Фармакогностическое изучение видов рода alchemilla l. пермского края
На правах рукописи
Зорина Елена Владимировна
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ВИДОВ
РОДА ALCHEMILLA L. ПЕРМСКОГО КРАЯ
Специальность 15.00.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
А В Т О Р Е Ф Е Р А Т
диссертации на соискание учёной степени
кандидата фармацевтических наук
ПЕРМЬ – 2009
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
кандидат фармацевтических наук, профессор Олешко Григорий Иванович
Официальные оппоненты:
заслуженный работник
доктор фармацевтических наук, профессор Фурса Николай Сергеевич, ГОУ ВПО «Ярославская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
кандидат фармацевтических наук, доцент Калина Милитина Александровна, ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Ведущая организация:
Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится 16 июня 2009 года в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГОУ ВПО ПГФА Росздрава по адресу 614990, г. Пермь, ул. Ленина, 48. Тел. (3422) 129-006, 123-445; Факс (3422) 129-476.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ПГФА
Росздрава по адресу: 614070 г. Пермь, ул. Крупской, 46.
Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА
http://www. psfa.ru 15 мая 2009 г
Автореферат разослан 15 мая 2009 г.
Учёный секретарь
диссертационного совета,
кандидат фармацевтических наук, доцент И.А. Липатникова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Одной из глобальных медико-социальных проблем мирового здравоохранения является стремительный рост распространения сахарного диабета. Экспертами ВОЗ сахарный диабет был признан неинфекционной эпидемией ХХ века. Сахарный диабет поражает большое число людей всех социальных групп во всем мире, им страдают от 1,5 до 5% населения планеты. Экспертная прогностическая оценка позволяет считать, что к 2010 году в мире будет насчитываться более чем 230 млн., а к 2025 году – 300 млн. больных сахарным диабетом, из которых 80–90% приходится на больных диабетом 2-го типа.
Поиск и разработка новых высококачественных и безопасных препаратов для лечения и профилактики сахарного диабета – одна из актуальных задач современной фармацевтической науки.
Фармакотерапевтическая активность фитопрепаратов обусловлена гармоничным сочетанием биологически активных веществ. Гипогликемическую активность обусловливают флавоноиды, которые способствуют увеличению ионов кальция, и стимуляции секреции инсулина -клетками поджелудочной железы; аскорбиновая кислота, потенцирующая сахароснижающий эффект флавоноидов; полисахариды препятствующие всасыванию углеводов в кишечнике. Эти группы веществ, а также полифенольные соединения оказывают противовоспалительный, диуретический, антигипоксический и другие эффекты важные в комплексной терапии сахарного диабета.
Растения рода Alchemilla L. перспективны для изучения в данном аспекте. Они широко распространены на территории Европейской части России, в том числе Пермского края, который является одним из центров видообразования рода.
Цель исследования – изучение возможности использования в медицинской практике травы манжетки и фитопрепаратов из неё в качестве противодиабетических средств.
Задачи исследования:
- Изучить морфолого-анатомические признаки и фитохимические характеристики видов манжетки в Пермском крае, объективно представляющих род Alchemilla L.
- Исследовать эколого-ценотические характеристики манжетки обыкновенной, приёмы и сроки заготовки, и динамику накопления биологически активных веществ (БАВ) сырья для разработки «Инструкции по заготовке и сушке травы манжетки». Обосновать возможности и перспективы заготовки и запасы сырья манжетки в Пермском крае
- Изучить товароведческие показатели, разработать методику количественного определения БАВ травы манжетки для проекта фармакопейной статьи «Alchemillae herba» – «манжетки трава».
- Определить оптимальные условия получения экстракта травы манжетки сухого и разработать проект нормативной документации – ФСП на экстракт травы манжетки сухой.
- Изучить фармакологическую активность травы манжетки и экстракта травы манжетки сухого.
Научная новизна. Проведено комплексное фармакогностическое исследование нового вида сырья – трава манжетки.
Выявлены диагностические признаки в морфолого-анатомическом строении вегетативных и генеративных органов 20 видов рода Alchemilla L. и содержащиеся в них БАВ: флавоноиды, полисахариды, аскорбиновая кислота, окисляемые вещества
Изучена динамика накопления в траве манжетки БАВ, в том числе свободных аминокислот в течение вегетационного периода. Изучено влияние сезонного изменения морфометрических показателей на содержание БАВ в траве манжетки.
Определены запасы сырья и выявлены перспективы заготовки травы манжетки в Пермском крае. Исследована возможность использования отавы в качестве дополнительного источника сырья манжетки.
Выявлена гипогликемическая и гиполипидемическая активность настоя и экстракта травы манжетки сухого. Выявлено иммунокорригирующее действие настоя и экстракта травы манжетки сухого, развитие которого связано с их способностью восстанавливать фагоцитоз, уровень Т- и В-лимфоцитов, экспрессию рецепторов иммунокомпетентных клеток. Приоритет проведённых исследований подтверждён Патентом РФ на изобретение (Заявка на выдачу патента № 2008100346/15(000378), решение от 28.11.2008г.)
Практическая значимость.
Научно обоснована возможность заготовки травы манжетки от сборного вида Alchemilla vulgaris L. и использования травы манжетки в качестве лекарственного средства и сырья для получения экстракта травы манжетки сухого.
Разработан проект «Инструкции по заготовке и сушке травы манжетки».
Определены ресурсы травы манжетки и перспективы её заготовки в Пермском крае.
Разработана и валидирована методика количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки. Методика адаптирована для сквозной стандартизации настоя и экстракта травы манжетки сухого.
Установлены параметры стандартизации травы манжетки, показатели качества включены в проект ФС «Alchemillae herba» – «манжетки трава».
Получена субстанция «экстракт травы манжетки сухой», установлены параметры её стандартизации, установлена гипогликемическая, иммунокоррегирующая и гиполипидемическая активность. Показатели качества включены в проект ФСП «Extractum herbae Alchemillae siccum» – «Экстракт травы манжетки сухой». Разработан лабораторный технологический регламент получения экстракта травы манжетки сухого. Проведена апробация получения экстракта травы манжетки сухого на ООО «Биохиммаш», г. Москва.
Результаты проведённых исследований используют в учебном процессе кафедры фармакогнозии, на факультете дополнительного профессионального образования, в интернатуре ГОУ ВПО ПГФА Росздрава и в качестве лекционного материала – в отделении повышения квалификации фармацевтов ГОУ ДПО Пермского областного центра повышения квалификации работников здравоохранения.
Положения, выносимые на защиту:
- фитохимический анализ и валидация методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки;
- товароведческий анализ травы манжетки;
- исследования динамики накопления БАВ травы манжетки;
- исследования сырьевой базы травы манжетки в Пермском крае;
- фитохимический анализа настоя и экстракта травы манжетки сухого и его стандартизация;
- изучение фармакологической активности настоя и экстракта травы манжетки.
Публикация материалов исследования и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе монография и патент. Материалы диссертационной работы представлены на научно – практических конференциях профессорско-преподавательского состава Пермской государственной фармацевтической академии (Пермь 2005, 2006, 2007гг.), на международной (Российско-Китайской) научной конференции (Пермь 2007 г); на международном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва 2003, 2004 гг.)
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО ПГФА Росздрава в соответствии с планом научно-исследовательских работ по теме «Изучение лекарственной флоры РФ» (номер Государственной регистрации 01.9.10.018875). Тема утверждена на заседании Учёного совета Пермской государственной фармацевтической академии (протокол № 3 от 24 ноября 2005 г).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на 200 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (6 глав), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована 30 рисунками и 106 таблицами. Список литературы включает 245 источников, в том числе 10 – на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.
В обзоре литературы (глава 1) обобщены данные о современном состоянии исследований химического состава, морфологической характеристики, фармакологической активности и условий произрастания видов рода Alchemilla L.
Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования.
В главе 3 приведены данные сравнительной характеристики видов рода Alchemilla L. по морфолого-анатомическому строению и химическому составу.
В главе 4 изложены материалы по разработке «Инструкции по заготовке и сушке травы манжетки».
В главе 5 приведены исследования по разработке проекта Фармакопейной статьи «Alchemillae herba» – «манжетки трава».
В главе 6 приведены исследования по разработке технологии получения экстракта травы манжетки сухого и его стандартизация.
В главе 7 представлены материалы по гипогликемической, иммуномодулирующей и гиполипидемической активности настоя и экстракта травы манжетки сухого.
Приложение включает проекты ФС«Alchemillae herba» – «манжетки трава», ФСП «Extractum herbae Alchemillae siccum» – «Экстракт травы манжетки сухой» и материалы, подтверждающие практическую значимость проведённых исследований.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объектами исследования служили около 200 чистых и смешанных образцов различной степени встречаемости видов манжетки, объективно представляющих род Alchemilla L. в Пермском крае. Заготовку проводили в с 2001 по 2007 гг., сушили воздушно-теневым способом, хранили в соответствии с требованиями ГФ ХI в.1, стр. 296. Семь образцов сырья использовали для разработки товароведческих показателей, а также водные, водно-этанольные извлечения из травы манжетки, хлороформные, этилацетатные фракции из экстракта травы манжетки сухого, полученные в условиях лаборатории, и субстанция «экстракт травы манжетки сухой», полученная на ОАО «Биохиммаш», г. Москва.
Для проведения качественного фитохимического анализа использовали химические реакции, методы восходящей хроматографии на бумаге и УФ-спектрофотометрии.
Количественное определение основных групп БАВ проводили: флавоноидов в пересчёте на рутин методом дифференциальной спектрофотометрии; полисахаридов гравиметрическим методом; аскорбиновой кислоты и суммы окисляемых веществ титриметрическим методом по ГФ XI, вып. 1, 2. Содержание суммы свободных аминокислот определяли по методике, разработанной совместно с д.ф.н., профессором Ярыгиной Т.И. (Заявка на выдачу патента № 2009111168(015134), решение от 26. 03. 2009 г.)
Изучение элементного состава травы манжетки и экстракта травы манжетки сухого проводили с помощью дифракционного спектрографа ДФС-13-1 методом атомно-адсорбционной пламенной спектрометрии в аккредитованном аналитическом испытательном центре ОАО «Уральская центральная лаборатория», г. Екатеринбург.
Ресурсоведческие исследования проводили методом работы на конкретных зарослях.
Изучение товароведческих показателей проводили в соответствии с требованиями ГФ XI и ОСТ 91500.05.001–00 «Стандарты качества лекарственных средств».
Экстракт травы манжетки сухой получали на ОАО «Биохиммаш», г. Москва, по разработанной нами технологии.
Изучение показателей качества экстракта сухого проводили в соответствии с требованиями общей статьи «Экстракты» (ГФ XI, вып. 2, с. 160).
Изучение микробиологической чистоты травы манжетки и экстракта проводили на кафедре микробиологии ГОУ ВПО ПГФА Росздрава (зав. каф., проф., д.ф.н.. Одегова Т.Ф.)
Изучение гипогликемической, гиполипидемической и иммунокоррегирующей активности настоя и экстракта травы манжетки проводили под руководством проф., д.м.н. Юшковой Т.А. на кафедре фармакологии ГОУ ВПО ПГФА Росздрава (зав. каф., проф., д.м.н. Юшков В.В.).
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИДОВ РОДА Alchemilla L.
В результате макроскопического исследования на образцах 20 видов манжетки установили видовую принадлежность и выделили признаки, очерчивающие границы видов. Это характер опушения стеблей и черешков прикорневых листьев; форма, степень вырезанности и опушение листовой пластинки; форма и количество лопастей листа; число, форма зубцов лопастей листовой пластинки; консистенция и характер опушения соцветия; форма, опушение и окраска гипантия, листьев чашечки и подчашия. Подтвердили сложность видовой идентификации растений и то, что изменение диагностических признаков после сушки делает определение подлинности сырья по видам практически невозможным. Микроскопически исследованные виды манжетки имели общий план анатомического строения стебля, черешка, листовой пластинки и цветка.
Детальное изучение морфолого-анатомических признаков видов рода Alchemilla L. позволило выделить наиболее часто встречаемые признаки рода и с учетом их вариабельности составить описание внешних и микроскопических признаков сборного вида Alchemilla vulgaris L.
Рис. 1. Схема совмещенной хроматограммы спиртоводных извлечений
травы манжетки 20 видов рода Alchemilla L.
(1-е направление – система 1- Б:У:В - 4:1:2; 2-е направление – система 2–У:В – 15:85)
Таблица 1
Характеристика пятен веществ на двумерных хроматограммах видов манжеток
| № пятна вещества | Rf * в системах | Окраска пятен веществ | Максимумы поглощения доминирующих веществ при длине волны, нм | ||||
| Б:У:В | У:В | УФ-свет | УФ + пары аммиака | после обработки AlCl3 | |||
| видимый свет | УФ-свет | ||||||
| 1 | 0,35 | 0,03 | фиолетовое | белое | светло-желтое | лимонно-желтое | 257 и 367 |
| 2 | 0,41 | 0,13 | коричневое | желтое | желтое | лимонно-желтое | 207 и 278 |
| 3 | 0,37 | 0,41 | ярко-желтое | ярко-желтое | ярко-желтое | ярко-желтое | 278 и 373 |
| 4 | 0,57 | 0,37 | коричневое | желтое | желтое | желто-коричнев. | 258 и 362 |
| 5 | 0,75 | 0,53 | фиолетовое | голубое | – | голубое | |
| 6 | 0,59 | 0,54 | фиолетовое | голубое | – | голубое | |
| 7 | 0,63 | 0,79 | фиолетовое | голубое | – | голубое | 205 и 271 |
| 8 | 0,17 | 0,70 | тёмное | желто-зеленое | ярко-желтое | ярко-желтое | |
| 9 | 0,24 | 0,63 | темное | желтое | желтое | желтое | |
| 10 | 0,20 | 0,55 | темное | желтое | желтое | желтое | |
| 11 | 0,52 | 0,18 | желтое | светлое | светло-желтое | голубое | |
| 12 | 0,54 | 0,20 | фиолетовое | голубое | светло-желтое | голубое | |
| 13 | 0,62 | 0,71 | фиолетовое | голубое | – | коричневое | |
| 14 | 0,11 | 0,24 | темное | зеленое | желтое | коричневое | |
| 15 | 0,11 | 0,80 | темное | темное | – | – | |
| 16 | 0,22 | 0,12 | темное | желтое | желтое | лимонно-желтое | |
*Примечание: даны средние значения величины.
Все исследованные образцы манжетки давали положительную реакцию на флавоноиды, полисахариды, аскорбиновую кислоту и дубильные вещества. Качественные реакции и одномерная хроматография на бумаге в системах 1 и 2 показали идентичность исследуемых видов манжеток. Методом двухмерной восходящей хроматографии на совмещённой хроматограмме 20 видов манжеток обнаружили не менее 16 веществ фенольной природы, 11 из которых по значению Rf и изменению окраски пятен предварительно отнесены нами к флавоноидам (рис. 1, табл. 1). Вещества с 1 по 10 и 16 присутствовали во всех видах, из них доминировали 1, 2, 3, 4 и 7. Вещества с 11 по 15 являются маркерами видов рода Alchemilla L. (табл. 2).
Максимальное содержание флавоноидов – 4,00% наблюдали в образцах манжетки сарматской, минимальное – 2,18% в м. Линдберга и м. коротколопастной. Содержание полисахаридов колебалось от 7,20% в м. остроугольной до 10,02% в м. шершавостебельной. Концентрация аскорбиновой кислоты составила от 0,13% в м. остроугольной и м. семиугольной, до 0,23% в м. замедленной. Сумма окисляемых веществ находилась в пределах от 8,12% в м. тонкопильчатой до 11,38% в м. коротколопастной. Статистический анализ не выявил достоверных различий между видами манжеток по содержанию флавоноидов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты и суммы окисляемых веществ (табл. 2). Установили близость качественного состава фенольного комплекса (одним из доминирующих компонентов которого является рутин) и количественного содержания флавоноидов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты и суммы окисляемых веществ в образцах видов манжеток.
Полученные данные по морфологии, анатомии, химическому составу согласуются с данными единичных определений других видов манжеток Пермского края и литературными данными по другим регионам, что позволяет объединить виды рода Alchemilla L. под названием Alchemilla vulgaris L., как производящего растения для заготовки сырья «Alchemillae herba».
Таблица 2
Количественное содержание БАВ в видах манжетки
| № п.п | Вид манжетки | Содержание БАВ, % | |||
| сумма флавоноидов | сумма окисляемых веществ | полисахариды | аскорбиновая кислота | ||
| 1. | Манжетка клобучковая Alchemilla glomerulans Bus. | 2,40±0,12 | 9,97±0,11 | 8,18±0,61 | 0,14±0,003 |
| 2. | М. остроугольная = М. остролопастная A. acutangula Bus.= A. acutiloba Opiz | 2,85±0,08 | 8,25±0,03 | 7,20±0,10 | 0,13±0,001 |
| 3. | М. замедленная A. cunctatrix Juz. | 2,81±0,10 | 10,03±0,15 | 8,24±0,32 | 0,23±0,0015 |
| 4. | М. сизоватая A. glaucescens Wallr. | 2,20±0,06 | 8,76±0,07 | 8,16±0,24 | 0,15±0,003 |
| 5. | М. горная = М. пастушья A. monticola Opiz = A. pastoralis Bus. | 3,30±0,05 | 8,25±0,01 | 9,30±0,09 | 0,15±0,005 |
| 6. | М. семиугольная A. heptagona Juz. | 2,50±0,07 | 9,20±0,04 | 8,70±0,18 | 0,13±0,002 |
| 7. | М. сибирская A. sibirica Zam. | 3,71±0,05 | 9,89±0,05 | 8,76±0,43 | 0,20±0,004 |
| 8. | М. городковатая A. subcrenata Bus. | 2,62±0,11 | 10,53±0,25 | 8,54±0,21 | 0,19±0,003 |
| 9. | М. неправильная A. irregularis Alech. | 2,99±0,02 | 9,01±0,14 | 8,54±0,34 | 0,16±0,003 |
| 10. | М. шершавостебельная A. hirsuticaulis Lindb. fil. | 3,23±0,04 | 8,77±0,13 | 10,02±0,33 | 0,17±0,002 |
| 11. | М. голообразная A. glabriformis Juz. | 2,77±0,10 | 10,21±0,12 | 7,98±0,92 | 0,15±0,003 |
| 12. | М. тупая A. obtusa Bus. ( A. samuelssonii Rothm. Ex Frohner) | 2,20±0,06 | 8,88±0,15 | 9,12±0,11 | 0,19±0,003 |
| 13. | М. острозубчатая = М. балтийская A. acutidens Lindb.fil.= A. baltica Sam. ex Juz. (A. nebulosa G. Sam.) | 3,74±0,13 | 9,81±0,06 | 8,47±0,23 | 0,21±0,003 |
| 14. | М. коротколопастная A. breviloba Lindb. fil. | 2,18±0,05 | 11,38±0,32 | 8,30±0,22 | 0,22±0,003 |
| 15 | М. Линдберга A. lindbergiana Juz. | 2,18±0,06 | 8,29±0,10 | 8,02±0,86 | 0,20±0,004 |
| 16 | М. изящная A. gracilis Opiz | 3,02±0,11 | 9,60±0,12 | 8,99±0,61 | 0,14±0,003 |
| 17 | М. волнистолистная A. cymatophylla Juz. | 2,58±0,04 | 9,02±0,08 | 9,66±0,19 | 0,15±0,003 |
| 18 | М. тонкопильчатая A. argutiserrata Lindb. fil. | 3,20±0,06 | 8,12±0,17 | 8,33±0,12 | 0,18±0,002 |
| 19 | М. голая A. glabra Neyg. (A. alpestris auch., non F.W.Schmidt) | 3,56±0,03 | 9,05±0,13 | 8,52±0,33 | 0,20±0,003 |
| 20 | М. сарматская = М. щетинковатая A. sarmatica Juz. = A. strigosula Lindb. fil. | 4,00±0,12 | 10,50±0,06 | 8,02±0,54 | 0,16±0,003 |
| М. обыкновенная = A. vulgaris L. (сборный вид = смешанные образцы) | 2,14 – 4,81 | 8,34–14,12 | 7,42 – 14,46 | 0,13 – 0,24 | |
ИЗУЧЕНИЕ ДИНАМИКИ НАКОПЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ
СОЕДИНЕНИЙ В ТРАВЕ МАНЖЕТКИ
Вегетативные и генеративные органы манжетки отличаются по общему качественному составу фенольных соединений. При этом наибольший спектр веществ отмечали на хроматограммах у цветков (до 21), наименьший у осевых органов растения (12). Это объясняется специфическими особенностями физиологических функций каждого из исследованных органов манжетки и согласуется с литературными данными по другим растениям.
Доля флавоноидов в общем качественном составе фенольных соединений в органах преобладала. В стеблях и черешках флавоноиды составили 91%, в цветках – 86%, в листьях – 63%. Из числа доминирующих компонентов на хроматограммах листьев и цветков идентифицировали рутин.
Во всех органах манжетки обыкновенной содержатся флавоноиды; наибольшее содержание их наблюдали в цветках (до 4,11%) и листьях (до 3,76%), наименьшее в стеблях (до 1%) и черешках (до 0,99%). Достоверные отличия в содержании флавоноидов в органах манжетки учтены нами при разработке числовых показателей проекта ФС.
Наблюдали сезонную зависимость качественного состава фенольных соединений по фазам вегетации растения.
В начале вегетации и в период бутонизации доля флавоноидов в качественном составе фенольных соединений практически не претерпевала изменений и составила 44, 43% соответственно. К цветению она достигала максимума – 56% и далее снижалась к фазе созревания плодов до 44%. На хроматограммах фаз вегетации в числе доминирующих веществ идентифицирован рутин.
Содержание флавоноидов в образцах манжетки, заготовленных в разные периоды вегетации растения, находилось в пределах от 2,00% до 3,82%. Концентрация флавоноидов по среднему показателю в фазу бутонизации (3,09 %) превышала незначительно аналогичный показатель в фазах начала вегетации (2,94%), цветения (2,51%) и плодоношения (2,74%). Статистически результаты не имеют достоверных отличий между собой, что позволяет вести заготовку сырья от растений, находящихся в различных фенологических фазах развития.
Наблюдали два цикла развития манжетки (рис. 3). Первый цикл – с мая до середины июля, когда растение проходило все фазы вегетации до увядания. Второй цикл с середины июля до конца вегетации характеризовался появлением молодых побегов, первоначально прикорневыми листьями и в дальнейшем развитием стеблей с листьями и соцветиями.
Содержание действующих веществ в образцах манжетки на фоне изменения морфометрических показателей (рис. 2), составило: флавоноидов от 2,49 до 4,01 %, полисахаридов от 6,99 до 8,76 %, суммы окисляемых веществ от 7,79 до 12,52 % (рис. 3 А).
Содержание аскорбиновой кислоты варьировало от 0,13 до 0,38 %, резкое снижение её содержания с 0,28 до 0,18 % наблюдали после заморозков (рис. 3 Б).
Рис. 2. Динамика массовой доли надземных органов манжетки в образцах сырья, заготовленного в течение вегетационного периода подекадно
В образцах с большей долей листовых пластинок и соцветий наблюдали увеличение содержания БАВ; при возрастании доли стеблей или черешков в сырье манжетки, их содержание снижалось.
Статистический анализ не выявил достоверных различий в содержании БАВ травы манжетки при подекадном сборе. Т.е. изменение доли соцветий и листьев, а также стеблей и черешков не оказывает существенного влияния на содержание флавоноидов, полисахаридов, окисляемых веществ, аскорбиновой кислоты, что благоприятно для заготовки сырья в любую декаду кроме периода заморозков.
В траве манжетки методом восходящей хроматографии на бумаге обнаружили 10 свободных аминокислот, в том числе валин, лейцин, изолейцин, метионин, треонин, аланин, глицин, серин, глутаминовая и аспарагиновая кислота. Присутствие в траве манжетки аланина, глутаминовой и аспарагиновой кислот согласуются с литературными данными.
Динамика содержания аминокислот в сырье манжетки в целом совпадает с таковой для ведущих групп БАВ. Но прослеживается более чётко.
В цветках манжетки накапливалось максимальное содержание свободных аминокислот (в среднем 0,89%). Далее оно уменьшалось в ряду листья (0,74%) > черешки (0,62%) > стебли (0,42%).
Прослеживали явную тенденцию к возрастанию концентрации аминокислот в траве манжетки от фазы начала вегетации к цветению. В период плодоношения наблюдали резкое снижение их концентрации почти вдвое.
При подекадной заготовке сырья в течение периода вегетации максимальные концентрации аминокислот манжетки отмечали в начале циклов развития: 2,41% – в первом цикле и 1,95% – во втором. Это связано с началом ростовых процессов, когда метаболизм аминокислот направлен главным образом на синтез белка (Рис. 3 В). Колебания содержания суммы свободных аминокислот в течение вегетационного периода манжетки были тесно связаны с развитием листовых пластинок. Причём, в первом цикле развития это стеблевые листья, по мере уменьшения их роста и доли в сырье с 21 до 6,5%, уменьшалось содержание аминокислот с 2,41 до 0,60%, во втором – листья прикорневой розетки, при их росте и увеличении доли в сырье количество аминокислот повышалось с 0,60 до 1,95%.
Дальнейшее развитие листьев манжетки второго цикла в осенний период сопровождалось снижением концентрации свободных аминокислот до 0,67% и последующим возрастанием их содержания до 0,97% в образце, заготовленном после заморозков.
Содержание флавоноидов в траве манжетки существенно зависело от условий места произрастания. Так, внутри зоны №1 наибольшее содержание данной группы соединений (5,48%) обнаружено в образце Юсьвенского района, характеризующегося дерново-сильноподзолистыми почвами и пихтово-еловой-травяно-кустарничковой растительностью; наименьшее (2,18%) в образце Соликамского района с дерново-кислыми почвами и сосновыми с берёзой лесами (табл. 3). Колебания содержания флавоноидов прослеживали в образцах внутри других ботанико-географических зон.
Варьирование показателей содержания полисахаридов, окисляемых веществ и аскорбиновой кислоты внутри каждой зоны находилось в пределах ошибки опыта и не имело существенных различий. Средние значения концентраций БАВ манжетки по зонам имеют близкие значения, что позволяет говорить об отсутствии зональной зависимости (табл. 4).
Таким образом, в образцах травы манжетки, заготовленных на территории Пермского края обнаружили значительный потенциальный запас групп активных соединений. В целом, содержание флавоноидов составило от 2,0 до 5,0%, полисахаридов – от 6,5 до 16,0%, окисляемых веществ – от 8,10 до 14,1 %, аскорбиновой кислоты – от 0,1 до 0,2%.
В исследованных образцах травы манжетки обнаружили эссенциальные и условно эссенциальные микроэлементы, их концентрации уменьшались в ряду: Mn (75,9-491,5 мг/кг)> Zn > Cu > V > Cr > Ni > Pb > Co > Mo > Sn (0,15-0,21 мг/кг). Содержание элементов, отражающих антропогенную нагрузку на растительные объекты, уменьшалось в ряду: Ti (113,7-515,0 мг/кг)>Sr >Ba >Zr >Y >Nb >W >Sc >Ga >Yb >Bi > Ag (0,01-0,08 мг/кг).
Содержание свинца (0,68-2,06мг/кг) в образцах не превышало предельно допустимые концентрации (ПДК), установленные СанПиНом 2.3.2.1078–01 и ЕФ5.
Рис. 3. Динамика содержания: А – БАВ в траве манжетки, заготовленной подекадно; Б – аскорбиновой кислоты в траве манжетки; В – свободных аминокислот в траве манжетки
Таблица 3
Среднее содержание БАВ в образцах травы манжетки,
заготовленных в ботанико-географических зонах Пермского края
| № п/п | Ботанико-географические зоны | Административные районы и территории (единицы) | Места заготовки | Содержание БАВ, % | |||
| сумма флавоноидов в пересчёте на рутин | полисахариды | сумма окисляемых веществ | аскорбиновая кислота | ||||
| 1 | Среднетаёжных елово – пихтовых лесов | Юсьвенский | суходольный луг на опушке смешанного леса | 5,48 ± 0,19 | 7,9 ± 0,3 | 14,1 ± 0,6 | 0,17 ± 0,006 |
| Соликамский | поляна у смешанного леса | 2,82 ± 0,07 2,87 ± 0,03 | 10,1 ± 0,3 | 12,1 ± 0,2 | 0,16 ± 0,005 | ||
| разнотравный луг | 3,23 ± 0,11 | – * | – | – | |||
| луг на берегу реки | 2,70 ± 0,02 | 8,3 ± 0,1 | 11,0 ± 0,3 | 0,14 ± 0,003 | |||
| поляна в лесу | 2,62 ± 0,05 3,71 ± 0,13 2,18 ± 0,07 | – – – | – – – | – – – | |||
| суходольный луг | 2,49 ± 0,09 | – | – | – | |||
| Кудымкарский | поляна у леса | 4,40 ± 0,05 | 9,1 ± 0,1 | 11,7 ± 0,4 | 0,15 ± 0,002 | ||
| Чердынский | разнотравный луг на берегу реки | 2,65 ± 0,01 2,72 ± 0,04 | 9,6 ± 0,4 – | 9,7 ± 0,5 – | 0,13 ± 0,004 – | ||
| поляна в лесу | 3,74 ± 0,07 | – | – | – | |||
| Гайнский | заливной луг р. Кама | 3,67 ± 0,09 | 9,4 ± 0,4 | 13,1 ± 0,2 | 0,15 ± 0,001 | ||
| Средние значения содержания БАВ по зоне №1 | 3,23 ± 0,02 | 9,1 ± 0,1 | 12,0 ± 0,2 | 0,15 ± 0,002 | |||
Примечание: * – отсутствие данных
Варьирование показателей содержания микроэлементов в образцах манжетки между зонами и внутри ботанико-географических зон отражает геохимические особенности почв мест произрастания. Вышеизложенное даёт основание считать микроэлементы биологически активными веществами травы манжетки, а их количество подтверждает экологическую чистоту сырья.
Ресурсоведческие исследования проводили в Пермском районе на конкретных зарослях, объективно представляющих типичные места произрастания и фитоценозы манжетки обыкновенной с различной степенью её участия и типом луга, характерных не только для зоны Урала, но и средней полосы России (луг 1 – злаково-манжетково-васильковый, 2 – разнотравно-злаковый, 3 – вейниково-разнотравный, 4 – клеверно-злаково-разнотравный).
Биологический запас воздушно-сухого сырья (БЗС) исследованных лугов составил от 1 до13 тонн; эксплуатационный запас сырья (ЭЗС) – от 0,6 до 9 тонн; возможный ежегодный объём заготовки (ВЕОЗ) – от 0,2 до 3 тонн.
На суммарной площади исследуемых зарослей в 11,6 га можно заготовить 4,4 тонны травы манжетки при однократном отчуждении надземной фитомассы.
На этих лугах проводилось сенокошение в двадцатых числах июня, в период цветения манжетки обыкновенной. Первое определение запаса сырья проведено после сенокошения, второе (в отаве) – в первых числах сентября. В отаве на луге №1 срезали надземную часть цветущих экземпляров манжетки в середине августа (отава 1) и аналогично другим лугам в начале сентября (отава 2). Плотность запаса сырья (ПЗС) манжетки увеличивалась с 390 кг/га при ранней заготовке в отаве (отава 1) до 700 кг/га в сентябре. Таким образом, отавность манжетки изменялась от 36 до 64%, в зависимости от срока повторного отчуждения фитомассы (табл. 5).
Таблица 4
Среднее содержание БАВ в образцах манжетки обыкновенной,
заготовленных в ботанико-географических зонах Пермского края
| № п/п | Ботанико-географические зоны | Кол-во образцов | Содержание БАВ, % | |||
| флавоноиды | полисахариды | окисляемые вещества | аскорбиновая кислота | |||
| 1 | Среднетаежных елово–пихто- вых лесов | 14 | 3,23 ± 0,02 | 9,10± 0,1 | 12,0 ± 0,2 | 0,15 ±,002 |
| 2 | Южно – таежных Камско- Печорско – Западноуральских пихтово-еловых лесов | 10 | 2,80±0,02 | 10,0 ± 0,1 | 10,8 ± 0,1 | 0,15 ±,001 |
| 3 | Широколиственно-елово-пихтовых (подтаежных) лесов | 27 | 3,09 ± 0,01 | 8,6 ± 0,1 | 9,9 ± 0,04 | 0,17 ±,001 |
| 4 | Островной Кунгурской лесостепи | 6 | 2,89 ± 0,10 | 8,6 ± 0,1 | 9,8 ± 0,1 | 0,15 ±,001 |
| 5 | Средне - и южнотаежных предгорных пихтово-еловых и елово-пихтовых лесов | 14 | 3,36 ± 0,02 | 9,8 ± 0,1 | 9,9 ± 0,1 | 0,14±0,007 |
| 6 | Севро- и средне-таежных кедрово-еловых горных лесов | 8 | 3,29 ± 0,03 | 9,1 ± 0,1 | 9,9 ± 0,1 | 0,16 ±,002 |
В целом на исследуемых лугах, отавность манжетки находилась в пределах от 268 до 1294 кг/га, что составляло 56 – 67 % от фитомассы травы манжетки за первый укос. Прогноз запасов сырья манжетки на 4-х отавных лугах в сумме определён в 8,1 тонны (эксплуатационный запас), т.е. 62% дополнительно от массы сырья основного укоса.
Прогноз запасов травы манжетки на типичных местах обитания в Пермском районе Пермского края составляет 21 тонну ЭЗС.
Таким образом, сырьевая база манжетки обыкновенной в Пермском крае перспективна для промышленного сбора сырья.
При химической таксации образцов травы манжетки и статистической обработке данных установили, что содержание флавоноидов в образцах с генеративными побегами и без них, заготовленных во время основного укоса и в отаве, не имело существенных отличий (рис.4).
Содержание полисахаридов в цветущих экземплярах манжетки обыкновенной составило от 6,53 до 7,47%; окисляемых веществ – от 8,61 до 11,52%; аскорбиновой кислоты – от 0,15 до 0,16%. Достоверных различий между лугами по содержанию в траве манжетки полисахаридов, окисляемых веществ и аскорбиновой кислоты не обнаружено.
На основании выше изложенного, рекомендуем проводить заготовку сырья при первом укосе и с отавных лугов от цветущих и не цветущих экземпляров манжетки обыкновенной следующих вариантах: 1- в нескошенном фитоценозе, выбирая из травостоя траву манжетки;2 - из свежескошенного сена, выбирая траву манжетки; 3 - в отаве, срезая надземную часть.
Таблица 5
Ресурсоведческая характеристика лугов и запасы травы манжетки Пермского района
| № луга | S, га | Метод модельных экземпляров | Отавность, % | |||||
| состояние луга | ср. масса модельного экз., г | ПЗС, кг/га | БЗС, кг | ЭЗС, кг | ВЕОЗ, кг; t=2 | |||
| 1 | 1,5 | основной укос | 3,95 ± 0,31 | 1076 ± 117 | 1615 ± 176 | 1264 | 421 | 36 |
| отава 1 | 1,43 ± 0,14 | 390 ± 48 | 584 ± 72 | 440 | 147 | |||
| отава 2 | 2,54 ± 0,19 | 692 ± 73 | 1038 ± 110 | 818 | 273 | 64 | ||
| 2 | 2,3 | основной укос | 4,47 ± 0,47 | 481 ± 107 | 1106 ± 246 | 614 | 205 | 56 |
| отава | 2,49 ± 0,13 | 268 ± 54 | 616 ± 125 | 366 | 122 | |||
| 3 | 1,3 | основной укос | 7,84 ± 0,38 | 1943 ± 131 | 2526 ± 181 | 2164 | 721 | 67 |
| отава | 5,22 ± 0,58 | 1294 ± 159 | 1682 ± 207 | 1268 | 423 | |||
| 4 | 6,5 | основной укос | 9,98 ± 0,97 | 1975 ± 285 | 12836 ± 1853 | 9131 | 3044 | 59 |
| отава | 5,88 ± 0,38 | 1163 ± 145 | 7563 ± 943 | 5676 | 1892 | |||
Рис. 4. Содержание флавоноидов в траве манжетки
Разработан проект «Инструкции по заготовке травы манжетки», регламентирующий сроки и приёмы заготовки сырья.
ИССЛЕДОВАНИЯ К РАЗРАБОТКЕ ПРОЕКТА ФАРМАКОПЕЙНОЙ СТАТЬИ
«МАНЖЕТКИ ТРАВА»
Установили показатели качества по внешним и микроскопическим признакам. При определении подлинности сырья диагностическое значение имеют морфолого-анатомические характеристики листовой пластинки, цветка и стебля. Установлены числовые показатели; определена микробиологическая чистота травы манжетки. Установлена стабильность показателей качества травы манжетки в течение 3 лет.
Для раздела «Количественное определение» проекта ФС разработана и валидирована методика оценки качества травы манжетки по содержанию суммы флавоноидов в пересчёте на рутин. Дифференциальные спектры светопоглощения комплекса флавоноидов с 2% раствором алюминия хлоридом в извлечениях из травы 20 видов рода Alchemilla, травы манжетки смешанных образцов совпадают и характеризуются чётко выраженным максимумом поглощения при длине волны 405 ± 5 нм. Максимум поглощения дифференциальной кривой флавоноидов травы манжетки совпадает с одним из максимумов поглощения комплекса РСО рутина с AlCl3. Аналитическая длина волны 405 нм (рис. 7).
Рис. 5. Спектры комплекса флавоноидов извлечения травы манжетки и РСО рутина с AlCl3
Оптимальные условия извлечения флавоноидов: размер частиц сырья – 0,5 1,0 мм, экстрагент– 70% этиловый спирт, трёхкратная экстракция по 30 мин. Соотношение объёмов извлечения и 2% раствора AlCl3 – 1 : 2. Образование устойчивого комплекса происходит 30 минут. Комплекс стабилен в течение часа. Относительная ошибка определения составила 2,59 % (табл. 6).
Таблица 6
Метрологическая характеристика методики количественного определения суммы
флавоноидов в траве манжетки
| n | f |  | S2 | S | Р,% | t(P, f) |  х |  ,% |
| 10 | 9 | 2,403 | 0,000757 | 0,02751 | 95 | 2,26 | 0,06217 | 2,59 |
Коэффициент корреляции линейного регрессионного графика составил r= 0,994, уравнение регрессии y = bx + a, при b =0,015, a = - 0,1074. Соблюдается линейная зависимость между величинами оптической плотности и содержанием флавоноидов в извлечениях из травы манжетки в интервале 25 – 150% от номинального значения определяемой величины.
Отсутствие систематической ошибки подтвердили методом добавок различных концентраций РСО рутина в извлечение из травы манжетки, результаты которого показали, что ошибка опыта находится в пределах ошибки единичного определения (табл. 7).
Испытания внутри и межлабораторной воспроизводимости валидируемой методики, проведённые в лабораториях кафедры фармакогнозии и РИЦ «Фарматест» ПГФА. указывают на прецизионность разработанной методики в условиях внутри и межлабораторной воспроизводимости результатов.
Таблица 7
Результаты количественного определения суммы флавоноидов в
траве манжетки с использованием метода добавок РСО рутина
| Содержание флавоноидов, мг | Ошибки | ||||
| в извлечении в пересчёте на рутин | добавлено РСО рутина | в извлечении при добавлении рутина | ожидаемое теоретически в извлечении при добавке рутина | абсолютная, мг | относительная, % |
| 44,5 | 11,9 | 56,5 | 56,4 | 0,1 | 0,18 |
| 44,5 | 12,4 | 57,1 | 56,9 | 0,2 | 0,35 |
| 44,5 | 18,0 | 61,7 | 62,5 | 0,8 | 1,28 |
| 44,5 | 18,0 | 63,1 | 62,5 | 0,6 | 0,96 |
Валидационная оценка методики, проведённая по характеристикам: специфичность, линейность, правильность и прецизионность (внутри и межлабораторная) в соответствии с проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов», подтвердила её пригодность для стандартизации травы манжетки.
ЭКСТРАКЦИОННЫЕ ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ИЗ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ
Настой 1:10 содержит больше БАВ (табл. 8) и проявляет достоверно высокую фармакологическую активность (табл. 13).
Таблица 8
Содержание флавоноидов, окисляемых веществ, полисахаридов и
аскорбиновой кислоты в настоях травы манжетки, %
| № образца | Флавоноиды | Окисляемые вещества | Полисахариды | Аскорбиновая кислота | ||||
| настой 1:10 | настой 1:20 | настой 1:10 | настой 1:20 | настой 1:10 | настой 1:20 | настой 1:10 | настой 1:20 | |
| 1 | 0,021± 0,0004 | 0,020± 0,0002 | 2,92± 0,06 | 2,26± 0,003 | 3,43± 0,34 | 2,30± 0,04 | 0,18± 0,001 | 0,17± 0,0003 |
| 2 | 0,020± 0,0005 | 0,010± 0,001 | 4,61± 0,05 | 4,26± 0,05 | 2,63± 0,23 | 2,09± 0,08 | 0,18± 0,005 | 0,16± 0,007 |
| 3 | 0,028± 0,001 | 0,011± 0,001 | 5,44± 0,01 | 5,31± 0,05 | 4,87± 0,09 | 2,72± 0,12 | 0,27± 0,009 | 0,21± 0,005 |
| 4 | 0,022± 0,001 | 0,011± 0,0002 | 5,42± 0,06 | 5,23± 0,06 | 2,09± 0,03 | 1,29± 0,06 | 0,26± 0,001 | 0,21± 0,001 |
| 5 | 0,021± 0,0003 | 0,010± 0,0002 | 4,61± 0,04 | 4,27± 0,06 | 2,20± 0,05 | 2,02± 0,02 | 0,22± 0,005 | 0,20± 0,003 |
| 6 | 0,023± 0,001 | 0,012± 0,001 | 4,40± 0,06 | 3,22± 0,02 | 2,46± 0,20 | 1,82± 0,08 | 0,23± 0,006 | 0,21± 0,005 |
| Среднее | 0,023 | 0,012 | 4,57 | 4,09 | 2,45 | 2,04 | 0,22 | 0,19 |
| Достоверность | tэ =5,1964; | tэ =0,7778; | tэ =1,9178; | tэ =1,6542; | ||||
Примечание. tк 2,2278.
В настое травы манжетки идентифицировали рутин из 8 обнаруженных веществ фенольной природы; свободные аминокислоты: лизин, гистидин, D,L–треонин, изолейцин, D,L–метионин, валин, глицин, глутаминовая и аспарагиновой кислоты.
Для сквозной стандартизации сырья и настоя предложена адаптированная для настоя методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на рутин (табл. 9).
Таблица 9
Метрологические характеристики методики количественного
определения суммы флавоноидов настоя травы манжетки
| n | f |  | S2 | S | Р,% | t(P, f) |  х |  ,% |
| 5 | 4 | 0,023 | 0,000057 | 0,00174 | 95 | 2,776 | 0,00078 | 3,39 |
Для получения экстракта травы манжетки сухого использовали параметры соотношения сырья и экстрагента, размера частиц установленные для настоя. Для экстракта дополнительно выбраны параметры: экстрагент (табл. 15); температура экстрагирования; продолжительность и кратность числа экстракций (равновесного состояния процесса настаивания).
Траву манжетки измельчают до размера частиц >1мм 3мм, экстрагируют водой очищенной в соотношении сырье : экстрагент – 1 : 10 методом ускоренной дробной мацерации в экстракторе при температуре 900± 50С в три этапа: в течение 1часа, 45 мин. и 30 мин. Объединенные извлечения отстаивают, фильтруют, декантируют, упаривают в вакууме до 1/10 объёма и высушивают в распылительной сушилке.
В составе экстракта идентифицировали рутин из 8 веществ фенольной природы и 9 из 11обнаруженных аминокислот, в их числе лейцин, изолейцин, метионин, треонин, лизин, аланин, глицин, аспарагиновая и глутаминовая кислоты.
Содержание эссенциальных и условно эссенциальных микроэлементов в экстракте уменьшалось в ряду: Mn (369,0мг/кг) > Cr = V > Ni = Cu = Zn > Co > Pb > Sn > Mo (0,74мг/кг). Концентрация микроэлементов, отражающих антропогенную нагрузку уменьшалась в ряду: Ti (822,0 мг/кг) > Ba > Sr > Zr > Y = Nb > Sc = Ga > Ge = Be > Bi = Yb > Ag (0,06мг/кг). Содержание тяжёлых металлов Pb (2,55 мг/кг) не превышает предельно допустимые концентрации (ПДК), установленные СанПиНом 2.3.2.1078–01 и ЕФ5.
Для сквозной стандартизации экстракта предложена адаптированная методика количественного определения суммы флавоноидов в пересчёте на рутин. Методика обладает хорошей воспроизводимостью, относительная ошибка среднего измерения при доверительной вероятности 95% составила – 3,61% (табл. 10).
Таблица 10
Метрологическая характеристика спектрофотометрического метода количественного определения флавоноидов в экстракте манжетки сухом
| n | f |  | S2 | S | Р,% | t(P, f) |  х |  ,% |
| 5 | 4 | 3,82 | 0,02 | 0,16 | 95 | 2,776 | 0,138 | 3,61 |
Разработаны показатели качества и включены в проект ФСП «Экстракт травы манжетки сухой».
Содержание БАВ в экстракте манжетки сухом 5 серий составило: флавоноиды 3,7 – 4,1%, окисляемые вещества – 4,7 - 5,5%, полисахариды – 24,3- 33,4%, аскорбиновая кислота – 0,3 - 0,3% (табл. 11).
Таблица 11
Содержание биологически активных веществ в экстракте манжетки сухом, %
| Номер серии | Группы БАВ | |||
| сумма флавоноидов в пересчёте на рутин | полисахариды | сумма окисляемых веществ в пересчёте на танин | аскорбиновая кислота | |
| 1 | 3,77 ± 0,12 | 26,37 ± 3,87 | 5,85 ±1,47 | 0,33 ± 0,02 |
| 2 | 4,10 ± 0,09 | 31,52 ± 4,91 | 4,01 ± 0,37 | 0,33 ± 0,01 |
| 3 | 3,73 ± 0,15 | 33,36 ± 0,70 | 4,70 ± 0,37 | 0,31 ± 0,01 |
| 4 | 3,75 ± 0,14 | 24,31 ± 4,17 | 3,25 ± 0,36 | 0,31 ± 0,03 |
| 5 | 3,77 ± 0,19 | 33,09 ± 1,06 | 3,23 ± 0,36 | 0,32 ± 0,02 |
Определены технологические характеристики экстракта: содержание влаги– 3,72%, насыпную массу при свободном падении– 0,3 г/см3, насыпную массу при уплотнении– 0,4 г/см3. Определение сыпучести и угла естественного откоса экстракта с помощью метода вибрирующей воронки на приборе ВП-12А показало, что экстракт травы манжетки сухой не сыпучий.
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ НАСТОЯ И ЭКСТРАКТА
ИЗ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ
В максимально введенной перорально дозе настой травы манжетки каких-либо проявлений токсического действия не выявлено. ЛД 50 настоя травы манжетки превышает 11,7 г/кг. Максимально введенная перорально доза экстракта травы манжетки составляет 10 г/кг. Расчетная ЛД 50 экстракта травы манжетки равна 8 г/кг. Настой и экстракт травы манжетки относятся к малотоксичным (табл. 12).
Гипогликемическое действие у настоя и экстракта травы манжетки подтверждено на модели экспериментального диабета, индуцированного аллоксаном.
Таблица 12
Острая токсичность
| Серии опытов | Максимально использованная доза | ЛД 50 |
| Настой травы манжетки | 14 000 мг/кг | 11 700 мг/кг |
| Экстракт травы манжетки | 10 000 мг/кг | 8 000 мг/кг |
Настой и экстракт травы манжетки не изменяли уровня глюкозы в крови у интактных крыс во все сроки наблюдения. Гипогликемический эффект проявлялся уменьшением глюкозы в крови по сравнению с фоном во все сроки наблюдения. О чём свидетельствуют достоверные отличия между уровнем глюкозы в крови контрольных (нагрузка глюкозы) и опытных (настой травы манжетки + нагрузка глюкозы, экстракт травы манжетки + нагрузка глюкозы) животных.
Таблица 13
Сравнительная оценка гипогликемической и гиполипидемической
активности настоя травы манжетки и настоя черники
| Серии опытов | Кол-во живот-ных | Уровень глюкозы, ммоль/л | Общий холестерин, ммоль/л | Триглицериды, ммоль/л | |
| 30 мин | 120 мин | ||||
| Контроль | 6 | 4,31±0,11 | 4,11±0,08 | 4,32±0,21 | 0,72±0,09 |
| Аллоксановый диабет | 6 | 9,97±0,22 ***1 | 10,01±0,05 ***1 | 5,66±0,07 ***1 | 1,94±0,02 ***1 |
| Аллоксановый диабет + настой манжетки (1:10) | 6 | 6,23±0,04 ***1 ***2 | 6,15±0,06 ***1 ***2 | 4,88±0,05 *1 ***2 | 1,03±0,03 **1 ***2 |
| Аллоксановый диабет + настой манжетки (1:20) | 6 | 7,55±0,15 ***1 ***2 | 7,18±0,07 ***1 ***2 | 4,98±0,03 *1 ***2 | 1,06±0,01 **1 ***2 |
| Аллоксановый диабет + настой черники (1:10) | 6 | 5,42±0,21 ***1 ***2 ***3 | 5,41±0,15 ***1 ***2 ***3 | 4,84±0,03 *1 ***2 | 0,93±0,03 ***2 |
| Аллоксановый диабет + настой черники (1: 20) | 6 | 6,78±0,14 ***1 ***2 **3 | 6,95±0,11 ***1 ***2 | 5,20±0,07 **1 ***2 *3 | 1,00±0,03 *1 ***2 |
Примечание: * = p < 0,05; ** = p < 0,01; *** = p < 0,001; 1 по сравнению с контролем; 2- по сравнению с аллоксановым диабетом; 3 – по сравнению с настоем травы манжетки (в равных концентрациях)
О специфичности данного эффекта свидетельствует дозозависимый эффект настоя и экстракта. Принципиальное значение имеет их способность проявлять гипогликемическое действие независимо от тяжести химически вызванного нарушения углеводного обмена.
Поскольку аллоксановый диабет сопровождается также и нарушением липидного обмена, то выявленная способность настоя и экстракта травы манжетки снижать уровень общего холестерина и триглицеридов свидетельствует о наличии гиполипидемического действия. Таким образом, настой и экстракт травы манжетки обладают типичными фармакологическими свойствами, присущими антидиабетическим препаратам. Антидиабетическая активность настоя травы манжетки несколько уступала фитопрепарату сравнения – настою побегов черники (табл. 13).
Сравнительный анализ влияния фитопрепаратов на аллоксановый диабет показал, что экстракт травы манжетки сухой в дозе 50 мг/кг по выраженности гипогликемического действия достоверно уступает настою черники. Экстракт травы манжетки сухой в дозе 50 мг/кг достоверно превосходил настой черники по влиянию на уровень общего холестерина. Аналогичная ситуация наблюдалась и в отношении снижения уровня триглицеридов. В этом случае экстракт травы манжетки сухой в дозе 50 мг/кг превосходил настой черники. Так, если экстракт травы манжетки сухой снижал уровень триглицеридов в 3,2 раза, тогда как настой черники - лишь в 2,1 раза (p < 0,001) (табл. 14).
Установлено, что сухие спиртовые экстракты, полученные при использовании в качестве экстрагента этиловый спирт, в дозе 50 мг/кг не проявили существенной гипогликемической активности на модели аллоксанового диабета (табл. 14). Спиртоводные экстракты травы манжетки не перспективны в качестве гипогликемических средств.
Таблица 14
Влияние сухих спиртовых экстрактов травы манжетки
на уровень глюкозы в крови у крыс с аллоксановым диабетом
| Серии опытов | Концентрация экстрагента, % | Доза, мг/кг | Коли-чество животных | Снижение уровня глюкозы, % | |
| 30 мин | 120 мин | ||||
| Водный экстракт травы манжетки сухой | - | 50 | 6 | 33,5 ± 0,4 ***1 | 36,4 ± 0,6 ***1 |
| Спиртовый экстракт травы манжетки сухой | 40 | 50 | 6 | 16,4 ± 1,3 *2 | 19,9 ± 1,7 *1 ***2 |
| 50 | 50 | 6 | 25,8 ± 0,5 **1 ***2 | 14,4 ± 0,8 ***2 | |
| 60 | 50 | 6 | 19,9 ± 2,3 *1 ***2 | 0,0 ± 0,0 ***2 | |
| 70 | 50 | 6 | 13,6 ± 0,8 ***2 | 8,3 ± 0,7 ***2 | |
| 80 | 50 | 6 | 30,7 ± 0,8 ***1 | 14,3 ± 0,8 ***1 | |
Примечание: *** = p < 0,001; 1 по сравнению контролем; 2 – по сравнению с водным экстрактом
Таблица 15
Влияние настоя травы манжетки на иммунодефицит
| Серии опытов | Доза | Количество животных | Количество | |
| Т – лимфоциты | В – лимфоциты | |||
| Контроль | – | 6 | 55,7 ± 1,5 | 16,8 ± 1,1 |
| Циклофосфан | 50 мг/кг | 6 | 23,5 ± 1,3 ***1 | 5,2 ± 0,7 ***1 |
| Циклофосфан+ настой травы манжетки (1:10) | 50 мг/кг + 1мл/100г | 6 | 53,0 ± 1,0 ***2 | 18,7 ± 0,8 ***2 |
| Циклофосфан + экстракт травы манжетки | 50 мг/кг + 50 мг/кг | 6 | 45,7 ± 1,4 ***1 | 14,0 ± 0,5 ***2 |
Примечание: ** = p < 0,01; *** = p < 0,001;
1 по сравнению с контролем; 2- по сравнению с циклофосфаном
В генезе сахарного диабета существенную роль играют и аутоиммунные процессы. На модели лекарственно индуцированного иммунодефицита установлено, что настою и экстракту травы манжетки присуще самостоятельное иммуномодулирующее действие. Об этом свидетельствовало устранение лейкопении, уменьшение патологических сдвигов морфологического состава крови, которые типичны для вызванного циклофосфаном иммунодефицита. Настой и экстракт травы манжетки устраняли иммунодепрессивное действие циклофосфана на Т- и В-лимфоциты (табл. 15).
По-видимому, данный эффект связан с прямым влиянием их на соответствующие популяции лимфоцитов. Гипотеза подтверждена влиянием фитопрепаратов на экспрессию рецепторов Т-лимфоцитов. Настой и экстракт травы манжетки устранял эффект трипсина в отношении Т-рецепторов (табл. 15).
Таблица 16
Влияние настоя травы манжетки на фагоцитоз на фоне иммунодефицита
| Серии опытов | Доза | Количество животных | Фагоцитарная активность нейтрофилов, % |
| Контроль | – | 6 | 48,5±1,3 |
| Циклофосфан | 50 мг/кг | 6 | 33,7±0,6 ***1 |
| Циклофосфан + настой травы манжетки (1:10) | 50 мг/кг + 1мл/100г | 6 | 43,4±1,1 ***2 |
| Циклофосфан + экстракт травы манжетки | 50 мг/кг + 50 мг/кг | 6 | 44,5±1,8 ***1 ***2 |
Примечание: ** = p < 0,01; *** = p < 0,001;
1 по сравнению с контролем; 2- по сравнению с циклофосфаном
Иммунокорригирующее действие настоя и экстракта травы манжетки включает ещё и фагоцитозстимулирующий эффект. Фитопрепараты манжетки восстанавливали фагоцитоз у крыс с экспериментальным иммунодефицитом (табл. 16).
Таким образом, настой и экстракт травы манжетки сухой обладают типичными фармакологическими свойствами, присущими антидиабетическими препаратам и иммунокорректорам.
ВЫВОДЫ
- Результаты исследований по морфологии, анатомии, химическому составу травы манжетки и литературные данные позволили объединить виды рода Alchemilla L. под названием Alchemilla vulgaris L., как производящего растения для заготовки сырья «Alchemillae herba».
- На основании результатов эколого-ценотической характеристики, морфометрического анализа и динамики накопления БАВ, исследований по срокам и приёмам заготовки разработана «Инструкция по заготовке травы манжетки».
- Сырьевая база манжетки обыкновенной в Пермском крае перспективна для промышленного сбора сырья. Прогноз запасов травы манжетки в Пермском районе Пермского края составил 21 т эксплуатационного запаса сырья.
- Установлена возможность заготовки травы манжетки в 2 срока: основной укос в период массового цветения и в период отрастания в отаве. Сбор сырья на отавных лугах позволит увеличить объёмы заготовки травы манжетки до 62% дополнительно от массы сырья основного укоса.
- Разработан проект ФС «Alchemillae herba – манжетки трава», регламентирующий качество сырья манжетки. Предложена валидированная методика количественного определения в траве манжетки суммы флавоноидов в пересчёте на рутин. Установлены показатели подлинности и доброкачественности сырья.
- Определены условия получения экстракта травы манжетки сухого, обеспечивающие максимальное содержание флавоноидов, полисахаридов, аскорбиновой кислоты, суммы окисляемых веществ и фармакологическую активность. Разработан проект ФСП «Extractum herbae Alchemillae siccum» – «Экстракт травы манжетки сухой» и составлена технологическая схема получения экстракта травы манжетки сухого.
- Выявлена гипогликемическая, гиполипидемическая и иммунокорригирующая активность настоя и экстракта травы манжетки сухого, что позволяет рассматривать траву манжетки как лекарственное средство и сырьё для получения новых антидиабетических средств и иммунокорректоров растительного происхождения.
Список опубликованных работ:
- Влияние фитопрепаратов на функциональную активность рецепторов инсулина / Е.В. Зорина, Г.И. Олешко, Т.А. Юшкова, Е.А. Голышева // Новая технологическая платформа биомедицинских исследований : материалы науч.-практ. конф., Ростов н/Д, 16-17 октября 2006 г. - С. 13.
- Зорина, Е.В. Исследование химического состава и фармакологической активности экстракта травы манжетки / Е.В. Зорина, Г.И. Олешко, Т.А. Юшкова // Человек и лекарство : тез. докл. ХII Рос. нац. конгр., Москва, 18-22 апр. 2005 г. – М., 2005. - С. 755.
- Зорина, Е.В. Количественное определение суммы флавоноидов в траве манжетки / Е.В. Зорина, Г.И. Олешко, А.Б.Седова // Вест. ПГФА. - 2007. – № 2. – С. 234–238.
- Зорина, Е.В. Исследования по разработке нормативной документации на траву манжетки / Е.В. Зорина, Г.И. Олешко, А.Б. Седова // Фармация – 2009. - № 1. – С. 11–15.
- Исследование некоторых видов манжеток как возможного гипогликемического средства / А.Б. Седова, Е.В. Зорина, Е.В. Челпанова, Г.И. Олешко // Человек и лекарство : тез. докл. Х Рос. нац. конгр., Москва, 7- 11 апр. 2003 г. – М., 2003. - С. 660.
- Морфолого-анатомическое строение генеративных органов представителей рода Alchemilla / Е.В. Зорина, Г.И. Олешко, А.Б. Седова, Е.В. Челпанова // Достижения и перспективы в области создания новых лекарственных средств : материалы науч.-практ. конф., посвящ. 70-летию ПГФА, Пермь, 27-28 нояб. 2007 г. – С. 432-436.
- Седова, А.Б. Лекарственные растения в лечении сахарного диабета: Монография / А.Б. Седова, Е.В. Зорина. – Пермь: ГОУ ВПО «ПГФА Росздрава», 2006. – 227с.
- Способ получения средства, обладающего гипогликемической и иммуномодулирующей активностью/ Е.В. Зорина, Г.И. Олешко, Т.А. Юшкова, В.В. Юшков. Заявка на выдачу патента № 2008100346/15(000378), решение от 28. 11. 2008г.
- Фармакогностическое изучение видов рода Alchemilla / Е.В.Зорина, А.Б.Седова, Г.И.Олешко С.Д., Марченко // Человек и лекарство : тез. докл. ХII Рос. нац. конгр., Москва, 18-22 апр. 2005 г. – М., 2005. - С. 755.
- Zorina, E.V. DEFINITION of the FACTORS INFLUENTIAL IN ACCUMULATION FLAVONOIDS In a GRASS ALCHEMILLA ORDINARY / E.V. Zorina, G.I. Oleshko, A.B. Sedova : materials of the 2-nd Russian–Chinese international scientific conferences on pharmacology «Fundamental pharmacology and pharmacy–clinical practice». - Perm, 2006. – P. 70.
