Стандартизация фукуса пузырчатого (fucus) и настоек гомеопатических матричных, получаемых на его основе
На правах рукописи
саканян карен маисович
СТАНДАРТИЗАЦИЯ ФУКУСА ПУЗЫРЧАТОГО (FUCUS) И НАСТОЕК ГОМЕОПАТИЧЕСКИХ МАТРИЧНЫХ, ПОЛУЧАЕМЫХ НА ЕГО ОСНОВЕ
15.00.02- фармацевтическая химия и фармакогнозия
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва, 2008 г.
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.
| Научный руководитель: доктор фармацевтических наук профессор | Сокольская Татьяна Александровна |
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук Лякина М. Н.
доктор фармацевтических наук Маркарян А. А.
Ведущая организация: Военно-медицинская Академия им. С. М. Кирова, Санкт-Петербург.
Защита диссертации состоится «___» ____________ 2008 г. в на заседании Диссертационного Совета Д 006.070.01 во Всероссийском НИИ лекарственных и ароматических растений РАСХН по адресу: 117216, г Москва, ул. Грина,7.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ВИЛАР по адресу:117216, г. Москва, ул. Грина, д.7
Автореферат разослан: «___»_________ 2008 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета Д 006.070.01,
доктор фармацевтических наук Громакова А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. В последние годы в отечественном практическом здравоохранении наблюдается устойчивая тенденция применения наряду с аллопатическим гомеопатического метода лечения, что в свою очередь, сопровождается появлением на фармацевтическом рынке России отечественных гомеопатических лекарственных средств (ГомЛС).
Однако, их ассортимент существенно уступает таковому зарубежных гомеопатических препаратов, что обусловлено рядом причин как объективного, так и субъективного характера. К их числу следует отнести отсутствие Российской Государственной Гомеопатической фармакопеи, нормирующей качество отечественных ГомЛС, ограниченный перечень отечественных гомеопатических субстанций различного происхождения, в том числе настоек гомеопатических матричных (НГМ), производство которых может быть организовано на базе отечественных предприятий.
В связи с этим достаточно актуальной задачей отечественной медицинской практики является увеличение ассортимента ГомЛС, назначаемых для профилактики и лечения наиболее выраженных патологий, к числу которых следует отнести нарушение обменных процессов, протекающих в человеческом организме.
Среди растительных объектов, используемых для этих целей в мировой гомеопатической практике, следует отметить различных представителей бурых водорослей. Наиболее часто используются представители рода ламинария - Laminariacae L., которые в настоящее время применяются в отечественной и зарубежной медицинской практике как лекарственные средства и биологически активные добавки (БАД) к пище. Однако не менее интересен с этой точки зрения другой представитель бурых водорослей – Phaeophyta, фукус пузырчатый – Fucus vesiculosus L.
Благодаря высокому содержанию йода, полисахаридов и других биологически активных веществ (БАВ) различные виды бурых водорослей применяются при заболеваниях щитовидной железы, воспалениях лимфатических желез, нарушение обменных процессов приводящих к ожирению.
НГМ Фукус включена в руководство В. Швабе, а также в различные отечественные и зарубежные гомеопатические рецептурные справочники и фармакопеи, в том числе Германии, Великобритании, Франции, Индии и др.
На российском фармацевтическом рынке представлены такие препараты Фукуса, как Fucus vesiculosus – Injeel (forte), Strumeel (forte), Thyreoidea compositum (Heel), капли ЭДАС-107, ЭДАС-907 (в их состав входит разведение Fucus C3).
Основное действие этих препаратов заключается в том, что влияют на нервную и эндокринную системы, на жировой и углеводный обмен и применяются при нарушениях обмена веществ, предрасположенности к избыточной массе тела, ожирении, заболеваниях щитовидной железы.
Химический состав слоевищ Фукуса как лекарственного растительного сырья изучен недостаточно, методики стандартизации отсутствуют. Поэтому, актуальным является комплексное фитохимическое изучение фукуса с использованием современных физико-химических методов, разработка методик стандартизации и их совершенствование, создание нормальной документации.
Цель и задачи исследования. Целью диссертационного исследования является фармакогностическое изучение слоевищ Фукуса пузырчатого, получение и фитохимическое исследование настоек гомеопатических матричных Фукус, препаратов Фукуса и их стандартизация.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
- Изучить фитохимический состав свежесобранного и высушенного сырья Фукуса пузырчатого и разработать методики качественного и количественного анализа основных груп БАВ.
- Предложить технологию получения и провести исследования химического состава НГМ из свежесобранного и высушенного сырья Фукуса. Разработать методики контроля качества НГМ.
- Разработать методики установления подлинности гомеопатических разведений Фукуса.
- Провести предварительную оценку фармакологической активности НГМ Фукус и ее разведений.
- Оформить проекты Фармакопейных статей на «Фукуса пузырчатого слоевища»; «Фукуса пузырчатого слоевища свежие»; «Fucus vesiculosus настойку гомеопатическую матричную» и «Fucus vesiculosus D1 настойку гомеопатическую матричную».
Научная новизна. Определены основные макро- и микродиагностические признаки сырья, его товароведческие показатели, установлены оптимальные сроки заготовки и условия сушки, для свежезаготовленного сырья – сроки использования и методы консервации.
С применением современных методов химического и физико-химического анализа установлен качественный и количественный состав БАВ свежих и высушенных слоевищ Фукуса пузырчатого. Определено, что в слоевищах Фукуса пузырчатого содержатся соединения йода и полисахариды. Так как полисахариды являются основной группой БАВ для этого растительного сырья, то с применением тонкослойной хроматографии (ТСХ), высоко-эффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектроскопии ядерного магнитного резонанса (13С) определен их компонентный состав. Показана необходимость стандартизации лекарственного растительного сырья Фукуса по содержанию в нем полисахаридов (гравиметрический метод), суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу (метод УФ-спектроскопии) и йода (титриметрический метод).
Предложена технология и разработаны показатели качества, а также методы их оценки для НГМ Фукус из свежего и высушенного ЛРС и лекарственных препаратов на их основе. Установлено, что для препаратов Фукуса также целесообразно использовать в качестве основных показателей качества содержание в них свободных сахаров, полисахаридов и йода.
Впервые проведено тестирование НГМ Фукус и их разведений, свободных и связанных моносахаридов с использованием биотест-систем в опытах in vitro, позволившая выявить выраженное антиоксидантное действие анализируемых объектов.
Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований разработаны проекты ФС:
- «Фукуса пузырчатого слоевища свежие»;
- «Фукуса пузырчатого слоевища»;
- «Fucus vesiculosus (Fucus) настойка гомеопатическая матричная»;
- «Fucus vesiculosus (Fucus) D1 настойка гомеопатическая матричная».
Связь задач исследования с проблемным планом развития фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ ГУ ВИЛАР РАСХН по «Программе фундаментальных и приоритетных прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса РФ на 2001-2005 и 2006-2010 г.г».
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты исследований химического состава свежесобранного и высушенного сырья Фукуса и НГМ Фукус, приготовленных из него, в сравнительном аспекте;
- Методики качественного и количественного анализа действующих веществ в ЛРС и НГМ Фукус, их разведениях;
- Результаты оценки фармакологической активности НГМ Фукус, и их разведений, а также выделенных из них моно- и полисахаридных комплексов;
- Проекты фармакопейных статей на ЛРС и НГМ Фукус.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Во в в е д е н и и раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы.
В п е р в о й г л а в е на основании литературных данных рассмотрены сведения о ботанико-морфологической характеристике Фукуса и близких ему видов водорослей; химическом составе, фармакологической активности и медицинском применении сырья и настоек гомеопатических матричных (НГМ) Фукуса пузырчатого; методах анализа основных действующих веществ и вопросах стандартизации сырья и НГМ Фукуса.
В разделе П о я с н е н и е к э к с п е р и м е н т у приводится характеристика объектов исследования – свежесобранного и высушенного ЛРС фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.),, заготовленного в 2002 – 2004 гг. в Чупинском заливе Белого моря (вблизи поселка Чупа, Архангельской области). а также НГМ, полученных из этого сырья. Описываются использованные в исследовании методы и приборы, хроматографические системы, сорбенты и реактивы.
В т о р а я г л а в а посвящена товароведческому анализу сырья Фукуса, установлению его морфолого-диагностических признаков и числовых показателей. Впервые подробно описаны внешний вид и диагностически значимые микроскопические признаки сырья Фукуса и его отличия от сырья ламинарии.
В т р е т ь е й г л а в е излагаются результаты фитохимического исследования сырья Фукуса, приводится разработка и обоснование методик качественного и количественного определения суммы полисахаридов, суммы связанных моносахаридов после гидролиза (в пересчете на глюкозу) и содержание йода в сырье Фукуса, а также динамика накопления полисахаридов и йода за один вегетационный период.
В ч е т в е р т о й г л а в е приводятся результаты фитохимического изучения НГМ Фукус, краткая технология их получения, разработка и обоснование методик качественного и количественного определения суммы моносахаридов после гидролиза в пересчете на глюкозу, а также соединений йода в НГМ Фукус.
Г л а в а п я т ь содержит результаты предварительной оценки фармакологической активности НГМ Фукус, их разведений, а также выделенных из них моно- и полисахаридных фракций, выполненных методом биотестирования.
Ш е с т а я г л а в а посвящена разработке показателей качества и установлению сроков годности ЛРС и НГМ Fucus vesiculosus, методикам идентификации БАВ в гомеопатических разведениях изучаемых настоек.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на страницах, содержит таблицы, рисунка и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальной части, библиографии из 217 источников литературы, из которых 52 – на иностранных языках и приложений.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
1. Товароведческий анализ ЛРС Фукуса
Микроскопический анализ. Для микроскопического анализа готовили препараты с поверхности слоевищ Фукуса (ГФ XI изд., вып. 2 с. 277).
Поперечный срез таллома характеризуется наличием корового слоя, состоящего из клеток почти квадратной формы с утолщенными стенками. Далее следуют клетки – псевдоткани с многочисленными округлыми слизистыми вместилищами, а также полостями округлой формы, предназначенными для осуществления функции дыхания. Наличие этих отверстий фиксируется и на продольном срезе таллома.
При изучении анатомического строения органов размножения Фукуса – рецептакул установлено, что они имеют коровый слой по строению аналогичный таковому таллома. Анализ особенностей строения скафидий (концептакул) показал, что их внутренняя часть заполнена слизью, в которой хаотично распределены споры.
Таким образом, в качестве основных анатомо-диагностических признаков высушенного и свежего сырья Фукуса пузырчатого может быть использовано характерное строение клеток корового слоя и псевдоткани таллома, наличие дыхательных отверстий и слизистых вместилищ, а также особенности строения рецептакул и скафидий.
Все вышеописанные микроскопические признаки слоевищ Фукуса подтверждены фотографическими снимками и включены в разработанные фармакопейные статьи «Фукуса пузырчатого слоевища».
Проведено сравнительное изучение числовых показателей (влажность, зола, содержание допустимых примесей, микробиологическая чистота и радиационный контроль) для ЛРС Фукуса пузырчатого.
2. Фитохимическое изучение ЛРС Фукуса
Для ЛРС фукуса разработаны критерии подлинности, включающие качественные реакции на углеводы, соединения йода и тонкослойную хроматографию.
Для обнаружения свободных моносахаров применяли метод ТСХ. В качестве исследуемого раствора использовали свежевыжатый сок из свежих слоевищ (разведенный водой в соотношении 1:2) и спирто-водные извлечения из высушенных слоевищ Фукуса пузырчатого. В качестве свидетелей применяли 0,05 % спиртовые растворы аутентичных образцов моносахаров. Для разделения моносахаров использовали хроматографические пластинки Sorbfil «ПТСХ-П-А» размером 15х15 см. В качестве подвижной фазы применяли смесь растворителей вода-метанол-уксусная кислота ледяная-хлористый этилен в соотношении 10:15:25:50. Зоны адсорбции моносахаров обнаруживали опрыскиванием хроматограммы 0,5 % раствором тимола в 95 % этиловом спирте.
В табл. 1 представлены обобщенные данные по хромато-графическому анализу сырья фукуса на содержание моносахаров.
| Таблица 1 | ||
| Величины Rs зон адсорбции испытуемых растворов и растворов стандартных образцов (по фруктозе) на хроматограммах | ||
| Хроматограмма СО моносахаров | Хроматограмма сока из свежих слоевищ Фукуса | Хроматограмма спиртового извлечения из высушенных слоевищ Фукуса |
| глюкоза | 0,80 | 0,78 |
| рамноза | 1,73 | 1,74 |
| галактоза | 0,75 | 0,76 |
| арабиноза | 1,82 | 1,84 |
| фруктоза | 1,0 | 1,0 |
Для уточнения результатов предварительного изучения состава моносахаров в сырье Фукуса с помощью тонкослойной хроматографии проводили их исследование на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "GILSON", ФРАНЦИЯ с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы "Мультихром для "Windows ".
Анализ осуществляли на металлической колонке размером 6,5x300 мм ALLTECHОА-1000 Organic Acids; подвижная фаза-0,005М раствор серной кислоты. Скорость подачи элюента – 0,4 мл/мин. Температура колонки 65°С. Продолжительность анализа 16 мин. Для детектирования моносахаридов применяли УФ-детектор при длине волны 190 нм. Исследование проводили в образцах сока из свежих слоевищ Фукуса пузырчатого и спирто-водного извлечения из сухих слоевищ (табл. 2).
Подготовка пробы: 1 мл сока из свежих слоевищ или спиртового извлечения из сухих слоевищ помещали в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляли 10 мл 0,005М раствора серной кислоты, перемешивали и доводили объем раствора до метки 0,005М раствором серной кислоты, затем перемешивали и фильтровали (исследуемый раствор).
Параллельно готовили серию 0,05 % растворов стандартных образцов в 95 % этиловом спирте. Оценка хроматограммы проводилась по временам удерживания и площади пика, в автоматическом режиме.
На основании данных ВЭЖХ установлено, что в сырье Фукуса пузырчатого идентифицированы свободные сахара – мальтоза, сахароза, лактоза, глюкоза, ксилоза, фруктоза, рамноза и арабиноза. Содержание фруктозы превалирует как в соке из свежих слоевищ (50,63 %), так и в спиртовом извлечении из сухих слоевищ Фукуса (42,18 %).
| Таблица 2 | |||
| Результаты исследования свободных сахаров в сырье Фукуса методом ВЭЖХ | |||
| Соединение | Время удерживания, мин | % содержание в пробе сока | % содержание в пробе спиртового извлечения |
| мальтоза | 1,12 | 6,27 | 4,14 |
| сахароза | 1,24 | 5,28 | 4,36 |
| лактоза | 11,50 | 7,94 | 4,85 |
| глюкоза | 13,45 | 5,21 | 4,49 |
| ксилоза | 14,30 | 9,84 | 7,17 |
| фруктоза | 14,95 | 50,63 | 42,18 |
| рамноза | 15,66 | 9,72 | 5,32 |
| арабиноза | 15,97 | 5,11 | 3,48 |
Для изучения мономерного состава полисахаридов Фукуса была выделена сумма полисахаридов из сырья и проведен ее гидролиз с использованием для этих целей методики, основанной на применении трифторуксусной кислоты (ТФУ).
Дальнейшее исследование качественного и количественного состава полисахаридного комплекса осуществляли методом денситометрии. Изучение качественного состава сахаров проводили с применением следующих систем элюентов: этилацетат-спирт изопропиловый- вода (5:3,2:1,6) и этилацетат-кислота муравьиная-вода (6:1,5:1,5).
Метод денситометрии был использован и для количественной оценки содержания сахаров. Результаты количественного определения приведены в табл. 3.
Полученные данные свидетельствуют о том, что преобладающими соединениями в составе полисахаридного комплекса являются глюкуроновая кислота и глюкоза.
| Таблица 3 | |||
| Результаты количественного определения моносахаров и их производных в гидролизате полисахаридного комплекса Фукуса | |||
| № | Соединение | Количество, в пере-счете на 100 мг гидролизата полисахаридов, полученного из сока Фукуса, мг | Количество, в пересчете на 100 мг гидролизата полисахаридов, полученного из спиртового извлечения из Фукуса, мг |
| 1. | Кислота глюкуроновая | 11,25 | 1,599 |
| 2. | Ксилоза | 1,32 | 0,145 |
| 3. | Арабиноза | 0,24 | 0,0387 |
| 4. | Мальтоза | 1,26 | 0,134 |
| 5. | Рамноза | 2,25 | 0,278 |
| 6. | Глюкоза | 9,687 | 0,845 |
Для подтверждения данных денситометрии было проведено спектроскопическое исследование суммы полисахаридов на ЯМР -спектрометре.
Полученные результаты свидетельствуют о том, что полисахаридный комплекс слоевищ Фукуса пузырчатого содержит значительное количество уроновых кислот; они являются преобладающим компонентом. Кроме того, подтверждено наличие в составе полисахаридного комплекса глюкозы, ксилозы, рамнозы, арабинозы, мальтозы, что согласуется с данными денситометрического определения.
Для оценки содержания БАВ в ЛРС Фукуса разработаны методики их количественного определения. Сырье предложено характеризовать по содержанию суммы полисахаридов, суммы моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу, а также по содержанию йода.
Содержание суммы полисахаридов, определяемое методом гравиметрии в пересчете на абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах Фукуса пузырчатого (Fucus vesiculosus L.) составляет около 35,29 % (свежее сырье) и 27,60 % (высушенное сырье). Ошибка единичного определения c 95% вероятностью методики количественного определения суммы полисахаридов в ЛРС Фукуса не превышает 8,11% (табл.4).
| Таблица 4 | ||||||||
| Метрологические характеристики методики количественного определения полисахаридов в сырье Фукуса пузырчатого | ||||||||
| Xср | f | S2 | S | Sx | Px | t P,f) | Xср. | , % |
| ЛРС Фукуса пузырчатого (свежее сырье) | ||||||||
| 35,292 | 4 | 3,6407 | 1,9081 | 0,8533 | 0,95 | 2,78 | 2,3722 | 6,72 |
| ЛРС Фукуса пузырчатого (высушенное сырье) | ||||||||
| 27,602 | 4 | 3,2442 | 1,8012 | 0,8055 | 0,95 | 2,78 | 2,239 | 8,11 |
Для определения содержания суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу и абсолютно сухое сырье в исследуемых образцах Фукуса пузырчатого была разработана методика дифференциальной УФ-спектроскопии. На рис. 1 представлены спектры поглощения анализируемых компонентов моносахаров с пикриновой кислотой.
Рис. 1. – Спектры поглощения комплекса моносахаров с пикриновой кислотой: 1 – испытуемый раствор (из высушенных слоевищ); 2 – испытуемый раствор (из свежих слоевищ); 3 – стандартный образец глюкозы.
Оно составляет около 31,84 % (для свежего сырья) и около 27,78 % (для высушенного сырья).
Ошибка единичного определения c 95 % вероятностью методики количественного определения суммы моносахаров в пересчете на глюкозу в ЛРС Фукуса не превышает 4,69 % (табл. 5).
Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками глюкозы к сумме полисахаридов Фукуса пузырчатого (табл. 6).
| Таблица 5 | ||||||||
| Метрологические характеристики методики количественного определения суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу в сырье Фукуса | ||||||||
| Xср | f | S2 | S | Sx | Px | t P,f) | Xср. | , % |
| ЛРС Фукуса пузырчатого (свежее сырье) | ||||||||
| 31,844 | 4 | 0,28838 | 0,53701 | 0,2402 | 0,95 | 2,78 | 0,6676 | 4,69 |
| ЛРС Фукуса пузырчатого (высушенное сырье) | ||||||||
| 27,782 | 4 | 0,16142 | 0,40177 | 0,1797 | 0,95 | 2,78 | 0,4996 | 4,02 |
| Таблица 6 | |||||
| Результаты опытов с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров в высушенном сырье Фукуса | |||||
| Взято полисахаридов, г | Добавле но глюкозы (г) | Должно быть (г) | Найде но (г) | Ошибка | |
| Абсолют ная (г) | Относитель ная (%) | ||||
| 0,2812 | 0,0703 | 0,3515 | 0,3509 | – 0,0006 | ± 0,171 |
| 0,2812 | 0,1406 | 0,4218 | 0,4222 | + 0,0004 | ± 0,0947 |
| 0,2812 | 0,2109 | 0,4921 | 0,49017 | – 0,00193 | ± 0,394 |
| 0,2812 | 0,2812 | 0,5624 | 0,5628 | + 0,0004 | ± 0,0711 |
Опыты с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров показали, что относительная ошибка не превышает ошибки единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Содержание йода в пересчете на абсолютно сухое сырье, определяемого титриметрическим методом по ГОСТ 26185-84, составляет 0,886% (для свежего сырья) и около 0,780 % (для высушенного сырья).
Ошибка единичного определения c 95 % вероятностью методики количественного определения йода в ЛРС Фукуса не превышает 7,22 % (табл. 7).
| Таблица 7 | ||||||||
| Метрологические характеристики метода количественного определения йода в сырье Фукуса | ||||||||
| Xср | f | S2 | S | Sx | Px | t P,f) | Xср. | , % |
| ЛРС Фукуса пузырчатого (свежее сырье) | ||||||||
| 0,8864 | 4 | 0,000295 | 0,01717 | 0,007679 | 0,95 | 2,78 | 0,02135 | 5,38 |
| ЛРС Фукуса пузырчатого (высушенное сырье) | ||||||||
| 0,7800 | 4 | 0,00041 | 0,02025 | 0,00906 | 0,95 | 2,78 | 0,02517 | 7,22 |
Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками йода, относительная ошибка определения составила не более ± 0,175 %.
С помощью разработанных методик изучена динамика накопления полисахаридов и йода в ЛРС Фукуса. Полученные результаты свидетельствуют о том, что заготовку слоевищ Фукуса пузырчатого можно осуществлять в течение всего вегетационного периода, то есть с мая по сентябрь.
Результаты выполненных исследований по определению условий и сроков хранения ЛРС Фукуса позволяют сделать вывод о том, что высушенные слоевища Фукуса пузырчатого следует хранить не более 3 лет в сухом, защищенном от света месте при температуре не выше 15° С, а свежие слоевища Фукуса необходимо хранить не более 24 часов при температуре не выше 4° С в холодильной камере.
3. Фитохимическое исследование настоек гомеопатических матричных Fucus
Для получения НГМ Фукуса из свежего и высушенного ЛРС использовали методы 3 и 4а ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные», так как содержание сока в свежем и высушенном сырье составило менее 60 %, установлено наличие слизей. Изучение компонентного состава НГМ Фукус пузырчатого осуществляли с помощью методов ТСХ, ВЭЖХ, и дифференциальной спектроскопии в УФ-области спектра.
Анализ свободных моносахаров, содержащихся в НГМ Фукус, осуществляли методом ТСХ на пластинках Sorbfil «ПТСХ-П-А» размером 15х15 см. В качестве свидетелей применяли 0,05% спиртовые растворы аутентичных образцов моносахаров. Зоны адсорбции моносахаров обнаруживали опрыскиванием хроматограммы 0,5 % раствором тимола в 95 % этиловом спирте.
В табл. 8 представлены обобщенные данные по хроматографи-ческому анализу настоек гомеопатических матричных Фукус на содержание моносахаров.
| Таблица 8 | ||
| Величины Rs зон адсорбции испытуемых растворов и растворов СО моносахаров (по фруктозе) на хроматограммах НГМ Fucus | ||
| Хроматограмма СО моносахаров | Хроматограмма НГМ из свежего сырья | Хроматограмма НГМ из высушенного сырья |
| Вода-метанол-уксусная кислота безв.-этиленхлорид (10:15:25:50) | ||
| глюкоза | 0,82 | 0,80 |
| рамноза | 1,75 | 1,72 |
| галактоза | 0,76 | 0,72 |
| арабиноза | 1,84 | 1,80 |
| фруктоза | 1,0 | 1,0 |
Для уточнения результатов предварительного изучения состава свободных моносахаров в НГМ Фукус с помощью тонкослойной хроматографии проводили их исследование на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы "GILSON", ФРАНЦИЯ с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы "Мультихром для "Windows".
Оценка хроматограммы проводилась, по временам удерживания и площади пика, в автоматическом режиме, в условиях, аналогичных условиям проведения эксперимента для сырья Фукуса.
Подтверждено наличие в составе свободных сахаров глюкозы, галактозы, ксилозы, рамнозы, арабинозы, мальтозы, сахарозы и фруктозы.
Содержание суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу определяемое методом дифференциальной спектрофотометрии составляет около 5,94 % (для НГМ из свежего сырья) и около 4,37 % (для НГМ из высушенного сырья). Ошибка единичного определения c 95 % вероятностью методики количественного определения суммы моносахаридов в пересчете на глюкозу в НГМ Фукус не превышает 3,66 % (табл. 9).
Для подтверждения отсутствия систематической ошибки были проведены опыты с добавками глюкозы к НГМ из высушенного сырья Фукуса (табл. 10).
| Таблица 9 | ||||||||
| Метрологические характеристики методики количественного определения суммы связанных моносахаров в пересчете на глюкозу в НГМ Фукус | ||||||||
| Xср | f | S2 | S | Sx | Px | t P,f) | Xср. | , % |
| НГМ Фукуса пузырчатого (из свежего сырья) | ||||||||
| 5,9388 | 4 | 0,003751 | 0,06125 | 0,027391 | 0,95 | 2,78 | 0,07615 | 2,87 |
| НГМ Фукуса пузырчатого (из высушенного сырья) | ||||||||
| 4,3672 | 4 | 0,003313 | 0,05756 | 0,02574 | 0,95 | 2,78 | 0,07156 | 3,66 |
| Таблица 10 | |||||
| Результаты опытов с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров в НГМ из высушенного сырья Фукус | |||||
| Взято полисахаридов, г | Добавле но глюкозы (г) | Должно быть (г) | Найде но (г) | Ошибка | |
| Абсолют ная (г) | Относитель ная (%) | ||||
| 0,04455 | 0,01114 | 0,05569 | 0,05575 | + 0,00006 | ±0,108 |
| 0,04455 | 0,02228 | 0,06683 | 0,06678 | – 0,00005 | ±0,0748 |
| 0,04455 | 0,03342 | 0,07797 | 0,07802 | + 0,00005 | ±0,0641 |
| 0,04455 | 0,04455 | 0,08910 | 0,08901 | – 0,00009 | ±0,101 |
Опыты с добавками глюкозы для методики количественного определения суммы связанных моносахаров показали, что относительная ошибка не превышает ошибки единичного определения и имеет отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Содержание йода, определяемое титриметрическим методом, использованным для анализа ЛРС составляет около 0,184 % для НГМ из свежего сырья и около 0,149 % для НГМ из высушенного сырья. Ошибка единичного определения c 95% вероятностью методики количественного определения йода в НГМ Фукус не превышает соответственно 6,76 % (табл. 11).
| Таблица 11 | ||||||||
| Метрологические характеристики методики количественного определения йода в НГМ Фукус | ||||||||
| Xср | f | S2 | S | Sx | Px | t P,f) | Xср. | , % |
| НГМ Фукуса пузырчатого (из свежего сырья) | ||||||||
| 0,1844 | 4 | 0,000078 | 0,00883 | 0,00395 | 0,95 | 2,78 | 0,01098 | 5,95 |
| НГМ Фукуса пузырчатого (из высушенного сырья) | ||||||||
| 0,1494 | 4 | 0,000066 | 0,00812 | 0,00363 | 0,95 | 2,78 | 0,0101 | 6,76 |
Для подтверждения отсутствия систематической ошибки проведены опыты с добавками йода. Ошибка опытов с добавками не превышает ± 0,106 %.
4. Предварительная оценка фармакологической активности НГМ Fucus, их разведений а также моно- и полисахаридных комплексов.
Первичный скрининг по определению биологической активности анализируемых объектов проводили с помощью запатентованных биотест-систем в опытах in vitro в НИЦ БМТ ВИЛАР.
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют об активации антиоксидантных ферментов: супероксиддисмутазы (СОД), каталазы (КАТ) и глютатионпероксидазы (ГП) с помощью настоек Fucus, а также разведений НГМ и фракций поли- и моносахаров, содержащихся в НГМ. Почти для всех изученных гомеопатических образцов (исключение составляет влияние свободных моносахаров на скорость СОД – реакции) в активности ферментов имеется выраженный максимум, соответствующий оптимальной концентрации вещества, а увеличение или уменьшение концентрации приводит к снижению эффекта. Матричные настойки, изначально имеющие высокую концентрацию действующих веществ, как правило, ингибирует скорость реакций ферментов антиоксидантной защиты. Поэтому, тестирование только настоек может вызвать представление о направленности фармакологического действия гомеопатического препарата, который обычно применяется в виде потенцированных растворов.
Тестирование с помощью биотест-систем в опытах in vitro показало, что матричные настойки и их разведения, полученные из высушенных слоевищ Фукуса, оказывают более выраженный эффект на ферменты антиоксидантной защиты. При этом, препараты из высушенных слоевищ значительно сильнее по сравнению с контролем увеличивают скорости СОД-, КАТ- и ГП-реакций, чем препараты из свежих слоевищ.
Поли- и моносахариды, содержащиеся в ЛРС и НГМ, в большей степени активируют ферменты СОД, ГП и КАТ, чем настойки гомеопатические матричные и их разведения. При этом они, в отличие от настоек, приготовленных из высушенных и свежих слоевищ, практически не оказывают влияния на скорость ГР-реакции.
Полученные результаты свидетельствуют о наличии у анализируемых объектов выраженной антиоксидантной активности и способности оказывать влияние на липидный обмен.
5. Разработка показателей качества и установление срока годности ЛРС, НГМ Fucus vesiculosus. Анализ гомеопатических разведений.
Для контроля качества ЛРС Фукуса пузырчатого предложены следующие показатели: описание ЛРС, диагностически значимые признаки, качественные реакции, числовые показатели, количественное определение БАВ – суммы полисахаридов, суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу и содержание йода.
Предложены следующие нормативы: влажность для свежего сырья – не менее 50 %, для высушенного сырья – не более 12 %; содержание золы общей не более 14 %; золы, не растворимой в 10 % хлористоводородной кислоте - не более 4 %; содержание минераль-ной и органической примеси не более 1,5 %; содержание суммы полисахаридов – не менее 28 %; содержание суммы моносахаридов после гидролиза (в пересчете на глюкозу) – не менее 27 %; содержание йода – не менее 0,50 %.
Предлагается установить срок годности высушенного ЛРС 3 года, срок использования свежего ЛРС – 24 часа.
Контроль качества НГМ Фукус регламентируется по следующим показателям: состав настойки; описание; критерии подлинности; сухой остаток, содержание спирта; плотность; тяжелые металлы; микробиологическая чистота; количественное определение суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу; содержание йода; срок годности.
Разработка показателей качества настойки проводилась на пяти сериях препарата. Критерии подлинности настоек включают реакции на углеводы с реактивом Фелинга (выпадение красно-оранжевого осадка, указывающее на наличие восстанавливающих сахаров); с дифениламином в кислой среде (на кетогруппу в углеводном остатке), а также с помощью метода ТСХ.
Хроматография в тонком слое сорбента проводится на пластинках Sorbfil «ПТСХ-П-А» размером 15х15 см. В качестве свидетелей применяли 0,05% спиртовые растворы аутентичных образцов моносахаров. Зоны адсорбции моносахаров обнаруживали опрыскиванием хроматограммы 0,5 % раствором тимола в 95 % этиловом спирте.
Содержание сухого остатка должно быть не менее 0,4 %, плотность – в пределах от 0,8325 до 0,8350. Содержание тяжелых металлов составляет не более 0,001%.
Количественное определение суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу было проведено по разработанной нами методике; в НГМ Фукус пузырчатого содержание должно быть не менее 4 %.
В настойках проведено испытания на микробиологическую чистоту. Результаты испытаний показали, что в 1 мл препаратов содержание сапрофитных форм бактерий не превышает 10. Бактерии сем. Enterobaceriaceae, St. aureus, Ps. aeruginosa не обнаружены. Настойки соответствуют требованиям, предъявляемым к данной лекарственной форме.
Нами проведено изучение состояния НГМ Фукус пузырчатого в процессе естественного хранения по всем показателям качества, регламентируемым проектом ФС. Срок годности НГМ Фукус установлен 2 года. Наблюдение за настойками в процессе хранения продолжаются.
Для оценки подлинности гомеопатических разведений Fucus, которые применяется в гомеопатической практике в качестве монопрепаратов, и для изготовления комплексных лекарственных средств, использованы качественные реакции и испытание методом ТСХ, при этом важным является установление наличия веществ, обуславливающих терапевтический эффект, в том числе моносахаров. Разведения настоек Fucus готовили по правилам гомеопатической технологии (ОФС 42-0027-05 «Настойки гомеопатические матричные»).
Первое десятичное (1D) разведение Fucus представляет собой прозрачную жидкость красно-коричневого цвета, со своеобразным запахом. Второе десятичное разведение (2D) - прозрачная жидкость светло-коричневого цвета практически без запаха; третье десятичное разведение (3D) - жидкость бледно-желтого цвета, спиртового запаха и четвертое десятичное разведение (4D) - бесцветная жидкость спиртового запаха.
Подлинность первого, второго, третьего, четвертого и последующих десятичных разведений (1D, 2D, 3D, 4D и т.д.) фукуса пузырчатого предлагается устанавливать спектрофотометрическим методом.
Проведенные нами исследования позволили установить, что разведения до D7 имеют характерный УФ-спектр поглощения, который в дальнейшем может быть использован для оценки подлинности препаратов (рис. 2). Кроме того, могут быть использо-ваны реакции подлинности на присутствие моносахаров с последующим снятием спектра в УФ-свете (рис. 3). Для оценки количественного содержания свободного и связанного йода, а также полисахаридов могут быть использованы методики, предложенные для анализа НГМ Фукус.
Рис. 2. – УФ-спектр D7 разведений НГМ Фукус
Рис. 3. – УФ-спектр фракции моносахаров
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
- Проведен товароведческий анализ ЛРС Фукуса, установлены диагностически значимые микроскопические признаки сырья «Фукуса пузырчатого слоевища», определены числовые показатели для ЛРС Фукуса.
- С помощью методов физико-химического анализа (ТСХ, ВЖХ, ЯМР С13-спектроскопии и др.) изучен в сравнительном аспекте углеводный состав ЛРС Фукуса, как свежего, так и высушенного, и НГМ, изготовленных из него.
- Разработаны методики количественного определения суммы связанных моносахаров после гидролиза в пересчете на глюкозу в слоевищах Фукуса пузырчатого свежих и высушенных и НГМ Фукус с помощью метода дифференциальной УФ-спектрофотометрии, а также содержания йода с помощью титриметрического метода.
- По результатам предварительной оценки фармакологической активности НГМ Fucus определено, что настойки гомеопатические матричные слоевищ Фукуса пузырчатого, их разведения, а также моно- и полисахаридные фракции, выделенные из них, обладают выраженной антиоксидантной активностью.
- Установлен срок годности высушенного ЛРС Фукуса – 3 года, срок использования свежего сырья Фукуса – 24 часа, НГМ – 2 года.
- По результатам исследований разработаны проекты ФС на ЛРС Фукуса: «Фукуса пузырчатого слоевища свежие» и «Фукуса пузырчатого слоевища»; а также на НГМ Фукуса: «Fucus vesiculosus настойка гомеопатическая матричная» и «Fucus vesiculosus D1 настойка гомеопатическая матричная» предназначенных для включения в Государственную гомеопатическую фармакопею РФ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Сокольская Т.А., Саканян К.М., Фукус пузырчатый (Fucus vesiculosus L.) в отечественной гомеопатической практике и методы оценки качества в гомеопатической практике //Тезисы докладов XVI Московской международной гомеопатической конференции, Москва, 27–29 января 2007 г., С. 119-120.
- Саканян К.М., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Определение показателей качества настойки матричной гомеопатической Фукус //Сборник материалов региональной научно-практичес-кой конференции с международным участием, посвященной 40-летию фармацевтического факультета КГМУ, Курск, 15 декабря 2007 г., С. 312-314.
- Саканян К.М., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Fucus vesiculosus L. и его применение в традиционной, народной и официнальной медицине //Сборник научных трудов конгресса «Традиционная медицина», Москва, 1–3 марта 2007 г., С. 82-85.
- Саканян К.М., Сокольская Т.А., Даргаева Т.Д. Изучение анатомо-диагностических признаков лекарственного раститель-ного сырья – Фукуса пузырчатого слоевищ (Fucus vesiculosus L.) //Сборник научных трудов «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции», Пятигорск, 2007 г., С. 106-108.
- Саканян К.М., Даргаева Т.Д., Сокольская Т.А. Анализ и стандартизация настойки матричной гомеопатической Фукус //Вестник Бурятского Государственного университета, Улан-Удэ, 2007 г., вып. 8, С. 25-29.
- Саканян К.М., Еникеева Р.А., Гаккель В.А., Сокольская Т.А. Некоторые гомеопатические препараты в отечественной медицинской практике //Вестник Российской Военно-медицинской академии, С-Пб., 2007 г., №1 (17), С. 480-481.
- Саканян К.М. Настойка Фукус и методы ее стандартизации //Сборник научных трудов «Российский гомеопатический съезд», Москва, 19–21 октября 2007 г., С.216-217.
