым в синапсах лягушки эффекта снижения квантового состава была подобрана концентрация CdCl2 2.5 мкмоль/л, которая существенно превышала использованную у лягушки концентрацию. CdCl2 вызывал уменьшение величины среднего квантового состава на 62±10% (n=6, р<0.05). Однако, в отличие от синапсов лягушки, где CdCl2 вызывал синхронизацию секреции, в нервно-мышечном соединении мыши блокирование кальциевых каналов приводило к возрастанию числа одноквантовых ТКП с большими значениями синаптических задержек. Появление ответов с большими синаптическими задержками привело к расширению гистограммы и сдвигу кумулятивной кривой вправо и, как следствие, к увеличению параметра P90 на 85±12% (n=6, р<0.05). Таким образом, в отличие от синапсов лягушки, в нервно-мышечном соединении мыши блокирование каналов ионами кадмия, вызывая сходное по выраженности снижение количества выделяющихся квантов, приводило не к синхронизации, а к десинхронизации секреторного процесса.
В связи с обнаруженным различием в эффектах кадмия, были проведены эксперименты с использованием другого двухвалентного катиона магния, который также является блокатором Са2+ каналов (Lansman J.B. et al., 1986; Allana J. and Lin J., 2004). При повышении концентрации ионов магния от 4 до 8 ммоль/л квантовый состав снизился на 73% от 0.38±0.03 до 0.12±0.03 (n=8, р<0.05). При этом происходило возрастание числа ТКП с большими значениями синаптических задержек и параметр Р90 увеличился на 95% от 1.69±0.12 мс до 3.31±0.45 мс (n=8, р<0.05). Таким образом, в синапсах мыши снижение входа ионов кальция в нервное окончание за счет действия двухвалетных катионов, также как и при уменьшении [Са2+]o, вызывало возрастание несинхронности секреции квантов.
3.2. Влияние специфического блокатора P/Q (CaV2.1) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах мыши
Поскольку в нервно-мышечном соединении мыши основным типом Са2+ каналов, обеспечивающим экзоцитоз медиатора, являются P/Q (CaV2.1) каналы (Westenbroek R.E. et al., 1998; Nudler S. et al., 2003), то исследования были начаты с использования -агатоксина IVA. Его концентрация, вызывающая 50% блокирования освобождения квантов (IC50), составляла в синапсах мыши 2-20 нмоль (Mintz I.M. et al. 1992). В наших экспериментах 10 нмоль/л токсина вызывало уменьшение среднего квантового состава на 56±6% по сравнению с исходной величиной (n=6, p<0.05). Однако при этом не наблюдалось изменения временных параметров секреции квантов: параметр Р90 составлял 1.61±0.08 мс в контроле и 1.72±0.31 мс (p>0.05, n=6) после действия токсина. Увеличение концентрации -агатоксина IVA до 20 и 40 нмоль/л не привело к дальнейшему усилению эффекта токсина на квантовый состав, который снижался на 53±5% и 41±9%, соответственно, при этом также не наблюдалось изменения параметра Р90, т.е. степени синхронности секреции квантов. Таким образом, в синапсах мыши P/Q (CaV2.1) каналы регулируют только число освободившихся в ответ на нервный стимул квантов медиатора. То обстоятельство, что при достижении насыщающей концентрации блокатора, не происходило дальнейшего снижения количества выделившихся квантов свидетельствует о том, что помимо P/Q (CaV2.1) каналов, заблокированных -агатоксином IVA, другие каналы могут принимать участие в обеспечении экзоцитоза в синапсах мыши.
3.3 Влияние специфического блокатора N (CaV2.2) каналов на выделение квантов ацетилхолина в синапсах мыши
Для выяснения роли N (CaV2.2) каналов в регуляции экзоцитоза в синапсах мыши был использован тот же -конотоксин GVIA (GTX), что и в экспериментах на синапсах лягушки. Концентрация токсина (1 мкмоль/л) на два порядка превышающая использованную у лягушки (10 нмоль/л), не оказывала влияния ни на квантовый состав (0.26±0.06 в контроле, 0.23±0.08 после действия токсина, p>0.05, n=6), ни на временные параметры секреции квантов (Р90 в контроле составлял 3.16±0.41 мс и равнялся 3.07±0.76 мс после действия токсина, p>0.05, n=6). Таким образом, использование блокатора N (CaV2.2) каналов не оказывало влияния на процессы квантового освобождения ацетилхолина в синапсах мыши.
3.4. Влияние блокатора L (CaV 1.2) кальциевых каналов на параметры квантовой секреции в синапсах мыши
Для блокирования каналов этого типа, также как и в синапсах лягушки, использовали нитрендипин, но в два раза большей концентрации (10 мкмоль/л), основываясь на данных о влиянии этого агента в реинервированных синапсах мыши (Katz E. et al., 1996). В исходных условиях (при внеклеточной [Са2+]o =0.5 ммоль/л) добавление нитрендипина не вызывало достоверного уменьшение квантового состава: в контроле 0.41±0.08 и 0.35±0.09 после добавления нитрендипина (n=7, p>0.05). Не наблюдалось также и изменения временных параметров секреции. Однако, учитывая данные, свидетельствующие о том, что в синапсах теплокровных L (CaV 1.2) каналы могут находиться в «молчащем» состоянии (Urbano F. J. et al., 2001) было предпринято исследование эффектов нирендепина при исходно высоком уровне асинхронности секреции квантов при [Са2+]o =0.2 ммоль/л.
Рис. 2. Относительное изменение величины квантового состава и степени синхронности секреции в синапсах лягушки (А) и мыши (Б) при действии специфических блокаторов потенциал-зависимых Са2+ каналов разных типов
В этих условиях нитрендипин вызывал достоверное уменьшение квантового состава на 27±8% (n=7, р<0.05), а также уменьшал количество одноквантовых ТКП с большими значениями синаптических задержек и достоверно снижал параметр P90 на 18±7% (р<0.05).
Таким образом, в синапсах мыши блокатор L (CaV 1.2) каналов оказывал влияние на процесс выделения квантов ацетилхолина, снижая их количество и синхронизируя освобождение, только в условиях исходно высокой степени несинхронности секреции.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Независимо от видовой и функциональной принадлежности синапсов химического типа, основные процессы, происходящие в них, принципиально схожи – будь то межнейрональный синапс центральной нервной системы или нервно-мышечное соединение (Зефиров А.Л. и Черанов С.Ю., 2000; Van der Kloot W. and Molgo J., 1994; Pietrobon D., 2005; Slater C., 2008). Именно это обстоятельство определяет тот факт, что нервно-мышечные синапсы лягушки и мыши являются классическими объектами для физиологических и фармакологических исследований, результаты которых обобщаются и переносятся на синапсы других теплокровных, в том числе и человека. Однако морфологические и физиологические особенности каждого из этих синапсов делают необходимым более тщательный анализ механизмов регуляции их работы, поскольку именно эти объекты служат тестовыми системами для испытания многих фармакологических препаратов, в том числе и каналоблокаторов. Проведенные исследования позволяют сопоставить характер изменения процесса выделения квантов ацетилхолина в ответ на нервный импульс в нервно-мышечных соединениях лягушки и мыши при изменении условий входа ионов кальция в нервное окончание путем снижения концентрационного градиента (при уменьшении [Са2+]o) или путем блокирования потенциал-зависимых Са2+ каналов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что в синапсах мыши и лягушки имеет место сходная по характеру зависимость от [Са2+]o как числа выделяющихся в ответ на нервный стимул квантов, так и временных параметров их освобождения: уменьшение квантового состава при понижении [Са2+]o сопровождается увеличением несинхронности секреции. Однако оценка степени кооперативности - коэффициента Хилла показала, что его величина для зависимости степени синхронности существенно ниже, чем для квантового состава. Полученные данные указывают на то, что для синхронного освобождения квантов с низкой степенью флуктуаций синаптических задержек необходимо действие не менее трех ионов кальция, тогда как для несинхронного выделения квантов с большими значениями синаптических задержек достаточно одного иона кальция.
Анализ роли потенциал-зависимых Са2+ каналов в регуляции квантового состава и кинетики секреции показал, что в отличие от широко распространенного мнения, согласно которому процесс экзоцитоза медиатора из моторных нервных окончаний лягушки опосредован входом ионов кальция через потенциал-зависимые N (CaV 2.2) кальциевые каналы, в условиях сниженного содержания ионов кальция во внеклеточной среде в контроле количества освобождаемых квантов медиатора и их кинетики принимают участие также P/Q (CaV 2.1) и L (CaV 1.2) каналы. Блокада всех исследованных типов кальциевых каналов приводит как к снижению количества освобождаемых квантов, так и к уменьшению дисперсии синаптических задержек (Рис. 2А). В отличие от описанной десинхронизации освобождения квантов при понижении [Са2+]o, блокада кальциевых каналов сопровождается синхронизацией этого процесса, что свидетельствует о разной реакции аппарата экзоцитоза на изменение условий входа Са2+ в нервное окончание. В синапсах мыши, где наблюдалось десинхронизирующее секрецию действие пониженного внеклеточного Са2+, блокада каналов неспецифическими блокаторами кадмием и магнием вызывала также появление ответов с большими синаптическими задержками, т.е. повышение несинхронности секреции. В то же время, в отличие от синапсов лягушки, блокирование основных для этих синапсов P/Q (CaV 2.1) каналов не изменяло временных параметров секреции квантов, а только снижало их количество. Отсутствие влияния блокатора N (CaV 2.2) каналов на вызванную секрецию ацетилхолина свидетельствует о том, что в зрелом синапсе мыши эти каналы не участвуют в регуляции экзоцитоза синаптических везикул, а появление квантов, выделяющихся с затянутыми синаптическими задержками в условиях существенно сниженной внеклеточной концентрации ионов кальция может быть обусловлено включением в секреторный процесс L (CaV 1.2) каналов, поскольку их блокирование нитрендипином вызывает снижение квантового состава и синхронизацию секреции. Выявленные различия в механизмах кальциевой регуляции параметров вызванной секреции квантов ацетилхолина в синапсах теплокровных и холоднокровных могут быть обусловлены особенностями морфофункционального состояния секреторного аппарата, к которым относятся: разные геометрические параметры области активной зоны и взаимного расположения ионных каналов и Са2+ сенсоров; разное сродство к Са2+ и скорость связывания Са2+-чувствительных сенсоров (изоформ везикул ассоциированного белка синаптотагмина), обеспечивающих синхронное и асинхронное освобождение квантов; разная степень активности Са2+-секвестрирующих систем, способных элиминировать Са2+ из области активной зоны.
ВЫВОДЫ
- Понижение концентрации ионов кальция от 0.6 до 0.2 ммоль/л во внеклеточной среде в синапсах лягушки и мыши наряду со снижением количества освобождаемых квантов ацетилхолина вызывает десинхронизацию их освобождения, при этом кинетика секреции в синапсах мыши зависит от внеклеточной концентрации ионов кальция в большей степени, чем в синапсах лягушки.
- Значения коэффициента Хилла для зависимости квантового состава от концентрации ионов кальция во внеклеточной среде примерно равны в синапсах лягушки и мыши и указывают на необходимость действия не менее трех ионов кальция для синхронного освобождения квантов ацетилхолина.
- Значения коэффициентов Хилла для зависимости от кальция параметра Р90, характеризующего степень несинхронности секреции, в обоих синапсах меньше единицы, что свидетельствует об отсутствии необходимости взаимодействия нескольких ионов кальция для освобождения квантов с большими синаптическими задержками.
- Неспецифический блокатор кальциевых каналов хлорид кадмия в нервно-мышечном синапсе лягушки, уменьшает количество выделившихся квантов и синхронизирует процесс их секреции.
- В нервно-мышечном соединении мыши снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки при блокаде кальциевых каналов ионами кадмия и магния, в отличие от синапсов лягушки, сопровождается увеличением асинхронности секреции квантов ацетилхолина.
- Блокада основных для синапсов лягушки потенциал-зависимых кальциевых каналов N (Сav2.2) типа специфическим блокатором конотоксином GVIA, вызывает уменьшение числа освободившихся квантов и повышает степень синхронности их освобождения, у мыши применение этого токсина не влияет на параметры вызванного экзоцитоза.
- В синапсах мыши блокирование P/Q (Сav2.1) потенциал-зависимых кальциевых каналов вызывает снижение количества квантов, но не влияет на кинетику их освобождения, а в синапсах лягушки приводит к снижению квантового состава и синхронизации процесса секреции.
- Потенциал-зависимые кальциевые L (Сav1.2) каналы в синапсах мыши и лягушки вносят вклад в обеспечение несинхронного освобождения квантов ацетилхолина, поскольку их блокада вызывает снижение квантового состава потенциалов концевой пластинки и синхронизацию процесса выделения квантов.
- Изменение условий входа ионов кальция в нервное окончание: снижение концентрационного градиента и блокирование потенциал-зависимых кальциевых каналов по-разному влияет на временные параметры секреции квантов в синапсах мыши и лягушки.
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ
Публикации в журналах, рекомендованных ВАК:
- Ценцевицкий А.Н., Васин А.Л., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Участие разных типов потенциал-зависимых кальциевых каналов в обеспечении вызванного освобождения медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. Доклады Академии наук, 2008, т.423, №6, с. 846-849.
- Бухараева Э.А., Ценцевицкий А.Н., Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Никольский Е.Е. Пресинаптические потенциал-зависимые кальциевые каналы и регуляция экзоцитоза нейромедиатора в периферической нервной системе. Биологические мембраны, 2009, т.4, №6, с. 308-309.
- Самигуллин Д.В., Васин А.Л., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Особенности кальциевого транзиента в различных участках нервной терминали лягушки в ответ на нервный импульс. Доклады Академии наук, 2010, т.431, №5, с. 711-713.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Роль кальция в модуляции кинетики синхронного и асинхронного освобождения квантов медиатора в нервно-мышечном синапсе. Биологические мембраны, 2010, т. 27, № 1, с. 92-100.
Статьи в сборниках и тезисы докладов:
- Самигуллин Д., Васин А., Никольский Е., Бухараева Э. Роль двухвалентных катионов и кальциевых каналов в регуляции кинетики вызванного освобождения квантов медиатора в нервно-мышечном соединении теплокровных. Сборник «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино, 2007, с. 135-138.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Кальциевая регуляция синхронного и асинхронного освобождения квантов медиатора в нервно-мышечном синапсе. Сборник «Рецепция и внутриклеточная сигнализация», Пущино, 2009, с. 172-177.
- Vasin A., Samigullin D., Bukharaeva E., Nikolsky E. Change of the kinetics of evoked quantal release in neuromuscular junction of mouse by bivalent cations. Abst. VIII East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology, Kazan, 2006, September, 13-17, p. 94.
- Samigullin D.V., Vasin A.L., Bykhovskaia M.B., Bukharaeva E.A. Modulation of the kinetics of evoked quantal release at mouse neuromuscular junctions by calcium and strontium. PENS Summer course «Contemporary Problems of Neurobiology: Molecular Mechanisms of Synaptic Plasticity». Kazan, 10-24 September 2007. p.25-26.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В. Роль ионов кальция в регуляции кинетики вызванного освобождения квантов медиатора. Тезисы XII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань, 25-26 апреля 2007 г. стр. 283-284.
- Самигуллин Д.В., Васин А.Л., Бухараева Э.А., Никольский Е.Е. Кальциевые каналы и регуляция кинетики вызванного освобождения квантов медиатора. Тезисы докладов XX Съезда физиологического общества им. И.П. Павлова, Москва, 4-8 июня 2007г., с. 407
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В. Влияние блокаторов кальциевых каналов на интенсивность и кинетику вызванной секреции квантов медиатора. Тезисы конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2008». Москва. МГУ, 8-11 апреля 2008г. с. 208-209.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Синхронное и асинхронное освобождение квантов нейромедиатора при ритмической стимуляции двигательного нерва. Тезисы VI Сибирского физиологического съезда. Барнаул 25-27 июня 2008г. с. 73.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В. Потенциал-зависимые кальциевые каналы в модуляции синхронности выделения квантов медиатора. Тезисы IV Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 10-20 июня 2008г. с. 76-77.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В. Модуляция интенсивности и кинетики вызванной секреции квантов медиатора блокаторами кальциевых каналов. Тезисы XIII Всероссийской научно-практической конференции «Молодые ученые в медицине». Казань, 23-24 апреля 2008г. с. 196-197.
- Бухараева Э.А., Самигуллин Д.В., Васин А.Л., Никольский Е.Е. Пресинаптические механизмы обеспечения пластичности синаптической передачи в нервно-мышечном соединении позвоночных. Тезисы IV Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 10-20 июня 2008г. с. 70-71.
- Самигуллин, Д.В., Васин А.Л., Бухараева Э.А. Роль двухвалентных катионов в регуляции кинетики вызванной секреции квантов медиатора. Тезисы IV Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 10-20 июня 2008г. с. 260-262.
- Бухараева Э.А., Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Никольский Е.Е. Особенности кинетики синхронной и асинхронной секреции квантов медиатора из двигательных нервных окончаний. Материалы конференции с международным участием, посвященная 90-летию со дня рождения академика Т.М. Турпаева «Механизмы нервных и нейроэндокринных регуляций», Москва, 24-26 ноября 2008, с. 41-42.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В. Исследование вызванного освобождения квантов ацетилхолина в синапсах животных разного возраста при ритмической стимуляции. Городское здравоохранение. Тезисы XIV Всероссийской научно-практическая конференции «Молодые ученые в медицине». Казань. 29-30 апреля 2009г. с. 162.
- Самигуллин Д.В., Васин А.Л., Бухараева Э.А. Внутриклеточный кальций: роль в модуляции экзоцитоза нейромедиатора и оптические методы регистрации в пресинаптическом нервном окончании. Тезисы V Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 3-13 июня 2009г. стр. 194-195.
- Васин А.Л., Самигуллин Д.В., Бухараева Э.А. Особенности процесса экзоцитоза нейромедиатора в синапсах теплокровных на разных этапах онтогенеза. Тезисы V Международного междисциплинарного конгресса «Нейронаука для медицины и психологии». Судак, Крым. 3-13 июня 2009, с. 66-67.
- Samigullin D.V., Vasin A.L., Bukharaeva E.A., Nikolsky E.E. Calcium transient in different parts of the frog neuromuscular junction in the response to nerve pulse. Abstract Book of International Conference “Molecular mechanisms of intracellular calcium signalling”, Kiev, Ukraine, October 11-13, 2009, p. 49.
- Vasin A., Samigullin D., Huzahmetova F., Tsentsevitsky A., Nikolsky E. Time course of evoked quantal secretion under change of the intracellular calcium at the motor nerve terminal. Abstract Book of International Conference “Molecular mechanisms of intracellular calcium signalling”, Kiev, Ukraine, October 11-13, 2009, P. 27.
- Васин А.Л. Роль дигидропиридин-чувствительных кальциевых каналов нервного окончания в регуляции квантовой секреции ацетилхолина. Тезисы докладов XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов -2010» секция «Биология», Москва, 2010, с.268-269.
[1] Часть исследований, представленных в данном разделе, выполнена совместно с кбн А.Н.Ценцевицким и кбн Д.В.Самигуллиным
